CN102746402A

CN102746402A - 全人源抗人催乳素受体单链抗体及其应用

Info

Publication number: CN102746402A
Application number: CN201210236119XA
Authority: CN
Inventors: 魏钦俊; 曹新; 屈芫; 何伟; 姚俊; 鲁雅洁
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2012-07-09
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明公开了一种全人源抗人催乳素受体单链抗体，它的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明还公开了上述全人源抗人催乳素受体单链抗体在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。本发明获得了一株具有高特异性和高亲和力的全人源抗人催乳素受体单链抗体HscFv918，初步研究证实该单链抗体对高表达人催乳素受体的乳腺癌细胞系具有一定的生长抑制作用，提示人催乳素受体可作为乳腺癌的生物免疫治疗的潜在靶向分子，从而为进一步研制抗乳腺癌药物提供应用基础。

Description

全人源抗人催乳素受体单链抗体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术和生物制品领域，具体涉及一种特异性全人源抗人催乳素受体单链抗体及其应用。

背景技术

乳腺癌是严重威胁女性健康的重要疾病。全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。在我国，乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤死亡率的首位。据近期的调查报告显示，乳腺癌已是上升幅度最快的恶性肿瘤之一，在过去30年中，上升比例高达96%，仅次于肺癌。迄今，乳腺癌的病因学尚不十分清楚，遗传、免疫、激素与各种环境因素相互作用，可能共同参与乳腺细胞癌变演进过程。近年来，随着对肿瘤信号转导途径研究的不断深入，分子靶向生物治疗已成为肿瘤治疗的一种新模式。筛选新型抗肿瘤靶标和设计组合靶标并探索其治疗作用及分子机制已成为现今乳腺癌生物治疗的重要研究方向。

催乳素（prolactin,PRL）和催乳素受体（prolactin receptor,PRLR）是乳腺细胞中一类与细胞生长、分化密切相关的信号分子。PRL不仅通过内分泌机制影响乳腺细胞生长、发育和分化，还可以作为乳腺所产生、释放的细胞因子，以旁分泌和自分泌方式调节乳腺细胞的反应。PRL作用的信号转导机制是通过细胞膜上的PRLR来完成，PRL和PRLR结合，使JAK2磷酸化而激活，诱导受体细胞内远侧酪氨酸磷酸化，并激活STAT蛋白，激活后的STAT转移入细胞核内，激活靶基因的转录，产生其生物学效应。另外，PRL信号也通过PRLR活化PI3K和MAPK信号通路，增加细胞周期素D1的表达，并促进乳腺癌细胞生长。研究表明，在乳腺癌组织中PRL表达水平明显高于正常乳腺组织和增生性上皮组织，与正常邻近肿瘤组织相比，70-95%原发性乳腺癌组织中PRLR表达水平也显著升高。在乳腺癌啮齿类动物模型中，PRL过表达与PRLR的激活、扩增增加了乳腺肿瘤发生率和生长率。PRL也能够与其它激素，如雌激素、生长激素等协同作用，促进乳腺癌细胞的增殖。使用PRLR拮抗剂，可竞争性地抑制内源性PRL与PRLR结合，从而干扰了PRLR的信号转导，抑制了乳腺癌细胞的增殖，促进细胞分化、凋亡和抗血管新生的作用。前期研究也表明，靶向PRLR的siRNA能够特异地抑制PRLR的表达进而影响PRL/PRLR结合引起的下游信号通路，部分抑制了乳腺癌细胞的增殖。以上研究结果，提示PRLR是乳腺癌生物治疗中的一个值得关注的候选抗肿瘤靶标。有效拮抗PRLR与PRL的结合或利用高表达的PRLR信号转导途径，为乳腺癌的生物免疫治疗提供了一种新的策略。

