CN103305517B - 一种肺组织特异性sp-d启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种肺组织异性SP-D启动子及其应用，特别提供了一种肺组织特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用，该启动子只在肺组织中具有启动特性，而在除肺组织外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子只在肺组织中特异性地启动下游基因的表达，因此能够满足目的基因在肺组织中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高猪的抗病性提供了一种重要的元件。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种肺组织特异性表达基因5′调控区特异性SP-D启动子及其在转基因猪中的应用。
背景技术
真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达模式的调节能够引起转录因子与相关元件的特异性结合，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的系列家族基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子显得非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。
肺表面活性物质（Pulmonary Surfactant,PS）是一种脂蛋白复合体，主要活性成分为二棕榈酰卵磷脂（DPPC)和与其结合的蛋白特异性蛋白质。存在于PS中并于磷脂分子相互作用的特异性蛋白称为肺表面活性物质结合蛋白，简称表面活性物质蛋白（Surfactant Protein，SP）。SP仅占PS总量的5%以下，但具有广泛的生理功能，为PS不可缺少的重要成分。猪表面活性物质蛋白基因SP目前已有四种表面活性物质蛋白被确定，按其生物化学特性分为两大类：(1)小分子疏水性SP，包括SP-B和SP-C；(2)大分子亲水性SP，包括SP-A和SP-D。其中猪的SP-D位于14号染色体。由8个外显子和7个内含子组成，编码378个氨基酸。通过克隆该基因启动子区并在体外分析其启动特性，利用相关序列构建肺组织特异性表达载体是一种有效的方法，但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和抗病性提高均没有起到较好的促进作用。
发明内容
基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪表面活性物质蛋白基因SP-D基因5′调控区具有肺组织特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种肺组织特异性SP-D启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有肺组织特异性启动特性，而在除肺组织外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在肺组织中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在肺组织中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。
本发明所提供的肺组织特异性表达基因5′调控区特异性启动子，其基因序列如Seq ID No:1所示；
除了上述的启动子之外，还可以是该启动子变体或者片段，但均具有如Seq ID No:1所示的基因序列。
“变体”是指对猪肺组织SP-D启动子Seq ID No:1序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于Seq ID No:1DNA序列的活性。
“片段”是指基本猪肺组织SP-D启动子Seq ID No:1序列的一个或者多个区域，其仍然类似于基本DNA序列的活性。
具有上述序列的启动子或其变体，或者片段，具有肺组织特异性启动特性，而在肺组织之外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子在肺组织中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在肺组织中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。
应用上述的启动子时，一般采用重组核酸序列，该序列中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在肺组织中特异性表达，作为分析、开发、改造肺组织特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括抗病基因，加快生长速度基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得肺组织特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将Toll样受体基因在该启动子指导下表达可以特异性提高肺组织中白介素和干扰素，提高猪的抗病性能。
在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程中。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在肺组织中表达，在其他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效果。
本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先获得无启动子红色荧光蛋白载体。然后通过PCR或者基因捕获等技术获得肺组织中特异性表达的猪表面活性物质蛋白基因SP-D型5′调控区，长度为2.97kb，插入红色荧光蛋白上游，得到启动子报告基因分析载体，将CMV启动子（589bp）连入空载体DsRed载体中作为阳性对照，空载体DsRed载体为阴性对照。质粒去内毒素后，转染V79仓鼠肺细胞系，同时转染3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系，C2C12小鼠骨骼肌细胞系和Marc145非洲绿猴肾细胞系为对照，48h后用倒置荧光显微镜观察红色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。其中之所以选择CMV连入的空载体中作为阳性对照，主要是因为CMV为已知公认的强启动子，将强启动子连入无启动子的载体上游可以启动报告基因RFP的表达，该载体转染如细胞作为阳性对照，可以证明实验中所用的细胞以及转染试剂、转染技术等不存在问题，证明阴性对照无RFP表达是由于没有启动子的存在，而不是其他因素造成。进而更有力的证明连入实验启动子的载体转入细胞后启动RFP的表达是因为该启动子的作用。
与现有技术相比，本发明选用了独特的载体DsRed载体(商业载体全称为pDsRed-Express2-1vector)，以适应本发明所采用的报告基因RFP（红色荧光蛋白），同时本发明为SP-D特别设计了引物、启动子序列以及酶切位点等供研究其使用，均具有独特的代表性，因此与现有的肺组织特异性启动子相比，本发明的技术具有明显的不同和显著的进步和针对性。
