CN104667279B

CN104667279B - 减少毒性的甲氨蝶呤佐剂及其使用方法

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Publication number: CN104667279B
Application number: CN201510004073.2A
Authority: CN
Inventors: W.加兰; B.弗伦策尔; T.卡格; T.威基; J.克诺佩尔斯基
Original assignee: Tosk Inc; University of California San Diego UCSD
Current assignee: Tosk Inc
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2029-03-02
Also published as: JP2011513415A; US20150072945A1; AU2009223453A2; JP5504179B2; WO2009114325A4; USRE48253E1; CA2729613A1; CN102014919B; IL207928A; HK1156526A1; CN102014919A; US9382287B2; EP2265274A2; WO2009114325A2; US7998967B2; US20110319419A1; WO2009114325A3; EP2265274A4; US20090325969A1; AU2009223453A1

Abstract

提供使用甲氨蝶呤(MTX)活性药物的方法，其中观察到减少的宿主毒性。这些方法的方面包括联合给予患者有效量的MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂，例如2,2'‑脱水嘧啶，其衍生物或尿苷磷酸化酶抑制剂。还提供用于实施本发明实施方案的组合物和药剂盒。这些方法和组合物具有包括治疗多种不同疾病状态在内的多种用途。

Description

减少毒性的甲氨蝶呤佐剂及其使用方法

相关申请的相互参考

按照35U.S.C.§119(e)，本申请要求2008年3月3日提交的美国专利临时申请序列号61/033,333提交日的优先权；该申请的公开内容通过引用结合到本文中。

导言

存在于细胞中的四氢叶酸(THFs)提供重要的维持生命过程的作用，例如生物合成、DNA和RNA的复制和修复。THFs通过提供完成促使这些过程的生物化学反应所需要的底物而完成该功能。在细胞内，通过二氢叶酸还原酶(DHFR)或其它二氢叶酸中间体还原叶酸，而生物合成THFs。蝶啶化合物：甲氨蝶呤(MTX；N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)的结构与叶酸相似(参见以下叶酸和MTX的结构)。

因此，MTX可与DHFR上的活性位点结合，并可通过竞争性抑制阻断THFs的形成，胸苷核苷(nucleoside thymidine)的更新合成需要THFs，DNA合成需要胸苷核苷。嘌呤碱合成也需要叶酸，所以所有的嘌呤合成将被抑制。因此，甲氨蝶呤抑制DNA、RNA、胸苷酸(thymidylates)和蛋白的合成，利用MTX抑制核酸合成的能力治疗畸形细胞生长已有50年历史((Jolivet et al.，N Engl J Med；309：1094-1104(1983)；Gangjee，Anti-CancerAgents in Medicinal Chemistry；7：524-542(2007)；Assaraf，Metastasis Review；26：153-181(2007)；Huennekens；Advanced Enzyme Regulation；34：397-419(1994)；Walling，Investigational New Drugs；24：37-77(2006)；Gangjee，Jain，Hiteshkumar，CurrentMedicinal Chemistry；4：405-410(2004))。尤其是，恶性细胞通常对THFs的需求量比正常细胞更大，因为它们增殖更快，因此对MTX的作用更敏感。在许多情况下，可用MTX选择性消弱癌细胞生长而不破坏正常细胞生长。由于其抗快速增殖细胞的有效性，MTX是最广泛使用的适应症为治疗实体瘤和血癌的抗癌药物中的一种。例如，单独用MTX或与其它治疗方法联合治疗肿瘤性疾病例如妊娠绒毛膜癌、恶性葡萄胎、水泡状胎块、白血病(例如急性淋巴细胞白血病)、乳腺癌、头和颈表皮样瘤、晚期蕈样肉芽肿病(皮肤T细胞淋巴瘤)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤；和滋养层肿瘤(trophoblastic neoplasms)例如绒毛膜癌、恶性葡萄胎、水泡状胎块(Physicians Desk Reference，第60版，Thomson Healthcare，Stamford，CT(2006)；Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第11版，McGraw-HillColumbus，OH(2005)；The Merck Manual of Diagnosis and Therapy第18版，John Wiley，Hoboken，NJ，(2006))。

另外，MTX为有效免疫抑制剂，其可用于防止由组织移植物导致的移植物抗宿主病，和用于治疗炎性疾病例如银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎和克罗恩氏病(Kokuryo)。MTX经常用于治疗银屑病和类风湿性关节炎的严重和伤残病例(Warren etal.，Br.J.Dermatology，153(5)，869-873(2005)；Cronstein，Pharmacol.Rev.，57(2)，163-172(2005))。

已颁布的公开MTX和MTX类似物、合成MTX或其类似物的方法和MTX用途的许多专利证明MTX在治疗畸形细胞生长中的重要性。例如，美国专利号2,512,572包含了活性剂MTX，美国专利号3,892,801、3,989,703、4,057,548、4,067,867、4,079,056、4,080,325、4,136,101、4,224,446、4,306,064、4,374,987、4,421,913和4,767,859要求制备MTX或在MTX合成中的潜在中间体的制备方法的权利。其它专利公开了标记的MTX类似物，例如美国专利号3,981,983、4,043,759、4,093,607、4,279,992、4,376,767、4,401,592、4,489,065、4,622,218、4,625,014、4,638,045、4,671,958、4,699,784、4,785,080、4,816,395、4,886,780、4,918,165、4,925,662、4,939,240、4,983,586、4,997,913、5,024,998、5,028,697、5,030,719、5,057,313、5,059,413、5,082,928、5,106,950和5,108,987，其中MTX与放射性核素或荧光标记、氨基酸、多肽、转铁蛋白或血浆铜蓝蛋白、软骨素或硫酸软骨素、抗体结合；或用于MTX测定、MTX定时释放的靶细胞的特异性细胞-表面受体的结合伴侣结合，作为对癌细胞有选择性的毒素，或促使MTX跨膜或通过体内屏障转运。

在颁布的公开MTX用法的许多专利中，多个专利例如美国专利号4,106,488、4,558,690和4,662,359公开了用MTX治疗癌症的方法。

遗憾的是，由于MTX疗法的有效性和广泛应用，用该药治疗患者涉及具有显著风险的严重副作用。因为MTX干扰细胞复制和分裂，主动增生，非癌组织例如肠粘膜和骨髓对MTX敏感，可证明因MTX治疗而消弱生长。当使用通常为得到最大效力需要的“大剂量方案”时，MTX和甲氨蝶呤的代谢物7-OH-MTX还与肾和肝毒性有关(Barak et al.，J.AmericanColl.Nutr.，3，93-96(1984)；Yazici et al.，J. Rheumatol.29(8)，1586-1589(2002))。

肠胃粘膜损伤是MTX的最大的损伤性副作用。被称为粘膜炎的这种并发症可在口腔或消化道的任何其它部分发生((Sonis et al.，Cancer，100：1995-2025(2004))。对患者尤其麻烦的一种类型的粘膜炎是口腔炎、口腔粘膜溃疡、一种使进食和吞咽痛苦和困难的病症。

粘膜炎使接受化疗的癌症患者的生活质量下降，同时增加他们住院风险(Naiduet al.Neoplasia，6：423-31(2004))。它也可导致严重的细菌感染(Pico et al.，Oncologist 3：446-451(1998)和McGuire，Support Care Cancer，11：435-41(2003))，经常导致需要使用饲管(Treister and Sonis，Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg.；15：123-9(2007))。这些并发症经常导致减少化疗剂量或完全中断化疗，因而减少化疗的效力(Sonis et al.，Cancer.100：1995-2025(2004))。因粘膜炎需要增加医疗处理又导致增加花费(Scully，Sonis，Diz，Oral Dis.；12：229-41(2006))。没有对粘膜炎的有效预防或治疗的方法(Sonis et al.，Rev Cancer.4：277-284(2004)。因此，减轻化疗引起的粘膜炎的佐剂可改善患者的生活质量和预后，同时减少癌症治疗的经济负担。

概述

提供在宿主中用佐剂减少甲氨蝶呤(MTX)的毒性的方法。在本方法中，将有效量的MTX活性药物联合本发明MTX毒性减少佐剂给予宿主，其中可将MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂序贯给予，先给予MTX药物或毒性减少佐剂，同时给予，或给予其组合。在一些实施方案中，MTX毒性减少佐剂为2，2′-脱水嘧啶、其衍生物，或尿苷磷酸化酶(UPase)抑制剂。还提供用于实施本方法的组合物，例如具有减少的毒性的MTX药用组合物和含所述组合物的药剂盒。本方法和组合物具有多种不同用途，包括治疗多种不同疾病状态。说明本发明方法和组合物的重要特点的示例性用途是减少MTX引起的粘膜炎。

附图简述

图1描绘的是依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在果蝇中降低MTX毒性的能力的一组结果(生存力)。在该研究中，将果蝇(Drosophilamelanogaster)卵(50卵/瓶)用0.005mg TK-112690+0.4mg MTX(第1组)、0.01mg TK-112690+0.4mgMTX(第2组)、0.04mg TK-112690+0.4mg MTX(第3组)、0.1mgTK-112690+0.4mg MTX(第4组)、0.4mg MTX单独(第5组)或盐水空白(第6组)处理。在每个剂量组中取2瓶卵，评价存活力(活蝇+蛹)。

图2描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在哺乳动物中减少MTX引起体重下降的一组数据。第1天，给予C57BL/6小鼠(10只动物/处理组)LPS(5μg，i.p.)。第2天，在MTX处理前3h和处理后3h，将动物用200mg/kg MTX+10或30mg/kg TK-112690处理。第3天，给予动物MTX 100mg/kg+10或30mg/kg TK±3hr。第8天，测定第8天-第1天体重的差，结果用ANOVA分析。第1组＝单独盐水，第2组＝单独MTX，第3组＝单独LPS，第4组＝MTX+LPS，第5组＝10mg/kgTK-112690+MTX+LPS或第6组＝30mg/kg TK-112690+MTX+LPS。

图3描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在哺乳动物中减轻MTX引起的粘膜通透性损失的能力的一组数据。在第2、3和4天，将C57BI/6雌性小鼠(n＝7)用100mg/kg MTX经腹膜内(ip)处理，在注射MTX前3小时或后3小时，用或不用60mg/kg TK-112690(ip)处理。第7天，通过测量经口给予的碘克沙醇的血浆浓度评价粘膜屏障损伤，碘克沙醇的血浆浓度通过HPLC用UV检测(具有最小和最大值(黑线)的框图(Boxplots)。经口给予的碘克沙醇未被吸收，不存在粘膜通透性增加。第1组＝盐水对照，第2组＝MTX，第3组＝MTX+TK-112690。

图4描绘的是通过测量升高的WBC浓度证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在哺乳动物中减轻MTX引起的感染的能力的一组数据。在第1、2、3、4、6和8天，将C57BL/6小鼠(n＝10/剂量组)用50mg/kgMTX i.p.和60mg/kg TK-112690i.p.联合处理(在3h±MTX处理前或后)，然后在未用MTX处理的天数中用单日剂量TK-112690处理。第11天，将动物处死，将得到的血液进行血液学分析。第1组＝盐水对照，第2组＝MTX对照，第3组＝MTX+TK-112690。

图5描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在人急性T细胞成淋巴细胞白血病细胞(体外生长)中不干扰MTX细胞毒性的一组数据。在该研究中，将购自ATCC的CCRF-CEM细胞培养，然后将含约10⁶细胞的12支试管用培养基(第1组)、MTX 0.03μM(第2组)、MTX+甲酰四氢叶酸1μM(第3组)、MTX+甲酰四氢叶酸10μM(第4组)、MTX+甲酰四氢叶酸100μM(第5组)、MTX+TK-1126901μM(第6组)、MTX+TK-11269010μM(第7组)和MTX₊TK-112690100μM(第8组)处理72小时。单独甲酰四氢叶酸和单独TK-112690试验与对照(第1组)相比在统计学上无差异。按alamarBlue吸光度下降百分率测量存活力。

图6描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在移植到哺乳动物的人淋巴瘤细胞(体外生长)中不干扰MTX细胞毒性的一组数据。在该研究中，将n＝10SCID小鼠/剂量组用CCRF-CEM人肿瘤处理，让肿瘤生长至约100mg大小。然后通过腹膜内(ip)注射对照20％DMSO/80％PBS(1x/天)x5天(第1天)、MTX 7.5mg/kg/注射(1x/天)x5天(第2组)或MTX 7.5mg/kg/注射(1x/天)x5天+TK-11269030mg/kg/注射±3h(第3组)处理动物。该图提供在该研究的第27天3组中各组的肿瘤大小。

图7描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在人淋巴瘤细胞(体外生长)中不干扰MTX细胞毒性的一组数据。在该研究中，使AS283细胞在补充L-谷氨酰胺二肽、丙酮酸钠、HEPES和10％FBS的RPMI-1640中生长。按10,000细胞/孔，总体积50μl，使用AS283细胞接种到3块96孔板中。在单独培养基孔中接种100μl培养基。将板温育过夜。次日，将25μl TK-112690和MTX储备液加入合适的孔中。向所有的孔中依次加入TK-112690、MTX。将25μl媒介加入单独TK-112690孔中。将25μl媒介和25μl培养基加入媒介对照孔中，将50μl培养基加入细胞对照孔中。用CellTiter-Glo测量细胞存活力，用DOX(10μM)作为参照标准。将板在37℃下，5％CO₂中培养72小时，然后从培养箱中取出，于室温下在工作台上放置30分钟。不振摇或振摇板。加入100μlCellTiter Gio试剂，并混合2分钟，然后在室温下再培养10分钟。在TriLux上记录荧光。在该研究中，MTX对AS283癌细胞有细胞毒性，但TK-112690(1、10、100μM)不降低MTX(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10、100μM)的细胞毒性。在图7中，图的上部提供用MTX或MTX+100和10μM浓度的TK-112690处理AS283人淋巴瘤细胞72小时后的IC₅₀曲线(上图)，而下图提供MTX和MTX+TK-1126901.0μM的IC₅₀曲线。

图8描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂在移植到哺乳动物中的人淋巴瘤细胞(体内生长)中不干扰MTX细胞毒性的一组数据。将AS283人淋巴瘤碎片移植到6周龄雄性SCID小鼠中。在处理开始前，让肿瘤达到75-198mg重(75-198mm³大小)。该实验由2个处理组和1个媒介处理对照组组成，每组10只动物，在第1天处理时有总计30只小鼠。

按30mg/kg/注射剂量，通过ip注射[每2天2次，每隔6小时1次，总计注射5次(q6hx2，q2dx5)]给予TK-112690。注射TK-112690后3小时，按剂量5.0mg/kg/注射，通过ip注射q2dx5给予MTX。按照相应的化合物给药方案，将对照组用两种媒介处理。

从首次处理之日起，测量皮下(sc)肿瘤，并每周称量动物体重3次。肿瘤移植21天后，终止研究。媒介处理对照组中所有10只小鼠中的肿瘤均长至评价点。在21天内，肿瘤中值达到4,387mg。MTX处理使异种移植的AS283淋巴瘤生长延缓，在第21天，肿瘤重量中值为对照组的2.8％，肿瘤重量中值(40.0mg)为处理开始时肿瘤重量中值(162mg)的24.7％。联合给予TK-112690和MTX延缓生长，第21天，肿瘤重量中值为对照组的3.5％，且肿瘤重量中值(9.0mg)为处理开始时肿瘤重量中值(162mg)的5.6％。MTX(第2组)与MTX+TK-112690(第3组)肿瘤体积之间在统计学上无差异(p＝1.0)，但两组均与盐水处理动物(第1组)的肿瘤体积统计学上存在高度差异(p＜0.01)。用Bonferroni单向ANOVA分析，接受MTX的两组在统计学上相同。框图显示中值组(黑线)、四分位数间距(方框)和异常值。

图9描绘的是证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂抑制鼠科动物和人尿苷磷酸化酶(UPase)的一组数据。通过小鼠和人小肠UPase酶体外抑制，研究了TK-112690阻止尿苷代谢分解的能力的剂量范围。通过HPLC分析，用UV检测尿嘧啶浓度测定UPase活性(UPase使尿苷分解代谢为尿嘧啶和核糖-1-磷酸)。由均化的小鼠和人小肠组织制备UPase酶物质。将TK-112690溶于水(50mg/ml)，并在含5mM尿苷、0.01MTris、0.01M磷酸盐、1mM EDTA和1mM DTT的水溶液中分析UPase抑制。在37℃下，在pH 7.3中进行反应。

由尿嘧啶测量值确定TK-11260对小鼠和人UPase的抑制，通过反相HPLC，用UV检测测定匀浆中尿嘧啶的浓度。结果证明，TK-112690抑制小鼠小肠UPase酶，其IC₅₀值为12.5μM。TK-112690抑制人小肠UPase酶，其IC₅₀值为20.0μM。

图10描绘的是进一步证明依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂为尿苷磷酸化酶(UPase)抑制剂。使敲除UPase的果蝇(Drosophilamelanogaster)的胚胎(19519)经口暴露于含一定剂量范围的MTX剂量的食物混合物。使野生型胚胎(Oregon-R)经口暴露于含和不舍0.04mg TK-112690的相同剂量范围的MTX。开始暴露MTX 15天后，按存活或死亡评分。看到敲除UPase的果蝇(D.melanogaster)(19519)耐受经口给予的一定剂量范围(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg)的MTX的致命作用。野生型果蝇(D.melanogaster)对≥0.1mg MTX的致命作用敏感。野生型果蝇(D.melanogaster)耐受经口给予的含0.04mg TK-112690的一定剂量范围(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg)的MTX的致命作用。

