CN104774838A

CN104774838A - 一种牛cmya1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法

Info

Publication number: CN104774838A
Application number: CN201510162705.8A
Authority: CN
Inventors: 郭宏; 丁向彬; 刘新峰; 李新; 刘仲伟
Original assignee: Tianjin Agricultural University
Current assignee: Tianjin Agricultural University
Priority date: 2015-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2015-07-15

Abstract

本发明公开了一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子及其制备方法，本发明首先克隆牛CMYA1基因启动子全长片段1155bp，并构建pEGFP-1-CMYA1启动子载体，转染小鼠C2C12成肌细胞、牛骨骼肌卫星细胞及牛成纤维细胞，证实该载体的肌肉特异性表达；然后对CMYA1启动子进行缺失研究，共设计CMYA1启动子缺失片段8条，分别构建载体pGL3-basic-CMYA1启动子缺失片段载体，然后转染C2C12细胞，通过验证，最终获得CMYA1核心启动子，基因序列为SQ2。本发明CMYA1启动子在肌肉细胞中特异性表达，且启动活性很高，人们可以利用这一特性对肌肉的发育，分化进行研究。

Description

一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，特别是一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法。

背景技术

1，CMYA1基因研究进展，不同物种CMYAl(Cardiomyopathy associated protein 1，原发性心肌症相关蛋白1)都含有5个高度保守的结构域，分别为富含脯氨酸的区域、16个氨基酸的重复序列(又叫Xin重复序列)、DNA结合结构域、SH3结构基序和核定位信号。牛CMYA1基因(CMYA1Gene ID:509670)位于Chromosome 22：12549676～12558895bp，有两个外显子一个内含子，编码1820个氨基酸，编码区全长6272bp，推导出来的蛋白质等电点(Isoelectricpoint):6.4162，分子量(Molecular weight):194814.91g/mol。

CMYA1基因最早通过mRNA差异显示技术在鸡胚的房室沟中发现，又命名为XIRPl或Xin基因。CMYA1蛋白定位于闰盘的粘附接头和骨骼肌的肌腱结合点，在哺乳动物中CMYA1基因存在两个外显子，第二个外显子包含整个编码蛋白区域(Julia Otten et al.,2010)。鸡(cXin)和小鼠(mXin)的氨基酸序列有46％的同源性，经过预测骨骼肌特异性CMYA1基因含有脯氨酸丰富区、16氨基酸重复单元、核酸定位信号和SH3结合基序。表达谱分析显示CMYA1基因于横纹肌表达。而后通过构建小鼠mXinβ打靶载体成功的获得了纯合的mXinβ缺失小鼠模型，发现完全缺失mXinβ基因的小鼠心肌层无序、心脏形态异常、室中隔缺失、心脏舒张功能紊乱、严重的生长迟缓和出生后死亡。mXinβ在调节N-钙粘蛋白(N-cadherin)控制出生后的心脏生长和动物存活中起着必要的功能，进一步证实CMYA1基因在心脏形成发育中的重要作用。Xin mRNA在肌损伤后12小时的肌肉组织中表达高升，免疫组化分析证明Xin基因在肌卫星细胞中表达。肌生成的转录分化因子MyoD、肌生因子Myf-5和肌生增强因子MEF2有能力激活Xin。很多研究表明，CMYA1基因特异性表达于肌肉组织中，因而CMYA1启动子很有可能是肌肉特异性表达的，未发现有人对牛CMYA1基因的启动子进行研究，本发明将为后续CMYA1肌肉特异性启动子的利用奠定基础。

2，肌肉特异性表达启动子，启动子是位于基因5’端上游转录起始位点附近的一段DNA序列，根据基因表达属性的不同，可将启动子分为组成型启动子和特异型启动子，前者在所有组织中均能启动基因表达，后者仅在一定发育时期的特定组织中启动基因表达。在最近几年，人们分离了许多肌肉特异性启动子，如肌肉肌酸激酶(MCK)、骨骼肌α-actin、肌球蛋白重链(MyHC)、生肌调控因子家族(MyoD、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子，进而对这些启动子对肌肉细胞的增殖、分化作用机理以及转录活性进行深入研究。启动子的上游区域转录调控元件的种类、数量、排列顺序对组织特异性基因的转录活性具有十分重要的作用。肌肉特异性启动子中含有多种上游转录调控元件,主要有:M-CAT元件、MEF-1元件、MEF-2元件、Trex/MEF-3元件、CACCC盒、SRE元件、MPEX元件、Pax3/7元件。

