CN104804092B - 一种抗b细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途，属于生物技术领域。一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。本发明的优点是：本发明筛选多个活性高且具有潜在中和能力的纳米抗体，最终得到了抗BAFF的纳米抗体52。该纳米抗体能特异性结合人BAFF抗原、调节与BAFF抗原与其配体相关的生物学活性，有效抑制BAFF抗原与其受体结合以及产生相应的信号级联效应。抗BAFF纳米抗体可以阻断BAFF与其三种相关受体的结合，显著抑制B细胞增殖或存活，该纳米抗体可用于检测和/或治疗多种与BAFF表达异常相关疾病。

Description

一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途，属于生物技术领域。

背景技术

淋巴瘤属原发于淋巴结或淋巴组织的恶性肿瘤，有淋巴细胞和(或)组织细胞的大量增生，占我国常见恶性肿瘤的第八位，且年轻化趋势明显，近年发病率由2-4/10万升至6.91/10万，并以每年5%的速度上升，每年新发患者约5万人，死亡人数超过2万。一般认为霍奇金淋巴瘤主要来源于B细胞，大多数的非霍奇金淋巴瘤也来源于B细胞，因此通过清除B细胞治疗淋巴瘤已成为一种新的治疗方案。

临床研究发现，淋巴瘤等恶性B细胞可以合成和分泌一种名为B淋巴细胞刺激因子(B cells-activating fact BAFF)的蛋白，属肿瘤坏死因子超家族成员，其可与表达在B细胞表面的受体结合，进而激活NF-kB途径，诱导抗细胞凋亡基因：Bcl-2、Bcl-xL的表达，减少成熟B细胞的凋亡。不同亚型B-细胞淋巴瘤患者血清可溶性BAFF含量较正常对照者是明显升高的，且BAFF血浆水平与基因变异及疾病的进展、严重程度及治疗敏感性呈正相关关系。

纳米抗体是由羊驼血液中发现的缺失轻链的重链抗体，经比利时科学家应用分子生物学技术结合纳米粒子科学的方法，而研发出来的最新及分子量最小的抗体分子。其具有结构简单，穿透力强，易于纯化和表达，亲和力及稳定性高，无毒副反应等一系列优点。

目前尚未有针对BAFF的纳米抗体的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抗BAFF的纳米抗体及其编码基因序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供抗BAFF的纳米抗体的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。该序列包括框架区和互补决定区；互补决定区为CDR1—CDR3；框架区为分别为FR1-FR4；互补决定区具有选自下组的氨基酸序列，具体为：

CDR1的氨基酸序列：NYHMG

CDR2的氨基酸序列：VAAINGRGSRTKYADSVKG

CDR3的氨基酸序列：AAGGPEFYRGRLEDYA

框架区的FR1-FR4的氨基酸序列，具体为：

FR1的氨基酸序列：QVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFK

FR2的氨基酸序列：WFRQAPGKEREF

FR3的氨基酸序列：RFTISRDNAERTVRLEMNSLKPEDTAVYYC

FR4的氨基酸序列：YWGPGTQVTVSS

所述抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体其氨基酸组成顺序：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。（序列表SEQ ID NO.1）命名为抗BAFF纳米抗体52。

所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体，其氨基酸序列与序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的同源性大于80%，优选大于90%，最优选大于95%。

一种多肽，选自上述纳米抗体，或称单域抗体片段，或称结构域抗体片段，或“dAb，VH，VHH”。

编码上述抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的基因序列。

所述基因序列为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

根据本发明的抗BAFF纳米抗体可变区中特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链基因的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗BAFF纳米抗体或相关蛋白或多肽产物。

包含所述基因序列的表达载体。载体可以为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或昆虫细胞表达载体。

包含所述表达载体的宿主细胞。所述的宿主细胞可以为原核表达细胞、真核表达细胞或昆虫细胞，所述原核表达细胞优选大肠杆菌。

通过所述宿主细胞制备抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的方法。

药用组合物，其包含一种或多种所述的抗BAFF纳米抗体分子作为活性成份，并包含可药用载剂。

所述药物载剂选自细胞毒素、放射性同位素、免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂或治疗性核酸的治疗剂。

