CN104630149A - 外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体，再将人工合成线粒体，通过内吞作用，进入哺乳动物细胞，得到含有外源线粒体的细胞，实现了外源线粒体在细胞内发挥有效功能。本发明导入后的人工合成线粒体DNA基因能够稳定表达，并可有效传代。本发明所述的外源线粒体导入到细胞中的方法，可作为全新的线粒体分子克隆方法，在线粒体中实现基因敲除，基因敲入，基因重排等，从而实现针对哺乳动物线粒体DNA的任意分子克隆改造，对线粒体DNA突变的疾病治疗有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物遗传工程领域，特别是涉及一种外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法。
背景技术
线粒体是真核生物最重要的细胞器，负责了细胞90%以上的能源供给，线粒体携带独立的基因组，线粒体DNA，具有与核基因组不同的独立的基因转录和蛋白翻译结构，哺乳动物细胞线粒体DNA编码了22条tRNA，2条rRNA，13条多肽。这些编码的多肽是线粒体进行有氧呼吸作用的各种蛋白复合体中非常关键的亚基，大量的研究表明，这些多肽的突变或表达降低均能明显抑制细胞有氧呼吸作用。
随着近代分子生物学的飞速发展，人类已经可以实现在核基因组中进行各种基因改造活动，如基因导入、基因敲除、定点突变、基因重排等等。然而，截至目前，人类对于线粒体的基因改造技术还非常不成熟，目前仅能在酵母等低等真核生物中实现线粒体基因改造，却一直没能在高等哺乳动物中实现。针对哺乳动物线粒体改造，目前已经报道的有多种尝试的方案，但总体而言，仍然没能真正实现。一种方案是在核基因组中表达目的基因，增加定位序列后导入线粒体，这种方案存在一些问题：首先，哺乳动物线粒体基因组大部分基编码的是功能RNA，而目前核基因组编码的RNA进入线粒体的机制还不是很清楚，已知的需要增加一段定位RNA序列，但这段序列是否会影响目标RNA的功能还是未知。另一方面，经过亿万年的进化，目前留在哺乳动物线粒体基因组中的这13条多肽与大部分核基因有很大不同，在核基因组中表达这些多肽有存在细胞毒性的可能，且这些多肽往往疏水性很强，不利于核基因组表达。第二种方案是开发线粒体特异性的转染介质，将目标基因转染进入线粒体。这方面有很多的文献报道，但由细胞外侧跨越三层膜结构而将目标核酸转入线粒体，是非常困难的，已经报道的例如地喹氯铵质体（DQAsome）、聚乙烯亚胺（PEI）及衍生物等等方法成功者寥寥无几，且已有的文献报道的方法引用率低，重复性不佳，因此该类方法也无法真正实现目标。第三种方案是利用核移植或者细胞胞质体杂交等技术，增加外源性野生型线粒体的比例从而实现改造线粒体遗传行为。这类方法无法根除内源性的线粒体和DNA，且该类方法会额外增加大量的外源细胞质成分，会带来一些不确定因素。第四种方案是表达靶向线粒体的TALEN分子，实现目标序列的破坏。这种方法已报道能成功破坏大片段缺失和特定点突变的线粒体DNA，是目前已报道的最有效的改造线粒体DNA的技术方法。但该方法依然存在很多的不足，一方面，对于特定的点突变，TALEN能否实现特异性选择目标序列仍有很多的疑问，另一方面，该方法只能针对性的破坏特定序列，还没法做到定点基因改造和基因导入。人类发现线粒体已经一百多年，发现线粒体DNA并致力于实现线粒体DNA改造也有几十年的时间，但直到目前，仍没能实现哺乳动物中线粒体DNA的有效基因改造，有效的哺乳动物线细胞内粒体基因改造技术是一个世界级的技术难题。
Craig J.Venter实验室2010年成功利用合成生物学技术获得了人工合成的小鼠线粒体DNA全序列，但没有对其进行任何改动，也未实现人工合成线粒体DNA在线粒体以及在哺乳动物细胞内的表达和功能鉴定。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种含有外源线粒体的哺乳动物细胞。
实现该目的的技术方案如下：
