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CN104710521A - 一个控制植物产量的相关基因及其应用 - Google Patents

一个控制植物产量的相关基因及其应用 Download PDF

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CN104710521A
CN104710521A CN201310689545.3A CN201310689545A CN104710521A CN 104710521 A CN104710521 A CN 104710521A CN 201310689545 A CN201310689545 A CN 201310689545A CN 104710521 A CN104710521 A CN 104710521A
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grain
protein
spermatophyte
seq
gene
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储成才
车荣会
赵明富
童红宁
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Original Assignee
Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
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Abstract

本发明公开了一个控制植物产量的相关基因及其应用。该控制植物产量的相关基因编码如下a）或b）的植物种子性状相关蛋白：a）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子植物粒重和/或粒长和/或粒宽相关的蛋白质。可以通过控制该植物种子性状相关蛋白的表达量从而得到所需要的种粒大小的转基因种子植物。

Description

一个控制植物产量的相关基因及其应用
技术领域
本发明涉及一个控制植物产量的相关基因及其应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，有着悠久的栽培历史，在国民经济中发挥着巨大的作用。但是，随着人口的不断增长，工业化程度的提高，生态环境的不断恶化，粮食短缺现象也不断加剧。估计到2030年，水稻产量需要增长40%左右才能与人类需要相持衡。同时，随着人们生活水平的提高，对水稻外观和品质的要求也随之提高。细长型的水稻深受中国南方、欧洲以及美洲一些国家的喜爱，而中国北方、日本和韩国偏向于小圆粒型。所以为了满足不同人们的需要，这就要求育种学家对水稻产量和粒型形成的分子机制有所了解，从而在育种改良中加以运用，最大程度地提高水稻的产量和改善粒型，以满足日益增长的需要。
水稻产量性状属于复杂的数量性状。水稻产量构成因素包括单位面积有效穗数、每穗总粒数和粒重。而粒重是产量构成因素中遗传力最高的一个，是水稻产量潜力的重要决定因素，也是育种家进行品种选育时使用的重要选择性状。水稻粒型（可以分解为粒长、粒宽和粒厚）决定粒重和品质。获得控制植物种子粒型基因对有效地进行分子育种研究十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种与控制植物种子性状（粒重和/或粒长和/或粒宽）相关的蛋白质及其编码基因与相关生物材料。
本发明所提供的与控制植物种子性状相关蛋白，名称为GL2，来源于水稻WFC，是如下a）或b）的蛋白质：
a）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子植物粒重和/或粒长和/或粒宽相关的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由394个氨基酸残基组成。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
与GL2相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与GL2相关的生物材料，为下述B1）至B7）中的任一种：
B1）编码GL2的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6）降低GL2表达的核酸分子；
B7）含有B6）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1）所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是SEQ ID No.1的第88-1272位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是SEQ ID No.3的第2606-6327位所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码GL2的cDNA分子或基因组DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码GL2的cDNA分子或基因组DNA分子。
