CN104911198B

CN104911198B - 蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2及其编码的蛋白及应用

Info

Publication number: CN104911198B
Application number: CN201510355910.6A
Authority: CN
Inventors: 陈文荣; 邵俊怡; 叶美娟; 余柯达; 吴洁慧; 郑晓梅
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2017-10-31
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: CN104911198A

Abstract

本发明公开了一种蓝莓耐盐、抗旱LON2蛋白酶基因VcLON2及其编码的蛋白及应用。VcLON2具有序列表中SEQ ID NO.1的序列；通过转化本氏烟，发现转基因植株的耐盐和抗旱能力明显提高。本发明的基因对培育耐盐和抗旱植物（特别是作物）具有重要作用。

Description

蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2及其编码的蛋白及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及蓝莓耐盐、抗旱LON2蛋白酶基因VcLON2及其编码的蛋白及应用。

背景技术

干旱和土壤盐渍化等非生物逆境是当今限制作物产量的主要环境因素，植物的生产量大大关系着人们的生活。干旱发生频率较高、范围较广，全球多数国家均遭受干旱的影响，干旱已经成为全球最严重的自然灾害之一，每年干旱造成经济损失达数千亿美元。而土壤盐渍化方面，全世界约有10亿公顷的土地存在不同程度的盐渍化，占世界陆地总面积的约10%，而我国就有近一亿公顷盐渍化土地。因此，提高作物的耐盐和抗旱能力已经成为现代作物育种工作急需解决的关键问题之一。

利用转基因技术将具有优良性状的基因转入植物中，以此开发高效的转基因新品种具有广阔的应用前景。一些研究已表明将植物本身及其他植物中耐盐抗旱相关基因转入植物中，可以提高转基因植物的耐盐抗旱能力。

LON蛋白酶是细胞器中蛋白质质量控制的最主要成分，其可以通过降解损伤或者错误折叠的蛋白来控制蛋白的命运，在多种生理过程中都有着重要的作用。然而，目前大多数研究主要集中在古生菌、原核生物和动物等非植物体中，在植物体内的研究相对较少。尤其该基因在植物抗逆（生物胁迫或非生物胁迫）中的功能研究尚无相关报道，因此，对于植物中LON蛋白酶的研究具有重要的研究价值和前景。特别是几乎没有关于蓝莓VcLON2在抗逆等功能方面的研究。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提出一种提高植物耐盐、抗旱性的蓝莓LON2蛋白酶基因VcLON2，所述VcLON2基因cDNA 核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提出一种蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2的克隆方法，提取蓝莓RNA，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过RT-PCR获得VcLON2基因序列，引物序列为：

VcLON2-F：5’-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’ ；

VcLON2-R：5’-TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’ 。

本发明还提出一种蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQID No.2所示。

本发明提出一种权利要求1所述的蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2在培育耐盐、抗旱植物中的应用。

进一步的，所述植物是烟草、玉米、水稻、小麦和蓝莓。

本发明还提出一种植物超表达载体，其含有蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2。

进一步的，所述植物超表达载体为pSH737-CaMV35S-VcLON2。

此外，本发明还提出一种提高耐盐性和抗旱性的方法，利用pSH737-CaMV35S-VcLON2借助于基因工程手段介导植物遗传转化，获得的转基因植物。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR 技术，分离与鉴定蓝莓耐盐、抗旱相关基因序列信息，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入本氏烟，经过耐盐、抗旱表型鉴定证明转入VcLON2基因的植株耐盐力和抗旱力明显提高。

附图说明

图1为 VcLON2基因全长cDNA序列的扩增结果；

图2 为实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）分析盐胁迫和干旱胁迫下VcLON2的表达情况；