含有外源线粒体的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞具有内吞功能（内吞作用）。
所述线粒体是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体，也可是分离得到的哺乳动物细胞线粒体。
所述外源DNA可以是人工合成的线粒体DNA，也可以是分离得到的DNA,在其中一个实施例中，所述外源DNA是人工合成的线粒体DNA，其来源不受限制。
在其中一个实施例中，所述人工合成的线粒体DNA是经过人工基因改造的哺乳动物细胞线粒体DNA。当然，所述人工合成的线粒体DNA也可以是野生型哺乳动物细胞线粒体DNA。
本发明所述的哺乳动物细胞，是指具有内吞功能的细胞，最优选的是巨噬细胞。
本发明的另一目的是提供上述含有外源线粒体的细胞的制备方法。
具体技术方案如下：
上述含有外源线粒体的哺乳动物细胞的制备方法，包括以下步骤：将所得外源线粒体加入到培养有具有内吞作用的哺乳动物细胞的细胞培养体系中，继续培养，即得含有外源线粒体的细胞。
在其中一个实施例中，所述哺乳动物细胞是巨噬细胞；所述培养条件：36-38℃，水饱和密闭培养箱，4.5-5.5%CO2。
本发明的另一目的是提供一种人工合成线粒体。
具体技术方案如下：
一种人工合成线粒体，其是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的。
本发明还提供上述人工合成线粒体的制备方法。
人工合成线粒体的制备方法，包括以下步骤：
（1）得到外源DNA；
（2）制备到线粒体空壳或分离到的线粒体；
（3）将步骤（1）所得的外源DNA电击转化导入步骤（2）所述线粒体空壳或分离到的线粒体中，即得人工合成线粒体。
在其中一个实施例中，所述外源DNA为分离得到的野生型DNA；或所述外源DNA是人工合成线粒体DNA，所述人工合成线粒体DNA制备包括以下步骤：
（1）在哺乳动物线粒体DNA序列的基础上，通过基因导入、基因敲除、定点突变、基因重排中的至少一种基因改造方式，设计新的DNA序列组成；或得到野生型DNA序列组成；
（2）根据DNA序列的组成，合成50bp～60bp的DNA片段，通过Gibson等温一步法拼接而成，获得人工合成线粒体DNA。
本发明的另一目的是提供一种外源线粒体导入到细胞中的方法。
实现该目的的技术方案如下：
一种外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法，包括以下步骤：
（1）得到外源线粒体，
（2）将步骤（1）所得的外源线粒体加入到培养有内吞作用的哺乳动物细胞的细胞培养体系中，继续培养，得到含有外源线粒体的细胞。
在其中一个实施例中，所述外源线粒体是分离得到的哺乳动物细胞的线粒体。
在其中一个实施例中，所述外源线粒体是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体。
在其中一个实施例中，所述外源DNA是分离得到的野生型DNA。
在其中一个实施例中，所述外源DNA是人工合成线粒体DNA，所述人工合成线粒体DNA制备包括以下步骤：
（1）在哺乳动物线粒体DNA序列的基础上，通过基因导入、基因敲除、定点突变、和基因重排中的至少一种基因改造方式，设计新的DNA序列组成；或得到野生型DNA序列组成；
（2）根据DNA序列的组成，合成50bp～60bp的DNA片段，通过Gibson等温一步法拼接而成，获得人工合成线粒体DNA。
在其中一个实施例中，所述哺乳动物细胞是巨噬细胞。
在其中一个实施例中，所述培养条件：36-38℃，水饱和密闭培养箱，4.5-5.5%CO2。
本发明利用合成生物学技术，人工合成线粒体DNA全序列，在野生型序列基础上实现了GFP与COX-I的融合表达，这为线粒体基因组分子克隆提供了简单有效的技术方法。我们成功首次开发出基于巨噬细胞内吞作用的将外源线粒体DNA导入细胞内的方法，获得了稳定表达GFP的，可稳定传代的转人工合成线粒体DNA细胞。