国内也有一些研究者分离克隆了一些基因的启动子，如小鼠MCK启动子的克隆与验证，克隆得到小鼠MCK启动子1355bp，并未做缺失筛选核心启动子片段，也有研究者克隆得到山羊MyoG基因启动子1200bp，也未进行启动子缺失研究，获得核心启动子片段。虽然一些肌肉特异性启动子已经获得，但其活性与效率差异不一，片段长短也不一样。很多研究表明，启动子的核心调控元件分布在启动子的3’端非翻译区，本发明以此为根据，固定3’端，在启动子5’端作缺失验证，以求最终获得较短的CMYA1肌肉特异性核心启动子序列，方便该肌肉特异性启动子的利用。

本发明对CMYA1基因及其启动子区域进行了综合分析，考虑启动子在基因组中的位置特点，发现在CMYA1基因第一外显子第一个碱基上游1135bp及下游20bp区域,不含保守序列“TATA”框和“CAAT”盒，含有保守序列“GC”盒，含有肌肉特异性表达转录调控元件SRE元件，MEF-1元件(E-box)，MEF-2元件，TreX元件和Pax3/7元件。SRE元件的核心序列为5’-CC[A/T]GG-3’，即血清应答元件，已知α-actin、肌球蛋白轻链(MyLC)、肌营养障碍基因(dystrophin)和早期生长应答因子-1(early growth response-1,Egr-1)的启动子中均存在SRE元件。MEF-1元件(E-box)的核心序列为5’-CANNTG-3’，其主要存在于生肌调控家族因子MyoD、Myf5、Myogenin和MRF4基因中，它们在骨骼肌生长和发育过程中起着至关重要的作用。MEF-2元件,其核心序列为5’-[C/T]TAAAAAT-AAC[C/T]-3’，该元件存在于肌球蛋白轻链2A基因的启动子增强子区域。富含A/T基序的MEF-2顺式作用元件可与MEF2因子结合，MEF2因子是MADS-box超家族蛋白一员，是哺乳动物生肌调控基因MyoD的重要下游调控因子。TreX结合序列为5’-[G/C/T][A/G/C]NGAT[A/G]G[G/C/T][G/C/T]-3’，TreX元件被证明在骨骼肌和心肌中对MCK基因启动子的表达至关重要。Pax3/7元件，其核心序列为5’-GTAAC-3’，与反式作用因子Pax3和Pax7复合物结合。Pax3/7元件主要存在于生肌调控因子MRF基因的启动子上游调控区域，起始MRF基因的表达，在胚胎的骨骼肌发育中起关键性作用。因此，本发明获得的CMYA1启动子，其特征如下：全长片段1155bp，位于CMYA1基因第一外显子第一个碱基上游1135bp及下游20bp,不含保守序列“TATA”框和“CAAT”盒，含有保守序列“GC”盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子，该核心启动子的基因序列为SQ2。

一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子的制备方法，包括步骤如下：

(1)牛CMYA1肌肉特异性启动子的克隆，

在NCBI上比对牛CMYA1全基因序列在染色体的位置，并找到第一外显子，根据启动子在基因序列的位置特点，克隆第一外显子第一个碱基上游1135bp及下游20bp序列，得到总共1155bp的启动子基因序列SQ1；

(2)构建pEGFP-1-CMYA1启动子载体并验证上述启动子只在肌肉细胞中特异性表达，

①设计用于扩增该片段的PCR上下游引物，上游引物5’端添加酶切位点XhoI(CTCGAG)，保护碱基为CCG，下游引物5’端添加酶切位点HindIII，(AAGCTT)，保护碱基为CCC，PCR扩增出该片段；