所述药物组合物也可以采用包含包装的药物试剂盒的形式提供，所述包装包含在分开容器内的或在单一容器内的一种或多种拮抗剂。

所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体用于制备检测BAFF的试剂的用途。包括但不限于用于双抗体夹心酶标免疫检测BAFF ELISA试剂中的捕获抗原用纳米抗体包被ELISA板和检测抗原用的生物素标记纳米抗体。

所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体用于制备治疗BAFF表达异常相关疾病的药物的用途；所述BAFF表达异常相关疾病为B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、涉及B细胞的自身免疫病或炎性疾病。

本发明构建了BAFF胞外区多肽重组基因克隆的pET30a表达载体，获得带有His标签的BAFF胞外区（BAFFECD）高纯化蛋白，与能高亲和力结合带有His标签蛋白的Ni+磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以此形式的抗原免疫羊驼，构建特异性的纳米抗体基因库（纳米抗体噬菌体展示基因库），筛选免疫纳米抗体基因库，而获得了B细胞刺激因子的特异性的纳米抗体（或称单域抗体片段，single domain antibody fragment），将此基因与表达载体连接重组，构建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株anti-BAFF52。在实验室进行摇瓶小规模生产，经Ni+树脂凝胶亲和层析纯化，可得到SDS-PAGE电泳纯达95%，约100mg/L细菌培养物的纳米抗体。

本发明涉及了针对BAFF的不同形式纳米抗体（单体、双体或五聚体）、制备B细胞生长刺激因子（BAFF）的纳米抗体的所有技术（技术参考：Tanha J,Dubuc G,Selection byphage display of llama conventional V(H)fragments with heavy chain antibody V(H)H properties.J Immunol Methods.2002,263(1-2):97-109）（Gueorguieva D,LiS.Identification of single-domain,Bax-specific intrabodies that conferresistance to mammalian cells against oxidative-stress-inducedapoptosis.FASEB J.2006,20(14):2636-8）及基于B细胞去除（B cell depletion)的免疫疗法。所述抗体可以发挥拮抗剂的作用，并且可以用于体外(in vitro)，原位(in situ)或体内(in vivo)检测或治疗与BAFF的存在(或缺乏)相关的哺乳动物细胞或病理情况。

本发明提供了使用BAFF抗体阻断或中和BAFF与TACI/或BCMA之间相互作用的方法。所述拮抗剂还可以阻断或中和BAFF与TACI/或BCMA的相互作用。抗BAFF受体抗体可与细胞毒性剂或酶相连，或与放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物相连。

本发明的优点是：本发明筛选多个活性高且具有潜在中和能力的纳米抗体，最终得到了抗BAFF的纳米抗体52。该纳米抗体能特异性结合人BAFF抗原、调节与BAFF抗原与其配体相关的生物学活性，有效抑制BAFF抗原与其受体结合以及产生相应的信号级联效应。抗BAFF纳米抗体可以阻断BAFF与其三种相关受体的结合，显著抑制B细胞增殖或存活，该纳米抗体可用于检测和/或治疗多种与BAFF表达异常相关疾病。

以下结合附图和具体实施方式详细说明本发明，并不以此限定本发明的实施范围。

附图说明

图1：BAFF胞外段蛋白表达和纯化后的电泳结果

图2：Protein G亲和层析法纯化重链抗体

图3：羊驼免疫血清效价

图4：第一轮次PCR普通重链抗体及单链抗体基因

图5：第二轮次VHH抗体目的片段

图6：sfiI/Pst酶切PHEN6载体

图7：sfiI/Pst酶切目的片段

图8：菌落PCR验证抗体插入率

图9：抗BAFF纳米抗体蛋白纯化结果

图10：FPLC方法纯化抗BAFF纳米抗体

图11：纳米抗体与BAFF抗原结合动力曲线

图12：纳米抗体对受体BCMA的竞争抑制作用

图13：纳米抗体对受体TACI的竞争抑制作用

图14：抗BAFF52纳米抗体对在体外对Raji细胞的增殖抑制作用

具体实施方式

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其它的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：BAFF胞外段蛋白的表达

1.sBAFF基因的钓取：抽取正常人静脉血，按照常规方法提取外周血单个核细胞(PBMC)。RNA的抽提按照Invitorgen公司的说明书进行。取3ug RNA逆转录制备cDNA模版，以其作为模板，扩增BAFF基因。