噬菌体抗体库技术是一种将抗体基因表达产物和亲和选择相结合的技术，以改建过的噬菌体为载体，利用DNA重组技术将待选抗体基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，外源DNA片段的表达产物与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白，展示在噬菌体表面，并保持一定的空间构象，再利用抗原抗体分子间的亲和力进行筛选，表达特异性的噬菌体抗体，同时测定外源DNA的序列即可得知其表达产物的氨基酸序列。由于噬菌体表达的scFv抗体分子量较小，仅为完整抗体分子的六分之一，且具有较好的血管或组织屏障穿透性、能够迅速到达靶抗原部位、半衰期短、分子结构稳定、不形成寡聚体、易从血液循环系统中清除，不含Fc段，减少了与体内Fc受体结合而带来的不利影响等优势，同时人源噬菌体抗体完全避免了HAMA（Human Anti-Mouse Antibody）反应，在一定程度上可消除单抗的免疫原性，使其在临床上可反复地应用，从而达到治疗效果而不至于引起人对其产生免疫反应，已广泛地应用于分子生物学及免疫学、药理学等医学领域，是目前研究的热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是在于为人乳腺癌的生物免疫治疗提出新的方向，提供一种以人催乳素受体（PRLR）为靶标的抗乳腺癌全人源化单链抗体（Single chainfragment variable,scFv）HscFv 918。

本发明还要解决的技术问题是提供编码上述特异性抗人PRLR单链抗体HscFv 918的基因。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述特异性抗人PRLR单链抗体HscFv918在制备治疗人乳腺癌生物免疫制剂中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种全人源抗人催乳素受体单链抗体，它是一株特异性的能够与人催乳素受体结合的单链抗体，它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述全人源抗人催乳素受体单链抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。

优选的是上述抗体的编码基因如SEQ ID No.1所示。

包含上述抗体的编码基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

由上述重组表达载体转化的重组微生物也属于本发明的保护范围。

上述全人源抗人催乳素受体单链抗体在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。发明的全人源抗人催乳素受体单链抗体采用如下思路获得：本发明利用噬菌体展示技术，直接从正常人外周血淋巴细胞出发，构建了库容为6.0×10⁸的天然全人源噬菌体单链抗体库，用BSA-PRLR表位多肽融合蛋白对上述文库进行多轮筛选，获得了1株特异性能够与乳腺癌细胞表面PRLR结合的抗人催乳素受体单链抗体，命名为HscFv918，抗体编码基因与噬菌粒载体pComb3XSS连接后构建的重组表达载体pCom-HscFv918，转化E.coli TOP10F’后，利用IPTG诱导后，可在大肠杆菌中进行可溶性表达，表达产物可利用Ni柱纯化回收目的蛋白。纯化的HscFv918抗体蛋白进一步采用ELISA法和细胞免疫荧光法检测其与PRLR抗原蛋白及PRLR高表达的人乳腺癌细胞系T-47D的结合能力，从而鉴定该单链抗体的特异性，结果显示HscFv918与抗原蛋白和T-47D细胞膜上的PRLR具有较强的亲和力。HscFv918抗体蛋白处理T-47D细胞后，能明显抑制T-47D细胞的生长。结果提示通过抑制PRLR蛋白功能，阻断PRL/PRLR信号通路，可为乳腺癌特别是PRLR高表达的乳腺癌的生物免疫治疗提供新的策略。本发明为以人PRLR为靶标的乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础，对于进一步研制抗乳腺癌药物提供了可能性。

具体的步骤如下：

1、天然全人源噬菌体单链抗体库的构建。

(1)淋巴细胞的分离纯化：从50例身体健康正常女性（年龄20~50岁）的外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA，通过RT-PCR逆转录合成cDNA。

(2)PCR扩增V_H、V_κ、V_λ基因：以cDNA为模板，用一组人源特异性抗体引物，包括12对V_H,16对V_κ和9对V_λ基因引物，分别扩增人免疫球蛋白V_H、V_κ、V_λ基因。

(3)scFv基因的扩增：等摩尔比混合VHB和VBkB，VH和VλB，利用overlap-PCR扩增scFv基因片段。

(4)噬菌体单链抗体库的建立：将上述制备的scFv纯化产物及载体质粒pComb3XSS同时用SfiI进行酶切，酶切产物纯化后进行连接，连接产物电转化感受态E.coliXL1-Blue，构建了库容为6×10⁸的全人源抗乳腺癌scFv噬菌体抗体库。

2、利用所构建的噬菌体单链抗体库富集筛选出全人源抗PRLR单链抗体。

(1)BSA-PRLR表位多肽融合蛋白的制备：应用生物信息学软件对人催乳素受体蛋白的抗原表位进行了预测，设计合成了BSA-PRLR表位多肽融合蛋白，由南京川博生物技术公司合成。

