CN104630379A - 非小细胞型肺癌标志物fam107a及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非小细胞型肺癌标志基因FAM107A及其应用。本发明对非小细胞型肺癌高通量转录组数据进行Meta分析，筛选出候选基因FAM107A，并进一步采用分子生物学方法证实了FAM107A基因与非小细胞肺癌的关系：FAM107A在癌组织中的表达水平明显低于正常组织，并且FAM107A与非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞肺癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。

Description

非小细胞型肺癌标志物FAM107A及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，本发明涉及非小细胞型肺癌标志物FAM107A及所述标志物在制备非小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。

背景技术

肿瘤流行病学资料显示，肺癌己成为目前癌症死亡的首要原因，其总发病率在世界范围内呈上升趋势。2000年全球每年新诊断的肺癌病例达120万，占恶性肿瘤总发病率的12.3％。在己确诊的肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)患者占了80-85％。大约70％的患者发现时己经是IIIb期或者IV期。然而非小细胞肺癌诊疗水平的提高远落后于发病率的上升，绝大多数患者就诊时己属晚期，失去手术切除的机会，非小细胞肺癌术后5年生存率在I期患者为70％，而IIIa期则降低至30％以下。从国内外的研究进展来看，早期诊断、早期治疗是提高肺癌治疗效果、降低死亡率的首选策略，而如何早期诊断肺癌，如何寻找肺癌化疗过程中诱导耐药的关键机制，是目前迫切需要解决的问题。

转录组学是研究活细胞在某一功能状态下所含信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的类型和拷贝数，反应了某一特定时间和空间细胞内所有基因的表达情况。转录组动态反应了细胞的生长发育状态，不同生理、病理状态下以及不同细胞类型都具有细胞特异的转录组，了解转录组是解读细胞的分子功能、组成成分及其完成的生物过程所必需的，对我们理解生命体机体发育、疾病发生与预防都具有重要作用。

本发明对已发表的非小细胞型肺癌高通量转录组数据进行Meta分析，获得1063个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下调的基因599个，并利用KEGG、GO、OMIM等各种生物学信息数据库和MATLAB等分析工具对差异表达基因进行功能分析，进而筛选出影响肺腺癌发生发展的关键基因和重要的信号通路，另外基于数据挖掘分析的结果，筛选出候选基因FAM107A，并进一步采用分子生物学方法证实了FAM107A基因与非小细胞肺癌的关系：FAM107A与非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞肺癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明目的是提供了非小细胞型肺癌致病相关基因FAM107A。

本发明目的是提供了一种非小细胞型肺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测FAM107A基因。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

进一步，所述的检测试剂盒为检测上述FAM107A表达水平的荧光定量PCR试剂盒。优选采用引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

进一步，本发明还提供了上述荧光定量PCR试剂盒使用方法。

本发明目的是提供了一种非小细胞型肺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测FAM107A蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

进一步，所述检测试剂盒为检测FAM107A蛋白的ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的FAM107A单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒还包括：HRP标记的IgG抗体、辣根过氧化物酶、底物缓冲液、蛋白标准品、阴性对照样品BSA。

进一步，所述检测试剂盒为检测FAM107A蛋白的胶体金检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的FAM107A单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗FAM107A单克隆抗体、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

本发明目的是提供FAM107A基因和/或FAM107A蛋白在制备非小细胞型肺癌的诊断或者预后产品中的应用。

为实现上述目的，本发明对已发表的非小细胞型肺癌高通量转录组数据进行Meta分析，获得1063个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下调的基因599个，并利用KEGG、GO、OMIM等各种生物学信息数据库和MATLAB等分析工具对差异表达基因进行功能分析，进而筛选出影响肺腺癌发生发展的关键基因和重要的信号通路，另外基于数据挖掘分析的结果，筛选出候选基因FAM107A。