图3 -a为大肠杆菌pMD19-T-VcLON2 PCR检测电泳结果；

图3-b为pSH737质粒和目的基因酶切图；

图4为 VcLON2转基因本氏烟植株的PCR 鉴定；

图5为转基因本氏烟及野生型在盐胁迫和干旱胁迫处理30 d后的生长情况；

图6为转基因本氏烟及野生型在盐胁迫和干旱胁迫处理30d后的株高、根长、鲜重和干重。

具体实施方式

实施实例1、VcLON2基因的获得

1.1 RNA的提取

(1) 取蓝莓组织0.1-0.2 g于研钵中，用液氮研磨成粉末状并快速转移至事先65℃预热的2 mL离心管（离心管中盛有0.9 mL CTAB提取液（20 g/L CTAB、20 g/L PVP、100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl）+30 μL β-巯基乙醇）中，用涡旋震荡仪震荡均匀；置于65℃水浴锅中预热10 min，期间颠倒混匀3次；

(2) 水浴后7000 r/min离心5 min，取上清，加入1/3体积的5 mol/L醋酸钾（pH4.8）混匀后冰浴30 min，再加入700 μL氯仿/异戊醇（24:1）涡旋混匀；

(3) 4℃下12000 r/min离心5 min，取上清，加入500 μL水饱和酚（pH 5.2）混匀后，再加入500 μL氯仿/异戊醇（24:1）涡旋混匀；

(4) 4℃下12000 r/min离心5 min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）涡旋混匀；

(5) 4℃下12000 r/min离心5 min，取上清，加入等体积的异丙醇混匀后冰浴沉淀30 min；

(6) 4℃下12000 r/min离心10 min，去上清，加入1 mL 75%酒精洗涤沉淀两次；

(7) 室温自然干燥10 min，适量DEPC水溶解，得到蓝莓RNA，-80℃保存备用。

1.2 cDNA的合成

本发明所用的反转录试剂盒为：PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis kit（TaKaRa）。

1)10 μL体系：Oligo dT Primer (50 μM) 1 μL

dNTP Mixture (10 mM each) 1 μL

Total RNA ＜5 μg

RNase free dH₂O Up to 10 μL

2)65℃变性5 min，迅速插入冰中，然后依次加入：

上述变性后反应液 10 μL

RNase free dH₂O 4.5 μL

5× PrimeScript Buffer 4 μL

RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL

PrimeScript RTase (200 U/μL ) 1 μL

3)轻轻混匀步骤2得到的反应液，42℃反应1 h；

4)70℃保温15 min，使酶失活，冰上放置冷却，-20 ℃保存备用。

1.3 cDNA的克隆

1.3.1 完整ORF预测及引物设计

根据葡萄的LON2基因cDNA序列（XM_002282621.2）对NCBI中的蓝莓EST库进行比对分析，获得一系列同源EST序列（SRR353286.100950.2、SRR353286.98047.2、SRR353287.39645.2、SRR353282.58737.2、SRR353291.8534.2、SRR353285.2047.2、SRR353283.12456.2、SRR353285.54358.2）。拼接序列，经基因预测，然后用软件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html）预测完整ORF。

在ORF序列两侧设计上游引物VcLON2-F：5’-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’(SEQ IDNO.3)和下游引物VcLON2-R：5’-TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’(SEQ ID NO.4)，用蓝莓cDNA（由步骤1.2合成的）进行RT-PCR。

1.3.2 PCR扩增VcLON2

PCR反应体系（25 μL）

10×LA PCR BufferⅡ（Mg²⁺ Plus） 2.5 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 2.0 μL

SEQ ID NO.3 1.0 μL

SEQ ID NO.4 1.0 μL

蓝莓cDNA（由步骤1.2合成的） 1.0 μL

LA Taq (5 U/μL) 0.25 μL

ddH₂O 17.25 μL

1.3.3 PCR扩增程序：94℃ 4 min；94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 3 min，30个循环；72℃ 15 min；4℃保温。

1.3.4 扩增得到该基因的ORF序列，回收扩增产物，并克隆到pMD19-T载体，筛选阳性克隆，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.5 得到包含整个编码框的VcLon2 cDNA序列，全长2667 bp，如图1所示。测序结果与预测的ORF进行比对，序列相似度为98%。