本申请使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
其中，SEQ ID No.1由1523个核苷酸组成，其编码序列是SEQ ID No.1的第88-1272位核苷酸，编码序SEQ ID No.2所示的蛋白质。SEQ ID No.3由6408个核苷酸组成，SEQ ID No.3的第7-2605位为启动子，第2606-6327位所示，SEQ ID No.3的第2606-2802位为第一外显子，SEQ ID No.3的第2803-2899位为第一内含子，SEQ ID No.3的第2900-3129位为第二外显子，SEQ ID No.3的第3130-3730位为第二内含子，SEQ ID No.3的第3731-4142位为第三外显子，SEQ ID No.3的第4143-5539位为第三内含子，SEQID No.3的第5540-5964位为第四外显子，SEQ ID No.3的第5965-6067位为第四内含子，SEQ ID No.3的第6068-6327位为第五外显子。SEQ ID No.3的第2606-2692为非翻译区，SEQ ID No.3的第6074-6327位为非翻译区，水稻WFC中的GL2基因的基因组基因编码SEQ ID No.2的蛋白质。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，B2）所述的含有编码GL2的核酸分子的表达盒（GL2基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达GL2的DNA，该DNA不但可包括启动GL2基因转录的启动子，还可包括终止GL2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I985)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
在本发明的一个实施方式中，所述GL2基因表达盒中启动SEQ ID No.2所示的GL2基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒的35S启动子，终止所述GL2基因转录的终止子为OCS终止子。在本发明的另一个实施方式中，所述GL2基因表达盒中启动SEQ ID No.3所示的GL2基因转录的启动子为是如下E1）、E2）或E3）的DNA分子：
E1）核苷酸序列是SEQ ID No.3的第7-2605位的DNA分子；
E2）与E1）限定的核苷酸序列具有75%或75%同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
E3）在高严谨条件下与E1）或E2）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子；终止所述GL2基因转录的终止子为花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子。
可用现有的植物表达载体构建含有所述GL2基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA2300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，B4）和B7）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。B5）和B7）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。
实验证明GL2、或上述与GL2相关的生物材料可用于调控植物种子性状（粒重和/或粒长和/或粒宽）。
其中，所述植物可为种子植物。
本发明提供了利用GL2的编码基因培育具有下述D1-D7性状的转基因种子植物的方法。
本发明所提供的培育具有D1-D8性状的转基因种子植物的方法，包括向受体种子植物中导入GL2的编码基因得到具有所述D1-D8性状的转基因种子植物的步骤：
D1、粒重和粒长和粒宽均高于所述受体种子植物；
D2、粒重和粒长均高于所述受体种子植物；
D3、粒重和粒宽均高于所述受体种子植物；
D4、粒重高于所述受体种子植物；
D5、粒长和粒宽均高于所述受体种子植物；
D6、粒长高于所述受体种子植物；
D7、粒宽高于所述受体种子植物；
D8、外观品质高于所述受体种子植物。
上述方法中，其中所述GL2基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GL2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。
上述方法中，GL2的编码基因的编码序列是SEQ ID No.1的第88-1272位核苷酸的DNA分子。GL2的编码基因也可为SEQ ID No.3的第2606-6327位核苷酸所示的DNA分子。