(2)抗PRLR单链抗体的富集筛选：纯化的BSA-PRLR表位多肽包被ELISA板，将噬菌体抗体库进行一次原库扩增后得到的新鲜噬菌体抗体加入包被过抗原的ELISA板中，进行三轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选，将最后一轮筛选得到的洗脱液感染E.coliXL1-Blue感受态细菌后铺于LB培养板上，随机挑取单克隆菌落分别接种加入LB培养其的96孔板中，每孔再加终浓度为1×10⁹pfu/ml辅助噬菌体VCSM13超感染，次日将96孔板，离心后取上清进行Phage-ELISA鉴定。

重组的BSA-PRLR表位多肽包被ELISA板，加入上述离心后的噬菌体上清，加入含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液稀释的HRP-Anti-M13抗体，孵育后加入TMB显色液，用2M硫酸终止显色反应，使用酶标仪测OD₄₅₀值。

3、抗PRLR scFv抗体基因的鉴定。

(1)噬菌粒的提取：选取ELISA鉴定阳性克隆的单菌落接种于LB液体培养基，扩大培养后收集菌体沉淀，使用质粒抽提试剂盒回收质粒DNA。

(2)PCR扩增抗人乳腺癌scFv基因片段：用载体pComb3XSS特异性引物Ompseq：AAGACAGCTATCGCGATT和Gback：GCCCCCTTATTAGCGTTT扩增scFv基因片段。PCR扩增产物大小约750bp。

(3)DNA序列分析鉴定单链抗体：上述PCR产物鉴定正确的菌株送公司测序，并对其进一步分析氨基酸序列和CDR区。

4、HscFv918的可溶性表达、纯化和功能学研究。

(1)HscFv918的可溶性表达：将噬菌体克隆质粒转化入E.coli TOP10F’感受态细胞，铺制Amp平板，挑取单克隆转接新鲜的SB培养基，加入IPTG诱导表达后，收集菌体。

(2)HscFv918的纯化：收集诱导表达后的菌体，超声裂解后加1%Triton-100乳化后，离心收集上清，上His Trap柱，洗脱的目的蛋白用含有尿素的透析液进行透析复性，透析完成后超滤管浓缩蛋白。

(3)纯化的HscFv918单链抗体蛋白的鉴定：纯化的HscFv918蛋白经用HRP标记的抗His抗体进行Western blot分析后发现，在26-34kD大小有一条目的条带，确定抗体有可溶性表达。

(4)ELISA鉴定HscFv918单链抗体的活性：BSA-PRLR表位多肽包被96孔板，将倍比稀释的纯化scFv抗体分别加于酶标板中，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBS以1:2000稀释的HRP标记的抗His抗体，孵育后加入TMB显色底物进行显色，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪读取OD₄₅₀吸光值。

(5)细胞免疫荧光法检测纯化的HscFv918抗体蛋白的特异性：将PRLR高表达的T47D细胞及阴性对照MDA-MB-231细胞分别接种于24孔板，贴壁后加入-20℃甲醇固定，3％BSA溶液封闭，加入纯化的HscFv918，孵育后用PBS洗涤细胞，加入1:32稀释的FITC-anti-Human IgG，置于荧光显微镜下观察HscFv918与T-47D细胞和MDA-MB-231细胞的结合能力。

(6)MTT法检测HscFv918对T-47D细胞增殖的影响：T-47D细胞及阴性对照MDA-MB-231细胞培养于96孔板，以50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml三种浓度的HscFv918处理细胞，同时设对照组，分别于6h、24h、48h、72h通过MTT法检测细胞生长状况。

本发明采用一种噬菌体载体pcomb3XSS，常用于噬菌体抗体库的构建。pcomb3XSS可以插入编码人免疫球蛋白G（IgG）的V_H、V_κ、V_λ基因。在载体设计时，pComb3XSS除在羧基端引入c-myc，His，HA标签等外，在抗体基因和外壳蛋白基因PⅢ之间插入一个琥珀终止密码子(Amber)TAG，当此密码子受到抑制时抗体就展示在噬菌体表面，而密码子不受抑制时抗体就分泌表达。因此，当重组噬菌体生长在抑制型E.coli XL1-Blue时，抗体基因就与PⅢ融合表达于噬菌体表面，用于筛选含有高亲和力的噬菌体抗体。当重组噬菌体生长在非抑制型E.coli Top10F’时，抗体基因就分泌表达于大肠杆菌的周质腔中，用于制备可溶性高亲和力抗体。