如图10所示，开始暴露MTX 15天后，≥0.1mg的甲氨蝶呤剂量导致野生型果蝇致死。通过加入0.04mg TK-112690抑制UPase活性提供防止剂量高达0.4mg甲氨蝶呤导致的死亡。给予UPase突变果蝇一定剂量范围的甲氨蝶呤显示相似的防止在联合给予甲氨蝶呤和TK-112690的野生型果蝇中看到的甲氨蝶呤致命性。另外，将TK-112690加入用一定剂量范围的甲氨蝶呤处理的UPase突变果蝇中，不增加防甲氨蝶呤毒性的保护作用。

图11描绘的是证明给予小鼠依据本发明的实施方案TK-112690：2，2′-脱水嘧啶MTX毒性减少佐剂后增加尿苷浓度的一组数据。在该研究中，向CD-1雌性小鼠ip注射120mg/kg TK-112690，通过HPLC，用UV检测分析动物血浆中TK-112690和尿苷。用UV检测，通过HPLC测定注射TK-112690后0.08、0.50、1、2、4或12小时采集的血浆样品中尿苷和TK-112690的浓度。血浆TK-112690浓度随经ip给予的TK-112690剂量增加而增加。注意到给予TK-112690后，血浆尿苷几乎立即升高。给予TK-112690后0.5小时，100μg/mL血浆TK-112690浓度与约2μg/mL尿苷的血浆尿苷浓度相关(基础尿苷浓度约0.5μg/mL)。正如所料，通过TK-112690抑制UPase导致血浆尿苷升高。

定义

当描述化合物、含此类化合物的药用组合物和此类化合物和组合物的使用方法时，除另有说明外，以下术语具有以下含义。还应理解，以下提出的定义的任何部分可被多个取代基取代，在它们的范围内，相应定义意欲包括此类取代的部分。

“酰基”是指基团-C(O)R，其中按本文定义，R为氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂烷基或杂芳基。代表性实例包括但不限于甲酰基、乙酰基、环己基羰基、环己基甲基羰基、苯甲酰基、苄基羰基等。

“酰基氨基”是指基团-NR’C(O)R，其中按本文定义，R′为氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基，而R为氢、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳基或杂芳基烷基。代表性实例包括但不限于甲酰基氨基、乙酰基氨基、环己基羰基氨基、环己基甲基-羰基氨基、苯甲酰基氨基、苄基羰基氨基等。

“酰氧基”是指基团-OC(O)H、-OC(O)-烷基、-OC(O)-芳基或-OC(O)-环烷基。

“脂族”是指特征在于组成碳原子的直链、支链或环状排列且不存在芳族不饱和键的烃基有机化合物或基团。脂族基团包括但不限于烷基、亚烷基、烯基、炔基和亚炔基。脂族基团通常具有1或2至6或12个碳原子。

“烯基”是指具有至多约11个碳原子，尤其是2-8个碳原子，更尤其是2-6个碳原子的单价烯属不饱和烃基，该烃基可为直链或支链且具有至少1个，尤其是1-2个烯属不饱和位点。特定的烯基包括乙烯基(-CH＝CH₂)、正丙烯基(-CH₂CH＝CH₂)、异丙烯基(-C(CH₃)＝CH₂)、乙烯基和取代的乙烯基等。

“烷氧基”是指基团-O-烷基。特定的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1，2-二甲基丁氧基等。

“烷氧基羰基”是指基团-C(O)-烷氧基，其中烷氧基定义同本文。

“烷氧基羰基氨基”是指基团-NRC(O)OR′，其中R为氢、烷基、芳基或环烷基，R′为烷基或环烷基。

“烷基”是指具有高达约12或18个碳原子的单价饱和烃基，更尤其是具有1-8个碳原子，甚至更尤其是具有1-6个碳原子的低级烷基。烃链可为直链或支链。可通过基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正辛基、叔辛基等举例说明该术语。术语“烷基”还包括如本文中定义的“环烷基”。

“亚烷基”是指尤其具有高达约12或18个碳原子，更尤其是1-6个碳原子的二价饱和脂族烃基，该烃基可为直链或支链。通过基团例如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、亚丙基异构体(例如-CH₂CH₂CH₂-和-CH(CH₃)CH₂-)举例说明该术语。

“炔基”是指尤其具有高达约12或18个碳原子，更尤其是2-6个碳原子的炔属不饱和烃基，该烃基可为直链或支链并具有至少1个，且尤其是1-2个炔基不饱和位点。炔基的特定非限制性实例包括炔属基团、乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH₂C≡CH)等。

“氨基”是指基团-NH₂。

“氨基酸”是指任何自然产生的D、L或DL形式的氨基酸(例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)。本领域中已知自然产生的氨基酸的侧链，它们包括例如氢(例如在甘氨酸中)、烷基(例如在丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)、取代的烷基(例如在苏氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和赖氨酸中)、烷芳基(例如在苯丙氨酸和色氨酸中)、取代的芳基烷基(例如在酪氨酸中)和杂芳基烷基(例如在组氨酸中)。

“氨基羰基”是指基团-C(O)NRR，其中各R独立为氢、烷基、芳基或环烷基，或其中R基团被连接形成亚烷基。

“氨基羰基氨基”是指基团-NRC(O)NRR，其中各R独立为氢、烷基、芳基或环烷基，或其中两个R基团连接形成亚烷基。

“氨基羰氧基”是指基团-OC(O)NRR，其中各R独立为氢、烷基、芳基或环烷基，或其中个R基团被连接形成亚烷基。

“含氨基的糖基”是指具有氨基取代基的糖基。代表性的含氨基的糖包括L-万古糖胺(vancosamine)、3-脱甲基-万古糖胺、3-表-万古糖胺、4-表-万古糖胺、acosamine、actinosamine、柔糖胺(daunosamine)、3-表-柔糖胺、利托糖胺(ristosamine)、N-甲基-D-葡糖胺等。

“芳烷基”或“芳基烷基”是指被一个或多个以上定义的芳基取代的以上定义的烷基。

“芳基”是指通过除去母体芳族环系统的单个碳原子上的一个氢原子衍生的单价芳族烃基。典型的芳基包括但不限于由以下化合物衍生的基团：醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯(acenaphthylene)、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、奥(azulene)、苯、屈(chrysene)、晕苯、荧蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、二氢化茚、茚、萘、octacene、octaphene、艾氏剂(octalene)、卵苯、戊-2，4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬、(perylene)、非那烯(phenalene)、菲、(picene)、七曜烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉红省、苯并菲、联三萘(trinaphthalene)等。尤其是，芳基含6-14个碳原子。

“芳氧基”是指-O-芳基，其中“芳基”定义同本文。

“自身免疫疾病”或“自体免疫病症”是指当身体组织被其本身免疫系统攻击时发生的疾病。自身免疫疾病或病症的实例包括多发性硬化、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、关节炎、银屑病、贝切特氏病和银屑病性关节炎。

“叠氮基”是指基团-N₃。

“碳水化合物”表示单糖、双糖、三糖或多糖，其中多糖的分子量可高达约20,000，例如羟丙基-甲基纤维素或壳聚糖。“碳水化合物”还包括糖部分的任何原子例如通过苷元碳原子与脱水嘧啶(例如脱水胸苷或脱水尿苷)共价连接的氧化、还原或取代的糖单基团或其衍生物。“单糖、双糖、三糖或多糖”也可包括含氨基的糖基团。作为说明，代表性“碳水化合物”包括己糖例如D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、万古糖胺、3-去甲基-万古糖胺、3-表-万古糖胺、4-表-万古糖胺、acosamine、actinosamine、柔糖胺、3-表-柔糖胺、利托糖胺、D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、N-乙酰基-D-葡糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺、唾液酸、艾杜糖醛酸、L-果糖等；戊糖例如D-核糖或D-阿拉伯糖；酮糖例如D-核酮糖或D-果糖；双糖例如2-O-(α-L-万古糖胺基(vancosaminyl))-β-D-吡喃葡糖-、2-O-(3-脱甲基-α-L-万古糖胺基)-β-D-吡喃葡糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖；衍生物例如乙缩醛；胺；酰化、硫酸化和磷酸化糖；具有2-10个糖单元的寡糖。糖可为其开环、r吡喃糖或呋喃糖形式。

“羧基”是指基团-C(O)OH。

“氰基”是指基团-CN。

“环烯基”是指具有3-10个碳原子并具有单环或多个缩合环和具有至少1个，尤其是1-2个烯属不饱和位点的环烃基，缩合环包括稠合和桥环系统。此类环烯基包括例如单环结构例如环己烯基、环戊烯基、环丙烯基等。

“环烷基”是指具有3-约10个碳原子并具有单环或多个缩合环的环烃基，缩合环包括稠合和桥环系统，该环烃基可任选被1-3个烷基取代。作为举例，此类环烷基包括单环结构例如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基、1-甲基环丙基、2-甲基环戊基、2-甲基环辛基等；和多环结构例如金刚烷基等。

“杂环烷基”是指含一个或多个独立选自N、O和S的杂原子的稳定的非芳族杂环和稠合环。稠合的杂环系统可包含碳环和仅需包含一个杂环。杂环的实例包括但不限于哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基和吗啉基。

“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。卤代基团可为氟或氯。

当用于描述化合物或描述存在于化合物上的基团时，“杂”表示该化合物或基团中的一个或多个碳原子被氮、氧或硫杂原子置换。杂可用于具有1-5，尤其是1-3个杂原子的上述任何烃基例如烷基例如杂烷基；环烷基例如杂环烷基；芳基例如杂芳基；环烯基例如杂环烯基；环杂烯基例如杂环杂烯基等。杂原子为除碳或氢以外的任何原子，且通常为但不限于氮、氧、硫、磷、硼、氯、溴或碘。未取代的杂原子是指侧(pendant)杂原子例如胺、羟基和硫醇。取代的杂原子是指侧杂原子以外的杂原子。

“杂芳基”是指通过除去母核杂芳环系统的单原子上的一个氢原子衍生的单价杂芳基。典型的杂芳基包括但不限于由以下化合物衍生的基团：吖啶、砷杂茚、咔唑、β-咔啉、苯并二氢吡喃、苯并吡喃、肉啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、二氢吲哚、中氮茚、异苯并呋喃(isobenzofuran)、异苯并吡喃(isochromene)、异吲哚(isoindole)、二氢异吲哚(isoindoline)、异喹啉、异噻唑、异唑、萘啶、二唑、唑、萘嵌间二氮杂苯、菲啶、菲咯啉、吩嗪、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯里嗪(pyrrolizine)、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻吩、三唑、呫吨等。杂芳基可为5-20元杂芳基，或5-10元杂芳基。特定的杂芳基是由以下化合物衍生的那些基团：噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、吡啶、喹啉、咪唑、唑和吡嗪。

“羟基”是指基团-OH。

“硝基”是指基团-NO₂。

“肽”是指含高达2、5、10或约100个氨基酸残基的聚氨基酸。

“多肽”表示约100个氨基酸单元-约1,000个氨基酸单元，约100个氨基酸单元-约750个氨基酸单元，或约100个氨基酸单元-约500个氨基酸单元的聚氨基酸。

“增殖性疾病”或“增殖性病症”是指特征为基础病理的病理性增长(pathologicgrowth as an underlying pathology)的疾病或病症。实例包括癌症、关节炎和银屑病。

“副作用”表示给予药物的不需要的不利结果，例如与给予甲氨蝶呤相关的粘膜炎。

与给出的化合物相关的“立体异构体”在本领域中熟知，并且指具有相同分子式的另一种化合物，其中组成其它化合物的原子的空间取向的方式不同，但其中相对于与其它原子连接的原子，其它化合物的原子与给出化合物中的原子相同(例如对映体、非对映体或几何异构体)。参见例如Morrison and Boyd，Organic Chemistry，1983，第4版，Allyn andBacon，Inc.，Boston，MA，第123页。

“取代的”是指其中一个或多个氢原子各自独立被相同或不同取代基替代的基团。“取代的”基团尤其是指具有一或多个取代基例如1-5个取代基，且尤其是1-3个取代基的基团，所述基团选自酰基、酰基氨基、酰氧基、烷氧基、取代的烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基羰基氨基、氨基羰基氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、叠氮基、羧基、氰基、环烷基、取代的环烷基、卤素、羟基、亚氨酸基(imidate)、酮基、硝基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫酮基(thioketo)、硫氢基、烷硫基、(取代的烷基)硫基、芳硫基、(取代的芳基)硫基、烷基-S(O)-、芳基-S(O)-、烷基-S(O)₂-和芳基-S(O)₂。典型的取代基包括但不限于-X、-R⁸(前提是R⁸不为氢)、-O-、＝O、-OR⁸、-SR⁸、-S^-、＝S、-NR⁸R⁹、＝NR⁸、-CX₃、-CF₃、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO₂、＝N₂、-N₃、-S(O)₂O^-、-S(O)₂OH、-S(O)₂R⁸、-OS(O₂)O^-、-OS(O)₂R⁸、-P(O)(O-)₂、-P(O)(OR⁸)(O^-)、-OP(O)(OR⁸)(OR⁹)、-C(O)R⁸、-C(S)R⁸、-C(O)OR⁸、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)O^-、-C(S)OR⁸、-NR¹⁰C(O)NR⁸R⁹、-NR¹⁰C(S)NR⁸R⁹、-NR¹¹C(NR¹⁰)NR⁸R⁹和-C(NR¹⁰)NR⁸R⁹，其中各X独立为卤素。

“取代的氨基”包括从本文中“取代的”的定义中引用的那些基团，尤其是指基团-N(R)₂，其中各R独立选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、环烷基、取代的环烷基，和其中两个R基团连接形成亚烷基。

“硫代烷氧基”是指-S-烷基。

“硫代芳氧基”是指-S-芳基。

“硫酮基”是指基团＝S。

“硫氢基”是指基团-SH。

“尿苷磷酸化酶”是指酶学中的磷酸化酶(EC 2.4.2.3)，该酶催化化学反应：尿苷+磷酸→尿嘧啶+α-D-核糖1-磷酸。该酶的两个底物为尿苷和磷酸，而其两个产物为尿嘧啶和α-D-核糖1-磷酸。该酶属于糖基转移酶，尤其是戊糖基(pentosyltransferases)转移酶家族。该组酶的系统命名为尿苷：磷酸α-D-核糖基转移酶。通常使用的其它名称包括嘧啶磷酸化酶、UrdPase、UPH和UPase。该酶参与嘧啶代谢。

本领域普通技术人员会意识到，无论芳族还是非芳族，在稳定的化学上可行的杂环中的杂原子的最大数目由环的大小、杂原子的不饱和度和化学价决定。一般而言，只要杂芳环是化学上可行的和稳定的，则杂环可具有1-4个杂原子。

详述

提供在宿主中用佐剂减少甲氨蝶呤(MTX)毒性的方法。在本方法中，将有效量的MTX活性药物和本发明MTX毒性减少佐剂联合给予宿主，其中可按任何顺序序贯、同时或其组合给予MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂。还提供用于实施本方法的组合物，例如具有减少的毒性的MTX药用组合物和含该组合物的药剂盒。发现这些方法和组合物具有多种不同用途，它们包括治疗多种不同的疾病。

作为佐剂的脱水核苷减轻MTX的毒副作用的用途，和用于实施本方法的组合物和其它用途特别有价值。脱水核苷是天然核苷的类似物，通常用作合成核苷衍生物的中间体。它们的特征在于除具有N-糖苷键外还具有直接或通过位于糖的2′、3′或5′碳和碱的碳、氧或氮原子(糖苷键的氮除外)之间的桥联原子连接的共价键。脱水嘧啶的特征在于嘧啶碱，该嘧啶碱直接或通过糖的2′、3′或5′碳与嘧啶碱的碳、氧或氮原子(糖苷键的氮除外)之间的桥联原子共价连接。MTX毒性减少佐剂2，2′-脱水嘧啶及其衍生物特别有价值。

在更详细地描述本发明前，须理解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这样的实施方案当然可以变化。还须理解，本文中使用的术语仅为描述具体实施方案，并非为限制性的，因为本发明的范围仅受其所附的权利要求书的限制。

当提供数值范围时，须理解，除本文中另有明确说明外，在该范围上下限之间的各插入数值至下限单位的十分之一，和在该所述范围内的任何其它所述或插入的数值均包括在本发明范围内。这些较小范围的上限和下限可独立包括在该较小范围内，且也包括在本发明内，服从所述范围内任何特别排除的限制。当所述范围包括在这些限制中的一个或二者时，排除包括在那些限制中的任一或两个的限制的范围也包括在本发明中(rangesexcluding either or both of those included limits are also included in theinvention)。

本文中提供其中在数值前以术语“约”修饰的一定范围。本文中在精确数值前用术语“约”为精确数值提供文字上的支持，和为位于该术语之后的接近或近似该数值的数值提供文字上的支持。在确定一个数值是否接近或近似具体引用的数值时，接近或近似的未引用的数值可以是数值，在上下文中出现时，该数值提供与具体引用的数值基本上相等的值。

除另有定义外，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文中所述那些相似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验，但现在仅描述代表性的示例性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用结合到本文中，如同各个单独的出版物或专利被特别和分别地指定通过引用结合到本文中，和通过引用公开和描述的方法和/或材料结合所引用的出版物结合到本文中一样。所引用的任何出版物均在本申请提交日前公开，不应视为这些出版物因在先发明的原因而本发明无权居于这种公布之先的认可。另外，提供的公布日可不同于可能需要独立确认的实际公布日。

注意，除上下文中另有明确说明外，在本文和在所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。还要注意，可草拟权利要求书，以排除任何任选的要素。同样，可意欲使该表述用作结合所要求保护的要素的引述使用这种排除性术语如“唯一”、“仅”等或使用“否定性”限制的前提基础。