②然后构建pEGFP-1-CMYA1启动子载体，分别转染C2C12细胞、牛骨骼肌卫星细胞和牛成纤维细胞，验证出该启动子只在肌肉细胞中特异性表达；

(3)筛选核心启动子，

①先进行启动子缺失片段设计，共设计缺失引物8对，上游引物5’端添加酶切位点XhoI，下游引物5’端添加酶切位点HindIII，扩增出相应的启动子缺失片段，并分别命名为P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7和P8，分别构建载体pGL3-Basic-CMYA1启动子缺失片段载体，与pRL-TK载体分别共转染C2C12细胞，pGL3-Basic为阴性对照，pGL3-Control为阳性对照；

②转染24小时后，裂解C2C12细胞，用PROMEGA公司生产的双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒检测CMYA1启动子活性，筛选出CMYA1核心启动子，该核心启动子序列长度477bp，基因序列为SQ2；

③使用C2C12细胞和牛骨骼肌卫星细胞转染实验，证明该核心启动子依然保留着其在肌肉细胞中特异性表达的性质；

而且，所述步骤(3)筛选核心启动子的第①步中的8对缺失引物如下面的表1所示，

表1.CMYA1启动子缺失片段引物设计

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明CMYA1启动子在肌肉细胞中特异性表达，且启动活性很高，人们可以利用这一特性对肌肉的发育分化进行研究，而且可以使某些基因在肌肉组织中特异表达某一种蛋白质或者激素等，有利于疾病的预防、诊断、治疗和家畜肉质性状的改善。

2.很多特异性启动子只在终末分化的肌细胞中启动表达，本发明启动子没有发现类似的情况。

3.本发明获得的肌肉特异性启动子核心片段只有477bp，比很多其它肌肉特异性启动子片段要短，可应用性更强，且富含肌肉特异性启动子转录调控元件。

附图说明

图1为pEGFP-1载体示意图；

图2、3及4分别为pEGFP-1-CMYA1启动子(1155bp)重组载体分别转染C2C12细胞、牛骨骼肌卫星细胞及牛成纤维细胞图；

图5为启动子缺失片段图；

图6为pGL3-basic载体示意图；

图7和8分别为构建启动子缺失片段载体菌液PCR及酶切鉴定图；

图9为pRL-TK载体示意图；

图10为双荧光素酶报告基因检测结果图；

图11、12及13为pEGFP-CMYA1核心启动子(477bp)重组载体分别转染C2C12细胞、牛骨骼肌卫星细胞及牛成纤维细胞图；

图14为牛肌肉特异性表达载体pCMYA1-DGAT1的结构示意图；

图15为定量PCR检测DGAT1的表达量示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子的制备方法包括步骤如下：

1、牛CMYA1肌肉特异性启动子的克隆及验证

具体步骤操作如下：

(1)牛CMYA1肌肉特异性启动子的克隆

在NCBI上比对牛CMYA1全基因序列(CMYA1 Gene ID:509670)在染色体的位置，并找到第一外显子，根据启动子在基因序列的位置特点，经分析结合肌肉特异性启动子包含的调控元件特点，克隆第一外显子上游1135bp及下游20bp序列，总共1155bp启动子序列，具体引物设计如下：

设计CMYA1启动子上游引物F-CCGCTCGAGGGCCAAT GCTGCCTGCCTGA(下划线处为XhoI酶切位点)、下游引物R-CCC AAGCTTGCTGCCCTAGCTCGGGGTCT(下划线处为HindIII酶切位点)，以西门塔尔杂交牛基因组DNA为模板。

PCR反应体系：采用20μL反应体系，0.1μL Taq DNA Polymerase(5U/μL)，2μL 10×TaqPCR buffer，0.4μL dNTPs，1μL模板，上游引物0.8μL(10μM)，下游引物0.8μL(10μM)，14.9μL灭菌超纯水。

PCR反应条件为，95℃预变性3min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸50s,30个循环，最后72℃5min。