1.4 基因表达分析（qRT-PCR）

1.4.2 盐胁迫和干旱胁迫下RNA的提取

将2年生的蓝莓苗‘戴安娜’和‘泽西’从土中取出，洗去根上的泥土，预培养1周后，以浸在Hogland营养液中为对照组，将苗分别浸在含200 mM NaCl（盐胁迫）和2% PEG6000（干旱胁迫）的Hogland营养液中处理24 h，取叶片提取RNA，提取方法与实施例1中的1.1RNA的提取方法相同，在此不再赘述。

1.4.3 cDNA的合成

合成方法与实施例1中的1.2 cDNA的合成方法相同，在此不赘述。

1.4.4 PCR反应

以cDNA为模板，引物为

VcLON2-DL-F：5’-CCTTTCAAAGGTTGTATTTGTGGC-3’(SEQ ID NO.5)

VcLON2-DL-R：5’- AACTCGTGGAATGAGATGTCGC-3’ (SEQ ID NO.6)

qRT-PCR反应体系：

SEQ ID No.5（10 μM） 0.4 μL

SEQ ID No.6（10 μM） 0.4 μL

cDNA 模板 1.0 μL

SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli ENaseH Plus),ROX plus 10 μL

ddH₂O 8.2 μL

PCR程序

用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System进行 qRT-PCR，采用两步法PCR 扩增标准程序： 95℃ 30 s； 95℃ 5 s，58℃ 35 s，总共40个循环；95℃ 15sec , 58℃ 1 min, 95℃ 15 sec进行qRT-PCR检测，并使用2^-ΔΔCt法进行计算分析。

结果表明：参考图2在盐胁迫和干旱胁迫下蓝莓‘戴安娜’和‘泽西’的VcLON2表达量均上调10倍以上，这说明其可能有利于提高植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。

实施例2、植株超表达载体的构建

2.1 pSH737-CaMV35S-VcLON2植物超表达载体的构建

为构建超表达载体pSH737-CaMV35S-VcLON2，在VcLON2起始密码子和终止密码子两端加上限制性酶切位点BamHⅠ和KpnⅠ，设计了引物VcLON2-BamHⅠ-F：5’-CGCGGATCCATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’(SEQ ID NO.7)和VcLON2-KpnⅠ-R：5’-CGGGGTACCTCATAACTTTGAGTGTTGTCTCCAAGGG-3’(SEQ ID NO.8)，用蓝莓cDNA（由步骤1.2合成的）进行RT-PCR，回收该片段，克隆至pMD19-T载体中鉴定、测序（具体步骤参照1.3）。测序结果与实施例1的1.3中的克隆得到的VcLON2序列进行比对，证明所扩增的序列正确。PCR鉴定结果见图3-a，再用碱变性法提取该质粒。

植物超表达载体pSH737-CaMV35S，选用BamHⅠ和KpnⅠ分别对pSH737质粒和含有目的基因的T载体进行酶切，回收载体大片段和目的基因片段，用T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

2.1.1 pSH737质粒和含有目的基因的T载体的酶切

双酶切体系如下：

10×K buffer 2 μL

质粒 2 μg

BamHⅠ 2 μL

KpnⅠ 2 μL

dd H₂O Up to 40 μL

于37℃酶切40 min。双酶切后琼脂糖凝胶对双酶切产物进行电泳检测，结果见图3-b。回收pSH737载体大片段和目的基因片段。

2.1.2 基因与酶切得到的pSH737大片段的连接

连接反应体系：

pSH737双酶切产物 5.5 μL

VcLON2片段双酶切产物 3μL

10×Ligase buffer 1 μL

T4 DNA ligase 0.5 μL

16℃连接12 h。

2.1.3 转化大肠杆菌

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含Kan 100 mg/L 的LB固体培养基中37℃培养。

2.1.4 重组子的鉴定

1)PCR 鉴定

挑取单菌落接种于1.5 mL含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养，用VcLON2基因特异性引物VcLON2-BamHⅠ-F和VcLON2-KpnⅠ-R进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。具体步骤参照1.3 cDNA的克隆。