如本领域技术人员阅读本公开后显而易见的那样，本文中所述和说明的各实施方案的每一个具有独立成分和特征，在不偏离本发明范围或实质的前提下，这些成分和特征可容易与任何其它几种实施方案的特征分离或结合。可按描述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序实施任何描述的方法。

在进一步描述本发明时，首先更详细地描述本发明方法，然后给出可用于本发明方法的各种组合物例如制剂和药剂盒的综述；和其中应用本发明方法和组合物的各种代表性应用的论述。

方法

如同以上概述的，本发明提供给予有需要的患者MTX活性药物的方法，例如用于治疗患有可通过MTX活性药物治疗的疾病或病症的宿主(如以下更详细描述的)。本发明方法的一个方面为将MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂联合给予患者。在一些实施方案中，MTX毒性减少佐剂为2，2′-脱水嘧啶，例如2，2′-脱水尿苷或其类似物/衍生物。“联合”表示在从同时至给予MTX活性药物前或后至多5小时或更长例如10小时、15小时、20小时或更长的任何时间点给予一定量的MTX毒性减少佐剂。在一些实施方案中，序贯给予MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂，例如其中在给予MTX毒性减少佐剂前或后给予MTX活性药物。在又其它实施方案中，将MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂同时给予，例如其中将作为两种分离制剂的MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂同时给予，或将它们结合到单一组合物中，将该组合物给予患者。无论按上述序贯还是同时或其任何有效的其它形式给予MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂，一起或联合给予所述药物均可视为本发明目的。两种药物的给药途径可不同，其中以下更详细地描述代表性的给药途径。

在本方法中，将有效量的MTX活性药物和有效量的MTX毒性减少佐剂联合给予有需要的宿主。“MTX活性药物”表示甲氨蝶呤或其类似物/衍生物。可存在于本组合物中的MTX及其类似物/衍生物包括但不限于在以下专利中描述的那些化合物：美国专利号2,512,572；3,892,801；3,989,703；4,057,548；4,067,867；4,079,056；4,080,325；4,136,101；4,224,446；4,306,064；4,374,987；4,421,913；4,767,859；3,981,983；4,043,759；4,093,607；4,279,992；4,376,767；4,401,592；4,489,065；4,622,218；4,625,014；4,638,045；4,671,958；4,699,784；4,785,080；4,816,395；4,886,780；4,918,165；4,925,662；4,939,240；4,983,586；4,997,913；5,024,998；5,028,697；5,030,719；5,057,313；5,059,413；5,082,928；5,106,950；5,108,987；4,106,488；4,558,690；4,662,359；4,396,601；4,497,796；5,043,270；5,166,149；5,292,731；5,354,753；5,382,582；5,698,556；5,728,692和5,958,928；它们的公开内容通过引用结合到本文中。

本发明的MTX活性药物包括给予MTX及其任何类似物/衍生物，当与依据本发明的毒性减少佐剂联合给予时，MTX及其任何类似物/衍生物的毒性减少。可用以下实验部分中使用的测定方法容易确定给出的MTX活性药物是否适用于本发明用途。通常，如果按以下实验部分所述，使用果蝇(Drosophila melanogaster)测定方法测定，MTX毒性减少佐剂减少其毒性2-10倍或更多，例如50倍或更多，有时100倍或更多，则MTX活性药物适用于本发明方法。在一些实施方案中，MTX活性药物为按以下实验部分中所述小鼠测定试验观察到的MTX毒性减少佐剂减少可观察的毒副作用的发生和/或强度的药物。

短语“MTX毒性减少佐剂”是指减少MTX活性药物的毒性的药物。重要的MTX毒性减少佐剂是用以下实验部分所述果蝇(Drosophila melanogaster)测定方法测得的使MTX活性药物的毒性减少2-10倍或更多，例如50倍或更多且包括100倍或更多的那些药物。在一些实施方案中，重要的MTX毒性减少佐剂是按以下实验部分中所述小鼠测定试验观察到的减少给出MTX活性药物的可观察的毒副作用的发生和/或强度的药物。依据一些本发明的毒性减少佐剂的实施方案的方面是按例如用以下实验部分中所述方案测定，基本上不减少MTX活性药物的细胞毒性的佐剂，在一些实施方案中，根本不影响MTX活性药物的细胞毒性的佐剂。

重要的MTX毒性减少佐剂为2，2′-脱水嘧啶及其衍生物。在某些实施方案中，2，2′-脱水嘧啶及其衍生物为式(I)化合物：

或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和前药形式，及其立体异构体；

其中：

各R¹、R²、R³和R⁴独立选自氢、取代或未取代的杂原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基、羟基、卤素、叠氮基、氨基、取代的氨基、碳水化合物、核酸、氨基酸、肽、染料、荧光团和多肽。

在一些实施方案中，化合物具有式(I)，R¹、R²、R³和R⁴独立为氢、羟基、杂原子、C₁-C₁₈烷基、C₁-C₁₈取代的烷基、C₁-C₁₈烯基、C₁-C₁₈酰基、氨基、取代的氨基，其中烷基、烯基或酰基为直链或支链的且任选被以下基团取代：羟基、酯基及其衍生物、羧基及其衍生物、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂原子，这些基团也可能包含在链中或与杂原子例如氮、氧和硫桥接。

重要的R¹组分的实例包括但不限于：氢；羟基；巯基(sulfyhydryl)；卤素例如氟、氯、溴或碘，和拟卤素例如1-5个碳的低级烷基例如甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-、丁基-、异丁基-、叔丁基-磺酰基；和戊磺酰基(pentasulfonyl)或芳基磺酰基例如苯、对甲苯、对硝基苯磺酰基；含1-20个碳的低级烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基等，低级烷基包括取代的低级烷基例如氨基甲基、羟基甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄氧基、亚氨酸酯(imidate)、烷硫基、(取代的烷基)硫基、芳硫基、(取代的芳基)硫基等；含1-20个碳的低级烯基例如乙烯基和取代的乙烯基、乙炔基和取代的乙炔基，其中取代的乙烯基或取代的乙炔基表示乙烯基或乙炔基的β位被卤素例如溴、氯、氟或碘取代，或被1-5个碳原子的烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等取代；或芳烷基例如苄基、对氯苄基、对硝基苄基等，或芳基例如苯基、对硝基苯基、对甲苯基、对茴香基、萘基(naphtyl)等；含1-20个碳的低级烷酰基(酰基)例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰、二十烷基(arachidyl)、stilligyl、棕榈酰基、油烯基、亚油烯酸基(linolenyl)、花生四烯酸基(arachidonyl)等；含1-20个碳的低级芳基例如苯基、对甲苯基、对氯苯基、对氨基苯基、对硝基苯基、对茴香基等；1-20个碳的低级芳酰基例如苯甲酰基和萘甲酰基，其中芳基还可被以下基团进一步取代：烷基、烷氧基、卤代或硝基部分，例如p-tolnoyl、对茴香酰、对氯苯甲酰基、对硝基苯甲酰基或2，4-二硝基苯甲酰基、五氟苯甲酰基等，或另一种芳酰基例如苄氧基苯甲酰基等；含1-20个碳的低级芳烷基例如苄基、二苯甲基、对氯苄基、间氯苄基、对硝基苄基、苄氧基苄基、五氟苄基等；氨基或含1-20个碳的烷基氨基例如单烷基-或单芳烷基氨基，例如甲氨基、乙氨基、丙氨基或苄氨基等；二烷基氨基例如二甲氨基、二乙氨基、二苄氨基、吡咯烷子基、哌啶子基或吗啉代(molpholino)等。

因此，在一些实施方案中，R¹为氢、羟基、巯基、氨基、取代的氨基、羟基甲基、单甲氧基、卤素、拟卤素或含1-20个原子的低级烃基(烃基可被取代或未被取代)。在特定实施方案中，R¹为低级烃基，所述烃基选自烷基、取代的烷基、烯基、烷酰基、芳基、芳酰基、芳烷基或烷基氨基。在特定实施方案中，R¹为被以下基团取代的低级烃基：烷氧基、取代的烷氧基、亚氨酸基(imidate)、芳硫基或(取代的芳基)-S-。在其它实施方案中，R¹为低级烷基，所述低级烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在其它实施方案中，R¹为低级烯基，所述低级烯基选自乙烯基、取代的乙烯基、乙炔基或取代的乙炔基。在其它实施方案中，R¹为低级烷酰基，所述低级烷酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰基、二十烷基、stilligyl、棕榈酰基、油烯基、亚油烯酸基、花生四烯酸基。在其它实施方案中，R¹为低级芳基，所述低级芳基选自苯基、对甲苯基、对氯苯基、对氨基苯基、对硝基苯基、对茴香基。在另外的其它实施方案中，R¹为选自苯甲酰基和萘甲酰基的低级芳酰基。在其它实施方案中，R¹为低级芳烷基，所述低级芳烷基选自苄基、二苯甲基、对氯苄基、间氯苄基、对硝基苄基、苄氧基苄基或五氟苄基。在某些其它实施方案中，R¹为低级烷基氨基，所述低级烷基氨基选自一烷基氨基、一芳烷基氨基、二烷基氨基、二芳烷基氨基和苄氨基。

本发明化合物包括但不限于式(I)化合物，其中R¹选自氢、氟、三氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-溴乙烯基、苯基、苄基、苯甲酰基、苄氧基苄基、苄氨基、烷氧基烷基、苄氧基烷基、亚氨酸基烷基酯基(imidatealkyl)、芳硫基和(取代的芳基)硫基。因此，在一些实施方案中，化合物具有式(I)，R¹为H、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苄基、苯甲酰基、苄氧基苄基、苄基-NH-、CH₃CH₂OCH₂、苄基-O-CH₂、CH₃OCH₂、CH₃C(NH)-O-CH₂或CH₃-苯基-O-CH₂。

重要的R²组分的实例包括但不限于：氢；羟基；巯基；卤素例如氟、氯、溴或碘，和拟卤素例如1-5个碳的低级烷基磺酰基例如甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-、丁基-、异丁基-、叔丁基-磺酰基和戊磺酰基；或芳基磺酰基例如苯、对甲苯、对硝基苯磺酰基；含1-20个碳的低级烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基等，所述低级烷基包括取代的低级烷基例如氨基甲基、羟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基等；含1-20个碳的低级烯基例如乙烯基和取代的乙烯基、乙炔基和取代的乙炔基，其中取代的乙烯基或取代的乙炔基表示乙烯基或乙炔基的β位被卤素例如溴、氯、氟或碘取代，或被1-5个碳原子的烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等取代；或芳烷基例如苄基、对氯苄基、对硝基苄基等，或芳基例如苯基、对硝基苯基、对甲苯基、对茴香基、萘基等；主链含1-20个碳的低级烷酰基(酰基)及其酯例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基，月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰基、二十烷基、stilligyl、棕榈酰基、油烯基、亚油烯酸基、花生四烯酸基等；含1-20个碳的低级芳基例如苯基、对甲苯基、对氯苯基、对氨基苯基、对硝基苯基、对茴香基等；含1-20个碳的低级芳酰基例如苯甲酰基和萘甲酰基，其中芳基还可被以下基团进一步取代：烷基、烷氧基、卤代或硝基部分例如p-tolnoyl、对茴香酰基、对氯苯甲酰基、对硝基苯甲酰基或2，4-二硝基苯甲酰基、五氟苯甲酰基等，或另一种芳酰基例如苄氧基苯甲酰基等；含1-20个碳的低级芳烷基例如苄基、二苯甲基、对氯苄基、间氯苄基、对硝基苄基、苄氧基苄基、五氟苄基等；含1-20个碳的低级芳氧基例如苯氧基(即O-苯基)、苄氧基(即O-苄基)、二苯甲氧基(即O-甲基二苯基(benzylhydryl))、对氯苄氧基(即O-(对氯苄基))、间氯苄氧基(即O-(间氯苄基))、对硝基苄氧基(即O-(对硝基苄基))、(4-苄氧基苄基)-氧基(即O-苄氧基苄基)或五氟苄氧基(即O-五氟苄基)；芳氧基的酯例如含1-20个碳的低级芳酰基氧基(即O-芳酰基)，例如苯甲酰氧基(即O-苯甲酰基)、二苯基乙酰氧基(即O-二苯基乙酰基)、对氯苯甲酰氧基(即O-(对氯苯甲酰基))、间氯苯甲酰氧基(即O-(间氯苯甲酰基))、对硝基苯甲酰氧基(即O-(对硝基苯甲酰基))、(4-苄氧基苯甲酰基)-氧基(即O-苄氧基苯甲酰基)或五氟苯甲酰氧基(即O-五氟苯甲酰基)；氨基或含1-20个碳的烷基氨基例如单烷基-单芳烷基氨基，例如甲氨基、乙氨基、丙氨基或苄氨基等；二烷基氨基例如二甲氨基、二乙氨基、二苄氨基、吡咯烷子基、哌啶子基或吗啉代等。

因此，在一些实施方案中，R²为氢、羟基、巯基、氨基、羟甲基、单甲氧基、卤素、拟卤素，或含1-20个原子的低级烃(所述烃可被取代或未被取代)及其酯。在特定实施方案中，R²为低级烃，所述烃选自烷基、烯基、烷酰基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳酰氧基、芳烷基或烷基氨基。在其它实施方案中，R²为低级烷基，所述低级烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在其它实施方案中，R²为低级烯基，所述低级烯基选自乙烯基、取代的乙烯基、乙炔基或取代的乙炔基。在其它实施方案中，R²为低级烷酰基，所述烷酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰基、二十烷基、stilligyl、棕榈酰基、油烯基、亚油烯酸基和花生四烯酸基。在其它实施方案中，R²为低级芳基，所述低级芳基选自苯基、对甲苯基、对氯苯基、对氨基苯基、对硝基苯基、对茴香基。在另外的其它实施方案中，R²为选自苯甲酰基和萘甲酰基的低级芳酰基。在其它实施方案中，R²为低级芳烷基，所述低级芳烷基选自苄基、二苯甲基、对氯苄基、间氯苄基、对硝基苄基、苄氧基苄基或五氟苄基。在其它实施方案中，R²为低级芳氧基，所述低级芳氧基选自苯氧基、苄氧基、二苯甲氧基、对氯苄氧基、间氯苄氧基、对硝基苄氧基、(4-苄氧基苄基)-氧基或五氟苄氧基。在其它实施方案中，R²为低级芳酰氧基，所述低级芳酰氧基选自苯甲酰氧基、二苯基乙酰氧基、对氯苯甲酰氧基、间氯苯甲酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、(4-苄氧基苯甲酰基)-氧基或五氟苯甲酰氧基。在某些其它实施方案中，R²为低级烷基氨基，所述低级烷基氨基选自单烷基氨基、单芳烷基氨基、二烷基氨基和二芳烷基氨基。因此，在一些实施方案中，R²不仅可为氢或羟基，也可为O-酰基、烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、O-烷基、O-亚烷基、O-炔基、O-芳烷基、O-芳基、O-芳氧基、O-碳水化合物、O-环烯基、O-环烷基、O-杂环烷基、O-杂芳基。另外，S可代替O。

重要的化合物包括但不限于式(I)化合物，其中R²选自氢、氟、三氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-溴乙烯基、苯基、苯氧基、苄基、苯甲酰基、苯甲酰氧基和苄氧基苄基。因此，在一些实施方案中，化合物具有式(I)，R²为H、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苯氧基、苄基、苯甲酰基、苯甲酰氧基或苄氧基苄基。

在特别重要的实施方案中，化合物具有式(I)，且R²为氢、羟基或连接O的取代基。该实施方案包括式(I)化合物，其中R²为H、OH或C₆H₅C(O)O。

重要的R³的实例包括但不限于：氢；羟基；叠氮基；巯基；卤素；拟卤素；含1-20个碳的低级烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基等，所述低级烷基包括取代的低级烷基例如氨基甲基、羟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基等；包括其酯在内的具有1-20个碳原子主链的低级烷酰基(酰基)例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰基、二十烷基、stilligyl、棕榈酰基、油烯基、亚油烯酸基、花生四烯酸基等；低级芳基例如苯基、对硝基苯基、对甲苯基、对茴香基、萘基等；1-20个碳的低级芳酰基(芳香酸的酰基)例如苯甲酰基和萘甲酰基，其中芳基还可被以下基团进一步取代：烷基、烷氧基、卤代、或硝基部分例如p-tolnoyl、对茴香酰基、对氯苯甲酰基、对硝基苯甲酰基或2，4-二硝基苯甲酰基、五氟苯甲酰基等；1-20个碳的低级芳氧基例如苯氧基、苄氧基、二苯甲氧基、对氯苄氧基、间氯苄氧基、对硝基苄氧基、(4-苄氧基苄基)-氧基或五氟苄氧基等；和芳氧基的酯，例如1-20碳低级芳酰氧基(O-芳酰基)例如苯甲酰氧基、二苯基乙酰氧基、对氯苯甲酰氧基、间氯苯甲酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、(4-苄氧基苯甲酰基)-氧基或五氟苯甲酰氧基等。R³也可为金刚烷酰基或取代的佥刚烷酰基。