在本发明的一个实施方式中，GL2的编码基因通过含有GL2的编码基因的表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中；所述表达盒中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子是35S启动子。所述重组表达载体为用SEQ ID No.2的第88-1272位所示的DNA分子替换pCAMBIA1300的BamHI和KpnI识别位点间的片段得到的重组表达载体pCAMBIA1300-GL2。
在本发明的另一个实施方式中，GL2的编码基因通过含有GL2的编码基因的表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中；所述表达盒中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子是如下E1）、E2）或E3）的DNA分子：
E1）核苷酸序列是SEQ ID No.3的第7-2605位的DNA分子；
E2）与E1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
E3）在高严谨条件下与E1）或E2）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。所述重组表达载体为用SEQ ID No.3的DNA分子替换pCAMBIA2300的BamHI和HindⅢ识别位点间的片段得到的重组表达载体为pCAMBIA2300-WFCPGL2。
所述GL2基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如小麦。既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦（如小麦品种扬麦16、科农199）。所述抗病具体可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）引起，所述禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）具体为禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）R0301。
上述方法中，所述转基因种子植物理解为不仅包含将所述基因转化受体种子植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因种子植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
扩增编码GL2的核酸分子片段的引物对；所述核酸分子片段包括SEQ ID No.2的第163位氨基酸残基的密码子的第一位和第二位核苷酸，即所述核酸分子片段包括SEQID No.1的第574-575位核苷酸或SEQ ID No.3的第3877-3878位核苷酸。所述核酸分子片段包括SEQ ID No.2的第2位氨基酸残基的密码子的第一位，即所述核酸分子片段包括SEQ ID No.1的第91位核苷酸或SEQ ID No.3的第2696位核苷酸。
本申请中，所述种子植物具体可为被子植物；进一步，所述被子植物可为单子叶植物和双子叶植物，如水稻。
本申请的实验证明，将GL2基因导入受体水稻得到的转GL2基因水稻的种子长度、种子宽度和种子千粒重显著高于受体水稻，与受体水稻相比，转GL2基因水稻在单株产量上也得到了很大的提高。可以通过控制GL2的表达量从而得到所需要的种粒大小的转基因种子植物。因此GL2对水稻产量的提高和改良具有巨大的潜在应用价值。
附图说明
图1为水稻WFC和博白B的株型、穂型和粒型的比较。
图2为GL2基因的表达模式。
图2中，YF：幼穗，EN：胚，S：茎，SH：叶鞘；R：根；L：剑叶。
图3为近等基因系NIL(GL2)和水稻博白B和T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻植株的种子。
图3中，左侧种子为水稻博白B，中间种子为T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻，右侧为近等基因系NIL(GL2)。
图4为近等基因系NIL(GL2)和水稻博白B的株型、穂型和粒型照片。
图4中，BBB为博白B，NIL(GL2)为近等基因系NIL(GL2)。
图5为近等基因系NIL(GL2)和水稻博白B的农艺性状。
图5中，BBB为博白B，F139为近等基因系NIL(GL2)。
图6为日本晴、转pCAMBIA1300水稻和转pCAMBIA1300-GL2水稻的种子照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本申请中的水稻WFC（赵明富等.水稻谷粒粒长显性主效QTL的遗传分析与定位.分子植物育种，2008年，第6卷，第6期，第1057-1060页）是大粒水稻，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本申请中的水稻博白B（赵明富等.水稻谷粒粒长显性主效QTL的遗传分析与定位.分子植物育种，2008年，第6卷，第6期，第1057-1060页）是小粒水稻，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本申请中的水稻日本晴（Hu B,Zhu C,Li F,Tang J,Wang Y,Lin A,Liu L,CheR,Chu C.2011.LEAF TIP NECROSIS1plays a pivotal role in regulation of multiplephosphate starvation responses in rice.Plant Physiology156:1101–1115.）公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、GL2基因的克隆及其功能验证