本发明所用的宿主细胞不受特别的限制，可选自大肠杆菌、酵母或真核细胞，优选E.coli XL1-Blue为感受态细胞。抗体表达则选用E.coli Top10F’。

有益效果：

本发明与现有技术相比，具有以下优势：本发明以DNA重组技术从临床确诊为乳腺癌患者的外周血中扩增出人免疫球蛋白G（IgG）V_H、V_κ、V_λ基因片段，插入噬菌体载体pComb3XSS相应位置，构建出天然全人源噬菌体单链抗体库。利用该库筛选获得的PRLR为靶向分子的抗乳腺癌全人源的单链抗体，经鉴定证实其与PRLR有特异性结合能力，且对PRLR高表达的乳腺癌细胞株有明显的生长抑制作用，从而为乳腺癌的生物免疫治疗提供了一种新的抗体药物的候选靶标分子。

附图说明

图1：12种重链可变区基因的PCR扩增结果。其中，M为DNA Marker；1~12分别为不同V_H基因的PCR扩增产物。

图2：16种轻链κ可变区基因的PCR扩增结果。其中，M为DNA Marker；1~16分别为不同V_κ基因的PCR扩增产物。

图3：9种轻链λ可变区基因的PCR扩增结果。其中，M为DNA Marker；1~9分别为不同V_λ基因的PCR扩增产物。

图4：scFv抗体基因的PCR扩增结果。其中，M为DNA Marker；1~8分别为不同scFv抗体基因的PCR扩增产物。

图5：pComb3XSS噬菌体载体结构图。

图6：HscFv918表达特异单链抗体蛋白Western blot鉴定结果。其中1、3为诱表达前蛋白纯化产物；2、4为诱导表达后蛋白纯化产物。

图7：免疫荧光结合实验验证HscFv 918与人PRLR蛋白的特异性结合结果。其中A、B为T-47D细胞；C、D为MDA-MB-231细胞。

图8A：MTT法分析HscFv918对人乳腺癌T-47D细胞的生长的影响。

图8B：MTT法分析HscFv918对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响。

图9：HscFv918抗体CDR区分析。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的技术路线及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：人外周血淋巴细胞分离及总RNA提取。

分批采集50份年龄分布为20~50岁、身体健康正常女性的抗凝外周血各2ml，分别以淋巴细胞分离液分离获得外周血淋巴细胞后混合，以灭菌PBS洗涤后重悬细胞，总RNA提纯试剂盒提取外周血淋巴细胞总RNA。

实施例2：人免疫球蛋白G（IgG）V_H、V_κ、V_λ基因的PCR扩增。

先将淋巴细胞总RNA逆转录为cDNA，用一组人源特异性抗体引物，包括：

V_H5’Sense Primers

HSCVH1-F

5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG3’

HSCVH2-F

5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG3’

HSCVH35-F

5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTGCAGCTGGTGSAGTCTGG3’

HSCVH3a-F

5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTGG3’

HSCVH4-F

5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG3’

HSCVH4a-F

5’GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG3’

V_H3’Reverse Primers

HSCG1234-B

5’CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACCGATGGGCCCTTGGTGGARGC3’

HSCM-B

5’CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTAAGGGTTGGGGCGGATGCACTCCC3’

Vκ5’Sense Primers

HSCK1-F

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC3’

HSCK24-F

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGATGACYCAGTCTCC3’

HSCK3-F

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGWTGACRCAGTCTCC3’

HSCK5-F

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC3’

Vκ3’Reverse Primers

HSCJK14_o-B

5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATYTCCACCTTGGTCCC3’

HSCJK2_o-B

5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3’

HSCJK3_o-B

5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATATCCACTTTGGTCCC3’

HSCJK5_o-B

5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC3’

V_λ5’Sense Primes

HSCLam1a

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTGGTGBTGACGCAGCCGCCCTC3’

HSCLam1b

5’GGGCCCAGCCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCCTC3’

HSCLam2

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGT3’

HSCLam3

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTC3’

HSCLam4

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAATCGCCCTC3’

HSCLam6

5’GGGCCCAGGCGCCCGAGCTCATGCTGACTCAGCCCCACTC3’

HSCLam78

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGGTGACYCAGGAGCCMTC3’

HSCLam9

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCTTC3’

HSCLam10

5’GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGGGCAGACTCAGCAGCTCTC3’

V_λ3’Reverse Primers

HSCJLam1236

5’GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCTAGGACGGTCASCTTGGTSCC3’

注：R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or T H=Aor C or T B=C or G or TV=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T.