因此，在一些实施方案中，R³为氢、羟基、叠氮基、巯基、羟甲基、卤素或拟卤素。在其它实施方案中，R³为低级烃，所述烃选自炕基、烷酰基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳酰氧基或芳烷基。在其它实施方案中，R³为低级烷基，所述烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在其它实施方案中，R³为低级烷酰基，所述烷酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基，己酰基、癸酰基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰基、二十烷基、stilligyl、棕榈酰基、油烯基、亚油烯酸基和花生四烯酸基。在其它实施方案中，R³为低级芳基，所述芳基选自苯基、对甲苯基、对氯苯基、对氨基苯基、对硝基苯基、对茴香基等。在其它实施方案中，R³为低级芳酰基，所述芳酰基选自苯甲酰基和萘甲酰基。在另外的其它一些实施方案中，R³为低级芳烷基，所述芳烷基选自苄基、二苯甲基、对氯苄基、间氯苄基、对硝基苄基、苄氧基苄基或五氟苄基。在其它实施方案中，R³为低级芳氧基，所述芳氧基选自苯氧基、苄氧基、二苯甲氧基、对氯苄氧基、间氯苄氧基、对硝基苄氧基、(4-苄氧基苄基)-氧基或五氟苄氧基。在其它实施方案中，R³为低级芳酰氧基，所述芳酰氧基选自苯甲酰氧基、二苯基乙酰氧基、对氯苯甲酰氧基、间氯苯甲酰氧基、对硝基苯甲酰氧基、(4-苄氧基苯甲酰基)-氧基或五氟苯甲酰氧基。因此，在一些实施方案中，R³不仅可为氢或羟基，也可为O-酰基、烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、O-烷基、O-亚烷基、O-炔基、O-芳烷基、O-芳基、O-芳氧基、O-碳水化合物、O-环烯基、O-环烷基、O-杂环烷基、O-杂芳基。另外，S还可代替O。

重要的化合物为式(I)化合物，其中R³为氢、羟基、卤素、叠氮基或连接O的取代基。所述化合物包括式(I)化合物，其中R³选自氢、羟基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、苯氧基、苄氧基、苯甲酰氧基和五氟苯甲酰氧基。因此，在一些实施方案中，化合物具有式(I)，且R³选自H、OH、CH₃CH₂CH₂CH₂O、(CH₃)₂CH₂CH₂O、(CH₃)₃CO、C₆H₅O、苯甲酰氧基和五氟苯甲酰氧基。

在特别重要的实施方案中，化合物具有式(I)，其中R³为H、OH、F、Cl、Br、I、N₃或C₆H₅C(O)O。其中R³为OH或O-酰基的式(I)化合物(例如酯例如C₆H₅C(O)O)具有特别价值。

R⁴的实例包括但不限于：氢；羟基；巯基；卤素例如氟、氯、溴或碘；氨基或低级烷基氨基。也可通过含酰基的低级烷基举例说明R⁴，其可为1-7个碳原子的低级炕酰基例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基等及其酯。因此，R⁴也可为芳酰基(及其酯例如连接O的芳酰基，即O-芳酰基或芳酰氧基)例如苯甲酰基和萘甲酰基，其中芳基还可被以下基团进一步取代：烷基、烷氧基、卤代或硝基部分例如p-tolnoyl、对茴香酰基、对氯苯甲酰基、对硝基苯甲酰基或2，4-二硝基苯甲酰基等。因此，在一些实施方案中，R⁴不仅可为氢或羟基，也可为O-酰基、烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、O-烷基、O-亚烷基、O-炔基、O-芳烷基、O-芳基、O-芳氧基、O-碳水化合物、O-环烯基、O-环烷基、O-杂环烷基、O-杂芳基。另外，S还可代替O。

因此，在一些实施方案中，R⁴为氢；羟基；巯基；卤素、氨基氨基甲基或氨基二甲基。在其它实施方案中，R⁴为低级烷基、酰基、芳酰基或芳酰氧基。这包括特别的实施方案，其中式(I)化合物为其中R⁴为氢、氟、羟基、氨基、氨基甲基、氨基二甲基、叔丁氧基、苯氧基或苯甲酰氧基的化合物(例如式(I)化合物，其中R⁴为H、F、OH、NH₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、(CH₃)₃CO、C₆H₅O或C₆H₅C(O)O)。

尤其有价值的化合物为那些式(I)化合物，其中R⁴为氢、羟基或连接O的取代基。在特别实施方案中，化合物具有式(I)，其中R⁴为H、OH或C₆H₅C(O)O。其中R⁴为OH或O-酰基的式(I)化合物(例如酯例如C₆H₅C(O)O)具有特殊价值。

其中：R¹为H、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苄基、苯甲酰基或苄氧基苄基，R²为H、OH、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苯氧基、苄基、苯甲酰基、苯甲酰氧基或苄氧基苄基，和其中R³和R⁴各自为羟基的式(I)化合物有价值。这些化合物包括以下化合物：2，2′-脱水尿苷；2，2′-脱水-5-氟尿苷；2，2′-脱水-5-三氟甲基尿苷；2，2′-脱水-5-甲基尿苷；2，2′-脱水-5-乙基尿苷；2，2′-脱水-5-丙基尿苷；2，2′-脱水-5-异丙基尿苷；2，2′-脱水-5-异丁基尿苷；2，2′-脱水-5-甲基酰基尿苷；2，2′-脱水-5-丙基酰基尿苷；2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；2，2′-脱水-5-苯基尿苷；2，2′-脱水-5-苄基尿苷；2，2′-脱水-5-苯甲酰基(benzyol)尿苷；和2，2′-脱水-5-(苄氧基苄基)-尿苷。2，2′-脱水-5-甲基尿苷或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和前药形式及其立体异构体具有特殊价值。

其它重要的化合物为式(I)化合物，其中：R¹为H、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苄基、苯甲酰基或苄氧基苄基，R²为H、OH、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、苯甲酰基、苯甲酰氧基或苄氧基苄基，和其中R³为羟基，和R⁴为苯甲酰氧基。这些化合物包括以下化合物：3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水尿瞢；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-氟尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-三氟甲基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-乙基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-异丙基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-O-脱水-5-异丁基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基酰基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基酰基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苄基尿苷；3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯甲酰基尿苷；和3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(苄氧基苄基)-尿苷。3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和前药形式及其立体异构体具有特别价值。

其中：R¹为H、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苄基、苯甲酰基或苄氧基苄基，R²为H、OH、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、苯甲酰基、苯甲酰氧基或苄氧基苄基，和其中R³为苯甲酰氧基，R⁴为羟基的式(I)化合物也有价值。这些化合物包括以下化合物：5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-氟尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-三氟甲基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-乙基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-异丙基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-O-脱水-5-异丁基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-叩基酰基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基酰基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苄基尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯甲酰基尿苷；和5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(苄氧基苄基)-尿苷。5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和前药形式及其立体异构体具有特别价值。

本发明的2，2′-脱水嘧啶化合物可包含在组合物中，此类组合物含单一立体异构体、立体异构体的混合物，及其可产生的作为互变异构体的平衡混合物的各种衍生物。例如，依据式(I)的2，2′-脱水嘧啶包含呋喃并(furano)环上的4个立体中心，该环包括α和β端基异构体，和L或D镜象构型。本发明的2，2′-脱水嘧啶化合物的立体异构体的实例为β-D-异构体、β-L-异构体、α-D-异构体和α-L-异构体，和互变异构体和包括α，β-D-异构体、α，β-L-异构体、α-DL-异构体和β-DL-异构体在内的混合物。因此在一个实施方案中，提供基本上由2，2′-脱水嘧啶的立体异构体组成的组合物，该立体异构体为β-D-异构体、β-L-异构体、α-D-异构体或α-L-异构体。在摩尔基础(molar basis)上显示改善的活性或对干扰MTX效力的专一性提高的立体异构体具有特殊价值。

尤其有重要的立体异构体包括：

1)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基(arabinofuranosyl))尿嘧啶；

2)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-氟尿嘧啶；

3)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三氟甲基尿嘧啶；

4)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿嘧啶；

5)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-乙基尿嘧啶；

6)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-正-丙基尿嘧啶；

7)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丙基尿嘧啶；

8)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丁基尿嘧啶；

9)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲酰基尿嘧啶；

10)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙酰基尿嘧啶；

11)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶；

12)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苯基尿嘧啶；

13)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苄基尿嘧啶；

14)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苯甲酰基尿嘧啶；和

15)2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(3-苄氧基苄基)尿嘧啶。

其它重要的立体异构体包括：

1)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶；

2)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-氟尿嘧啶；

3)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三氟甲基尿嘧啶；

4)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿嘧啶；

5)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-乙基尿嘧啶；

6)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-正丙基尿嘧啶；

7)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丙基尿嘧啶；

8)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丁基尿嘧啶；

9)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲酰基尿嘧啶；

10)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙基酰基尿嘧啶；

11)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶；

12)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苯基尿嘧啶；

13)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苄基尿嘧啶；

14)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苯甲酰基尿嘧啶；和

15)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(3-苄氧基苄基)尿嘧啶。

其它重要的立体异构体包括：

1)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶；

2)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-氟尿嘧啶；

3)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-三氟甲基尿嘧啶；

4)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿嘧啶；

5)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-乙基尿嘧啶；

6)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-正丙基尿嘧啶；

7)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丙基尿嘧啶；

8)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丁基尿嘧啶；

9)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲酰基尿嘧啶；

10)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙基酰基尿嘧啶；

11)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶；

12)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苯基尿嘧啶；

13)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苄基尿嘧啶；

14)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-苯甲酰基尿嘧啶；和

15)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(3-苯氧基苄基)尿嘧啶。

本发明的2，2′-脱水嘧啶及其立体异构体的其它类似物或衍生物的实例包括：3′-O-乙酰基-2，2′-脱水-5-丙基尿苷(3′-O-乙酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙基尿嘧啶)；和3′-O-乙酰基-2，2′-脱水-5-异丙基尿苷(3′-O-乙酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-异丙基尿嘧啶)；以及2，2′-脱水胞苷及其类似物和衍生物，其中立体异构体2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶是一个实例。

如上所述，尤其重要的立体异构体和各种2，2′-脱水嘧啶是在摩尔基础上显示提高的活性或不干扰MTX效力的提高的专一性的那些。为此目的，可通过对特别重要的化合物的基质进行比较容易选择此类化合物，例如在表1中举例说明的那些化合物(其中化合物具有式(I))。

如上所述，表I中的化合物为说明性而非限制性的。例如，R⁴不仅可为羟基，而且也可为O-酰基、烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、O-烷基、O-亚烷基、O-炔基、O-芳烷基、O-芳基、O-芳氧基、O-碳水化合物、O-环烯基、O-环烷基、O-杂环烷基、O-杂芳基。另外，S可代替O，结构元素的其它组合例如本文中所述和其它立体化学(streochemical)取向也是可能的。

在一些实施方案中，式(I)的2，2′-脱水嘧啶的酰基衍生物具有价值。因此，式(I)化合物包括那些化合物，其中R¹、R²、R³和R⁴定义同上，其中R²、R³和R⁴中的至少一个为酰基衍生物。“酰基衍生物”意指式(I)的2，2′-脱水嘧啶的衍生物，其中R²、R³和R⁴中的至少一个为可由羧酸得到的基本上无毒的有机酰基取代基，该羧酸通过酯键与式(I)的核糖或嘧啶环上的羟基连接。

式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物的酰基衍生物包括那些化合物，其中R¹定义同上，且R²、R³和R⁴各自独立为氢、羟基或酰基，前提是R²、R³和R⁴中的至少一个不为氢。在另一个实施方案中，2，2′-脱水嘧啶的酰基衍生物为式(I)化合物，其中R¹和R²定义同上，前提是R²不为氢，R³和R⁴各自独立为羟基或酰基。在一个实施方案中，2，2′-脱水嘧啶的酰基衍生物为式(I)化合物，其中R¹定义同上，R²为氢，且R³和R⁴各自独立为羟基或酰基。其中R¹为甲基，R²为氢，且R³和R⁴各自独立为羟基或酰基的式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物的酰基衍生物具有特别的价值。其中R¹为甲基，R²为氢，且R³和R⁴各自为酰基的式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物的酰基衍生物也是重要的。

一般而言，式(I)酰基衍生物的酯键可在生理条件下，在体外例如细胞基系统和/或在体内例如通过身体代谢被裂解。因此，在一些实施方案中，酰基为代谢物的基团。此类酰基取代基包括但不限于由以下酸衍生的那些取代基：乙酸、脂肪酸、氨基酸、硫辛酸、羟基乙酸、乳酸、烯醇丙酮酸(enolpyruvic acid)、丙酮酸、乳清酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、肌酸(creatinic acid)、琥珀酸、富马酸、己二酸、苯甲酸和对-氨基苯甲酸。特别重要的酰基取代基是正常存在于体内的作为饮食成分或中间代谢物的化合物，当在体内从目标2，2′-脱水嘧啶化合物裂解时该化合物基本上无毒。

含3′-O-酰基-2，2′-脱水嘧啶或其衍生物的组合物具有特别的价值。例如，重要的酰基衍生物是包括式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物的那些化合物，其中R¹、R²和R³各自独立选自氢、羟基、巯基、氨基、羟甲基、甲氧基、卤素、拟卤素，和取代或未取代的含1-20个碳的低级烃，例如选自烷基、烯基、烷酰基、芳基、芳酰基、芳烷基和烷基氨基的低级烃及其酯，和其中R⁴为O-酰基。

在一些实施方案中，酰基衍生物包括式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物，其中R⁴为O-酰基，且其中O-酰基含1-10个碳原子，例如选自芳酰氧基、芳烷酰基氧基(aralkoyloxy)、杂芳酰氧基和环烷酰基氧基(cycloalkoyloxy)的O-酰基。

因此，式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物的酰基衍生物包括3′-O-酰基-2，2′-脱水嘧啶、5′-O-酰基-2，2′-脱水嘧啶、3′，5′-O-酰基-2，2′-脱水嘧啶及其衍生物。例如，3′-O-酰基-2，2′-脱水嘧啶或其衍生物包括3′-O-芳酰基-2，2′-脱水嘧啶，例如3′-O-芳酰基-2，2′-脱水尿苷或其衍生物。尤其有价值的实例是3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水尿苷或其衍生物，例如3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷。其中3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷为3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿嘧啶立体异构体的化合物也有价值。

在某些实施方案中，式(I)的2，2′-脱水嘧啶化合物的酰基衍生物包括那些化合物，其中：R¹为H、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苄基、苯甲酰基或苄氧基苄基，R²为H、OH、F、CF₃、CH₃、CH₃CH₂、CH₃CH₂CH₂、(CH₃)₂CH、(CH₃)₂CH₂CH₂、CH₃(O)CCH₂、CH₃(O)CCH₂CH₂、Br-CH＝CH、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、苯甲酰基、苄氧基苄基或酰基，和其中R³和R⁴各自独立为羟基或酰基。这些包括以下化合物：

1)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水尿苷；

2)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-氟尿苷；

3)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-三氟甲基尿苷；

4)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷；

5)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-乙基尿苷；

6)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基尿苷；

7)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-异丙基尿苷；

8)3′-O-苯甲酰基-2，2′-O-脱水-5-异丁基尿苷；

9)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲酰基尿苷；

10)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙酰基尿苷；

11)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；

12)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯基尿苷；

13)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苄基尿苷；

14)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯甲酰基尿苷；和

15)3′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(苄氧基苄基)-尿苷；

16)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水尿苷；

17)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-氟尿苷；

18)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-三氟甲基尿苷；

19)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷；

20)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-乙基尿苷；

21)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基尿苷；

22)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-异丙基尿苷；

23)5′-O-苯甲酰基-2，2′-O-脱水-5-异丁基尿苷；

24)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲酰基尿苷；

25)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙酰基尿苷；

26)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；

27)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯基尿苷；

28)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苄基尿苷；

29)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯甲酰基尿苷；和

30)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(苄氧基苄基)-尿苷；

31)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水尿苷；

32)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-氟尿苷；

33)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-三氟甲基尿苷；

34)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷；

35)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-乙基尿苷；

36)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基尿苷；

37)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-异丙基尿苷；

38)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-O-脱水-5-异丁基尿苷；

39)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲酰基尿苷；

40)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙酰基尿苷；

41)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；

42)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苯基尿苷；

43)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苄基尿苷；

44)3′，5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-苄基尿苷；和

45)3′，5′-O-苄基-2，2′-脱水-5-(苄氧基苄基)-尿苷；

或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和前药形式，及其立体异构体。

3′-O-苄基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷、5′-O-苄基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷，和3′，5′-O-苄基-2，2′-脱水-5-甲基尿苷或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物及其前药形式及其立体异构体具有特别价值。这些化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和前药形式的β-D-阿拉伯呋喃糖基异构体具有特别的价值。

在另一个实施方案中，特别重要的依据式(I)的化合物为其中R¹和R⁴定义同上，且R²和/或R³为环烃基的那些化合物。“环烃基”意指具有3-约10个碳原子并具有单环或多个稠合环的烃基环结构，所述单环或多个稠合环可被取代。重要的环烃基选自芳基、芳烷基、芳氧基、芳酰基、芳酰氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳酰氧基、环烷基、环烷氧基和环烷酰基氧基。因此，特别重要的环烃基为连接O的式(I)核糖或嘧啶环。其中R²和/或R³为环烃基的化合物显示在摩尔基础上的提高的活性，或在不干扰MTX效力方面的提高的专一性。

因此，本发明一些化合物含5′-O-(环烃基)-2，2′-脱水嘧啶或其衍生物。该实施方案包括5′-O-(环烃基)-2，2′-脱水-5(R⁵)-尿苷或其衍生物，其中R⁵为R¹(例如R⁵＝R¹，其中″5(R⁵)″是指且与式(I)的R¹相同)。