1、GL2基因的克隆
为了便于克隆控制粒型的QTL，选择粒型存在较大差异的两个亲本材料水稻WFC和水稻博白B作为杂交亲本，它们不仅在外观上差别明显（图1中A）而且在籽粒的长度、宽度和千粒重上都存在明显差异（图1中B和C）。小粒亲本“博白B”(BBB)的粒重仅为20.06g，而大粒亲本（WFC）的千粒重是40.2g，是小粒亲本两倍多。
除了粒型方面差异比较大之外，两个亲本在株型和穗型（图1中A和B）也存在较大差异。其中亲本BBB株高仅仅是WFC株高的一半，且WFC的穗长与BBB的穗长相比明显变长。总之，所选两个亲本在粒型、株型、穗型和千粒重上都有很大的差异。特别在粒型（粒长和粒宽）上两者之间的差异比较大，适合用于构建定位水稻粒型QTL的遗传群体。
对亲本及其F1的粒型进行分析，结果显示组合BBB/WFC F1粒长介于双亲长度之间且明显偏向长粒亲本，粒宽表现出同样的分布。且BC2F1群体中粒长分布出现了明显的双峰分布，长粒和端粒分别为27株和25株，经x2测验，符合1:1。随机连续选取355株BC3F2群体分析得知，粒长和粒宽分别为268株和87株，比例为3.1:1，经x2测验，符合3:1。结果表明粒长是由一个主效的显性基因控制，且长粒对短粒显性。
利用F2群体中300株极端小粒群体进行定位的结果表明2号染色体上的一段DNA为控制水稻谷粒长度的基因，将其命名为GL2基因。水稻WFC中的GL2的基因组基因包含了5个外显子和4个内含子，其核苷酸序列如SEQ ID No.3的第2606-6327位所示，SEQ ID No.3的第2606-2802位为第一外显子，SEQ ID No.3的第2803-2899位为第一内含子，SEQ ID No.3的第2900-3129位为第二外显子，SEQ ID No.3的第3130-3730位为第二内含子，SEQ ID No.3的第3731-4142位为第三外显子，SEQ ID No.3的第4143-5539位为第三内含子，SEQ ID No.3的第5540-5964位为第四外显子，SEQ ID No.3的第5965-6067位为第四内含子，SEQ ID No.3的第6068-6327位为第五外显子。SEQID No.3的第2606-2692为非翻译区，SEQ ID No.3的第6074-6327位为非翻译区，水稻WFC中的GL2基因的基因组基因编码SEQ ID No.2的蛋白质。
水稻博白B的等位基因的外显子中的编码序列与水稻WFC中的GL2基因的外显子中的编码序列相比，第一外显子的第91位（SEQ ID No.3的第2696位）不同，水稻博白B是g，水稻WFC中是a，导致编码的氨基酸也不同，水稻博白B该位置编码的氨基酸是Ala，水稻WFC该位置编码的氨基酸是Thr（SEQ ID No.2的第2位氨基酸残基）；第三外显子的第147-148位（SEQ ID No.1的第574-575位、SEQ ID No.3的第3877-3878位核苷酸）不同，水稻博白B中是TC，水稻WFC中的GL2基因该位置处是AA（SEQ IDNo.2的第163位氨基酸残基的密码子的第一位和第二位核苷酸），导致编码的氨基酸也不同，水稻博白B该位置编码的氨基酸是Ser，水稻WFC该位置编码的氨基酸是Lys。
2、GL2基因的表达模式
利用qRT-PCR方法对GL2基因的组织定位进行了研究。具体方法如下：提取水稻WFC各个组织的总RNA，取2μg总RNA，用Promega反转录酶M-MLV进行反转录。反应体系包括：总RNA2μg、Oligo(dT)2μl、加DEPC-H2O至10μl，70℃，5min，反应后迅速放于冰上5min。然后加入：5×Reaction buffer5μl、dNTPs（10mM）1.25μl、RNA酶抑制剂0.625μl、反转录酶1μl、加DEPC-H2O至最终体积25μl。混匀后42℃反应90min。取1μl反转录后cDNA稀释10倍，作为模板进行PCR反应。Real-time PCR使用C1000TM Thermal Cycler（CFX96real-timesystem，BioRad，USA）进行。20μl PCR反应体系：14.5μl H2O、2μl10×buffer、0.5μl SYBR Green dye、0.3μldNTP、0.2μlTaq酶、1.5μl Primer、1μl cDNA。数据的处理采用Comparative Ct的方法。以水稻ACTIN1RNA作为PCR内参。所使用引物为：
检测WFCPGL2的引物为：qGL2-F:AGACCTCGCTGATGAGAATG，和qGL2-R:AGCAACAAGGCCAGTATGAG。