引物序列为：

5’CGGGAATTCCTGGTGCCACGCGGTGCCGTCAGGGTCCAGAAG3’（SEQ ID No.3）

5’CCCAAGCTTTCACAGCAGTTTCAATGC3’（SEQ ID No.4）

PCR反应条件：

2.表达载体的构建：PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离、回收，用EcoRI（BioLab公司）、HindIII（BioLab公司）消化后，与同样酶处理的载体pET-30a（Sigma）按3:1的末端比例进行黏性末端连接。连接产物按CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌JM109（Sigma），利用卡那霉素抗性筛选重组克隆。提取阳性克隆的质粒DNA，进行EcoR I、HindIII双酶切和琼脂凝胶电泳分析，并进行菌落PCR。将初步鉴定正确的阳性重组子，送交上海博亚生物技术有限公司、上海申能博彩生物技术有限公司进行DNA序列分析，并将测序结果与数据库中已知基因的序列进行比对。

3.目的基因的表达：以含有测序正确的BAFF基因的表达载体，按CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌BL21（Sigma）；同时，以不含BAFF基因的空载体质粒转化感受态大肠杆菌BL21作为阴性对照。挑取单个菌落，接种于含卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至对数期后，加入或不加入IPTG继续培养，诱导目的基因的表达。取少量诱导、未诱导细菌的培养液，离心、沉淀。去上清后，将菌体加入到SDS加样缓冲液中煮沸，分析目的蛋白的表达。

4.目的蛋白的大量表达与纯化：挑选单个菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，于LB培养至对数期后，加入IPTG于30℃继续培养过夜。将菌体培养液于4℃以12000r/min离心15min。收集细菌用细菌裂解液悬浮后，以超声波破碎菌体。离心后，分别收集细菌上清液和包涵体沉淀。以镍螯合琼脂糖凝胶（北京本元正阳基因技术股份有限公司）为柱填充介质，对细菌上清的提取液进行亲和层析。目的蛋白的洗脱采用升高咪唑的浓度完成。收集不同浓度的咪唑洗脱峰样品，用SDS-PAGE分析目的蛋白。）（图1）

BAFF胞外段蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.5所示：

AVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFVPWLLSFKRGSALEEKENKILVKETGYFFIYGQVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGDELSLVTLFRCIQNMPETLPNNSCYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKLL（SEQ ID No.5）

实施例2：抗BAFF特异性纳米抗体库的构建

1.免疫羊驼，酶免方法分析纳米抗体产生情况。

羊驼颈背部皮下多点注射抗原总计1.5mg，并加入福氏佐剂，分4次免疫，跟踪观察注射包块吸收情况，以确认免疫正确。第一次免疫一个月后测定血清抗体效价（图2）；其后免疫，每次免疫间隔时间减半，并测定效价。用Protein G柱，亲和层析方法分离第四次免疫后一周的血清，ELISA法检测重链抗体产生情况及抗体效价，在第四次免疫后，羊驼免疫血清效价可达到1：10000。（图3）。

2.分离羊驼外周血淋巴细胞

分离羊驼外周血淋巴细胞，用RNA抽提试剂盒（QIAGEN），从得到的淋巴细胞中提取总RNA。

3.巢式PCR方法获得骆驼重链抗体可变区-VHH。

为提高扩增特异性，逆转录引物采用重链抗体的特异引物，合成cDNA第一链，以此模板，分别用两套引物进行PCR扩增重链抗体VHH基因片段。采用巢式PCR方法，第一次PCR扩增中大于800bp的为普通重链基因片段，在800～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段（图4），切胶回收缺失轻链重链抗体基因片段，以此为模板用VHH特异性引物经PCR扩增得到VHH目的基因（500bp）（图5）。

多样性引物的合成：

Heavy Chain Fd5’primers:

YTCh-1:CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA（序列表SEQ ID NO.6）

YTCh-2:GGG GTA CCT GTC ATC CAC GGA CCA GCT GA（序列表SEQ ID NO.7）

Heavy Chain Fd3’primers:

YT1BN:GCC CAG CCG GCC ATG GCC SMK GTR CAG CTG GTG GAK TCTGGG GGA G（序列表SEQ ID NO.8）

YT2BN:GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA AAG CTG GAG GAG TCTGGG GGA G（序列表SEQ ID NO.9）