2)质粒的酶切鉴定

用碱变性法提取质粒，选取BamHⅠ和KpnⅠ酶进行酶切，酶切体系同上，琼脂糖凝胶电泳检测是否有预期片段。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

3.1 农杆菌GV3101感受态的制备

（1）挑取GV3101单菌落，接种于含有Rif（50 mg/L）的YEP液体培养基中，28℃，180rpm 震荡培养过夜至OD₆₀₀值为0.5；

（2）将菌液转入50 mL无菌离心管中，冰浴30 min；

（3）4℃，5000 rpm，离心5 min，去上清，加入10 mL 0.15 M预冷的NaCl溶液重悬；

（4）4℃，5000 rpm，离心5 min，去上清，加入2 mL 20 mM预冷的CaCl₂溶液重悬；

（5）分装成100μL-200μL 每管，液氮速冻，置于-80℃备用。

3.2 农杆菌GV3101的转化

（1）-80℃冰箱中取出感受态，冰上缓慢融化；

（2）分别取3 μg重组质粒至GV3101感受态中，轻轻吸打混匀，冰浴30min;

（3）然后用液氮冻2 min，再置于37℃ 5min；

（4）冰上静置 2min 后，加入800 μL YEP液体培养基，28℃震荡培养4 h ；

（5）5000 rpm，离心5 min，弃去800 μL上清，剩下的上清用来重悬菌块，用玻璃棒涂布固体YEP培养基平板（含Kan 100 mg/L，Rif 50mg/L），28℃，倒置培养48 h。

3.3 菌体PCR 鉴定

菌体PCR 方法及程序同步骤2.1.4重组子的鉴定。

实施例4、转化本氏烟及转基因功能验证

4.1转基因本氏烟的获得

4.1.1无菌播种本氏烟

在超净工作台取适量本氏烟种子置于1.5 mL离心管中，用75%酒精浸泡30 s，吸去酒精；用10% NaClO浸泡20 min，期间不停颠倒混匀，吸去NaClO；用无菌水洗涤3-4遍后，将3-4粒种子均匀置于组织培养瓶中的MS培养基中培养，生长条件为恒温25℃ 16 h光照和8h黑暗，相对湿度70%。

4.1.2获取菌液

取携带VcLON2基因超表达载体的农杆菌接种到50 mL YEP（Kan 100 mg/L, Rif50 mg/L）培养液中，28℃、200 rpm培养至OD₆₀₀值0.8，用于本氏烟的转化。

4.1.3预培养

将之前在组培瓶中培养的无菌本氏烟外植体叶片剪成小块叶盘（0.5cm×0.5cm），接种到用于本氏烟生长和愈伤组织培养的MS培养基（1 mg/L 6-BA）上预培养2-3 d。

4.1.4侵染共培养

将锥形瓶内的菌液倒入50ml离心管中，4℃，4000 rpm，离心15 min收集菌液。去上清液，尽快加入约100mL MS+AS（100 μM）液体培养基悬浮（25℃，50 rpm，40 min）农杆菌从而增加菌体的活性；将已预培养的本氏烟外植体加入到上述悬浮液中，期间不断摇动（25℃，50 rpm， 20 min），侵染本氏烟叶片。取出叶片，用无菌滤纸吸去菌液，将叶片移至MS+6-BA+AS固体培养基中，26℃暗培养2 d。

4.1.5继代培养

2 d后，将叶片转移到筛选培养基——MS固体培养基（6-BA 1mg/L，Kan 75 mg/L和Cef 0.5g/L，Timentin 100 mg/L）中，之后筛选培养基一周一换。

4.1.6生根培养

等抗性芽长到1 cm左右时，切下抗性小芽并切去芽基部的愈伤组织，转移至诱导生根培养基，即含有75 mg/L Kan，100 mg/L Timentin和0.5 g/mL Cef的1/2MS的生根培养基上进行生根培养。