检测ACTIN1的引物为ACTIN-F:ACCATTGGTGCTGAGCGTTT，和ACTIN-R:CGCAGCTTCCATTCCTATGAA。
结果表明GL2基因主要在小穗和胚中有高水平的表达，而在根、茎、叶等组织中的表达量比较低，这也暗示了GL2基因可能参与了调控种子大小的途径(图2)。
3、GL2基因的功能验证
3.1、近等位基因系研究GL2基因的功能
为了研究GL2基因的功能，构建了以小粒品种博白B（轮回亲本）为遗传背景、大粒亲本WFC为供体亲本的近等基因系(NIL，Nearly Isogenic Line)NIL(GL2)。NIL(GL2)中目标QTL/GL2基因的染色体区域来自WFC亲本，而遗传背景基本上为博白B的染色体片段。在构建NIL(GL2)过程中，选取了均匀分布在水稻染色体396对分子标记进行遗传背景选择。在分子标记辅助选择的基础上，从BC7F2群体中筛选到近等基因系NIL(GL2)，该近等基因系中包含WFC的GL2基因所在染色体片段小于5CM。
在相同环境下种植收获水稻博白B和近等基因系NIL(GL2)的种子。测量种子的长度（粒长）、宽度（粒宽）和千粒重。实验重复三次，每次重复水稻博白B和近等基因系NIL(GL2)各测定20粒种子。结果表明近等基因系NIL(GL2)的种子长度为9.74±0.25mm，水稻博白B的种子长度为7.79±0.21mm，近等基因系NIL(GL2)的种子宽度为3.16±0.095mm，水稻博白B的种子宽度为2.56±0.047mm，近等基因系NIL(GL2)的千粒重为29.67±0.86g，水稻博白B的千粒重为18.43±0.81g。说明与水稻博白B相比，近等基因系NIL(GL2)的粒长和粒宽分别提高了25%和23%，千粒重提高了61%。可见，NIL(GL2)提高粒重主要原因是由于粒长的增加，其次是由于粒宽的增加。
近等基因系NIL(GL2)和水稻博白B在株型上已经没有明显差异，其最大差异在粒型方面（图3），其株型、穂型和粒型如4，其农艺性状如图5所示。
为了解GL2基因在调控水稻谷粒粒长方面是否也受到母本效应的影响，对博白B和NIL(GL2)之间进行了正反交实验。结果显示，正反交并没有对谷粒的粒长、粒宽和千粒重产生明显的差异。可见，GL2基因对粒型的调控不受父本或者母本效应的影响。
3.2、通过转基因研究GL2基因的功能
3.2.1转GL2基因水稻的获得
用引物对PGL2-F和PGL2-R从水稻WFC的基因组DNA中进行PCR扩增SEQ ID No.3所示的水稻WFC的GL2基因及其启动子（名称为WFCPGL2），再利用TA克隆策略对得到的PCR产物加尾后与pMD18-T载体连接，用限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切鉴定连接产物，将酶切鉴定正确的连接产物命名为pMD18-T-WFCPGL2。对pMD18-T-WFCPGL2进行测序，测序结果表明，pMD18-T-WFCPGL2中含有的PCR扩增产物的核苷酸序列是SEQ ID No.3。SEQ ID No.3的第7-2605位为启动子，SEQ ID No.3的第2606-6327位为水稻WFC的GL2基因，编码SEQ ID No.2的蛋白质。SEQ ID No.3的第2606-2802位为第一外显子，SEQ ID No.3的第2803-2899位为第一内含子，SEQ ID No.3的第2900-3129位为第二外显子，SEQ ID No.3的第3130-3730位为第二内含子，SEQ ID No.3的第3731-4142位为第三外显子，SEQ ID No.3的第4143-5539位为第三内含子，SEQID No.3的第5540-5964位为第四外显子，SEQ ID No.3的第5965-6067位为第四内含子，SEQ ID No.3的第6068-6327位为第五外显子。SEQ ID No.3的第2606-2692为非翻译区，SEQ ID No.3的第6074-6327位为非翻译区。利用限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切pMD18-T-WFCPGL2，回收目的片段WFCPGL2，同时利用BamHI和HindⅢ双酶切pCAMBIA2300（Cambia,澳大利亚），回收载体大片段，最后利用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化DH5a感受态细胞，涂卡那霉素抗性平板，置37℃培养箱中，之后挑单克隆并提取质粒酶切鉴定，最后进行测序确认。将测序结果表明用SEQ IDNo.3的DNA分子替换pCAMBIA2300的BamHI和HindⅢ识别位点间的片段得到的重组表达载体命名为pCAMBIA2300-WFCPGL2。pCAMBIA2300-WFCPGL2中的GL2基因表达盒中的启动子是SEQ ID No.3的第7-2605位，终止子是OCS。
其中，引物对PGL2-F和PGL2-R的序列如下：
PGL2-F:ggatccCGGTCTACTTGATGGAACAG；
PGL2-R:aagcttGTTGCTGCACTGATGTTGAC。
将pCAMBIA2300-WFCPGL2通过根癌农杆菌AGL1（购自ATCC）介导的水稻转化方法转入水稻博白B。具体实验方法如下：
