CN104928285A

CN104928285A - 载体克隆表达区基因和蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体

Info

Publication number: CN104928285A
Application number: CN201410109231.6A
Authority: CN
Inventors: 徐明恺; 邹瑾; 孟北乾; 李旭; 张惠文
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明涉及基因重组和蛋白表达领域，具体说是一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体克隆表达区基因的设计及其应用，设计并合成一种载体克隆表达区基因，其具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；将该基因片段克隆连接至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1的Nhe I和Hind III限制性内切酶识别位点区间，构建了一种新型表达载体pcDNA3.1-secreting，该载体可使编码基因连接于多克隆位点处的外源蛋白在哺乳动物宿主细胞中以胞外分泌的形式表达出来，分泌于细胞培养液中，便于收集和纯化。

Description

载体克隆表达区基因和蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体

技术领域

本发明涉及基因重组和蛋白表达领域，具体说是一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体克隆表达区基因的设计及其应用，构建成一种新型的蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-secreting。

背景技术

众所周知，大量哺乳动物来源的蛋白都是糖蛋白，这类蛋白在表达过程中需要翻译后修饰。因此，如以基因工程技术来大量制备此类蛋白，原核宿主细胞如细菌细胞等是不适合的。由于这个原因，研究者开发了利用高等真核细胞（如哺乳动物细胞）的蛋白表达系统。然而，以哺乳动物细胞表达的蛋白，其生产和回收技术存在的主要问题是这些蛋白主要被表达于细胞质内，而不能分泌到细胞外空间，因此后续对这些蛋白的纯化必须先裂解细胞，然后经几步程序使所表达的目的蛋白与其它胞内蛋白分离。解决这个问题的方法之一是使表达的重组蛋白能够分泌到细胞外的培养基中。这样可以较为容易而有效地进行纯化。此外，分泌产生的重组蛋白的另一个优点是可避免被蛋白酶水解并且蛋白质正确折叠的机会更大。蛋白质的成功分泌要求蛋白质能有效穿越内质网膜和细胞膜。这就需要在要表达的目的蛋白氨基端连接一段附加的肽序列，此附加序列可使其后融合的目的蛋白分子进入分泌通路。此附加肽序列被称为信号肽序列。

载体pcDNA3.1载体是一种可在哺乳动物细胞中表达外源蛋白的表达载体，其高效的CMV启动子，可在多种哺乳动物细胞中被高效激活，用于多种真核生物蛋白的表达。但是pcDNA3.1载体缺乏有效信号肽序列，不能将表达的蛋白质分子分泌到细胞外，这对于后续对表达的蛋白的提取和分离造成严重不便。本发明在大量生物信息学模拟分析，多种序列组合的设计和实际生物学活性筛选结果的基础上，对pcDNA3.1载体进行改造，设计并合成一种载体克隆表达区基因，构建了一种新型表达载体pcDNA3.1-secreting，该载体可使编码基因连接于多克隆位点处的外源蛋白在哺乳动物宿主细胞中以胞外分泌的形式表达出来，分泌于细胞培养液中，便于收集和纯化。

发明内容

本发明的目的是设计一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体克隆表达区基因及其应用，获得一种能够有效的将外源蛋白分泌表达到细胞外培养基中的新型哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-secreting。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

设计并合成载体克隆表达区基因，其具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；

SEQ ID NO：1

GGCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGC 40

TTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCAAGCTT 72

利用限制性核酸内切酶Nhe I和Hind III的酶切连接技术，将合成的载体克隆表达区基因（序列表SEQ ID NO：1中碱基序列）整合入表达载体pcDNA3.1克隆表达区，构建成新型表达载体pcDNA3.1-secreting。该载体可使编码基因连接于多克隆位点处的外源蛋白在哺乳动物宿主细胞中以胞外分泌的形式表达出来，分泌于细胞培养液中，便于收集和纯化。

本发明具有如下优点：

1.本发明构建的新型表达载体pcDNA3.1-secreting，在紧邻启动子下游区添加了高效的分泌信号肽序列，可使克隆于下游的外源编码基因表达的蛋白分子分泌到细胞外培养基中，既方便了后续的纯化提取，省略了细胞破碎的过程；又避免表达的外源蛋白在细胞内被胞内蛋白酶水解，因此可以显著提高蛋白表达效率。

2.本发明构建的新型表达载体pcDNA3.1-secreting，在启动子下游和多克隆位点上游添加了ATG起始密码子和Kozak序列，Kozak序列可以极大提高基因转录后的蛋白翻译效率。因此以本发明所构建的载体在哺乳动物细胞中行进外源蛋白表达时，无需再于编码基因中额外添加ATG和Kozak序列，大大的简化了外源基因片段亚克隆至本载体的过程。

3.本发明构建的新型表达载体pcDNA3.1-secreting，尽可能地保留了原载体的pcDNA3.1的多克隆位点区的限制性内切酶识别序列，方便外源基因片段的连接和插入。