进而，本发明通过荧光定量PCR方法以5例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织和正常组织为样本验证筛选到的非小细胞型肺癌致病基因FAM107A在非小细胞型肺癌患病病人的癌组织和正常组织的表达情况。为了实现上述目的，本发明首先分别提取了5例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织和5例正常组织，对其总RNA的进行提取，设计了用于扩增FAM107A基因的2条引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，用于扩增内参基因β-actin的2条引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。制备了含有FAM107A基因序列的标准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用qRT-PCR的方法比较FAM107A基因在非小细胞型肺癌组织和正常组织中的表达水平。结果表明：qRT-PCR扩增结果稳定，其中FAM107A在正常组织中的表达水平明显高于非小细胞型肺癌癌组织，实验结果验证了生物信息学筛选结果。进一步，发明人在134例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织及癌旁组织中检测FAM107A基因表达情况，结果显示132例非小细胞型肺癌患病病人的癌组织中FAM107A基因表达低于癌旁组织中的表达，准确率达98.5％，即FAM107A基因与非小细胞型肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂。

本发明目的是提供了一种检测非小细胞型肺癌的荧光定量PCR试剂盒及其使用方法。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。所述荧光定量PCR反应液包括2×UltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water。

本发明还公开了一种检测非小细胞型肺癌的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：上游引物；下游引物；样品RNA 10pg-100ng；2×UltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)，SuperEnzyme Mix，加RNase-Free Water至25μL。荧光定量PCR程序：95℃10min预变性，接30-40个循环：95℃15s，60℃60s。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

所述的试剂盒应用于非小细胞型肺癌FAM107A基因的定量检测，一步法荧光定量PCR，方便快速，适用于临床检测。

本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为10⁶-10²copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。

本发明优点：

(a)本发明提供的FAM107A与非小细胞型肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂。

(b)本发明提供的检测FAM107A表达水平的荧光定量PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所用的整套试剂，并且采用了一步法荧光定量PCR，既方便临床使用，又保证了结果的一致性。

附图说明

图1RNA提取后凝胶电泳图

图2荧光定量扩增曲线图

图3荧光定量溶解曲线图

图4FAM107A基因在癌组织及正常组织中相对表达量图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1非小细胞型肺癌组织及正常组织FAM107A基因表达情况

一材料和方法

1、材料

收集5例非小细胞型肺癌癌组织及5例正常组织，对其进行分组及编号。

2、方法

2.1非小细胞型肺癌组织及正常组织总RNA的提取

按康为世纪超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit(DNase I)，货号CW0597)说明书提取非小细胞型肺癌组织及正常组织的RNA，结果见图1所示，凝胶电泳显示RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。

采用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取，主要操作步骤如下：

1.样品处理，30-50mg组织在液氮中充分研磨后加入1ml Buffer RLT，或在组织样品中加入1ml Buffer RLT后匀浆处理。

2.样品中加入Buffer RLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

3.以每1ml Buffer RLT加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。

4.4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。

5.在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase的水配制)，颠倒混匀。

6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2ml)的吸附柱(Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。

9.向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。

10.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

11.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

12.重复步骤11。

13.12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

14.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(Collection Tube 1.5ml)中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

15.总RNA完整性鉴定：取2μl RNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。

16.用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。

2.2FAM107A检测引物设计与合成

根据PCR引物设计原则，应用Premier 5.0和增强版的OligoArchitect^TM软件进行引物设计。

FAM107A的上、下游引物序列分别为：

上游引物：5'-AGAAGAAGAAGGAGGAGCTGGAA-3'；SEQ ID NO.1

下游引物：5'-TCTCTCTTCGCTGGTCAGTGTG-3'；SEQ ID NO.2

产物长度为185bp。

内参β-actin上、下游引物序列分别为：

上游引物：5'-ACTTAGTTGCGTTACACCCTT-3'；SEQ ID NO.3

下游引物：5'-GTCACCTTCACCGTTCCA-3'；SEQ ID NO.4

产物长度为156bp。

2.3定量标准曲线的建立

标准DNA模板的制备

按照说明书，从非小细胞型肺癌组织中，利用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA，接着用康为世纪SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤如下：1.将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2.配置反应体系，总体积为20μl：终浓度为50pg-5μg的RNA模板、2μl PrimerMix、4μl dNTP Mix、4μl RT Buffer、1μlSuperRT，加RNase-Free Water补平到20μl。