取2微升pCAMBIA2300-WFCPGL2质粒加入到根癌农杆菌AGL1中，液氮冷冻5分钟之后37度复苏5分钟，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到转入pCAMBIA2300-WFCPGL2的重组菌，命名为AGL1/pCAMBIA2300-WFCPGL2。
将AGL1/pCAMBIA2300-WFCPGL2导入水稻博白B的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代（2周/代）；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基（1），上，在分化培养箱（每天12小时光照，12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基（2）上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得2株T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻（株系名称分别为B-1、B-2）。
上述方法中，所用培养基如表1。
表1、培养基
3.2.2、转GL2基因水稻的鉴定
取步骤3.2.1的株系名称分别为B-1和B-2的2株T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻按照如下方法进行实时定量PCR检测GL2基因的表达情况：
提取植株的总RNA，取2μg总RNA，用Promega反转录酶M-MLV进行反转录。反应体系包括：总RNA2μg、Oligo(dT)2μl、加DEPC-H2O至10μl，70℃，5min，反应后迅速放于冰上5min。然后加入：5×Reaction buffer5μl、dNTPs（10mM）1.25μl、RNA酶抑制剂0.625μl、反转录酶1μl、加DEPC-H2O至最终体积25μl。混匀后42℃反应90min。取1μl反转录后cDNA稀释10倍，作为模板进行PCR反应。Real-time PCR使用C1000TM Thermal Cycler（CFX96real-timesystem，BioRad，USA）进行。20μl PCR反应体系：14.5μl H2O、2μl10×buffer、0.5μl SYBR Green dye、0.3μldNTP、0.2μlTaq酶、1.5μl Primer、1μl cDNA。数据的处理采用Comparative Ct的方法。以水稻ACTIN1 RNA作为PCR内参。所使用引物为：
检测WFCPGL2的引物为：qGL2-F:AGACCTCGCTGATGAGAATG，和qGL2-R:AGCAACAAGGCCAGTATGAG。
检测ACTIN1的引物为ACTIN-F:ACCATTGGTGCTGAGCGTTT，和ACTIN-R:CGCAGCTTCCATTCCTATGAA。
实验重复三次，实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2- ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT=（CT.Target－CT.OsACTIN1）Time x－（CT.Target－CT.OsACTIN1）Time0
Time x表示任意时间点，Time0表示经OsACTIN校正后1倍量的目标基因表达。
结果表明，在Actin基因作为内参的情况下，与受体水稻—水稻博白B相比（GL2基因表达量记为1），T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻株系B-1和B-2的GL2基因表达量极显著高于水稻博白B（p＜0.01）。将水稻博白B的GL2基因表达量记为1，T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻株系B-1和B-2的GL2基因表达量分别为2.2及3.5。
3.2.3、GL2基因的表达变化可显著改变谷粒长度
收获步骤2中的株系名称分别为B-1和B-2的2株T0代转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻植株所结的种子（T1代种子），将T1代种子种植在相同环境下收获T1代植株所结的种子（T2代种子），并在相同环境下种植收获水稻博白B种子。测量转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻植株的T2代种子和水稻博白B种子的长度。实验重复三次，每次重复每个株系测定20粒种子。结果表明B-1的转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻植株的T2代种子长度为9.56±0.21mm，B-2的转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻植株的T2代种子长度为9.77±0.24mm，水稻博白B的种子长度为7.78±0.21mm。说明GL2基因表达增加了水稻种子长度，GL2对水稻种子发育具有正调控作用。B-1和B-2的转pCAMBIA2300-WFCPGL2水稻植株的T0代种子长度与近等基因系NIL(GL2)粒型相似(图3)。