重要的化合物为5′-O-芳基-2，2′-脱水嘧啶或其衍生物，其中包括各种2，2′-脱水尿苷衍生物。这包括其中5′-O-芳基-2，2′-脱水嘧啶为5′-O-芳酰基-2，2′-脱水嘧啶的化合物，例如：5′-O-苄基-2，2′-脱水嘧啶；5′-O-氯苄基-2，2′-脱水嘧啶；5′-O-硝基苄基-2，2′-脱水嘧啶；5′-O-羟基苄基-2，2′-脱水嘧啶等。

在一个实施方案中，显示在摩尔基础上提高的活性或在不干扰MTX效力方面提高的专一性的化合物为5′-O-芳基-2，2′-脱水尿苷、5′-O-芳酰基-2，2′-脱水尿苷及其衍生物，例如5′-O-芳基-2，2′-脱水-5(R⁴)-尿苷、5′-O-芳酰基-2，2′-脱水-5(R⁴)-尿苷和它们的衍生物。实例包括5′-O-芳基-2，2′-脱水-5-甲基-尿苷；5′-O-芳基-2，2′-脱水-5-乙基-尿苷；5′-O-芳基-2，2′-脱水-5-丙基-尿苷；5′-O-芳基-2，2′-脱水-5-苄基-尿苷；和5′-O-芳基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；及其衍生物。实例还包括5′-O-芳酰基-2，2′-脱水-5-甲基-尿苷；5′-O-芳酰基-2，2′-脱水-5-乙-基-尿苷；5′-O-芳酰基-2，2′-脱水-5-丙基-尿苷；5′-O-芳酰基-2，2′-脱水-5-苄基-尿苷；和5′-O-芳酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷；及其衍生物。特别重要的化合物包括5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5(R⁴)-尿苷，例如5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-甲基-尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-乙基-尿苷；5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-丙基-尿苷；5′-O-苄基-2，2′-脱水-5-苯甲酰基-尿苷；和5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-5-(2-溴乙烯基)-尿苷。

重要的立体异构体包括为β-D-异构体的5′-O-(环烃基)-2，2′-脱水嘧啶。实例包括但不限于：

10)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-丙酰基尿嘧啶；

15)5′-O-苯甲酰基-2，2′-脱水-1-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-(3-苄氧基苄基)尿嘧啶。

如上所述，以上化合物的类似物/衍生物也是重要的，其中此类类似物/衍生物减少MTX毒性，以致当将化合物和依据本发明的MTX联合给予时MTX毒性减少。又如上所述，有效量的MTX毒性减少佐剂用于本方法中。

在一些实施方案中，所使用的MTX毒性减少佐剂的量大于所使用的MTX活性药物的量。在一些实施方案中，MTX毒性减少佐剂的量为小于给予的等摩尔的MTX活性药物量的量。通常，给予的毒性减少佐剂的量与MTX活性药物的量比较小于约75％、小于约50％、小于约25％，在许多实施方案中，小于约15％、小于约10％，甚至小于约5％或1％。在一个实施方案中，有效量为约1％-50％MTX活性药物的量，例如约3％-40％，包括约5％-30％MTX活性药物的量。在其它实施方案中，有效量与活性药物的量相同，在一些实施方案中，有效量为大于MTX活性药物量的量。可用以下实验部分提供的数据，按经验容易地确定有效量。

上述2，2′-脱水嘧啶及其衍生物为市售可获得的，或可通过本领域技术人员已知的技术按常规制备。例如，描述包括其中间体和前体、分析和合成/制备在内的各种2，2′-脱水嘧啶和衍生物的代表性专利包括美国专利号3,975,367；4,145,531；4,230,698；4,247,544；4,544,740；4,604,382；4,613,604；4,681,933；4,841,039；4,916,122；4,987,224；5,008,384；5,077,280；5,084,445；5,141,943；5,190,926；5,212,293；5,278,167；5,384,396；5,455,339；5,476,855；5,596,093；5,610,292；5,721,241；5,723,449；5,739,314；5,760,202；5,889,013；5,861,493；6,060,592；6,090,932；6,222,025；6,369,040；6,642,367；6,670,461；6,867,290；和7,176,295；其公开内容通过引用结合到本文中。也可参见以下参考文献：Veres et al.，Biochem Pharmacol.34(10)：1737(1985)；Veres et al.，Drugs Exp Clin Res.13(10)：615(1987)；el Konui et al，Mol.Pharmacology 34：104(1988)；Cienfuegos et al.Org.Lett.7(11)：2161(2005)；Choi et al.，NucleosidesNucleotides Nucleic acids 22(5-8)：547(2003)；Rodriquez et al.，J Med Chem 37(20)：3389(1994)；McGee，D.P.C.et al.，″通过2，2’脱水尿苷衍生物的分子内功能化的新核苷(Novel Nucleosides via Intramolecular Functionalization of 2，2′Anahydrouridine Derivatives)″，Tetr.Lett.，37(12)：1995(1996)；Machulla et al.J.Nucl.Med.42(5)：257(2001)；Czernecki S.et al.Nucleosides&Nucleotides14：1227(1995)；Heterocyclic Chemistry(第3版)，Thomas.L. Gilchrist，Prentice Hall(1997)；Movassaghi，M.and M.D.Hill，J.Am.Chem.Soc.128(44)：14254(2006)；Brown，DJ.杂环混合物：嘧啶(Heterocyclic Compounds：The Pyrimidines).第52卷.New York：Interscience，1994；Eaton，(1995)Annu.Rev.Biochem.64，837；Usman and Cedergreen TIBS17：334(1992)；Greene and Wuts(1991)有机合成中的保护基团(Protective Groups in OrganicSynthesis)，第2版，.Wiley Interscience)；Moffatt，(1979)Nucleoside Analogues，Ed.Walker，NY，Plenum.；Townsend，(1988)Chemistry of Nucleosides and Nucleotides，NY，Plenum；和Sproat，et al.，(1991)寡核苷酸和类似物：实用方法(Oligonucleotidesand Analogues：A Practical Approach)，ed.F.Eckstein，NY，Oxford Univ.Press))。

2，2′-脱水嘧啶及其衍生物尤其有价值，它们为尿苷磷酸化酶的抑制剂。尿苷磷酸化酶(UPh；EC 2.4.2.3)为嘧啶核苷磷酸化酶家族的一员，该酶催化尿苷的C-N糖苷键的磷酸化裂解，形成核糖1-磷酸和尿嘧啶(Timofeev et al.，A cta Crystallogr Sect FStruct Biol Cryst Commun.，63：852-854(2007))。

本发明范围包括MTX活性药物的前药和MTX毒性减少佐剂。一般而言，此类前药为化合物的功能衍生物，此类功能衍生物在体内容易转化为需要的化合物。因此在本发明方法中，术语“给予”包括给予具体公开的化合物或含未具体公开但给予有需要的患者后在体内转化为特定化合物的化合物。有关用于选择和制备合适的前药衍生物的常规方法的描述参见例如wermuth，″设计前药和生物前体(Designing Prodrugs and Bioprecursors)″inWermuth，ed.The Practice of Medicinal Chemistry，第2版，第561-586页(AcademicPress 2003)。前药包括在体内(例如在人体内)水解得到适合本发明的本文中所述化合物的酯。合适的酯基包括但不限于由药学上可接受的脂族羧酸，尤其是链烷酸、链烯酸、环烷酸和链烷二酸衍生的那些基团，其中各烷基或烯基部分具有的碳原子不超过6个。示例性酯包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯、柠檬酸酯、丁二酸酯和乙基丁二酸酯。

制剂

还提供用于本方法的含MTX活性药物和/或MTX毒性减少佐剂的药用组合物。因此，可将MTX活性药物和/或MTX毒性减少佐剂配制为用于上述本方法的口服、局部或肠胃外给药的药用组合物，例如药学上可接受的盐形式。在一些实施方案中，例如其中给予作为分离制剂的化合物(例如在其中序贯给予它们的那些实施方案中)，提供分离或不同的药用组合物，所述组合物各自含不同的活性药物。在另外的其它实施方案中，提供含MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂的单一制剂(即含两种活性药物的一个组合物)。

作为说明，可将MTX活性药物和/或MTX毒性减少佐剂与常规药学上可接受的载体和赋性剂(即媒介)混合，按水溶液、片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。在一些实施方案中，此类药用组合物含约0.1-约90％重量的活性化合物，更通常含约1-约30％重量的活性化合物。药用组合物可含普通载体和赋性剂，例如玉米淀粉或明胶、乳糖、葡萄糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢二钙、氯化钠和藻酸。通常用于本发明制剂的崩解剂包括交联羧甲基纤维素、微晶纤维素、玉米淀粉、羟基乙酸淀粉钠和藻酸。

液体组合物通常由所述化合物或药学上可接受的盐在合适的液体载体中形成的混悬液或溶液组成，合适的液体载体为例如乙醇、甘油、山梨醇、非水溶剂例如聚乙二醇、油或水，并可含悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、湿润剂、矫味剂或着色剂。或者，液体制剂可由可重新配制的粉末制备。

例如，可用水将含活性化合物、悬浮剂、蔗糖和甜味剂的粉末重新配制，形成混悬液，糖浆可由含活性成分、蔗糖和甜味剂的粉末制备。

可用通常用于制备固体组合物的任何合适的药用载体制备片剂形式的组合物。此类载体的实例包括硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素和粘合剂例如聚乙烯吡咯烷酮。也可提供具有色素薄膜衣或具有包含的作为载体一部分的色素的片剂。另外，可将活性化合物配制为控释剂型如含亲水或疏水基质的片剂。

可用常规包胶方法，例如通过将活性化合物和赋性剂掺入硬明胶胶囊制备胶囊剂形式的组合物。或者，可制备活性化合物和高分子量聚乙二醇的半固体基质，填充到硬明胶胶囊中；或可制备活性化合物的聚乙二醇溶液或活性化合物在食用油例如液体石蜡或分馏椰子油中的混悬液，并填充到软明胶胶囊中。

可包含的片剂粘合剂为阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯基吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可使用的润滑剂包括硬脂酸镁或前体硬脂酸金属盐、硬脂酸、硅氧烷流体、滑石粉、蜡、油和硅胶。

也可使用矫味剂例如薄荷油、冬青油、樱桃香精等。另外，还可能需要加入着色剂，以使剂型外观更动人或帮助鉴别产品。

当肠胃外给药时，可将本发明化合物和它们的有活性的药学可接受的盐配制为用于肌内、胸内或静脉内给药的形式。

用于肌内或胸内给药的典型组合物为活性成分在油例如落花生油或芝麻油中的混悬液或溶液。用于静脉内或胸内给药的典型组合物为含例如活性成分和葡萄糖或氯化钠或葡萄糖和氯化钠的混合物的无菌等渗水溶液。其它实例为乳酸林格氏注射液、乳酸林格氏液加葡萄糖注射液、Normosol-M和葡萄糖、Isolyte E、酰化林格氏注射液等。任选，助溶剂例如聚乙二醇、螯合剂例如乙二胺四乙酸和抗氧剂例如焦亚硫酸钠可包含在制剂中。或者，可将溶液冻干，然后在临给药前用合适的溶剂重新配制。

可将在直肠给药中有效的本发明化合物和它们的药学上可接受的盐配制为栓剂。典型的栓剂制剂通常由活性成分和粘合剂和/或润滑剂例如明胶或可可豆脂或其它低熔点植物或合成蜡或脂肪组成。

可将在局部给药中有效的本发明化合物和它们的药学上可接受的盐配制为透皮组合物或透皮递药装置(“贴剂”)。此类组合物包括例如基材(backing)、活性化合物储库、控制膜、衬里和接触胶布。可用此类透皮贴剂提供连续或不连续输注的控制量的本发明化合物。递送药物的透皮贴剂的制备和用途在本领域中熟知。参见例如美国专利号5,023,252，其通过引用全文引用到本文。可制备用于连续、脉冲或按需要递送药物的此类贴剂。

在一些重要的实施方案中，按单一药物制剂给予MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂，该制剂除含有效量的活性药物和毒性减少佐剂外还含其它合适的化合物和载体，且也可与其它活性药物联用。因此，本发明还包括含药学上可接受的赋性剂的药用组合物。药学上可接受的赋性剂包括例如任何合适的媒介、辅剂、载体或稀释剂，并可在市场上容易地得到。本发明的药用组合物还可含本领域中熟知的其它活性药物。

本领域技术人员会意识到，可得到给予有需要的患者或宿主(例如病人)本发明制剂的多种合适的方法，且尽管可用大于一种途径给予特定制剂，但特定途径可提供比另一种途径更迅速和更有效的反应。本领域技术人员也熟知药学上可接受的赋性剂，且容易得到。赋性剂的选择将部分取决于具体化合物和给予组合物使用的具体方法。因此，存在本发明药用组合物的众多合适的制剂。以下方法和赋性剂仅为举例说明，绝非限制性的。

适合口服给药的制剂可由以下组成：(a)液体溶液，例如溶于稀释剂例如水、盐水或橙汁的有效量的化合物；(b)胶囊剂、小药囊或片剂，各自合作为固体或颗粒的规定量的活性成分；(c)悬浮于合适液体中的混悬液，和(d)合适的乳液。片剂形式可包括一种或多种乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、羧甲基纤维素、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋性剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂和药理上配伍的赋性剂。锭剂形式可含活性成分和矫味剂，所述矫味剂通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；和含在惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分的软锭剂；除活性成分外还含本领域中已知的此类赋性剂的乳剂、凝胶剂等。

可将本发明的主题制剂制成通过吸入给予的气雾剂制剂。可将这些气雾剂制剂置于加压的可接受的抛射剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。也可将它们配制为非加压制剂药物，例如用于雾化器或喷雾器的制剂。

适合肠胃外给药的制剂包括水和非水等渗无菌注射溶液，此类注射液可含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预定的接受者血液等渗的溶质；和水和非水无菌混悬液，此类混悬液可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可按单位剂量或多剂量密闭容器例如安瓿和小瓶提供制剂，并可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临用前加入无菌液体赋性剂例如注射用水。可由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备即配即用注射液和混悬液。

可作为除活性成分外，还含本领域中已知的其它此类合适载体的软膏剂、凝胶剂、糊剂或泡沫剂提供适合局部给药的制剂。

还通过使其与多种基质例如乳化基质或水溶性基质混合提供栓剂制剂。可作为阴道环、止血垫、软膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂提供适合阴道给药的制剂。

可提供用于口服或直肠给药的单位剂型例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中各剂量单位例如茶匙量、汤匙量、片剂或栓剂含规定量的组合物，该组合物含一种或多种抑制剂。同样，用于注射或静脉给药的单位剂型可含溶于无菌水溶液、标准盐水或另一种药学上可接受的载体的抑制剂组合物。

本文中使用的术语“单位剂型”是指适用于人和动物患者的作为单一剂量在物理上分离的单位，各单位含规定量的经计算的足以产生需要作用的量的本发明化合物和组合在一起的药学上可接受的稀释剂、载体或媒介。本发明的新单位剂型的规格取决于使用的具体化合物和预达到的作用，和与宿主中各化合物相关的药效。

本领域技术人员容易地意识到，可根据具体化合物的功能、递药媒介的性质等改变剂量水平。本领域技术人员可通过多种方法容易确定给出化合物的合适的剂量。

在本发明全文中，给予动物，尤其是人的剂量应在该动物中在合理的时间范围内足以引起预防性或治疗性反应。本领域技术人员会意识到，剂量须取决于多种因素，包括使用的具体化合物的规格、动物的病症和动物的体重，和疾病的严重性和疾病的阶段。也可通过可能伴随具体化合物的给予的任何有害副作用的存在、性质和程度确定剂量的大小。可通过比较已知引起需要的生长抑制或免疫抑制反应的抗癌药或免疫抑制剂确定合适的剂量和给药方案。

任选地，药用组合物可含其它药学上可接受的成分，如缓冲剂、表面活性剂、抗氧剂、粘度改性剂、防腐剂等。本领域中熟知各种此类成分。参见例如美国专利号5,985,310，其公开内容通过引用结合到本文中。

适用于本发明制剂的其它成分可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia，Pa.，第17版(1985)中找到。在一个实施方案中，环糊精水溶液还含葡萄糖，例如约5％的葡萄糖。

实用性

发现本方法具有多种应用中具有用途。在一些应用中，方法为调节至少一种细胞功能例如DHFR介导的DNA合成和/或修复的的方法。在该方面，发现本方法和组合物可用于已知的MTX应用中，例如治疗可用MTX治疗的疾病或病症。本发明组合物的用途在以下方面具有特别的实用性：例如治疗包括但不限于癌症、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和组织-移植物排斥(tissue-graft·rejection)在内的疾病和病症，和需要免疫抑制剂的病症。在这些性能中，使用本发明组合物将导致减少的毒性，同时保留需要的MTX活性。

同样，发现本方法和组合物具有其中给予MTX是对症治疗的用途。代表性的治疗应用为治疗细胞增殖疾病，例如特征在于畸形细胞增殖的癌症和相关病症。此类疾病包括癌症和肿瘤性疾病和特征在于存在有害细胞增殖的其它疾病例如增生等。自身免疫疾病如多发性硬化的特征也为免疫细胞的不适当增殖。

治疗表示实现与折磨宿主的病症有关的症状的至少缓解，其中按广义使用缓解，是指至少减少参数例如与所治疗的病症或给予药物所致副作用有关的症状的程度。同样，治疗还包括其中病理性病症或至少与该病症有关的症状完全被抑制的情况，例如阻止发生，或停止例如终止，致使宿主不再患该病症或至少不再出现特征在于该病症的症状。