4.VHH片段和噬菌体展示载体的连接及电转化TG1感受态。

（1）SfI单酶切VHH片段：

混匀，暂短离心，.置50℃PCR仪中酶切过夜，纯化酶切后的PCR产物。

（2）SfI单酶切载体质粒：

混匀，暂短离心，置50℃PCR仪中酶切过夜，凝胶回收试剂盒（QIA）纯化。

（3）pstI单酶切载体质粒：

混匀，暂短离心置37℃水浴酶切1h用PCR产物纯化试剂盒（QIA）纯化酶切后的质粒载体，1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒。

（4）连接体系：

混匀后暂短离心，置16℃PCR仪连接28h。

将VHH片段及pHEN6载体(Conrath,KEM other.Antimicrob Agents Chemother(Antimicrobial Chemotherapy)2001,45:(10)2807-12.，中国专利ZL20111028003.1)分别经SfiI/PstI酶切并连接（图6-7），电转化至TG1感受态细胞中，涂布平板，经菌落PCR验证抗体插入率。重组基因克隆效率检测：取电转化菌液涂布LB/Amp平板上，32℃，过夜培养，次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率，噬菌体抗体库的连接效率在90%以上。（图8）

5.VHH抗体基因库的库容及多样性的鉴定和保存

根据转化后测定的滴度乘以转化的总量计算库存量。另外，随机选出电转后筛选平板生长的20～50个阳性克隆，测序，如果没有重复序列发生，可以判断其多样性良好。将剩余菌液加入适量2YT/Amp培养基2小时培养后，加甘油分装，于-80℃冻存，从而得到BAFF免疫的VHH型抗体基因库。

6.VHH噬菌体抗体库的制备和初级功能鉴定

抗体库加入辅助噬菌体M13K07（Invitrogen）进行拯救：将1μl M13K07加入至含有6ml2YT、0.4ml20%glucose+4μl Amp(100mg/ml)培养基的被感染细胞中，37℃静置15min后，将此6ml培养基加入至含有92ml2YT,92μlAMP的培养基中，静置15min，37℃250rmp，1h后，加100μl Kan(50mg/mL)37℃过夜。拯救后上清取100μl用于抗体库的初级功能鉴定，剩余部分用PEG8000沉淀噬菌体，4℃条件下，离心收集沉淀，保存并测定噬菌体抗体库滴度。

实施例3：抗BAFF纳米抗体的获得

1.抗BAFF特异性纳米抗体的筛选

用生物素化BAFF抗原，以链霉素亲和素磁珠方法从噬菌体库筛选抗体出抗BAFF的纳米抗体。将生物素标记的BAFF抗原与噬菌体抗体库按比例混合，4℃反应过夜。将抗原-噬菌体抗体复合物加入含有链霉亲和素磁珠的EP管中，翻滚转动0.5h，使磁珠与生物素标记的抗原-噬菌体抗体复合物充分结合。PBST(0.05%T20)、PBS各漂洗10次后，用TEA洗脱噬菌体，室温静置10min。1M Tris-HCl中合TEA，冰上保存。将噬菌体感染半对数期生长TG1，取适量菌液稀释后涂布AMP/LB平板，32℃培养，测定洗脱液滴度，其余菌液扩大培养后以M13K07超感染并振荡培养过夜，第2天收集上清，用PEG纯化，浓缩后即为用于下一轮筛选的次级噬菌体抗体库。经3轮筛选，测定每轮筛选后所获得的特异性噬菌体抗体的滴度，并计算每轮筛选噬菌体投入\产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标。

表l：亲和筛选对噬菌体抗体的富集效应

2.噬菌体ELISA方法挑选阳性克隆

从第3轮筛选生长菌落的琼脂平板上随机挑取单个菌落，接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔培养板中培养，用辅助噬菌体超感染诱导表达噬菌体抗体。收获表达上清，以BAFF为抗原进行ELISA测定，挑选出BAFF阳性孔，经DNA测序以鉴定抗BAFF纳米抗体克隆的基因序列。得到包括序列表SEQ ID NO.2基因序列在内的一系列纳米抗体基因序列，用于进一步表达和筛选特异性、高活性的纳米抗体。

实施例4：特异性纳米抗体表达质粒的构建

PCR扩增实施例3所获得的特异性的纳米抗体基因，而获得带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点PCR产物，用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和载体(pSJF2载体)(kim Is.Biosic Biochem.2002,66(5):1148-51，中国专利ZL201110280031），经T4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒BAFF52pSJF2，并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。