附图说明

图1为酶联免疫吸附法（ELISA）检测的原有pcDNA3.1(+)载体和本发明中的pcDNA3.1-secreting载体在HEK293细胞中表达重组人IL-6（rhIL-6）蛋白片段的结果，白框部分为细胞培养基中的rhIL-6含量，灰框部分为细胞破碎后细胞质中的rhIL-6含量。由图可知，以pcDNA3.1(+)载体在HEK293细胞中表达的rhIL-6，基本分部于细胞质中，而培养基中含量极低；而以本发明中构建的新型表达载体pcDNA3.1-secreting在HEK293细胞中表达的rhIL-6，可以被有效的分泌到细胞培养基中，便于后续的分离与纯化。

具体实施方式

实施例1

载体克隆表达区基因的制备，其具有序列表SEQ ID NO：1中所示的碱基序列：

（1）SEQ ID NO.1的信息（参见序列表）

（a）序列特征：

*长度：72碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

（b）分子类型：寡聚核苷酸链

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：设计并人工合成

(2)载体克隆表达区基因的制备

1）载体克隆表达区基因的设计合成：

根据构建新型表达载体的预期目的，设计并合成两条寡聚核苷酸链：正向链p-F:

5’-GCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCA-3’；

反向链p-R:

5’-AGCTTGCACCTCACCCCGGGAAGCCACAAAAGCAGCAAGCCCAGAAATTGAGGAGGAACTCTCATC-3’

2）寡聚核苷酸链的退火：

10×退火杂交缓冲液（SSC）成分：1.5mol/L NaCl

0.3M柠檬酸三钠·2H₂O，

以HCl调pH至7.0

退火反应体系：

10×SSC buffer 1μl

正反寡聚核苷酸链各5pmol

无菌超纯水补齐体积至10μl

退火反应条件：94℃ 10min；

0℃ 10min；

72℃ 20min

实施例2

新型表达载体pcDNA3.1-secreting的构建

（1）pcDNA3.1载体的双酶切：将pcDNA3.1(+)载体质粒（Invitrogen）DNA经Takara公司的限制性核酸内切酶Nhe I和Hind III充分消化，消化产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化5400bp大片段；

（2）酶切产物的连接及转化：将退火的寡聚核苷酸链和经过酶切回收的pcDNA3.1(+)载体大片段以5:1的摩尔比例混合，并以Takara公司的T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建成表达载体pcDNA3.1-secreting。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞（转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley&Sons出版社1995年第三版P39-40），以氨卞青霉素抗性筛选转化子。

（3）表达载体pcDNA3.1-secreting的验证：将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA（质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30），并以Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序证实连接正确。

实施例3

新型表达载体pcDNA3.1-secreting的实际应用及效果评价

（1）编码重组人IL-6（rhIL-6）的基因rhil-6片段购自Sino Biological公司的全长ORF克隆质粒，以此质粒为DNA模板，根据IL-6的编码基因序列，设计PCR引物如下：

il-6F:5’-TGGATCCAACTCCTTCTCCACAAGC-3’

il-6R:5’-CGAATTCCTACATTTGCCGAAGAGC-3’

引物上下游分别添加BamHI和EcoRI酶切位点。

（2）以Takara公司的PCR试剂盒进行常规PCR反应，具体PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒+55℃30秒+72℃60秒（30个循环）；72℃5分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化640bp片段。

（3）回收的片段经Takara公司的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI充分消化，消化产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化640bp片段。

（4）质粒DNA：pcDNA3.1-secreting和pcDNA3.1(+)，都以Takara公司的限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI充分消化，消化产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化5400bp大片段。

（5）分别将（4）中双酶切回收后的pcDNA3.1-secreting和pcDNA3.1(+)质粒DNA片段，与（3）中得到的640bp的rhil-6片段，以1:5的摩尔比例混合，并以Takara公司的T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建成表达载体pcDNA3.1-secreting-rhil-6和pcDNA3.1-rhil-6。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞（转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约JohnWiley&Sons出版社1995年第三版P39-40），以氨卞青霉素抗性筛选转化子。

（6）将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA（质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30），并以Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序证实连接正确。

（7）将构建好的rhIL-6表达载体pcDNA3.1-secreting-rhil-6和pcDNA3.1-rhil-6质粒DNA，以Invitrogen公司的细胞转染试剂盒lipofectamineLTX&PLUS，转染HEK293细胞，按照试剂盒说明书操作，转染后12小时换培养基，继续在37℃，5%的CO₂浓度下培养48小时。

（8）分别收集细胞培养基上清液（A组份），并将贴壁细胞以胰酶消化，PBS清洗两次，再以等培养基体积的PBS溶液重悬细胞，匀浆破碎，12000g离心20min收集上清（B组份）。

以Abcam公司的人IL-6的酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒，分析A和B组份中的rhIL-6表达含量。以酶标仪读取吸光度并计算结果。由ELISA结果可知（附图1），以pcDNA3.1(+)载体在HEK293细胞中表达的rhIL-6，基本分部于细胞质中，而培养基中含量极低；而以本发明中构建的新型表达载体pcDNA3.1-secreting在HEK293细胞中表达的rhIL-6，可以被有效的分泌到细胞培养基中，便于后续的分离与纯化。

Claims

1.载体克隆表达区基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列。

2.一种蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体，其特征在于：将序列表SEQID NO：1中碱基序列克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1的Nhe I和HindIII限制性内切酶识别位点区间，构建成蛋白分泌型哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-secreting。