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2×Taq MasterMix(货号CW0682)进行常规PCR，反应体系和条件如下：2×Taq MasterMix 25μl、上下游引物各2μl、cDNA0.5μg、补平至50μl。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；最后72℃延伸2min。

取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在10⁸-10²copies/μl)。

2.3敏感性实验

取重组质粒按比例稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²个拷贝/μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为10⁸-10²copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。

2.4qRT-PCR检测FAM107A基因表达量

取上述5例非小细胞型肺癌组织和正常组织超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA，进而用UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)进行RT-PCR。具体步骤：

1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2.RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix 0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

4.将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应：反转录：45℃10min；95℃10min预变性，接45个循环：95℃15s，60℃60s。

对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows 11.5软件，相关数据采用χ2检验和Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软件来计算。

二结果

实时定量PCR扩增曲线(见图2)拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线(见图3)是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较FAM107A基因在非小细胞型肺癌组织和正常组织中的表达水平。结果显示(具体见图4)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中FAM107A在癌组织中的表达水平明显低于正常组织，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析FAM107A在非小细胞型肺癌组织中低表达的结果。

实施例2非小细胞型肺癌组织及癌旁组织FAM107A基因表达情况

一材料和方法

1、材料

非小细胞型肺癌取自于2005年-2010年住院病例，取134例非小细胞型肺癌癌组织及癌旁组织，对其进行分别编号。

2、方法

参考实施例1中的实验方法。

二结果

134例非小细胞型肺癌样品中，132例样品中FAM107A在癌组织中的表达水平低于癌旁组织，仅有2例样品中FAM107A在癌组织中的表达水平与癌旁组织没有明确区别，准确率为98.5％，表明FAM107A基因与非小细胞型肺癌具有很好的相关性，可用于制备非小细胞型肺癌辅助诊断或者预后制剂。

实施例3 一种检测非小细胞型肺癌中FAM107A基因的检测试剂盒及使用方法

RNA提取试剂：超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)

荧光定量试剂：UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)

荧光定量PCR反应体系及方法：

RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzyme Mix 0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。

反应调节：反转录：45℃10min；95℃10min预变性，接30-40个循环：95℃15s，60℃60s。

本发明采用生物信息学结合分子生物学实验验证，筛选出非小细胞型肺癌致病相关基因FAM107A，并提供了检测FAM107A表达水平的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便临床使用，又保证了结果的一致性，具有很好的临床应用前景。

Claims (10)

1.FAM107A基因在制备非小细胞型肺癌的诊疗产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的非小细胞型肺癌的诊疗产品包括用RT-PCR、基因芯片或免疫方法检测非小细胞型肺癌中FAM107A基因和/或FAM107A蛋白的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用于RT-PCR检测非小细胞型肺癌中FAM107A基因的产品含有一对特异性扩增FAM107A基因的引物；所述的基因芯片包括与FAM107A基因的核酸序列杂交的探针；所述用免疫方法检测非小细胞型肺癌的产品包括与FAM107A蛋白特异性结合的抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增FAM107A基因的引物上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测非小细胞型肺癌中FAM107A蛋白的产品为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。

6.一种检测非小细胞型肺癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因FAM107A，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。

7.根据权利要求7所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。

8.一种检测非小细胞型肺癌相关蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测FAM107A蛋白。

9.根据权利要求8所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：HRP标记的IgG抗体、辣根过氧化物酶、底物缓冲液、蛋白标准品、阴性对照样品BSA。

10.一种权利要求6-9任意一项所述的试剂盒在制备非小细胞型肺癌辅助诊疗制剂中的应用。