1.获得VHH目的基因的PCR扩增条件，50μl PCR体系的组成：

PCR反应条件：

正义链引物—TATGAAGACACCAGGCCCAGGTRMAGCTGGWGGAGTCT；（序列表SEQ IDNO.10）

反义链引物——GAAGATCTCCGGATCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT。（序列表SEQ IDNO.11）

2.目的基因的酶切：

3.载体质粒的酶切：

混匀，暂短离心，置37℃水浴中酶切1h，用胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段及质粒载体。

4.连接目的基因与载体

在1.5ml Eppendorf管中依次加入下列组分：

混匀后暂短离心，16℃中连接18h，得到特异性纳米抗体表达质粒BAFF52-pSJF2的质粒。

实施例5：抗BAFF纳米抗体的表达和纯化

1.纳米抗体蛋白在大肠杆菌中表达、纯化：

（1）将实施例4所述的含有质粒BAFF52-pSJF2的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37℃过夜。

（2）挑选单个菌落接种于20ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜。

（3）转种于1L含氨基苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养，240转/分，培养到OD值达0.6～1.0时，加入0.1～0.5M IPTG，继续培养过夜。

（4）离心，收菌。

（5）加融菌酶裂解细菌，离心，收上清中可溶性纳米抗体蛋白。

（6）经Ni+离子亲和层析高压液相获得纯度达95%以上的蛋白。

表达的抗BAFF纳米抗体蛋白，经Ni+树脂凝胶亲和层析纯化，1-4号为250mM咪唑洗脱出抗BAFF纳米抗体，M为标准分子量蛋白marker，纯化蛋白SDS-PAGE结果所示，纯化蛋白纯度可达95%以上。（图9）

2.快速蛋白液相色谱：

（1）抗原及缓冲液准备准备：用0.22μm微孔滤膜过滤蛋白溶液及PB缓冲液。

层析柱准备：用PB缓冲液(PH7.2)平衡Superdex75TM层析柱，流速为0.5ml/min。

（2）样品纯化：用注射器将1ml纳米抗体样品注入样品环中，流速为0.5ml/min，以紫外检测器自动测定洗脱液的A280nm值，收集所需纯化的纳米抗体。

经分子筛葡聚糖凝胶（superG75）过滤高压液相分析实验所显示，抗BAFF纳米抗体的洗脱峰出现的时间经与标准分子量蛋白Marker相比较，其峰值的分子量应为15kd。（图10）

测序得到抗BAFF纳米抗体52的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。

实验例6：生物膜层干涉技术对抗BAFF纳米抗体亲和力测定实验

1.生物素化抗原准备：先将溶解在PBS中的BAFF抗原（实施例1方法制备）与生物素按1:3的摩尔比混合均匀，室温静置0.5h，然后通过10KD超滤管超滤除去游离的生物素分子，得到生物素化的BAFF抗原，并测定生物素化抗原的浓度。

2.抗体准备：Broford法测定抗体浓度，用PBST(0.005%T20)稀释抗BAFF纳米抗体为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM5个不同浓度，设20μM抗CD20抗体(R&D)为无关对照。

3.包被抗原：将生物素化的抗原用PBST(0.005%T20)缓冲液稀释至20μg/ml，然后在OctetQk系统上（Fortebio,pull公司），将6根SA传感器置于抗体溶液中反应，使抗原偶联在SA传感器上。

4.抗原与抗体结合动力学分析：在OctetQk系统上，将包被了抗原的传感器分别置于5个不同浓度的BAFF纳米抗体及对照抗体溶液中，作用300s，使抗体与传感器上的抗原结合，然后将传感器置于PBST溶液中，使结合在芯片表面的抗体解离，解离时间1500s。这一过程中机器会自动记录抗原与抗体结合、解离的实时信息。

5.亲和常数计算：所得数据用分析软件进行1：1Langmuir结合模型拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。结合常数：kon(1/Ms):5.71E+03，解离常数：kdis(1/s)1.82E-02；亲和力：KD(M)3.18E-06。

生物膜层干涉技术方法对纳米抗体的亲和力测定及动力学分析，分别用不同浓度（20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM）的纳米抗体与BAFF抗原结合，通过结合常数及解离常数，计算抗体的亲和力为3.18E-06。（图11）