当上述的启动子，或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通过添加各种功能性基因，使得转基因猪可以获得更好的抗病品质，更高的生长速度，更好的抗病性以及降低饲养成本，还可以在特定药物的生产中得到更为广泛的应用，对于该领域的研究有着很好的参考价值。
附图说明
图1为SP-D(F)和SP-D(R)引物PCR扩增SP-D启动子片段电泳图，图中泳道M为MassRuler Maker，1为PCR产物；
图2为无启动子的DsRed载体图谱；
图3为转染SP-D promoter DsRed48h仓鼠V79细胞照片灰度图，
图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达，SP-D promoter有启动活性；
图4为转染SP-D promoter DsRed48h小鼠胚胎成纤维3T3-L1细胞照片灰度图，
图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，SP-D promoter无启动活性；
图5为转染SP-D promoter DsRed48h小鼠骨骼肌C2C12细胞照片灰度图，
图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，SP-D promoter无启动活性；
图6为转染SP-D promoter DsRed48h非洲绿猴肾Marc145细胞照片灰度图，
图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，SP-D promoter无启动活性；
图7为转染CMV Promoter DsRed48h仓鼠V79细胞照片灰度图，
图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，可见RFP表达，转染技术有效；
图8为转染promoter less DsRed48h仓鼠V79细胞照片灰度图，
图中左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好；右侧为绿光激发下照片，无RFP表达，转染试剂有效。
具体实施方式
在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1启动子报告基因载体的构建
基因组提取：取大约克夏猪耳组织，按照TIANamp genomic DNA（天根）试剂盒说明书进行基因组DNA提取。
无启动子的DsRed载体作为阴性对照；以DsRed为骨架用Sma Ⅰ（Fermentas）酶切，回收4107bp片段，得到无启动子片段。将完整的CMV启动子正向连入该载体中，得到该载体的阳性对照载体。
将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照1：500的比例分别接种至含卡那霉素100μg/ml LB培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi（QIAGEN）说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。
根据NCBI(GeneID:397198)设计如下引物，SP-D(F)基因序列如Seq ID No:2所示，SP-D(R)基因序列如Seq ID No:3所示，它包含了从转录起始位点下游47bp到上游2916bp的范围。
PCR程序设定如下
将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.8%TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收，按Promega琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，同时用T4Polynucleotide Kinase（Fermentas）进行磷酸化处理，无启动子的DsRed载体用Sma Ⅰ（Fermentas）酶切，同时加入FastAPTMThermosensitive Alkaline Phosphatase（Fermentas）进行去磷酸化处理，将SP-D启动子用Rapid DNA Ligation（Fermentas）与去磷酸化的载体连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向并测序，测序无误后获得SP-D启动子DsRed质粒，启动子序列如Seq ID No:1所示。将包含测序正确的菌液按照1：500的比例接种至含卡那霉素100μg/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi（QIAGEN）说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸SP-D Promoter DsRed载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证SP-D启动子的启动特点。
采用SP-D(F)和SP-D(R)引物PCR扩增获得的SP-D启动子片段电泳图如图1所示。
实施例2细胞培养与转染
V79仓鼠肺细胞系培养在含10vt%胎牛血清（Gibco）的RPMI1640(Gibco)培养基中，培养条件为37℃,5%CO2，保持细胞汇合度在50%。
3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系培养在含10vt%新生牛血清（Gibco）的DMEM(Gibco)培养基中，培养条件为37℃,5%CO2。
小鼠成肌细胞系C2C12培养在含10vt%胎牛血清（Gibco）的DMEM(Gibco)培养基中，培养条件为37℃,5%CO2，保持细胞汇合度在50%，诱导培养基为含2vt%马血清(Hyclone)的DMEM培养基
Marc145非洲绿猴肾细胞系培养在含10vt%胎牛血清（Gibco）的DMEM(Gibco)培养基中，培养条件为37℃,5%CO2，保持细胞汇合度在50%。
将待转染的细胞用1×PBS(Gibco)漂洗贴壁细胞两次，加入37℃预热的0.05%胰酶(Gibco)，消化5min，加入无抗生素的完全培养基采用含10vt%胎牛血清（Gibco）的RPMI1640(Gibco)培养基重悬细胞，细胞计数后每孔按1×104接种至24孔板，12h后用37℃无血清无抗生素RPMI1640(Gibco)培养基洗涤细胞一次，每孔加入500μl新鲜的无抗生素的完全培养基，12h后进行转染，此时细胞汇合度为90%～95%。
将阳性对照载体CMV Promoter DsRed，阴性对照载体无启动子的DsRed，实验载体SP-D PromoterDsRed三种质粒同时转染V79仓鼠肺细胞系，3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系，C2C12小鼠骨骼肌细胞系和Marc145非洲绿猴肾细胞系，每孔将750ng质粒稀释至100μl opti-MEM中，加入0.75μl LipofectamineTMPLUS(Invitrogen)彻底混匀，5min后加入3μl LipofectamineTMLTX(Invitrogen)转染试剂颠倒混匀，25℃孵育，30min后轻轻加至每一孔中，混匀。转染12h后更换诱导培养基至C2C12细胞系中，诱导细胞分化融合。转染48h后与荧光倒置显微镜下观察RFP表达情况：阳性对照载载体的转染效率在30%（如图5和图7所示），阴性对照载体转染后无红色荧光蛋白表达。转染SP-D Promoter DsRed载体后，只有V79仓鼠肺细胞系有红色荧光蛋白表达（如图3所示），在鼠胚胎成纤维细胞系，小鼠骨骼肌细胞系和非洲绿猴肾细胞系中均无红色荧光蛋白表达。，（如图4、5、6所示）。