取5μL扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法回收1155bp CMYA1启动子基因片段。按照T-载体PCR产物克隆试剂盒的方法连入pUCm-T载体，得到载体pUCm-T-CMYA1启动子，转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定，成功克隆得到CMYA1启动子1155bp，得到基因序列为SQ1。

SQ1:

ggccaatgctgcctgcctgacgctgactcaatggaaaagagtgagcagtgcctggcatcacttcctggcaccagagggcacccaggatgtcagaagaaagaccctgttctgccagctagcggaacacaacttcgacatggaacctgggcaaaatgcctcagtcatttgtgctctgcatggtctcctgatgcccctcgccacactgcccttcccagcctaaatgccaggatctctggagcctactaaggcccttgggctctgggcagccaaggaggggcagccgtgacctccacacacaaacatacacacatactccttctgtgacgggaagctgatgactccgggtcagaaataacccccgagtcagctccccgcgtgctgcccctcccctctcctccgttcccagaaagcctgggccctgagtcagaggcgagagcctgacagtaaacaagacccagataatctgctgtgaacaccgcagaccatgctggggaatcctctgacaatcccggacccggtgaagaaccggggcctggaatatgtcttcccccaaacccagctgtgtgcactcagggctgtatatacctgtgcggtgggatgcggggagggatggaagagacaggggaaaggtctagcgcaggagtggggagaagaagggccttactctcaggggtatccgggctgggaaatgaggagcaagggcctaggcctgccctcagggggcctccagtctcctggcaggatgggcacacgccacacgtcagacatagtcagaggctggggtagagacgtgggggctcacaggatggggggccaagttgaccaggtgtcagatgctcctccttattcattccctcagaatagtctgggatgtccgcaccccacaccacagctgagtcactgaccccaatcctcagaggagacttggatgaatgaagctctcccccactcactcctcttcccctccctagcagaaaggacatgtaactgatgcccgagatggagagtaacttccagagccctaaaaataactgaaccacttcatactctgaccttagcctcccccactgcccccacctcggcccaccccctaaccagccagataaaggcagctgctgaggctggcaggggacacagaccccgagctagggcagc

(2)构建pEGFP-1-CMYA1启动子载体

XhoI和HindIII双酶切载体pUCm-T-CMYA1启动子：

酶切体系：采用50μL反应体系，超纯水21μL，10×Fast Digest Buffer 5μL,pUCm-T-CMYA1启动子20μL，Fast Digest XhoI 2μL，Fast Digest HindIII 2μL。

反应条件为，37℃酶切1h，80℃酶失活10min。胶回收酶切产物。

XhoI和HindIII双酶切载体pEGFP-1，如图1所示，

酶切体系：采用50μL反应体系，超纯水21μL，10×Fast Digest Buffer 5μL，pEGFP-1 20μL，Fast Digest XhoI 2μL，Fast Digest HindIII 2μL。

反应条件：37℃酶切1h，80℃酶失活10min。胶回收酶切产物。

连接体系：连接采用20μL反应体系，pUCm-T-CMYA1启动子回收产物2μL，pEGFP-1回收产物4μL，T₄DNA Ligase 0.5μL，T₄DNA Ligase Buffer 2μL，超纯水11.5μL。反应条件为22℃连接4h。转化大肠杆菌DH5α，酶切鉴定，测序鉴定，得到载体pEGFP-1-CMYA1启动子。

(3)CMYA1启动子活性及特异性验证

细胞培养：本次培养的细胞为小鼠C2C12细胞、牛骨骼肌卫星细胞以及牛成纤维细胞，细胞培养基配置：79％DMEM高糖+20％胎牛血清+1％青链霉素。

细胞消化：用PBS清洗细胞1-2次，加入3mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分钟，收集细胞消化液，1000rpm离心5min。

细胞转染：在转染前一天把C2C12细胞、牛骨骼肌卫星细胞及牛成纤维细胞培养到35mm培养皿内，使第二天细胞密度能达到细胞培养皿约70-80％。在进行下述转染步骤前，把35mm内换成新鲜的细胞培养液。培养液的体积约为1.75mL。