重要的特定用途是用脱水核苷，尤其是2，2′-脱水嘧啶及其衍生物缓解MTX引起的粘膜炎。因此，在一些实施方案中，为有需要的宿主提供治疗方法，该方法为联合给予有效量的MTX活性药物和有效减少宿主中MTX引起的粘膜炎的量的MTX毒性减少佐剂，其中MTX毒性减少佐剂为2，2′-脱水嘧啶或其衍生物。在相关实施方案中，MTX引起的粘膜炎为口腔炎。在另一个相关实施方案中，MTX引起的粘膜炎的特征在于选自以下的一种或多种特征：骨髓抑制、体重下降、炎症和感染。2，2′-脱水-5-甲基尿苷及其酰基衍生物作为MTX毒性减少佐剂减少宿主中MTX引起的粘膜炎具有特别的价值。

MTX引起的粘膜炎减少的特征在于防止、缓解或减少由用MTX活性药物治疗宿主导致的粘膜炎发作的可能性。该减少包括用有效量的MTX活性药物联合有效减少宿主中MTX引起的粘膜炎的量的MTX毒性减少佐剂治疗有需要的宿主，其中当粘膜炎发生后，MTX毒性减少佐剂提高成功防止或消除粘膜炎的一种或多种特征的可能性，包括：(i)防止：即造成临床症状不发展，例如防止骨髓抑制、体重下降、炎症和/或感染、和/或防止这些特征中的一种或多种进行到有害状态；(ii)抑制：即阻止临床症状发展或进一步发展，例如缓解或完全抑制粘膜炎的活跃(正在进行的)特征，以使该特征减少至不再严重有害的程度，该减少可包括完全消除宿主中的粘膜炎；和/或(iii)缓解：即造成临床症状的消退，例如造成骨髓抑制、体重下降、炎症、感染和/或由用MTX活性药物治疗宿主造成的其它症状的缓解。

例如，通过目视检查与病症有关的口腔、咽喉和/或肛门病变、询问受试者或患者(你的口腔或咽喉痛吗？)或通过利用任何或所有3种充分接受的疾病评级：5级世界卫生组织(WHO)口腔毒性评级(Miller AB et al.，Cancer 1981；47：207-214)、用于粘膜的5级Radiation Therapy Oncology Group(RTOG)急性放射-发病率评分标准；国立癌症研究所(National Cancer Institute)普通毒性标准，2.0版，1999年4月30日和用于口腔粘膜炎的4级Western Consortium for Cancer Nursing Research(WCCNR)修订的分期系统，评价口腔炎：Western Consortium for Cancer Nursing Research(WCCNR)口腔炎分期系统的改进(Can Oncol Nurs J1998；8：160-165)，可容易地评价包括口腔粘膜炎(口腔炎)在内的粘膜炎的严重性。因此，可用任何或所有这些试验系统容易地测定用MTX毒性减少佐剂治疗的效果。

按照本方法，可治疗多类患者。通常，此类宿主为“哺乳类动物”或“哺乳动物”，其中按广义用这些术语描述属于哺乳动物纲的生物体，它们包括食肉动物目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)、和灵长目(例如人、黑猩猩和猴)。在许多实施方案中，患者为人。

在一些实施方案中，患者为已诊断患病因此需要给予活性药物的患者。在一些实施方案中，方法可包括诊断患者是否存在通过给予活性药物治疗的疾病。

在其它应用中，发现本方法可用于治疗包括肿瘤性疾病例如癌症和自身免疫疾病在内的细胞增殖疾病。在此类用途中，将有效量的MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂给予有需要的患者。治疗按以上定义在广义上使用，包括至少缓解疾病的一种或多种症状；和完全终止其；和反转和/或完全除去疾病即治愈。

存在与细胞增殖失调有关的许多病症，例如细胞增殖性疾病。目标病症包括但不限于下述病症。

本方法可用于治疗多种病症，其中存在平滑肌细胞增殖和/或迁移，和/或炎性细胞进入血管的内膜层，导致通过该血管的血流受阻，例如新内膜增生性闭塞病变的那些病症。涉及的闭塞性血管病症包括动脉粥样硬化、移植后移植物冠状血管疾病(graftcoronary vascular disease)、静脉移植物所致狭窄(vein graft stenosis)、全吻合修复术移植物所致狭窄(peri-anastomatic prosthetic graft stenosis)、血管成形术或斯滕特印模放置后的再狭窄等。

通过给予本化合物，可减少其中存在过度增殖和组织重建或生殖组织修复的疾病，例如子宫、睾丸和卵巢癌；子宫内膜异位；子宫颈的鳞状细胞和腺上皮细胞癌等的细胞数。

可治疗的有关肿瘤包括癌例如结肠、十二指肠、前列腺、乳腺癌；黑素瘤；管、肝、胰腺、肾脏、子宫内膜、胃癌；口腔粘膜发育不良；息肉病；侵袭性口腔癌；非小细胞肺癌；尿路移行和鳞状细胞癌(transitional and squamous cell urinary carcinoma)等；神经恶性疾病例如成神经细胞瘤、神经胶质瘤等；血癌例如儿童急性白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、恶性皮肤T细胞、蕈状真菌病、非MF皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、T细胞富集的皮肤淋巴样增生(T-cell richcutaneous lymphoid hyperplasia)、大疱性类天疱疮、盘状红斑狼疮、扁平苔藓、妊娠绒毛膜癌、恶性葡萄胎、水泡状胎块、头和颈的表皮样瘤；绒毛膜上皮瘤例如绒毛膜癌、恶性葡萄胎、水泡状胎块等等。

某些特定目标癌症包括乳腺癌，它们主要为腺癌亚型。乳腺导管原位癌(Ductalcarcinoma in situ)(DCIS)是最普通类型的非侵袭性乳腺癌。在DCIS中，癌细胞尚未通过管壁转移到乳腺的脂肪组织中。浸润性(或侵袭性)导管癌(IDC)已通过管壁转移并侵入乳腺的脂肪组织中。浸润性(或侵袭性)小叶癌(ILC)类似于IDC，共同点在于它具有在身体的其它地方转移的潜力。约10％-15％侵袭性乳腺癌为侵袭性小叶癌。

非小细胞肺癌也是目标癌症。非小细胞肺癌(NSCLC)由3种普通亚型的肺癌组成。表皮样癌(又称为鳞状细胞癌)通常起源于较大支气管之一且生长相对缓慢。这些肿瘤大小可从极小到相当大。腺癌在肺的外表面附近开始生长，大小和生长速度均可不同。某些缓慢生长的腺癌被描述为肺泡细胞癌。大细胞癌起源于肺表面附近，生长迅速，当被诊断时，生长通常已经相当大。肺癌的其它较不常见形式为类癌瘤、圆柱瘤、粘液表皮样瘤和恶性间皮瘤。

黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。尽管大多数黑素瘤起源于皮肤，但它们也可起源于粘膜表面或神经脊细胞游走的其它部位。黑素瘤主要发生在成人，超过一半的病例发生于皮肤的表观正常区域(apparently normal areas)。预后受临床和组织学因素及损害的解剖位置的影响。黑素瘤的厚度和/或侵袭水平、有丝分裂指数、肿瘤浸润淋巴细胞和主要部位溃疡或出血影响预后。临床分期根据肿瘤是否扩散至区域淋巴节或远端部位。对于临床上局限在原始部位的疾病，淋巴节转移的机会越大和预后越差与黑素瘤局部侵入的厚度或深度越大有关。黑素瘤可通过局部延伸(通过淋巴管)和/或通过血源性途径扩散至远端部位。转移可涉及任何器官，但肺和肝是共同部位。

其它有关的增生性疾病涉及表皮过度增生、组织重建和修复。例如，牛皮癣的慢性皮肤炎症与增殖性表皮角质细胞和渗入单核细胞有关，渗入单核细胞包括CD4+记忆T细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞。

本发明方法可提供治疗即使不是大多数也是许多恶性疾病的方法，这些恶性疾病包括由选自以下的细胞衍生的肿瘤：皮肤、结缔组织、脂肪、乳腺、肺、胃、胰腺、卵巢、子宫颈、子宫、肾脏、膀胱、结肠、前列腺、中枢神经系统(CNS)、视网膜和血液等。代表性的目标癌症包括但不限于：头、颈和肺组织(例如头和颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、肠胃道和胰腺(例如胃癌、结肠直肠腺瘤、结肠直肠癌、胰腺癌)、肝组织(例如肝细胞癌)、肾脏和尿道(例如尿道上皮发育不良、膀胱癌、肾癌、维尔姆斯瘤)、乳腺(例如乳腺癌)、神经组织(例如成视网膜瘤、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤和恶性脑膜瘤；皮肤(例如正常表皮、鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤等)。

本发明的方法还可提供治疗造血组织(例如淋巴瘤、慢性髓细胞白血病(CML)、急性前髓细胞白血病(APL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)等等的方法。

在本发明上下文中，给予动物，尤其是人的剂量应在合理的时间范围内，在动物中足以实现预防或治疗反应。本领域技术人员会认识到，剂量将取决于多种因素，这些因素包括使用的具体化合物的规格、甲氨蝶呤的剂量、使用的甲氨蝶呤的给药方案、动物的状态和动物的体重，和疾病的严重性及疾病的阶段。

也可通过给予具体化合物后可能伴随的任何有害副作用的存在、性质和程度确定剂量大小。

在用本发明化合物治疗某些个体中，可能需要使用大剂量方案结合非恶性细胞的救援药物(rescue agents)。在这种治疗中，除佐剂外，也可使用可救援非恶性细胞的任何药物，例如嗜橙菌因子(citrovorum factor)、叶酸衍生物或甲酰四氢叶酸。本领域普通技术人员熟知此类救援药物。

其中可使用本方法和组合物的具体应用包括在美国专利号2,512,572；3,892,801；3,989,703；4,057,548；4,067,867；4,079,056；4,080,325；4,136,101；4,224,446；4,306,064；4,374,987；4,421,913；4,767,859；3,981,983；4,043,759；4,093,607；4,279,992；4,376,767；4,401,592；4,489,065；4,622,218；4,625,014；4,638,045；4,671,958；4,699,784；4,785,080；4,816,395；4,886,780；4,918,165；4,925,662；4,939,240；4,983,586；4,997,913；5,024,998；5,028,697；5,030,719；5,057,313；5,059,413；5,082,928；5,106,950；5,108,987；4,106,488；4,558,690；4,662,359；4,396,601；4,497,796；5,043,270；5,166,149；5,292,731；5,354,753；5,382,582；5,698,556；5,728,692；和5,958,928中所述那些用途；它们的公开内容通过引用结合到本文中。

药剂盒与系统

还提供可用于实施上述本方法的药剂盒和系统。例如，用于实施本方法的药剂盒和系统可包含一种或多种药物制剂，此类制剂含MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂中的一种或两种。同样，在一些实施方案中，药剂盒可含以一个或多个单位剂量提供的单一药用组合物，其中该组合物含MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂。在其它的实施方案中，药剂盒可含两种或更多种分离的药用组合物，各组合物含MTX活性药物或MTX毒性减少佐剂。

除以上成分外，本药剂盒还可含实施本方法的使用说明书。这些使用说明书可以多种形式存在于本药剂盒中，可将一种或多种形式的说明书置于药剂盒中。可提供的这些使用说明书的一种形式是位于合适的介质或底物的印刷信息，例如其上印有信息的一张或多张纸、在药剂盒包装中的印刷信息、在包装插页等中的印刷信息。还一种方法为计算机可读介质，例如在其上已记录信息的磁盘、CD等。可提供的再一种方法为可使用的通过访问远程站点信息的网址。可按任何便利的方式存在于药剂盒中。例如，依据一个实施方案的药剂盒包括使用作为第一种成分(a)的MTX毒性减少佐剂的使用说明书，和作为第二种成分的(b)含MTX毒性减少佐剂、MTX活性药物或其组合的药用组合物。

有特殊价值的药剂盒是含本发明2，2′-脱水嘧啶药用组合物和适合实施本发明主题方法，例如减少MTX活性药物引起的粘膜炎包括口腔炎和例如治疗细胞增殖性疾病的那些药剂盒。

本文中使用的术语“系统”是指按单个或不同组合物形式存在的MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂的集合体，为实施本方法，将这些组合物集合在一起。例如，按照本发明，分别得到的集合在一起的并联合给予患者的MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂剂型为依据本发明的系统。

以下实施例进一步说明本发明，但不应视为对本发明范围的任何限制。

实验

I.果蝇研究I(防止致死)

如果有减少与用细胞毒药物治疗有关的不利事件的药物可供使用，则可改善癌症化疗的效力。为了该目的，果蝇(Drosophila melanogaster)(俗称果蝇)是筛选用于此类减少副作用药物(side-effect-reducing agents)的化合物的理想生物体。该研究的目的旨在找到2，2′-脱水嘧啶试验品防止MTX诱导的昆虫死亡的剂量。

将递增量的2，2′-脱水嘧啶试验品(通常0.03-0.1mg)在水溶液中与0.3(或0.4)mgMTX混合。将4毫升(mL)2，2′-脱水嘧啶试验品+MTX溶液加入适当量的速溶果蝇培养基(instant fly medium)中。将果蝇卵加入2，2′-脱水嘧啶试验品+MTX处理的培养基中，并温育至多31天。温育31天后，通过点计每瓶中成熟果蝇和蛹的数目评定各测定的得分。

在Applied Scientific(Hampton，NH)透明无菌聚苯乙烯窄直径瓶中进行测定。将瓶储存在盘中，在避光培养箱中，在25℃下温育。

使用的试剂和材料为：50mg/mL MTX的H₂O(pH 8)溶液，20mg/mL 2，2′-脱水嘧啶试验品的H₂O溶液，水，Applied Scientific的无菌聚苯乙烯窄直径瓶，速溶Drosophila Food培养基、Oregon-R果蝇(Drosophila melanogaster)、25℃培养箱和15mL聚苯乙烯锥形试管。

各测定在不同的果蝇瓶中进行。用递增量的2，2′-脱水嘧啶(0.005-1.0mg)测试MTX对果蝇卵的副作用减少。从溶于水的20mg/mL储备液中取出多个量的2，2′-脱水嘧啶试验品。在15ml锥形试管中，将9mL 2，2′-脱水嘧啶+0.3(或0.4)mg MTX溶液与水预混合。用4mL2，2′-脱水嘧啶试验品+0.3(或0.4)mg MTX溶液进行平行双份测定(Duplicateassays)。将预先测定量的速溶果蝇培养基加入各测定管中以达到最佳水合水平。对照为(1)单独4mL水，和(2)单独0.3(或0.4)mg MTX。精确将～18小时龄的50只果蝇卵加入各测定管中。将测定管用合适的塞子封闭，在避光的25℃培养箱中温育30天。通过清点每一管中死亡的蛹或成熟果蝇的数目对测定评分。

图1提供MTX在果蝇模型中典型的一组毒性结果曲线，该图描绘了代表性的2，2′-脱水嘧啶试验品(2，2′-脱水-5-甲基尿苷，又称为TK-112690)在果蝇模型中对防止致死的保护作用。第6组对应于盐水处理的果蝇。第5组对应于MTX处理的果蝇。第1-4组对应于MTX+TK-112690处理的果蝇。MTX的剂量为0.4mg和TK-112690的剂量范围为0.005-0.1mg。

图1中所述数据显示MTX对果蝇的致死作用是高度显著性的(第5与第6组之间的差异p＜0.01)，同时由TK-112690提供的保护作用是高度显著性的(第1-4组与第5组或第6组之间的差异p＜0.01)。这些数据证明，2，2′-脱水嘧啶例如TK-112690减少MTX毒性。

II.小鼠研究I(防止体重下降)

如果有减少与用细胞毒药物治疗有关的不利事件的药物可供使用，则可改善癌症化疗的效力。为了该目的，小鼠是进一步分析在果蝇模型中初始鉴定的保护药物的理想生物体。该研究的目的旨在找到2，2′-脱水嘧啶试验品防止MTX引起小鼠体重下降的剂量，体重下降是粘膜炎的主要特征。

由文献方法(de Koning et al.，Int Immunol 18：941(2006))改进该小鼠模型。在第一天，用单个剂量的脂多糖(LPS)通过腹膜内(ip)处理小鼠，然后连续两天分别用200和100mg/kg甲氨蝶呤ip处理。对照包括第1、2和3天单独盐水处理，第1天盐水处理+第2和3天MTX处理；第一天LPS处理，第2和3天盐水注射处理。第1天ip给予实验组LPS，第2和第3天，在注射甲氨蝶呤3小时前和3小时后，ip给予10或30mg/kg代表性2，2′-脱水嘧啶试验品TK-112690。第一次注射后至第二次注射甲氨蝶呤后实验终止5天(第8天)，每日测量动物重量。体重下降是代表性的MTX引起的毒性及MTX引起的粘膜炎的一个方面。

图2中给出TK-112690的典型结果。在该图中，第1组对应于盐水处理组。第2组对应于脂多糖(LPS)处理的小鼠。第3组对应于MTX处理的小鼠。第4组对应于LPS+MTX处理的小鼠。第5组对应于LPS+MTX+TK-112690(10mg/kg)处理的小鼠。第6组对应于用LPS+甲氨蝶呤+TK-112690(30mg/kg)处理的小鼠。图中的纵座标为第1天与第8天之间的平均重量差。

在该研究中，由TK-112690得到的保护作用是高度显著性的(第5组平均重量变化与第4组相比(p＜0.004)，第6组与第4组相比(p＜0.0005)。30mg/kg剂量的作用大于10mg/kg剂量的作用。第5组和第6组与第1组(盐水)之间的差异无统计学意义。