转染结果表明只有在仓鼠肺细胞系中猪SP-D启动子才有启动活性，在胚胎成纤维细胞中，骨骼肌细胞中并没有启动活性，在肾细胞中也无启动活性，表明猪SP-D启动子具有肺组织特异性启动活性，可以驱动目的基因在肺组织特异性表达。
实施例3SP-D启动子变体功能
根据制造商的说明，利用Stratagene QuikChangeTM定点突变试剂盒（Stratagene），设计突变引物构建该启动子变体，包括核酸的缺失，取代和插入。变更的启动子通过序列测定验证突变。将突变后的启动子重组至目的基因上游，驱动目的基因的表达。
实施例4串联SP-D启动子的应用
根据NCBI(Gene ID:397198)设计如下引物，上下游引物分别引入Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切位点及保护碱基。SP-D2(F)基因序列如Seq ID No:4所示，SP-D2(R)基因序列如Seq ID No:5所示。
PCR程序设定如下
将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.8%TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收2.87kb片段，按Promega琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物。用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ（Fermentas）酶切PCR纯化产物并回收酶切产物。将酶切纯化过的SP-D调控区用Rapid DNA Ligation（Fermentas）与酶切后的载体连接，并转化TOP10，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1：500的比例接种至含卡那霉素100μg/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi（QIAGEN）说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸Double SP-D Promoter DsRed载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证双SP-D启动子的启动特点。
将阳性对照载体CMV Promoter DsRed，阴性对照载体无启动子的DsRed，以及上述的实验载体DoubleSP-D Promoter DsRed三种质粒同时转染V79仓鼠肺细胞系，3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系，C2C12小鼠骨骼肌细胞系和Marc145非洲绿猴肾细胞系，每孔将750ng质粒稀释至100μl opti-MEM中，加入0.75μlLipofectamineTMPLUS(Invitrogen)彻底混匀，5min后加入3μl LipofectamineTMLTX(Invitrogen)转染试剂颠倒混匀，25℃孵育，30min后轻轻加至每一孔中，混匀。转染48h后与荧光倒置显微镜下观察RFP表达情况：阳性对照载载体的转染效率在30%，阴性对照载体转染后无红色荧光蛋白表达。转染Double SP-DPromoter DsRed载体后，只有V79仓鼠肺细胞系有红色荧光蛋白表达，在鼠胚胎成纤维细胞系，小鼠骨骼肌细胞系和非洲绿猴肾细胞系中均无红色荧光蛋白表达。
转染结果表明只有在仓鼠肺细胞系中猪Double SP-D启动子才有启动活性，在胚胎成纤维细胞中，骨骼肌细胞中并没有启动活性，在肾细胞中也无启动活性，表明猪Double SP-D启动子具有肺组织特异性启动活性，可以驱动目的基因在肺组织特异性表达。
实施例5SP-D启动子片段应用
根据NCBI(Gene ID:733580)设计如下引物，上下游引物分别引入Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切位点及保护碱基。SP-D3(F)基因序列如Seq ID No:6所示，SP-D3(R)基因序列如Seq ID No:7所示。
PCR程序设定如下
将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.8%TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收2.87kb片段，按Promega琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物。用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ（Fermentas）酶切PCR纯化产物并回收酶切产物。将酶切纯化过的SP-D调控区用Rapid DNA Ligation（Fermentas）与酶切后的载体连接，并转化TOP10，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1：500的比例接种至含卡那霉素100μg/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi（QIAGEN）说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸Segment SP-D Promoter DsRed载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证双SP-D启动子的启动特点。
将阳性对照载体CMV Promoter DsRed，阴性对照载体无启动子的DsRed，以及上述的实验载体Segment SP-D Promoter DsRed三种质粒同时转染V79仓鼠肺细胞系，3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞系，C2C12小鼠骨骼肌细胞系和Marc145非洲绿猴肾细胞系，每孔将750ng质粒稀释至100μl opti-MEM中，加入0.75μlLipofectamineTMPLUS(Invitrogen)彻底混匀，5min后加入3μl LipofectamineTMLTX(Invitrogen)转染试剂颠倒混匀，25℃孵育，30min后轻轻加至每一孔中，混匀。转染48h后与荧光倒置显微镜下观察RFP表达情况：阳性对照载载体的转染效率在30%，阴性对照载体转染后无红色荧光蛋白表达。转染Segment SP-DPromoter DsRed载体后，只有V79仓鼠肺细胞系有红色荧光蛋白表达，在鼠胚胎成纤维细胞系，小鼠骨骼肌细胞系和非洲绿猴肾细胞系中均无红色荧光蛋白表达。
转染结果表明只有在仓鼠肺细胞系中猪Segment SP-D启动子才有启动活性，在胚胎成纤维细胞中，骨骼肌细胞中并没有启动活性，在肾细胞中也无启动活性，表明猪Segment SP-D启动子具有肺组织特异性启动活性，可以驱动目的基因在肺组织特异性表达。
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1.一种肺组织特异性SP-D启动子，其特征在于：该启动子的基因序列如Seq ID No:1所示。
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