把lipofectamine2000试剂轻轻混匀，在一洁净无菌离心管内依次加入3.5μLlipofectamine2000，适量不含抗生素和glutamine的DMEM溶液及1.75μg质粒pEGFP-1-CMYA1启动子，使最终体积为100μL，用枪轻轻吹打混匀。

25℃孵育15分钟。把100μL lipofectamine 2000-质粒pEGFP-1-CMYA1混合物全部加入培养皿内。6小时后吸除含有lipofectamine2000-质粒pEGFP-1-CMYA1的培养液。加入2ml新鲜细胞培养液继续培养。

转染24小时后，在荧光显微镜下观察小鼠C2C12细胞，如图2所示，牛骨骼肌卫星细胞，如图3所示，以及牛成纤维细胞，如图4所示，绿色荧光蛋白表达情况，发现C1C12细胞和牛骨骼肌卫星细胞有绿色荧光蛋白表达，牛成纤维细胞没有绿色荧光蛋白表达，证明CMYA1启动子是肌肉特异性表达的。

2，牛CMYA1肌肉特异性表达启动子核心启动子筛选

(1)克隆CMYA1启动子缺失基因片段

首先根据CMYA1启动子全长序列为模板，设计缺失引物8对，如表1和图5所示，上下游引物5’端分别添加酶切位点XhoI和HindIII。利用8对引物分别得到相应的8个启动子缺失片段，并分别命名为P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7和P8。

表1.CMYA1启动子缺失片段引物设计

PCR反应体系：均采用20μL反应体系，0.1μL Taq DNA Polymerase(5U/μL)，2μL10×Taq PCR buffer，0.4μL dNTPs，1μL模板，上游引物0.8μL(10μM)，下游引物0.8μL(10μM)，14.9μL灭菌超纯水。

PCR反应条件为，95℃预变性3min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s,30个循环，最后72℃5min。

均取5μL扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的方法回收8段CMYA1启动子基因片段。按照T-载体PCR产物克隆试剂盒的方法分别连入pUCm-T载体，得到pUCm-T-CMYA1启动子缺失片段载体，转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定。

(2)构建pGL3-basic-CMYA1启动子缺失片段载体

将8条缺失的启动子片段P1-P8分别连接到pGL3-basic载体上，载体如图6所示，其具体的实施方案如下：

XhoI和HindIII双酶切载体pUCm-T-CMYA1启动子缺失片段：

酶切体系：采用50μL反应体系，超纯水21μL，10×Fast Digest Buffer 5μL,pUCm-T-CMYA1启动子缺失片段载体20μL,Fast Digest XhoI 2μL，Fast Digest HindIII 2μL。

反应条件：37℃酶切1h，80℃酶失活10min。胶回收酶切产物。

XhoI和HindIII双酶切载体pGL3-basic：

酶切体系：采用50μL反应体系，超纯水21μL，10×Fast Digest Buffer 5μL，pGL3-basic20μL，Fast Digest XhoI 2μL，Fast Digest HindIII 2μL。

反应条件：37℃酶切1h，80℃酶失活10min。胶回收酶切产物。

连接体系：连接采用20μL反应体系，pUCm-T-CMYA1启动子缺失片段回收产物2μL，pGL3-basic回收产物4μL，T₄DNA Ligase 0.5μL，T₄DNA Ligase Buffer 2μL，超纯水11.5μL。反应条件为22℃连接4h。转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR及酶切鉴定，如图7、图8所示，测序鉴定，得到pGL3-basic-CMYA1启动子缺失片段载体8个。

(3)牛CMYA1启动子缺失片段的活性验证

本次验证采用PROMEGA公司生产的双荧光素酶报告基因系统验证启动子缺失片段活性，具体操作如下：

细胞培养：本次培养的细胞为小鼠C2C12细胞，细胞培养基：79％DMEM高糖+20％胎牛血清+1％青链霉素。

细胞消化：待C2C12细胞密度能达到35mm细胞培养皿约70-80％，用PBS清洗细胞1-2次，加入3mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分钟，收集细胞消化液，1000rpm离心5min。