4.1.7炼苗及种植

待抗性芽长有5-8条主根后，除去组培瓶上封口膜，在25℃下培养3 d，然后移栽到营养钵中，置于室温常规培养。

4.2 转基因阳性植株鉴定

4.2.1 用SDS法，提取本氏烟转化植株的基因组DNA。

4.2.2 PCR 鉴定阳性植株

PCR 扩增转基因植株的基因组DNA 为模板，引物用基因特异性引物，PCR 反应体系和反应条件同步骤1. 3 cDNA的克隆，结果见图4（图4中的M为Marker，-为野生型本氏烟植株，1~10为转基因本氏烟植株）。

4.3 本氏烟转化系的抗性鉴定

4.3.1 播种

选取T1代本氏烟转基因（P1、P2和P5）与野生型（WT）种子，消毒（具体步骤见4.1.1无菌播种本氏烟），再将消毒的野生型（作为对照）及T1代种子分别平铺到1/2MS 播种培养基上，暗培养2-3 d ；然后放置（25±2）℃，16 h光照和8h黑暗，相对湿度70%条件下培养。

4.3.2 幼苗耐逆性试验的鉴定

取长势基本一致的野生型（WT）和转基因阳性（P1、P2和P5）植株，分成三份，一份对照处理，一份进行盐胁迫，另一份进行干旱胁迫。对照处理：在MS 固体培养基上培养；盐胁迫：在200 mM NaCl 的MS 固体培养基上培养；干旱胁迫：在2% PEG6000的MS 固体培养基上培养。于（25±2）℃，16 h光照和8h黑暗，相对湿度70%，每个处理至少20 株苗，继续培养30天后，观察转基因和野生型本氏烟幼苗的生长情况。由图5（其中，WT为野生型本氏烟植株，P1、P2和P5分别为转基因本氏烟3个株系）可知，在适宜条件下（对照处理）下，野生型和转基因本氏烟长势一致，无明显差异；而在盐胁迫和干旱胁迫下转基因植株生长明显优于野生型。由图6（WT为野生型本氏烟植株，P1、P2和P5分别为转基因本氏烟3个株系）可知，在适宜条件下（对照处理）下，野生型和转基因本氏烟株高、根长、鲜重和干重无差异；而在盐胁迫下，转基因本氏烟在株高、根长、鲜重和干重均显著优于野生型；在干旱胁迫下，转基因本氏烟仅根长优于野生型。（图6中的a为株高，b为根长，c为鲜重，d为干重）上述结果均表明VcLON2可显著提高本氏烟对盐胁迫和干旱胁迫的耐受力。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江师范大学

<120> 蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2及其编码的蛋白及应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2667