实施例7：抗BAFF纳米抗体52与受体BCMA/TACI的ELISA竞争抑制实验

1.0.05M NaHCO₃（pH9.5）稀释BAFF抗原（实施例1制备）至10μg/ml，100μl抗原包被2块96孔板，4℃过夜。

2.300μl0.5%BSA-PBS封闭96孔板，37℃2h。

3.先在第1块96孔板的板孔中加入浓度为50μg/ml的BCMA（B细胞成熟抗原，Sigma）50μl，再将抗BAFF纳米抗体以一定浓度比例稀释，按50μl/孔加入，37℃，1h。

阴性对照Anti-CD20（R&D公司）

表2：纳米抗体对受体BCMA的竞争抑制作用

4.依照第3步加样办法，在第2块96孔板的板孔中加入浓度为10μg/ml的TACI（跨膜激活物与亲环素相互作用物，Sigma）50μl，再将抗BAFF纳米抗体以一定浓度比例稀释，按50μl/孔加入，37℃，1h。

表3：纳米抗体对受体TACI的竞争抑制作用

5.将HRP-GAH-Ig-抗体（辣根过氧化物酶标记的山羊抗人二抗，Abbkine公司）按1:5000倍稀释，每孔加入100μl，37℃1h后，用0.05%PBST洗板三次。

6.加TMB100μl，避光室温静置20min。

7.1mol/LHCl100μl终止反应。

8.用酶标仪测定450nm波长下的样品OD值。

图12和图13显示，在纳米抗体及BAFF抗原的受体TACI、BCMA与BAFF抗原结合的竞争ELISA实验中，发现纳米抗体对TACI有一定的抑制作用，（抑制率为29%）且作用特异（无关对照抗CD20纳米抗体结果呈阴性）。

实施例8：抗BAFF纳米抗体对BAFF刺激Raji细胞增殖的抑制作用

1.细胞培养：Raji细胞（人B淋巴细胞瘤，购于ATCC）于10%FBS的1640培养基（Gibico公司）于37℃、5%CO2条件下常规培养。

2.细胞计数：计数培养细胞，将细胞配制成10⁶/ml的细胞悬液后，以每孔100μl加入至96孔细胞培养板中，每孔约10⁵个细胞。

3.BAFF刺激Raji细胞增殖：将BAFF抗原（实施例1制备）按终浓度0ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1μg/ml，对照组为100μl无血清改良型RPMI-1640培养基，每组设3个重复孔，分别培养24h、48h、72h后，加入10μl的CCK-8（Doj indoLaboratories），于37℃、5%CO2条件下继续常规培养5h。在450nm波长下，检测各孔的吸光度值，观察BAFF刺激Raji细胞增殖作用。

表4：BAFF刺激Raji细胞增殖

4.纳米抗体对细胞的增值抑制：在BAFF抗原刺激Raji细胞增殖第24h及48h后，加入抗BAFF纳米抗体52使其终浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml，每组3个复孔，再分别继续培养细胞48h、24h，使BAFF抗原刺激Raji细胞增殖达72h。

图14显示，750ng/ml的BAFF抗原对刺激Raji细胞72h，细胞可见明显见增殖。在BAFF抗原刺激48h后加入纳米抗体，对细胞增殖的抑制作用更加明显。

Claims (9)

1.一种抗B细胞生长刺激因子(B cells-activating factor,BAFF)的纳米抗体，其特征在于：其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的基因序列。

3.根据权利要求2所述的编码抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的基因序列，其特征在于：所述基因序列为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.包含权利要求2或3所述基因序列的表达载体和/或宿主细胞。

5.包含权利要求2或3所述基因序列的宿主细胞。

6.权利要求5的宿主细胞用于制备权利要求1所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的用途。

7.药用组合物，其特征在于：其包含权利要求1所述的抗BAFF纳米抗体分子作为活性成份，并包含药物载剂；所述药物载剂选自细胞毒素、放射性同位素、免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、治疗性核酸或化学治疗剂。

8.权利要求1所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体用于制备检测BAFF的试剂的用途。

9.权利要求1所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体用于制备治疗BAFF表达异常相关疾病的药物的用途；所述BAFF表达异常相关疾病为B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、涉及B细胞的自身免疫病或炎性疾病。