这些结果证明，用2，2′-脱水嘧啶试验品处理可在哺乳动物宿主中减少MTX引起的毒性，且2，2′-脱水嘧啶的保护作用为剂量依赖性的。

III.小鼠研究II(防止粘膜通透性降低)

该研究的目的是评价代表性化合物2，2′-脱水嘧啶试验品减少MTX引起的粘膜通透性降低的能力。在第2、3和4天，在MTX注射前和后3小时，将C57BI/6雌性小鼠(n＝7)用100mg/kg MTX(ip)处理，用和不用60mg/kg TK-112690(ip)处理。第7天，通过测量经口给予的碘克沙醇的血浆浓度评估粘膜屏障损伤，该浓度通过HPLC用UV检测测定。经口给予的碘克沙醇未被吸收，粘膜通透性不增加。

图3提供来自该研究的数据。在该图中，第1组为盐水对照的处理的动物。第2组为单独甲氨蝶呤处理的动物，和第3组为甲氨蝶呤+TK-112690处理的动物。通过增加的经口给予的碘克沙醇的血浆浓度表明，第2、3和4天用100mg/kg MTX处理的小鼠有粘膜屏障损伤。通过减少的经口给予的碘克沙醇的血浆浓度表明，在给予MTX 3小时前和3小时后，共同给予60mg/kg TK-112690防止了小鼠出现MTX引起的粘膜屏障损伤。结果在统计学上具有显著性(p＜0.05)。

总之，通过增加的经口给予的碘克沙醇的血浆浓度表明，ip给予小鼠MTX造成小肠粘膜屏障损伤，而通过经口给予的碘克沙醇的血浆浓度下降表明，联合给予TK-112690和MTX防止了MTX引起的粘膜屏障损伤。

IV.小鼠研究III(感染研究)

该研究的目的是通过测量哺乳动物白细胞计数检验代表性的2，2′-脱水嘧啶试验品减少MTX引起的感染的能力。感染是MTX引起的毒性的代表和MTX引起的粘膜炎的一个方面。

为努力开发确认防止在LPS/MTX测定中观察到的粘膜炎的模型，检验了若干参数。在检验完全血细胞计数(CBCs)中，当用MTX处理小鼠时，观察到一致升高的白血病计数水平(WBCs)(图4)。在又用TK-112690处理的动物中未观察到这种升高(图4)。可通过回忆MTX伤害粘膜表面和产生肠衬里完整性破裂，使基底组织暴露于细菌最恰当理解这些结果。LPS是革兰氏阴性菌外膜上的大分子。暴露于LPS的组织表达促炎性细胞因子例如TNF-α和IL-10。因组织暴露于LPS导致这些细胞因子增加产生免疫反应，该反应反过来增加WBCs。

对于图4给出的数据的研究，在第1、2、3、4、6和8天，在3h±MTX处理后，用50mg/kgMTX i.p.和60mg/kg TK-112690i.p联合处理C57BL/6小鼠(n＝10/剂量组)，然后在不用MTX处理的日内，用单日剂量TK-112690处理，在第11天，采取动物的血液，用得到的血液样品进行血液学测量。血液学测量结束后，将动物处死。

图4中给出的数据提示，MTX处理增加全身WBC(甲氨蝶呤处理的动物中的WBC水平在统计学上大于盐水或MTX+TK-112690处理的动物中的水平(p＜0.02)，盐水或MTX+TK-112690处理的动物之间在统计学上无差异)。总之，TK-112690防止MTX引起的粘膜炎，可通过防止MTX处理的小鼠中WBC计数的增加来测量该作用。

V.细胞培养研究I(CCRF-CEM人白血病细胞)

该研究的目的是检验代表性的2，2′-脱水嘧啶试验品体外不干扰需要的MTX的活性的能力。

以下为从人癌细胞系CCRF-CEM中筛选得到的代表性数据，数据显示代表性2，2′-脱水嘧啶试验品TK112690在这种人白血病细胞系中不干扰甲氨蝶呤细胞毒性。肿瘤细胞系CCR-CEM(人T-细胞急性淋巴细胞白血病)得自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(CRL-1593.2)，除以下改变外，其余按产品说明书培养：用55.3cm²皮氏培养皿代替75cm²培养瓶，将1％青霉素-链霉素溶液(HyClone SV30010)和1％GlutaMAX^TM(Gibco 35050)加入培养基中。

将TK112690：代表性2，2′-脱水嘧啶试验品溶于40％DMSO，无菌过滤，然后用无菌蒸馏水稀释，得到10、100和1000μM初始工作溶液。在试验中，在培养基中稀释100倍，得到终测定浓度0.1、1.0和10.0μM。将MTX(SAFC Biosciences M8407)溶于无菌蒸馏水和5N NaOH中，然后无菌过滤。储备液的最终pH为7.8，用无菌蒸馏水制备用于终测定浓度30、3.0、0.3、0.03和0.003μM的工作溶液。将甲酰四氢叶酸(Sigma F-7878)溶于无菌蒸馏水，无菌过滤，用无菌蒸馏水稀释，得到终测定浓度0.1、1.0和10.0μM。

将100μl细胞悬浮液的等份试液接种在96孔微量滴定板(Corning costar 3595)中，放入37℃、5％CO₂气氛中(Fisher Scientific lsotemp3500CO₂培养箱)。24小时后，将100μl生长培养基[用丙酮酸钠(HyClone SH₃0239.01)、胎牛血清(SAFC Biosciences12107C)和HEPES缓冲液(Gibco 15630)强化的RPMI-1640w/L-谷氨酰胺(Cambrex12-702Q)]和2μl试验溶液或媒介分别加入各孔中，将板温育另外72小时。评价0.003、0.03、0.30和3.0μM浓度的单独MTX，或上述浓度的MTX联合0.1、1.0、10.0μM浓度的2，2′-脱水嘧啶试验品或甲酰四氢叶酸。在温育结束时，按照标准alamarBlue^TM(Biosource)方案，通过在λ＝570和600nm的吸光度[Spectramax 250(Molecular Devices)]测定抗细胞增殖的效力。

图5描绘的是证明试验品不干扰MTX细胞毒性的一组代表性数据。第1组为细胞对照(用培养基处理)。第2组对应于用0.03μM MTX处理的细胞。第3组为用1.0μM甲酰四氢叶酸处理的细胞。第4组为用0.1μM甲酰四氢叶酸处理的细胞。第5组为用10μM TK-112690处理的细胞。第6组为用MTX+10μM TK-112690处理的细胞。第7组为用MTX+1.0μM TK-112690处理的细胞。第8组MTX+0.1μM TK-112690。

第2组(单独甲氨蝶呤)与第1、3、4、5、6和7组相比在统计学上存在显著差异(分别为p＜0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)但与MTX+TK-112690组(第6、7和8组相比在统计学上无差异(分别为p＜0.844、0.918和1.000)。甲酰四氢叶酸+MTX组(第3和4组)与证明阳性对照提供保护的第2组相比在统计学上存在显著差异(分别为p＜0.000和0.002)。

这种人细胞培养研究说明，2，2′-脱水嘧啶如TK-112690在人淋巴瘤细胞培养模型中不干扰甲氨蝶呤细胞毒性。

VI.小鼠研究IV(使用CCRF-CEM移植物的异种移植)

该研究的目的是检验代表性的2，2′-脱水嘧啶试验品在体内不干扰需要的MTX的活性的能力。

进行异种移植研究，以分析给予TK-112690药对MTX抗人癌的体内效力的作用。将人CCRF-CEM(T-ALL)细胞皮下移植在SCID小鼠中。在正常基础上记录肿瘤体积，一旦建立肿瘤，立即给予治疗。图6显示该实验中第27天的肿瘤体积。该图中的第1组显示仅接受盐水的动物。第2组显示用MTX处理的动物，第3组含从接受MTX和30mg/kg TK-112690的动物中得到的数据。ip给予所有处理，在给予MTX前3小时和后3小时，给予TK-112690。图6中所示结果证明，盐水处理组与两个处理组之间存在显著差异(p＜0.01)，但两个处理组之间不存在显著差异(p＝1)。

VII.细胞培养研究II(AS283人淋巴瘤细胞)

该研究的目的是检验代表性的2，2′-脱水嘧啶试验品体外不干扰需要的MTX活性的能力。

以下是从人癌细胞系AS283中筛选得到的代表性数据，数据显示代表性2，2′-脱水嘧啶试验品TK112690在这种人淋巴瘤细胞系中不干扰甲氨蝶呤细胞毒性。

让AS283细胞在补充L-谷氨酰胺二肽、丙酮酸钠、HEPES和10％FBS的RPMI-1640中生长。让AS283细胞生长，按10,000细胞/孔，接种到3块96孔板中，总体积至50μl。将100μl培养基接种在仅含培养基的孔中。将板温育过夜。次日，将25μl MTX和TK-112690储备液加入到合适的孔中。将TK-11269、MTX依次加入所有孔中。将25μl媒介加入单独TK-112690孔中。将25μl媒介和25μl培养基加入媒介对照孔中，将50μl培养基加入细胞对照孔中。加入10μM多柔比星作为阳性对照。TK-112690浓度为1、10和100μM。MTX浓度为0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10、100μM。用CellTiter-Glo测量细胞存活力，用DOX(10μM)作为对照标准。

将板在37℃、5％CO₂下温育72小时，然后从培养箱中取出，置于长条试验台上，在室温下保持30分钟。不要将板堆叠或振摇。加入100μl CellTiter-Glo试剂并混合2分钟，然后在室温下再温育10分钟。在TriLux上记录发光。

图7提供浓度分别为100和10μM的MTX、MTX+TK-112690和1.0μM的MTX、MTX+TK-112690的IC₅₀曲线。MTX试验孔与含MTX+TK-112690(1、10、100μM)的试验孔中的细胞存活力之间不存在统计学上的差异。因此，加入的TK-112690不改变MTX的抗增殖活性。这种人细胞培养研究说明，2，2′-脱水嘧啶如TK-112690在人淋巴瘤细胞培养模型中不干扰甲氨蝶呤的细胞毒性。

VIII.小鼠研究V(使用AS283移植物的异种移植)

该研究的目的是测定TK-112690是否影响MTX对皮下(sc)移植在雄性C.B.-17SCID小鼠中的AS283人淋巴瘤异种移植物的抗肿瘤效力。用单独给予的MTX作为对照。

实验前，使6周龄雄性C.B.-17SCID小鼠在试验室适应环境7天。用12-口径套管针将30-40mg AS283人淋巴瘤碎片sc移植在小鼠的右侧腹附近，并使其生长。在开始处理前，让肿瘤重达75-198mg(75-198mm³体积)。在充足数量的小鼠中进行移植，以便选择尽可能窄的重量范围的肿瘤，用于处理启始日(肿瘤移植后第8天)的试验。将选择的具有在适当体积范围内的肿瘤的那些动物分配到各处理组，以使第一天处理的肿瘤重量中值彼此尽可能接近(所有组均为162mg)。实验由两个处理组和一个媒介处理对照组组成，每组10只动物，在处理的第一天，处理的小鼠总数为30只。

每日通过将化合物溶于100％DMSO(在需要时涡流搅拌)制备15mg/mL TK-112690溶液，然后加入PBS制成3mg/mL给药溶液。媒介的最终组成为20％DMSO/80％PBS。每日注射时，用盐水将25mg/mL注射用MTX储备液稀释至0.75mg/mL给药溶液。根据确切的体重，每10g体重使用0.1mL注射体积，ip给予两种化合物。

按30mg/kg/注射剂量，通过腹膜内(ip)注射给予TK-112690[每2天两次，每隔6小时注射一次，共计5次(q6h x 2，q2d x 5)]。注射TK-112690.3小时后，按5.0mg/kg/注射剂量，通过腹膜内(ip)注射(q2dx 5)给予MTX。对照组用两种媒介处理，按照相应的化合物给药计划给予媒介。

在首次处理日开始时测量sc肿瘤，每周测量动物体重三次。通过卡尺测量值(mm)，用求椭圆体球体的公式：L x W²/2＝mm³测定肿瘤体积，其中L和W是指在各测量中采集的较大和较小的垂直尺寸。该公式还用于计算肿瘤重量，假定单位密度(1mm³＝1mg)。

肿瘤移植21天后，研究终止。在研究终止前，将发现的垂死的任何动物和肿瘤达到4,000mg、溃烂或脱落的任何动物无痛处死。

图8提供第21天的肿瘤体积。在该图中，第1组为用盐水对照处理的动物，第2组为用MTX处理的动物，和第3组为用MTX+TK_-112690处理的动物。在媒介处理的对照组中，所有10只小鼠的肿瘤生长至评价点。在第21天，肿瘤中值达到4，387mg。MTX处理延缓AS283淋巴瘤异种移植物的生长，肿瘤重量中值为第21天对照的2.8％，肿瘤重量中值(40.0mg)比开始处理时的肿瘤重量中值(162mg)小24.7％。联合给予TK-112690和MTX延缓生长，肿瘤重量中值为第21天对照的3.5％，肿瘤重量中值(9.0mg)比开始处理时的肿瘤重量中值(162mg)小5.6％。MTX(第2组)和MTX+TK-112690(第3组)的肿瘤体积之间在统计学上不存在差异(p＝1.0)，但两组与盐水处理的动物(第1组)的肿瘤体积相比在统计学上均具有高度差异(p＜0.01)。

IX.用小鼠和人肠组织匀浆进行的研究

该研究的目的是评价作为尿苷磷酸化酶(UPase)抑制剂的TK-112690的体内活性。通过小鼠和人小肠UPase酶的体外抑制，用于研究TK-112690阻止尿苷代谢分解的能力的剂量范围为0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000、5000和10000μM)。通过HPLC分析，用UV检测的尿嘧啶浓度确定UPase活性的检测(UPase催化尿苷分解代谢为尿嘧啶和核糖-1-磷酸)。

由均化小鼠和人小肠组织制备UPase酶物质。将TK-112690溶于水(50mg/ml)，并分析在含5mM尿苷、0.01M Tris、0.01M磷酸盐、1mM EDTA和1mM DTT的水溶液中的UPaSe抑制。在37℃下，在pH 7.3中进行反应。

通过反相HPLC，用UV检测来分析TK-11260对小鼠和人UPase的抑制。在环境温度下，用配备C18ECONOSIL 5U ALLtech柱的Water 2695Alliance系统进行HPLC分析。将20μlUPase反应样品自动注入柱上。流动相由先洗脱2.5ml的水和12.5ml至100％的乙腈梯度液组成(流速0.5ml/分钟)。通过240-320nm范围内的UV吸收度监测出口流分。UPase酶活性按尿嘧啶峰的AUC计。

图9提供代表性结果。发现TK-112690抑制小鼠小肠UPase酶，其IC₅₀值为12.5μM。TK-112690抑制人小肠UPase酶，其IC₅₀值为20.0μM。

X.果蝇研究II(敲除UPase的果蝇)

该研究的目的是评价经口给予的一定剂量范围(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg)的MTX在野生型(Ore-R)和UPase突变果蝇(Drosophila melanogaster)中产生的致死作用。使敲除UPase的果蝇(Drosophila melanogaster)(19519)的胚胎经口暴露于食物混合物中的一定剂量范围的MTX(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg)。使野生型(Oregon-R)的胚胎经口暴露于相同剂量范围的含和不含0.04mg TK-112690的MTX。MTX暴露开始后15天，基于存活或死亡进行评分。

图10中提供代表性结果。观察到敲除UPase的果蝇(D.melanogaster)(19519)抵抗经口给予的一定剂量范围(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg)的MTX的致死作用。野生型果蝇(D.melanogaster)对≥0.1mg MTX的致死作用敏感，但如果还存在0.04mg TK-112690，则野生型果蝇(D.melanogaster)抵抗经口给予的宽范围剂量(0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg)的MTX的致死作用。

总之，敲除UPase的杲蝇(D.melanogaster)抵抗经口给予的MTX的致死作用，而野生型果蝇(D.melanogater)对MTX敏感，但在UPase抑制剂如TK-112690的存在下，野生型果蝇(D.melanogaster)抵抗经口给予的MTX。

XI.小鼠研究VI(TK-112690处理后的血浆尿苷浓度)

该研究的目的是评价给予CD-1小鼠TK-112690以评价通过抑制UPase增加血浆尿苷浓度的能力的TK-112690剂量范围。

用TK-112690如下处理动物后，通过HPLC，用UV检测测定血浆尿苷浓度。将TK-112690溶于PBS，得到浓度500mg/mL。向CD-1雌性小鼠ip注射一系列TK-112690剂量(0、15、30、60和120mg/kg)，分析动物血浆中预计通过TK-112690抑制UPase升高的TK-112690尿苷浓度。测定TK-112690注射后0.08、0.50、1、2、4或12小时采集的血浆样品中的血浆尿苷浓度。

在室温下，用ThermoFinnigan进行HPLC分析。光谱系统配备脱气装置、泵、自动进样器和UV检测器。由配备笔的制图记录仪绘制色谱图。用Phenomenex C₁₈反相柱(250x4.6mm)分离分析物。表2描述的是在HPLC分析期间使用两个独立的流动相的梯度条件：(1)5％甲醇/纳米水/0.1％甲酸(2)5％甲醇/乙腈/0.1％甲酸(流速＝0.5mL/分钟)。

将10μl样品自动注入柱上。在262nm，通过UV吸收鉴定尿苷、TK-112690和5-FU。在各样品进样前，用纳米水洗涤HPLC针和进样器。

尿苷、TK-112690和5-FU的保留时间分别为9.3、8.9和7.7分钟。

通过由尿苷和5-FU校正曲线生成的线性方程(y＝mx+b)确定血浆尿苷的微摩尔浓度。通过尿苷和5-FU的峰高(mm)比例计算y值。用直尺测量HPLC色谱图中的以毫米计的所有峰高。