<212> DNA

<213> 蓝莓

<400> 1

atggcggaat cggtcgagct cccgaatcga ctggcaattc ttcccttcag gaacaaggtt 60

ctgttgcctg gtgcaattat tcggattcga tgcacctcac ccagcagtgt gaaactggtg 120

gagcaagaat tatggcagag ggaggagaag gggttaattg ggattttgcc agttagggat 180

gccacagaga caacatcagt gggtcccacg ttatctccag gtgtagcgac tgattcgggg 240

gagggaagct caaaaattca tctgggtaca tcagattctc acaagttcga tgggaaaaat 300

cagcaggaat tcattcattg gcataccagg ggagttgcag ctcgtgcgtt acatttgtca 360

agaggagtgg agaaaccaag tggaagggtc acatacatag ttgtccttga aggtttgtgc 420

agattcagtg tacaagagct tagcacaaga gggacgtatt atactgcacg gattgcttct 480

gctgatatga cgaaagctga gatggagcaa gttgagcagg acccagattt catagtgttg 540

tcgcgccagt ttaaggctac tgcgatggag cttatctctc ttcttgagca gaaacaaaaa 600

actggtgcaa ggacaaaagt tctgttggag acggttccag tccacaaatt ggcagatata 660

tttgttgcca gctttgagat tagcttcgag gagcagctct ctatgttaga ttcggttgat 720

gtcaaagtta ggatatcaaa agctacggag ttagttgacc ggcatttgca gtcaattcgt 780

gtagccgaga agattacaca aaaggttgag gggcagttgt caaagaccca gaaggagttt 840

tttcttcgac agcagatgag agctatcaaa gaggagcttg gggacaatga tgatgatgag 900

gatgatgtgg ctgctctgga aagaaaaatg gaaggtgcag gaatgccccc agatatttgg 960

aagcatgcac agagagaact aaggagactt aaaaaaatgc aacctcagca accgggatat 1020

agtagttctc gtgtttacct ggaacttctt gccgatctac cttggcagaa ggctagtgaa 1080

gaacttgaat tggacttgag ggctgcaaga gagcgtcttg acagtgacca ctatggtttg 1140

gtgaaggtca aacaacggat cattgaatat ctagcagttc gaaagctcaa accagaggca 1200

agaggcccag tcttatgctt tgttggcccg cctggtgttg ggaaaacatc tttggcatca 1260

tctattgctg ctgctttggg cagaaagttt gtacgcatat cccttggtgg tgtcaaggat 1320

gaggctgata ttagagggca taggaggaca tatattggaa gcatgccggg gcgtctgatt 1380

gatggattga agagagcggc catttgcaac ccagttatgc tgctagatga gattgacaag 1440

actgggtctg atgttcgggg tgatccagct tcagctctac tagaggttct tgatcctgaa 1500

caaaacaaaa cattcaacga tcactatttg aatgttccgt ttgacctttc aaaggtagta 1560

tttgtggcaa ctgcaaacag ggtgcaacct attcctccag cattgctaga caggatggaa 1620

gtcattgaat tgcctggata tacccccgaa gaaaagctta gaatagcaat gcgacatctc 1680

attccacgag ttctagatca gcatggcttg aatgccgagt accttcaaat tcctgaggct 1740

atggtgaaac ttgtcattca gagatacacc agagaagctg gtgttaggaa tctggagagg 1800

aacttagctt ccttagctcg tgctgcagct gtgagagttg cagagcaaga acactctcta 1860

cctctgacca aagacgtgca ccatcttggt tcaccgcttc tggagagcag acttgctgat 1920

ggaggggagg tagaaatgga agtcattccg atgggtgtta gcaatcatga aatatcaact 1980

gcattcagag ttagctcacc ttttgtcgtg gatgaagcta tgctggaaaa aatattgggg 2040

cctccaagat atgatgacaa agaaactgcc gaacgtgtct caagtcctgg cgtatctgtt 2100

ggtttggttt ggactgcttt tggtggtgaa gttcagtttg tcgaggctac agccatggtg 2160

ggaaagggtg atcttcatct cactgggcag cttggtgatg ttattaaaga atcagctcag 2220