V_H引物组合如下：

HSCVH1-F HSCVH2-F HSCVH35-F HSCVH3a-F

HSCG1234-B HSCG1234-B HSCG1234-B HSCG1234-B

HSCVH4-F HSCVH4a-F HSCVH1-F HSCVH2-F

HSCG1234-B HSCG1234-B HSCM-B HSCM-B

HSCVH35-F HSCVH3a-F HSCVH4-F HSCVH4a-F

HSCM-B HSCM-B HSCM-B HSCM-B

V_κ引物组合如下：

HSCK1-F HSCK24-F HSCK3-F HSCK5-F

HSCJK14₀-B HSCJK14₀-B HSCJK14₀-B HSCJK14₀-B

HSCK1-F HSCK24-F HSCK3-F HSCK5-F

HSCJK2₀-B HSCJK2₀-B HSCJK2₀-B HSCJK2₀-B

HSCK1-F HSCK24-F HSCK3-F HSCK5-F

HSCJK3₀-B HSCJK3₀-B HSCJK3₀-B HSCJK3₀-B

HSCK1-F HSCK24-F HSCK3-F HSCK5-F

HSCJK5₀-B HSCJK5₀-B HSCJK5₀-B HSCJK5₀-B

V_λ引物组合如下：

HSCLam1a HSCLam1b HSCLam2 HSCLam3

HSCJLam1236 HSCJLam1236 HSCJLam1236 HSCJLam1236

HSCLam4 HSCLam6 HSCLam78 HSCLam9

HSCJLam1236 HSCJLam1236 HSCJLam1236 HSCJLam1236

HSCLam10

HSCJLam1236

以制备的cDNA为模板，利用上述的12对V_H,16对V_κ和9对V_λ基因引物，分别扩增V_H、V_κ、V_λ基因片段，每个扩增体系均包含以下内容：

反应条件如下：

94°C5min；94°C15sec，50°C30sec，72°C1min，30个循环；72°C10min。

将所有的V_H、V_k和V_λ分别混合，1%琼脂糖凝胶电泳观察所扩增片段的大小。12对V_H基因的扩增结果如图1所示，各组引物均有350bp左右的目的条带出现；16对轻链κ可变区基因扩增结果如图2所示，各组引物均有350bp左右的目的条带出现；9对轻链λ可变区基因扩增结果如图3所示，各组引物均有350bp左右的目的条带出现。

实施例3：天然全人源噬菌体单链抗体库的构建。

等摩尔比混合VHB和VBkB，VH和VλB，利用overlap-PCR扩增scFv基因，反应体系如下：

反应条件如下：

94°C5min；94°C15sec，56°C30sec，72°C1min，25个循环；72°C10min。

结果扩增出具有良好多样性的scFv基因片段（图4），长度为750bp左右，与预期大小相符。

将上述制备的scFv纯化产物及噬菌粒载体质粒pComb3XSS用SfiI酶切，在高浓度连接酶作用下PCR产物的酶切片段与噬菌体载体pCom3XSS连接，电转入感受态细胞E.coli XL1-Blue后，将转化菌均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，收集所有克隆的质粒DNA，即构建得库容为6.0×10⁸的人乳腺癌IgG噬菌体单链抗体库。实施例4：人源抗PRLR特异性噬菌体单链抗体的筛选、鉴定。

应用生物信息学软件对人PRLR蛋白的抗原表位进行了预测，设计合成了BSA-PRLR表位多肽融合蛋白（由南京川博生物技术公司合成）。纯化的BSA-PRLR表位多肽包被ELISA板，将噬菌体抗体库进行一次原库扩增后得到的新鲜噬菌体抗体加入包被过抗原的ELISA板中，经过三轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选，噬菌体抗体收获率提高了17倍（表1）。

表1噬菌体单链抗体库的富集筛选

注：收获率(%)=产出量(pfu)×100/投入量(pfu)