实施例2、利用GL2基因培育转基因水稻
1、转GL2基因水稻的获得
提取水稻WFC的幼穗的总RNA，反转录为cDNA，用引物GL-1F和GL-1R用高保真DNA聚合酶(KOD-FX酶)扩增GL2基因的CDS。再利用TA克隆策略对得到的PCR产物加尾后与pMD18-T载体连接，用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切鉴定连接产物，将酶切签订正确的连接产物命名为pMD18-T-GL2。对pMD18-T-GL2进行测序，测序结果表明，pMD18-T-GL2中的GL2基因PCR扩增产物具有核苷酸序列是SEQ ID No.2的第88-1272位所示的GL2基因的CDS。其中，GL-1F的序列是:GGTACCatgacgatgccgtatgcct，GL-1R的序列是:GGATCCTCAGTCACCATTAGTTGATCGA。
利用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切pMD18-T-GL2，回收目的片段GL2基因，同时利用BamHI和KpnI双酶切pCAMBIA1300（Cambia,澳大利亚），回收载体大片段，最后利用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化DH5a感受态细胞，涂卡那霉素抗性平板，置37℃培养箱中，之后挑单克隆并提取质粒酶切鉴定，最后进行测序确认。将测序结果表明用SEQ ID No.2的第88-1272位所示的DNA分子替换pCAMBIA1300的BamHI和KpnI识别位点间的片段得到的重组表达载体命名为pCAMBIA1300-GL2。pCAMBIA1300-GL2中的GL2基因表达盒中的启动子是35S启动子，终止子是OCS。
按照实施例1中的3.2.1的方法将pCAMBIA1300-GL2通过根癌农杆菌AGL1（购自ATCC）介导的水稻转化方法转入水稻日本晴，得到3株T0代转pCAMBIA1300-GL2水稻（株系名称分别为1-1、1-2、1-3）。同时将pCAMBIA1300通过根癌农杆菌AGL1（购自ATCC）介导的水稻转化方法转入水稻日本晴，得到2株T0代转pCAMBIA1300g水稻（株系名称分别为K-1、K-2）。
2、转GL2基因水稻的鉴定
按照实施例1中3.2.2的方法对步骤1的3株T0代转pCAMBIA1300-GL2水稻株系1-1、1-2、1-3、2株T0代转pCAMBIA1300水稻株系K-1、K-2和日本晴进行实时定量PCR检测GL2基因的表达情况，实验重复三次，实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT=（CT.Target－CT.OsACTIN1）Time x－（CT.Target－CT.OsACTIN1）Time0
Time x表示任意时间点，Time0表示经OsACTIN校正后1倍量的目标基因表达。结果表明，在Actin基因作为内参的情况下，与受体水稻—水稻日本晴相比（GL2基因表达量记为1），T0代转pCAMBIA1300-GL2水稻株系1-1、1-2和1-3的GL2基因表达量极显著高于日本晴（p＜0.01），T0代转pCAMBIA1300水稻株系K-1和K-2的GL2基因表达量与日本晴无显著差异。将水稻日本晴的GL2基因表达量记为1，T0代转pCAMBIA1300-GL2水稻株系1-1、1-2和1-3的GL2基因表达量分别为2.88±0.32、9.17±0.24及17.10±0.89，T0代转pCAMBIA1300水稻株系K-1和K-2的GL2基因表达量分别为1.05±0.032及0.98±0.05。
收获株系名称分别为1-1、1-2和1-3的3株T0代转pCAMBIA1300-GL2水稻植株所结的种子（T1代种子），种植T1代种子收获T1代植株所结的种子（T2代种子），并在相同环境下种植收获水稻日本晴种子和T2代转pCAMBIA1300空载体水稻株系K-1和K-2的种子。测量各株系的种子长度（粒长）、种子宽度（粒宽）和千粒重。实验重复三次，每次重复每个株系测定20粒种子。结果表明1-1的转pCAMBIA1300-GL2水稻植株的T2代种子长度为8.79±0.10mm、种子宽度为3.28±1.11mm、千粒重为24.56±0.56g，1-2的转pCAMBIA1300-GL2水稻植株的T2代种子长度为9.32±0.14mm、种子宽度为3.51±0.13mm、千粒重为27.08±0.54g，1-3的转pCAMBIA1300-GL2水稻植株的T2代种子长度为9.94±0.15mm、种子宽度为3.55±0.10mm、千粒重为30.56±0.42g，日本晴的种子长度为7.36±0.10mm、种子宽度为3.02±0.11mm、千粒重为24.3±0.32g，K-1的转pCAMBIA1300水稻植株的T2代种子长度为7.40±0.12mm、种子宽度为3.20±0.13mm、千粒重为23.89±0.45g，K-2的转pCAMBIA1300水稻植株的T2代种子长度为7.34±0.14mm、种子宽度为3.32±0.12mm、千粒重为24.05±0.52g。1-1、1-2和1-3的转pCAMBIA1300-GL2水稻植株的T2代种子长度、种子宽度和种子千粒重显著高于日本晴，k-1、K-2的转pCAMBIA1300-Flag水稻植株的T2代种子长度、种子宽度和种子千粒重和日本晴没有显著差异。