attgcattga cttgggtaag atcaagagca gcagaactta aattggcttc tactgagggg 2280

gttaatctgc tggagggacg tgacgttcat atacattttc ctgctggtgc tgtgcctaag 2340

gatggaccct cagcaggtgt gactctagtt acatcactgg tttcactgtt tagtcagaga 2400

agggtgagag ctgatacagc aatgactgga gagatgactc ttaggggtct agtcttacca 2460

gttggtggca ttaaggataa ggttttggcc gctcatcgat atggcatcaa gagagttatc 2520

cttccagaaa ggaacttgaa ggacttggtt gaagtaccat cagcagttct tggcaatttg 2580

gagatactac ttgctaagcg aatggaagac gtgctggaac acgcttttga agggggttgc 2640

ccttggagac aacactcaaa gttatga 2667

<210> 2

<211> 888

<212> PRT

<213> 蓝莓

<400> 2

Met Ala Glu Ser Val Glu Leu Pro Asn Arg Leu Ala Ile Leu Pro Phe

1 5 10 15

Arg Asn Lys Val Leu Leu Pro Gly Ala Ile Ile Arg Ile Arg Cys Thr

20 25 30

Ser Pro Ser Ser Val Lys Leu Val Glu Gln Glu Leu Trp Gln Arg Glu

35 40 45

Glu Lys Gly Leu Ile Gly Ile Leu Pro Val Arg Asp Ala Thr Glu Thr

50 55 60

Thr Ser Val Gly Pro Thr Leu Ser Pro Gly Val Ala Thr Asp Ser Gly

65 70 75 80

Glu Gly Ser Ser Lys Ile His Leu Gly Thr Ser Asp Ser His Lys Phe

85 90 95

Asp Gly Lys Asn Gln Gln Glu Phe Ile His Trp His Thr Arg Gly Val

100 105 110

Ala Ala Arg Ala Leu His Leu Ser Arg Gly Val Glu Lys Pro Ser Gly

115 120 125

Arg Val Thr Tyr Ile Val Val Leu Glu Gly Leu Cys Arg Phe Ser Val

130 135 140

Gln Glu Leu Ser Thr Arg Gly Thr Tyr Tyr Thr Ala Arg Ile Ala Ser

145 150 155 160

Ala Asp Met Thr Lys Ala Glu Met Glu Gln Val Glu Gln Asp Pro Asp

165 170 175

Phe Ile Val Leu Ser Arg Gln Phe Lys Ala Thr Ala Met Glu Leu Ile

180 185 190

Ser Leu Leu Glu Gln Lys Gln Lys Thr Gly Ala Arg Thr Lys Val Leu

195 200 205

Leu Glu Thr Val Pro Val His Lys Leu Ala Asp Ile Phe Val Ala Ser

210 215 220

Phe Glu Ile Ser Phe Glu Glu Gln Leu Ser Met Leu Asp Ser Val Asp

225 230 235 240

Val Lys Val Arg Ile Ser Lys Ala Thr Glu Leu Val Asp Arg His Leu

245 250 255

Gln Ser Ile Arg Val Ala Glu Lys Ile Thr Gln Lys Val Glu Gly Gln

260 265 270

Leu Ser Lys Thr Gln Lys Glu Phe Phe Leu Arg Gln Gln Met Arg Ala

275 280 285

Ile Lys Glu Glu Leu Gly Asp Asn Asp Asp Asp Glu Asp Asp Val Ala

290 295 300

Ala Leu Glu Arg Lys Met Glu Gly Ala Gly Met Pro Pro Asp Ile Trp

305 310 315 320

Lys His Ala Gln Arg Glu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Met Gln Pro Gln

325 330 335

Gln Pro Gly Tyr Ser Ser Ser Arg Val Tyr Leu Glu Leu Leu Ala Asp

340 345 350

Leu Pro Trp Gln Lys Ala Ser Glu Glu Leu Glu Leu Asp Leu Arg Ala

355 360 365

Ala Arg Glu Arg Leu Asp Ser Asp His Tyr Gly Leu Val Lys Val Lys

370 375 380

Gln Arg Ile Ile Glu Tyr Leu Ala Val Arg Lys Leu Lys Pro Glu Ala

385 390 395 400

Arg Gly Pro Val Leu Cys Phe Val Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Thr