将最后一轮筛选得到的洗脱液感染E.coli XL1-Blue感受态细菌后铺于LB培养板上，随机挑取50个克隆菌落分别接种到含LB培养基的96孔板中，每孔再加终浓度为1×10⁹ pfu/ml辅助噬菌体VCSM13超感染，次日将96孔板，离心后取上清进行Phage-ELISA鉴定。用重组的BSA-PRLR表位多肽包被ELISA板，加入上述离心后的噬菌体上清，加入含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液稀释的HRP-Anti-M13抗体，孵育后加入TMB显色液，用2M硫酸终止显色反应，使用酶标仪测OD₄₅₀值。Phage-ELISA鉴定结果显示，其中得到七株（CX8、CX10、CX19、CX30、CX33、CX65、CX89）抗PRLR的单链抗体。将将其中三株CX8、CX19、CX30进行测序，鉴定为同一个克隆，命名为HscFv918。其编码基因的核苷酸序列，抗体蛋白的氨基酸序列和CDR区分析结果见SEQID No.2、SEQ ID No.3。

实施例5：HscFv918抗体的表达、纯化及鉴定。

（1）HscFv918的可溶性表达：将噬菌体克隆质粒转化入E.coli TOP10F’感受态细胞，铺Amp平板，挑取单克隆转接新鲜的SB培养基，加入IPTG诱导表达后，收集菌体。

（2）HscFv918的纯化：收集诱导表达后的菌体，超声裂解后加1%Triton-100乳化后，离心收集上清，上His Trap柱，洗脱的目的蛋白用含有尿素的透析液进行透析复性，透析完成后超滤管浓缩蛋白。

（3）纯化的HscFv918单链抗体蛋白的鉴定：纯化的HscFv918蛋白经用HRP标记的抗His抗体进行Western blot分析后发现，在26-34kD大小有一条目的条带（图6），确定抗体有可溶性表达。

（4）ELISA鉴定变性复性后HscFv918单链抗体的活性：BSA-PRLR表位多肽包被96孔板，将倍比稀释的纯化HscFv918抗体分别加于酶标板中，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBS以1:2000稀释的HRP标记的抗His抗体，孵育后加入TMB显色底物进行显色，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪读取OD₄₅₀吸光值。结果最高浓度scFv抗体的OD₄₅₀值均在1.0以上，且随着稀释梯度的增加呈线性下降趋势，说明复性后的蛋白具有生物学活性（表2）。

表2ELISA鉴定HscFv918活性

实施例6：免疫荧光法检测HscFv918抗体蛋白的特异性结合能力。

将T-47D细胞及MDA-MB-231细胞接种于24孔板，标记实验组和阴性对照组。待细胞贴壁，细胞密度约为80％后，弃去培养液，PBS洗涤，加入-20℃甲醇，置于4℃封闭10min。弃去固定液，自然风干5min，加入1ml3％BSA溶液，细胞板置于湿盒，于37℃封闭1h。弃去实验组孔内的BSA溶液，加入1ml3％BSA稀释的G2总蛋白；细胞板置于湿盒，于4℃孵育过夜。PBS洗涤细胞板3次，加入1：32稀释的FITC-anti-Human IgG。细胞板置于湿盒，于37℃孵育1-2h。PBS洗涤细胞板3次，置于荧光显微镜下观察结果显示HscFv918能与高表达PRLR的T-47D细胞结合，结合部位位于细胞膜上，对于无PRLR表达的MDA-MB-231细胞并无亲和力，证明了该单链抗体对于PRLR胞外区有特异性的识别结合能力（图7）。

实施例7：MTT法检测HscFv918对乳腺癌细胞系增殖的影响。

取对数生长期的T-47D细胞和MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为1×10⁵/ml，接种于96孔板，每组设6个复孔。以纯化的HscFv918蛋白，分别以作用浓度0μg/ml（阴性对照组）、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，处理细胞，处理6h、24h、48h、72h后分别取一块细胞板，每孔加入20μl MTT溶液，置于37℃染色4h，弃去全部培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使晶体充分溶解，酶标仪490nm读取吸光值。分析结果显示，随着HscFv918浓度的升高和作用时间的增长，T-47D细胞增殖速度减慢，剂量与效应、时间与效应成正相关关系。而在MDA-MB-231细胞中，随着剂量升高，细胞增殖并未受到影响。结果说明HscFv918可能通过与T-47D表面的PRLR结合，抑制了PRLR蛋白，从而阻断其下游的信号通路，从而对T-47D细胞的增殖产生显著的抑制作用（图8A和图8B）。

Claims

1.一种全人源抗人催乳素受体单链抗体，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述全人源抗人催乳素受体单链抗体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述的编码基因如SEQ ID No.1所示。

4.包含权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。

5.由权利要求4所述重组表达载体转化的重组微生物。

6.权利要求1所述的全人源抗人催乳素受体单链抗体在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。