说明提高水稻中GL2基因表达量时能够使水稻的粒长、粒宽和粒重出现明显增加，且GL2基因表达量与籽粒大小成正相关关系（图6）。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a）或b）的蛋白质：
a）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子植物粒重和/或粒长和/或粒宽相关的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B7）中的任一种：
B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6）降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；
B7）含有B6）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是SEQ ID No.1的第88-1272位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是SEQ ID No.3的第2606-6327位所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述相关生物材料的下述C1-C8中的应用：
C1、在调控种子植物粒重和粒长和粒宽中的应用；
C2、在调控所述种子植物粒重和粒长中的应用；
C3、在调控所述种子植物粒重和粒宽中的应用；
C4、在调控所述种子植物粒重中的应用；
C5、在调控所述种子植物粒长和粒宽中的应用；
C6、在调控所述种子植物粒长中的应用；
C7、在调控所述种子植物粒宽中的应用；
C8、在调控所述种子植物品质中的应用。
5.一种培育具有D1-D8性状的转基因种子植物的方法，包括向受体种子植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到具有所述D1-D8性状的转基因种子植物的步骤：
D1、粒重和粒长和粒宽均高于所述受体种子植物；
D2、粒重和粒长均高于所述受体种子植物；
D3、粒重和粒宽均高于所述受体种子植物；
D4、粒重高于所述受体种子植物；
D5、粒长和粒宽均高于所述受体种子植物；
D6、粒长高于所述受体种子植物；
D7、粒宽高于所述受体种子植物；
D8、外观品质高于所述受体种子植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述受体植物为水稻。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因为1）-4）中任一种：
1）其编码序列是SEQ ID No.1的第88-1272位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是SEQ ID No.3的第2606-6327位所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
8.根据权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因通过含有所述蛋白质的编码基因的表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中；所述表达盒中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子是包括来源于植物自身或其他生物或人工合成启动子。
9.根据权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因通过含有所述蛋白质的编码基因的表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中；所述表达盒中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子是如下E1）、E2）或E3）的DNA分子：
E1）核苷酸序列是SEQ ID No.3的第7-2605位的DNA分子；
E2）与E1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
E3）在高严谨条件下与E1）或E2）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
10.扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子片段的引物对；所述核酸分子片段包括SEQ ID No.2的第163位氨基酸残基的密码子的第一位和第二位核苷酸，或所述核酸分子片段包括SEQ ID No.2的第2位氨基酸残基的密码子的第一位核苷酸。
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