405 410 415

Ser Leu Ala Ser Ser Ile Ala Ala Ala Leu Gly Arg Lys Phe Val Arg

420 425 430

Ile Ser Leu Gly Gly Val Lys Asp Glu Ala Asp Ile Arg Gly His Arg

435 440 445

Arg Thr Tyr Ile Gly Ser Met Pro Gly Arg Leu Ile Asp Gly Leu Lys

450 455 460

Arg Ala Ala Ile Cys Asn Pro Val Met Leu Leu Asp Glu Ile Asp Lys

465 470 475 480

Thr Gly Ser Asp Val Arg Gly Asp Pro Ala Ser Ala Leu Leu Glu Val

485 490 495

Leu Asp Pro Glu Gln Asn Lys Thr Phe Asn Asp His Tyr Leu Asn Val

500 505 510

Pro Phe Asp Leu Ser Lys Val Val Phe Val Ala Thr Ala Asn Arg Val

515 520 525

Gln Pro Ile Pro Pro Ala Leu Leu Asp Arg Met Glu Val Ile Glu Leu

530 535 540

Pro Gly Tyr Thr Pro Glu Glu Lys Leu Arg Ile Ala Met Arg His Leu

545 550 555 560

Ile Pro Arg Val Leu Asp Gln His Gly Leu Asn Ala Glu Tyr Leu Gln

565 570 575

Ile Pro Glu Ala Met Val Lys Leu Val Ile Gln Arg Tyr Thr Arg Glu

580 585 590

Ala Gly Val Arg Asn Leu Glu Arg Asn Leu Ala Ser Leu Ala Arg Ala

595 600 605

Ala Ala Val Arg Val Ala Glu Gln Glu His Ser Leu Pro Leu Thr Lys

610 615 620

Asp Val His His Leu Gly Ser Pro Leu Leu Glu Ser Arg Leu Ala Asp

625 630 635 640

Gly Gly Glu Val Glu Met Glu Val Ile Pro Met Gly Val Ser Asn His

645 650 655

Glu Ile Ser Thr Ala Phe Arg Val Ser Ser Pro Phe Val Val Asp Glu

660 665 670

Ala Met Leu Glu Lys Ile Leu Gly Pro Pro Arg Tyr Asp Asp Lys Glu

675 680 685

Thr Ala Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Val Ser Val Gly Leu Val Trp

690 695 700

Thr Ala Phe Gly Gly Glu Val Gln Phe Val Glu Ala Thr Ala Met Val

705 710 715 720

Gly Lys Gly Asp Leu His Leu Thr Gly Gln Leu Gly Asp Val Ile Lys

725 730 735

Glu Ser Ala Gln Ile Ala Leu Thr Trp Val Arg Ser Arg Ala Ala Glu

740 745 750

Leu Lys Leu Ala Ser Thr Glu Gly Val Asn Leu Leu Glu Gly Arg Asp

755 760 765

Val His Ile His Phe Pro Ala Gly Ala Val Pro Lys Asp Gly Pro Ser

770 775 780

Ala Gly Val Thr Leu Val Thr Ser Leu Val Ser Leu Phe Ser Gln Arg

785 790 795 800

Arg Val Arg Ala Asp Thr Ala Met Thr Gly Glu Met Thr Leu Arg Gly

805 810 815

Leu Val Leu Pro Val Gly Gly Ile Lys Asp Lys Val Leu Ala Ala His

820 825 830

Arg Tyr Gly Ile Lys Arg Val Ile Leu Pro Glu Arg Asn Leu Lys Asp

835 840 845

Leu Val Glu Val Pro Ser Ala Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Leu Leu

850 855 860

Ala Lys Arg Met Glu Asp Val Leu Glu His Ala Phe Glu Gly Gly Cys

865 870 875 880

Pro Trp Arg Gln His Ser Lys Leu

885

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcggaat cggtcgagct 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcataacttt gagtgttgtc tcc 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctttcaaag gttgtatttg tggc 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aactcgtgga atgagatgtc gc 22

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcggatcca tggcggaatc ggtcgagct 29

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggggtacct cataactttg agtgttgtct ccaaggg 37

Claims

1.一种蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2，其特征在于：所述VcLON2基因的cDNA 核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

2.根据权利要求1 所述的蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2的克隆方法，其特征在于，提取蓝莓RNA ，将其反转录为cDNA ，以cDNA 为模板，以下述序列为引物，通过RT-PCR 获得VcLON2基因序列，引物序列为：VcLON2-F：5’-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’；VcLON2-R：5’-TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’。

3.一种由权利要求1 所述的蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID No.2 所示。

4.一种权利要求1 所述的蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2在培育耐盐、抗旱植物中的应用，其特征在于，所述植物是烟草。

5.一种植物超表达载体，其特征在于，含有权利要求1 所述的蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2。

6.根据权利要求5 所述的植物超表达载体，其特征在于，所述植物超表达载体为pSH737-CaMV35S-VcLON2。

7.一种提高耐盐性和抗旱性的方法，其特征在于，权利要求6 所述的pSH737-CaMV35S-VcLON2 借助于基因工程手段介导烟草遗传转化，获得的转基因烟草。