除用通过由注射到HPLC的相同量的TK-112690和尿苷测得的响应因子减去(attenuated)TK-112690的响应外，用相同方法定量样品中的TK-112690。

图11中提供由研究得到的代表性结果。TK-112690的血浆浓度随ip给予的TK-112690的剂量增加而增加。注意到，给予TK-112690后，血浆尿苷浓度几乎立即增加。在给予TK-112690后0.5小时，100μg/mL血浆TK-112690浓度与约2μg/mL尿苷相关(基线尿苷浓度约0.5μg/mL)。

XII.新UPase抑制剂的合成

A.使核碱(nucleobases)与四乙酸核糖偶联的方法：

将核碱1A-D(2.0当量)溶于无水乙腈(2ml/mmol)。加入N，O-双-三甲基甲硅烷基酰胺(trimethylsilylamide)(4.0当量)，将混合物在室温下搅拌至澄清(1-24小时)。将溶液冷却至0℃。缓慢加入四乙酸核糖(2)(1.0当量)的无水CH₃CN溶液(5ml/mmol)，接着加入SnCl₄(1.2当量)。将溶液在室温下搅拌过夜。通过小心加入饱和碳酸氢钠水溶液将反应淬灭。然后小心加入1M HCl水溶液，将混合物搅拌1小时。将溶液用乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机液用1M HCl、水、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。然后有机部分经Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩，得到粗残留物，该残留物经快速柱层析(梯度，99∶1-90∶10的氯仿∶甲醇)纯化，得到三乙酰化核糖核苷3A-D。

3A：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝9.56(bs，1H)，7.44(t，J＝1.5Hz，1H)，6.16(d，J＝4.0Hz，1H)，5.36-5.32(m，2H)，4.32(s，2H)，4.24(dd，J＝2.0，13.0Hz，1H)，4.19(dd，J＝1.5，13.0Hz，1H)，3.40(s，3H)，2.17(s，3H)，2.12(s，3H)，2.07(s，3H)

3B：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝11.35(bs，1H)，7.94(s，1H)，5.78(d，J＝5.5Hz，1H)，5.37(d，J＝6.0Hz，1H)，5.10-5.09(t，J＝5.0Hz，1H)，5.07(d，J＝5.0Hz，1H)，4.09-4.00(m，3H)，3.95(q，J＝5.0Hz，1H)，3.83(q，J＝3.5Hz，1H)，3.62(ddd，J＝5.5，8.5，12.0Hz，1H)，3.53(dt，J＝4.5，12.0Hz，1H)，3.41(dq，J＝1.5，7.0Hz，2H)，3.32(s，2H)，1.09(t，J＝7.0Hz，3H)

3C：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝9.01(bs，1H)，7.50(m，1H)，7.38-7.30(m，5H)，6.14-6.12(m，1H)，5.35(d，J＝4.0Hz，1H)，4.70(s，1H)，4.60(s，2H)，4.37-4.29(m，5H)，2.14(s，3H)，2.10(s，3H)，1.99(s，3H)

3D：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝9.64(bs，1H)，7.37-7.25(m，5H)，6.43(bs，1H)，6.17(s，2H)，6.11(d，J＝5.5Hz，1H)，5.80(dd，J＝2.5，6.5Hz，1H)，5.67(dd，J＝6.5，8.0Hz，1H)，5.23-5.18(m，2H)，4.3-4.1(m，2H)，2.09(s，3H)，2.08(s，3H)，2.05(s，3H)

B.用于乙酸酯水解反应的代表性方法：

将四乙酸核糖核苷3A-D溶于7N氨水的甲醇溶液。将溶液在室温下搅拌过夜。然后在真空下减少溶液。将得到的残留物用乙醚研磨，得到游离核糖核苷，为白色固体，通过过滤将该固体分离，在用于下一步之前，在高真空下干燥。

C.用于环合反应的代表性方法：

方法A：将核糖核苷(1.0当量)溶于无水二甲基乙酰胺(100μl/mmol)。加入碳酸二苯酯(1.0当量)和碳酸氢钠(0.05当量)，将混合物在150℃下搅拌1小时。加入乙醚，使产物沉淀，产物为胶状物。将溶剂倾去，粗残留物经快速柱层析或制备型HPLC纯化。

方法B：将核糖核苷(1.0当量)溶于无水二甲基甲酰胺(100μl/mmol)。加入碳酸二苯酯(1.0当量)和碳酸氢钠(0.05当量)，将混合物在100℃下搅拌8-12小时。加入乙醚，使产物沉淀，产物为胶状物。将溶剂倾去，粗残留物经快速柱层析或制备型HPLC纯化。

5A：¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝7.73(s，1H)，6.34(d，J＝5.7Hz，1H)，5.86(d，J＝4.3Hz，1H)，5.19(d，J＝5.7Hz，1H)，4.95(t，J＝5.0Hz，1H)，4.37(d，J＝4.3Hz，1H)，4.10-4.04(m，2H)，3.30(s，3H)

5B：¹H NMR(500MHz，DMSO_ds)δ＝7.71(s，1H)，6.36(d，J＝5.7Hz，1H)，5.88(bs，1H)，5.19(d，J＝5.7Hz，1H)，4.95(t，J＝5.2Hz，1H)，4.41(bs，1H)，4.11(dd，J＝1.4，4.0Hz，2H)，3.49(q，J＝7.0Hz，2H)，3.28-3.22(m，1H)，3.19-3.13(m，1H)，1.14(t，J＝7.0Hz，3H)

5C：¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝7.79(t，J＝1.5Hz，1H)，7.38-7.34(m，4H)，7.32-7.27(m，1H)，6.36(d，J＝5.5Hz，1H)，5.88(bs，1H)，5.74(s，1H)，5.20(d，J＝5.5Hz，1H)，4.96(t，J＝5.0Hz，1H)，4.56(s，2H)，4.38(bs，1H)，4.20-4.19(m，2H)，4.09-4.05(m，2H)，3.28-3.27(m，1H)，3.19-3.15(m，3H)

5D：¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝7.31(m，4H)，7.22(m，1H)，6.64(s，1H)，6.20(d，J＝5.7Hz，1H)，5.83(d，J＝3.9Hz，1H)，5.46(t，J＝6.4Hz，1H)，5.10(d，J＝5.7Hz，1H)，4.93(t，J＝5.3Hz，1H)，4.33(bs，1H)，4.17-4.05(m，3H)，3.99(t，J＝5.3Hz，1H)，3.18-3.14(m，2H)，3.05-3.00(m，1H)

D.2，2′-脱水-5′-氟-5-甲基尿苷

将5-甲基尿苷-2′，3″-丙酮化合物(acetonide)6(5.6g，18.8mmol，1.0当量)溶于无水二氯甲烷(80ml)，并冷却至0℃。加入咪唑(2.6g，37.6mmol，2.0当量)和叔丁基氯化二苯基硅烷(2.8g，18.8mmol，1.0当量)，让混合物升至室温，并搅拌1小时。通过旋转蒸发将二氯甲烷除去，将残留物溶于200ml乙酸乙酯，依次用水、盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥。过滤并除去溶剂后，化合物经快速柱层析纯化，得到7(6.8g，88％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝9.13(s，1H)，7.31(s，1H)，5.92(d，J＝3.0Hz，1H)，4.76(dd，J＝3.0，6.5Hz，1H)，4.72(dd，J＝2.0，6.5Hz，1H)，4.27(q，J＝3.0Hz，1H)，3.91(dd，J＝2.5，11.5Hz，1H)，3.80(dd，J＝3.5，11.5Hz，1H)，1.91(s，3H)，1.58(s，3H)，1.35(s，3H)，0.90(s，9H)，0.09(s，3H)，0.09(s，3H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ＝163.98，150.32，136.35，114.26，110.80.91.95，86.11，84.73，80.36，63.27，27.21，25.83，25.30，18.31，12.40，-5.44，-5.54

将化合物7(4.8g，1.0当量)溶于4∶1的吡啶和CH₂Cl₂(75ml)混合物。依次加入Boc酐(5.2g，4.0当量)、DMAP(200mg，cat.)，将溶液在室温下搅拌过夜。通过旋转蒸发将溶剂除去，残留物经快速柱层析纯化，得到8(4.8g，80％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝7.31(s，1H)，5.82(d，J＝3.0Hz，1H)，4.74(dd，J＝3.0，6.0Hz，1H)，4.71(dd，J＝2.5，6.0Hz，1H)，4.28(q，J＝3.0Hz，1H)，3.87(dd，J＝3.0，11.5Hz，1H)，3.75(dd，J＝1.5，11.5Hz，1H)，1.88(s，，3H)，1.56(s，9H)，1.53(s，3H)，1.32(s，3H)，0.88(s，9H)，0.06(s，3H)，0.05(s，3H)¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ＝161.45，148.41，147.80，136.68，114.04，110.14，92.82，86.60，84.96，80.46，63.28，27.32，27.15，25.78，25.24，18.23，12.48，-5.51，-5.58

将化合物8(4.8g，1.0当量)溶于无水THF(333ml)。一次性加入TBAF(14ml，1M的THF溶液，1.5当量)，将溶液在室温下搅拌2小时。通过旋转蒸发将溶剂除去，得到的残留物经快速柱层析纯化，得到9(2.7g，72％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝7.18(s，1H)，5.54(d，J＝3.0Hz，1H)，5.08(dd，J＝3.0，6.0Hz，1H)，4.97(dd，J＝4.0，7.0Hz，1H)，4.27(q，J＝3.0Hz，1H)，3.20(dd，J＝2.5，12.5Hz，1H)，3.79(dd，J＝3.0，12.5Hz，1H)，1.93(s，3H)，1.60(s，9H)，1.57(s，3H)，1.36(s，3H)

在氮气氛下，将化合物9(2.2g，1.0当量)溶于无水THF。依次加入甲苯磺酰氟(1.92g，2.0当量)、16.5ml 1M TBAF的THF(3.0当量)溶液。将混合物加热至60℃，在该温度下搅拌12小时。冷却后，将溶剂除去，残留物经快速柱层析纯化，得到化合物10(1.76g，80％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝7.13(s，1H)，5.83(s，1H)，4.93-4.91(m，1H)，4.87(dd，J＝4.0，6.5Hz)，4.75-4.57(m，2H)，4.41-4.35(m，1H)，1.93(s，3H)，1.60(s，9H)，1.58(s，3H)，1.36(s，3H)

将化合物10(1.6g，1.0当量)溶于16ml 50％TFA水溶液，并搅拌2小时。通过旋转蒸发将溶剂除去，与甲苯一起共沸蒸馏3次、然后与CH₂Cl₂共沸蒸馏2次，得到1.09g(quant.)完全脱保护的化合物11，为白色泡沫。

¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝11.36(s，1H)，7.39(s，1H)，5.78(d，J＝5.0Hz，1H)，4.70-4.63(m，1H)，4.60-4.53(m，1H)，4.04(t，J＝5.0Hz，1H)，3.99-3.93(m，2H)，1.78(s，3H)

通过以上方法B进行环化，得到化合物12，为灰白色固体(130mg，通过在乙醇/乙醚中重结晶纯化)。

¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝7.70(d，J＝1.0Hz，1H)，6.33(d，J＝5.5Hz，1H)，6.11(bs，1H)，5.21(d，J＝5.5Hz，1H)，4.45-4.25(m，4H)，1.78(s，3H)；¹³C NMR(125MHz，DMSO-d)δ＝171.53，159.34，132.07，116.68，94.19，90.11，88.10，86.32，86.19，83.18，81.84，74.51，74.47，13.27

E.2，2′-脱水-5′-叠氮基-5-甲基尿苷

向化合物13(2.52g，1.0当量)的16ml DMF溶液中加入叠氮化钠(1.74g，4.0当量)。将溶液在室温下搅拌过夜，通过旋转蒸发将溶剂除去。粗产物经硅胶柱层析纯化，得到14(2.16g，定量收率)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ＝10.11，(bs，1H)，7.13(d，J＝1.5Hz，1H)，5.65(d，J＝1.5Hz，1H)，5.05(dd，J＝2.0，6.5Hz，1H)，4.84(dd，J＝4.5，6.5Hz，1H)，4.24(dd，J＝4.5Hz，10.5Hz，1H)，3.66-3.60(m，2H)，1.92(d，J＝1.5Hz，3H)，1.56(s，3H)，1.35(s，3H)

按与化合物10相同的方式，使化合物14(0.9g，1.0当量)脱保护。共沸蒸馏除去溶剂后，将粗油状物用乙醚研磨，将得到的固体过滤，并干燥，得到15(0.42g，54％)。

¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝11.36(bs，1H)，7.51(s，1H)，5.78(d，J＝6.0Hz，1H)，5.40(bs，1H)，5.25(bs，1H)，4.15(t，J＝5.5Hz，1H)，3.94-3.88(m，2H)，3.59(d，J＝5.0Hz，2H)，1.79-1.80(m，3H).

通过方法B将15(0.4g，1.4mmol，1.0当量)环化，经硅胶柱层析纯化，得到16(83mg，22％)。

¹H NMR(500MHz，DMSO_d6)δ＝7.80(d，J＝1.0Hz，1H)，6.33(d，J＝6.0Hz，1H)，6.05(d，J＝4.5Hz，1H)，5.22(dd，J＝1.0，6.0Hz，1H)，4.32-4.29(m，1H)，4.2(ddd，J＝2.5，4.0，7.5Hz，1H)，3.41(dd，J＝4.0，13.5Hz，1H)，3.18(dd，J＝7.5，13.5Hz，1H)，1.79(d，J＝1.0Hz，3H).

XIII.由合成的化合物得到的测定结果

用实验I(果蝇研究I，防止致死)和实验IX(用小鼠和人肠组织匀浆进行的小鼠研究)试验方法评价按实验XII中所述方法合成的某些化合物。表3中提供评价结果。

若干化合物(TK-000006、TK-000007、TK-000008、TK-000009和TK-100616)为鼠科动物UPase的活性抑制剂(UPase IC₅₀＜100μM)。一个化合物TK000009在果蝇模型中也有防止MTX引起死亡的活性。到目前为止，在果蝇模型中具有活性的所有化合物也是活性UPase抑制剂。但在果蝇模型中，并非所有活性UPase抑制剂也是活性保护剂。

显然，由以上结果可得出：本发明提供减少MTX活性药物的毒性，同时保留它们的所需活性的方法。同样，本发明发现具有多种不同用途，并代表对本领域的重要贡献。

尽管通过为清晰理解提供的说明和实施例对前述发明进行了相当详细的描述，但根据本发明的讲授，在不偏离其所附权利要求书的实质或范围的前提下，可对本发明进行某些改变和修饰，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

因此，前述仅说明本发明原理。可以意识到到，本领域技术人员可设计各种安排，尽管未在本文中明确描述或显示，但这些安排包括本发明原理且包括在其实质和范围内。另外，本文中引用的所有实施例和限制性术语主要旨在帮助读者理解本发明人为本领域发展贡献的本发明原理和概念，并可视为不限于此类具体引用的实施例和条件。另外，本文中引用本发明原理、方面和实施方案及其具体实施例的所有表述包括其结构和功能等价物。另外，此类等价物包括目前已知的等价物和未来开发的等价物两者，即开发的执行相同功能的各种结构的任何元素。因此，本发明范围不限于本文中显示和描述的示例性实施方案。更确切地说，本发明范围和精神被包括在其所附权利要求书中。

Claims

1.一种有效量的甲氨蝶呤(MTX)活性药物联合有效减少所述MTX活性药物的毒性的量的MTX毒性减少佐剂在制备给予有需要的宿主的用于减少甲氨蝶呤在宿主中的毒性的药物中的用途，其中所述MTX毒性减少佐剂为式(I)的2,2'-脱水嘧啶：

或其药学上可接受的盐；

其中：

R¹选自氢、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的环烷基；

R²为氢；和

R³和R⁴各自为羟基。

2.权利要求1的用途，其中R¹选自氢、和取代或未取代的含1-20个碳的低级烷基。

3.权利要求2的用途，其中所述低级烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、和戊基。

4.权利要求2的用途，其中R¹选自氢、低级烷基、被烷氧基或被取代的烷氧基取代的低级烷基。

5.权利要求4的用途，其中所述烷氧基或被取代的烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。

6.权利要求4的用途，其中R¹为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、CH₃CH₂OCH₂和CH₃OCH₂。

7.权利要求1的用途，其中所述2,2'-脱水嘧啶为

8.权利要求1的用途，其中所述MTX活性药物的所述毒性为粘膜炎。

9.权利要求8的用途，其中所述粘膜炎为口腔炎。

10.一种药用组合物，所述组合物含有在药学上可接受的媒介中的有效量的MTX活性药物和MTX毒性减少佐剂，其中所述MTX毒性减少佐剂为式(I)的2,2'-脱水嘧啶：

或其药学上可接受的盐；

其中：

R²为氢；和

R³和R⁴各自为羟基。

11.权利要求10的药物组合物，其中R¹选自氢、和取代或未取代的含1-20个碳的低级烷基。

12.权利要求11的药物组合物，其中所述低级烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。

13.权利要求11的药物组合物，其中R¹选自氢、低级烷基、被烷氧基或被取代的烷氧基取代的低级烷基。

14.权利要求13的药物组合物，其中所述烷氧基或被取代的烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2-二甲基丁氧基。

15.权利要求10的药物组合物，其中R¹为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、CH₃CH₂OCH₂和CH₃OCH₂。

16.权利要求10的药物组合物，其中R¹为甲基、CH₃CH₂OCH₂或CH₃OCH₂。