细胞转染：本次采用电转染的方式进行细胞转染，电转染采用BTX生产的ECM 2001多功能电融合仪，具体电转参数：电压：240V，电击时间：4ms，具体操作：用电转染缓冲液悬浮细胞，质粒pGL3-basic-CMYA1启动子缺失片段质粒与pRL-TK质粒，如图9所示，共20ug加于细胞悬液中，pGL3-basic-CMYA1启动子缺失片段质粒与pRL-TK质粒浓度比为30:1，置于冰上预冷10min,将细胞悬液转移至电击杯中，执行电击，待电击结束后，于冰上继续预冷10min，用2ml细胞完全培养基中和，于35mm培养皿培养。

双荧光素酶报告基因检测：细胞转染24h后，裂解C2C12细胞，将细胞裂解液用于PROMEGA公司生产的双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，最终，通过由CMYA1启动子激活启动表达的萤火虫荧光素酶经过催化产生的荧光值与阳性对照海肾荧光素酶催化产生的荧光值校对之后，得出牛CMYA1肌肉特异性启动子核心片段(P7)，该片段长度477bp，基因序列为SQ2。

SQ2:

gggctgggaaatgaggagcaagggcctaggcctgccctcagggggcctccagtctcctggcaggatgggcacacgccacacgtcagacatagtcagaggctggggtagagacgtgggggctcacaggatggggggccaagttgaccaggtgtcagatgctcctccttattcattccctcagaatagtctgggatgtccgcaccccacaccacagctgagtcactgaccccaatcctcagaggagacttggatgaatgaagctctcccccactcactcctcttcccctccctagcagaaaggacatgtaactgatgcccgagatggagagtaacttccagagccctaaaaataactgaaccacttcatactctgaccttagcctcccccactgcccccacctcggcccaccccctaaccagccagataaaggcagctgctgaggctggcaggggacacagaccccgagctagggcagc

具体操作如下：

采用96孔黑板进行双荧光素酶检测，首先每孔加入100ul的细胞裂解液，然后加入LARII溶液，用多功能酶标仪迅速进行化学发光值检测，此时检测的为萤火虫荧光素酶活性，然后加入Stop和Glo试剂，充分混匀，迅速进行化学发光值检测，此时检测的为海肾荧光素酶活性，通过两种酶的校对值从而获得CMYA1启动子的活性，如图10所示，由图可以看出，P7启动子片段相对荧光值较高，且片段较短，为CMYA1核心启动子。

(4)CMYA1核心启动子肌肉特异性表达验证

构建pEGFP-CMYA1核心启动子(477bp)载体，并分别转染C2C12细胞，如图11、牛骨骼肌卫星细胞，如图12和牛成纤维细胞，如图13，发现CMYA1核心启动子依然只有在C2C12细胞和牛骨骼肌卫星细胞中特异性表达，而在牛成纤维细胞中未见表达，说明CMYA1核心启动子(477bp)不但活性很好，而且依然保留着其在肌肉细胞中特异性表达的性质。具体体系及操作同牛CMYA1肌肉特异性启动子的克隆及验证。

(5)实施例

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

将pcDNA 3.1质粒载体进行改造，利用Mlu I和HindⅢ双酶切去掉CMV启动子，插入CMYA1核心启动子(477bp)。将牛DGAT1基因(NM_174693.2)CDS序列SQ3利用Eco R Ⅰ和Eco RV酶切位点插入pcDNA 3.1质粒载体的多克隆位点。得到牛肌肉特异性表达载体pCMYA1-DGAT1，如图14所示。

其中，SQ3:

ATGGGCGACCGCGGCGGCGCGGGCGGCTCCCGGCGCCGGAGGACGGGGTCGCGGCCTTCGATCCAGGGCGGCAGTGGGCCCGCGGCAGCGGAAGAGGAGGTGCGGGATGTGGGCGCTGGAGGGGACGCGCCGGTCCGGGACACAGACAAGGACGGAGACGTAGACGTGGGCAGCGGCCACTGGGACCTGAGGTGTCACCGCCTGCAGGATTCCCTGTTCAGTTCTGACAGTGGCTTCAGCAACTACCGTGGCATCCTGAATTGGTGTGTGGTGATGCTGATCTTAAGCAACGCACGGTTATTTCTAGAGAACCTCATCAAGTATGGCATCCTGGTGGACCCCATCCAGGTGGTGTCTCTGTTCCTGAAGGACCCCTACAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGGTCATTGTGGCCAATATCTTTGCCGTGGCTGCGTTCCAGGTGGAGAAGCGCCTGGCCGTGGGAGCTCTGACGGAGCAGGCGGGGCTGCTGCTGCACGGGGTCAACCTGGCCACCATTCTCTGCTTCCCAGCGGCCGTGGCCTTTCTCCTCGAGTCTATCACTCCAGTGGGCTCCGTGCTGGCCCTGATGGTCTACACCATCCTCTTCCTCAAGCTGTTCTCCTACCGGGACGTCAACCTCTGGTGCCGAGAGCGCAGGGCTGGGGCCAAGGCCAAGGCTGCTTTGGCAGGTAAGGCGGCCAACGGGGGAGCTGCCCAGCGCACCGTGAGCTACCCCGACAACCTGACCTACCGCGATCTCTACTACTTCCTCTTCGCCCCCACCCTGTGCTACGAGCTCAACTTCCCCCGCTCCCCCCGCATCCGAAAGCGCTTCCTGCTGCGGCGACTCCTGGAGATGCTGTTCCTCACCCAGCTCCAGGTGGGGCTGATCCAGCAGTGGATGGTCCCGGCCATCCAGAACTCCATGAAGCCCTTCAAGGACATGGACTACTCCCGCATCGTGGAGCGCCTCCTGAAGCTGGCGGTCCCCAACCACCTCATCTGGCTCATCTTCTTCTACTGGCTCTTCCACTCCTGCCTGAACGCCGTGGCTGAGCTCATGCAGTTTGGAGACCGCGAGTTCTACCGGGACTGGTGGAACTCCGAGTCCATCACCTACTTCTGGCAGAACTGGAACATCCCTGTTCACAAGTGGTGCATCAGACACTTCTACAAGCCCATGCTCCGGCGGGGCAGCAGCAAGTGGGCAGCCAGGACGGCAGTGTTTCTGGCCTCCGCCTTCTTCCACGAGTACCTGGTGAGCATCCCCCTGCGCATGTTCCGCCTCTGGGCCTTCACCGGCATGATGGCGCAGATCCCGCTGGCCTGGATAGTGGGCCGCTTCTTCCGCGGCAACTACGGCAACGCGGCCGTGTGGCTGTCACTCATCATCGGGCAGCCGGTGGCCGTCCTGATGTACGTCCACGACTACTACGTGCTCAACCGTGAGGCGCCGGCAGCCGGCACCTGA

重组表达载体pCMYA1-DGAT1转染C2C12细胞，转染组和未转染对照组分别设置3个重复，转染48h后提取RNA，采用定量PCR检测DGAT1的表达量。实验结果见图15，定量PCR检测结果表明，转染pCMYA1-DGAT1后，DGAT1基因在C2C12细胞中的表达量是对照组的30.8倍，证明CMYA-1启动子成功驱使外源的DGAT1在C2C12细胞中表达，而且与未转染组相比两者间的差异极显著。本实施例证明了我们筛选出的CMYA1核心启动子(477bp)具有很好的肌肉表达特异性，而且比很多其它肌肉特异性启动子片段要短，可应用性比较强。

Claims

1.一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子，其特征在于：该核心启动子的基因序列为SQ2。

2.一种牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子的制备方法，其特征在于：包括步骤如下：

(1)牛CMYA1肌肉特异性启动子的克隆，

(3)筛选核心启动子，

③使用C2C12细胞和牛骨骼肌卫星细胞转染实验，证明该核心启动子依然保留着其在肌肉细胞中特异性表达的性质。

3.根据权利要求2所述的牛CMYA1肌肉特异性表达核心启动子的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)筛选核心启动子的第①步中的8对缺失引物如下面的表1所示，

表1.CMYA1启动子缺失片段引物设计