本发明是世界上首次成功实现针对哺乳动物线粒体DNA的分子克隆操作，本发明基于巨噬细胞内吞作用的将外源线粒体DNA导入细胞内，可使外源线粒体中基因得以在哺乳动物细胞中稳定表达，并可有效传代，从而实现了外源线粒体在细胞内发挥有效功能。本发明所述的将外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法，可作为全新的线粒体分子克隆方法在线粒体中实现定点突变、基因插入、基因剔除、基因重排等，从而实现针对哺乳动物线粒体DNA的任意分子克隆改造，不存在来源局限性，且纯度高，对线粒体DNA突变的疾病治疗具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中所描述的外源线粒体进入巨噬细胞的结果。图1A为DsRed2检测结果，表示来源于NIH3T3的外源线粒体。图1B为EYFP检测结果，表示巨噬细胞内源的线粒体。图1C为双色叠加效果。
图2为实施例3中所述的体外组装的人工合成线粒体；图2A是组装的人工合成线粒体中检测到正确的转录产物，图2B是组装的人工合成线粒体中检测到DNA的复制。附图标记说明：M：分子量Marker；阳性：阳性对照；组装：组装的人工合成线粒体；阴性：阴性对照。
图3为实施例4中所述的GFP-COX I在小鼠巨噬细胞RAW264.7中融合表达，图3A为Mito-Tracker Red染料染色后指示的细胞内所有线粒体的位置Mito-Tracker Red为线粒体特异性的染料，图3B为绿色GFP-COX I融合基因的GFP信号，图3C为DAPI染色结果，指示细胞核的位置，图3D为三色叠加的结果。
具体实施方式
本发明中的所述的基因改造，是指通过体外设计与全合成的方法，构建目标序列的脱氧核糖核酸（DNA）分子，这些分子可以是任意人为设计的序列。本发明所述的基因改造，参照哺乳动物线粒体DNA序列，根据需求，可设计为与野生型完全一致的序列或进行任意序列改造，包括定点突变、基因插入、基因剔除、基因重排。
内吞作用（endocytosis）又称入胞作用，是通过质膜的变形运动将细胞外物质转运入细胞内的过程。根据入胞物质的不同大小，以及入胞机制的不同，可将内吞作用分为三种类型：吞噬作用、吞饮作用、受体介导的内吞作用。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例，结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1
本实施例是证实外源线粒体可以通过内吞作用进入哺乳动物细胞内。通过在巨噬细胞中稳定表达定位于线粒体的荧光蛋白EYFP，将巨噬细胞内源的线粒体标记上EYFP，在NIH3T3细胞中稳定表达定位于线粒体的荧光蛋白DsRed2，将NIH3T3细胞的线粒体标记上DsRed2，分离带有DsRed2标记的NIH3T3线粒体，加入巨噬细胞的培养体系中，12小时后在共聚焦显微镜中观察，能观察到DsRed2标记的线粒体进入巨噬细胞中，可以呈现出与巨噬细胞内源的EYFP标记的线粒体一致的形态。具体为：
1、小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞及NIH3T3细胞培养基（高糖DMEM（购自Hyclone，货号：SH30022.01B）；10%胎牛血清（购自GIBCO，货号：16000-044）；双抗（含10000U/ml青霉素和10000μg/ml链霉素，1:100稀释使用，购自GIBCO，货号：15140-122）），按照常规方法，分盘培养。
2、mitoDsRed2及mitoEYFP质粒是通过分子克隆手段构建获得，用标准的DsRed2（GenBank:AFS63392.1）和EYFP（GenBank:ACO48266.1）荧光蛋白序列在N端加上线粒体定位序列信号
（MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL），在pMXs载体中构建，电转法转染对应的细胞，流式分选单克隆培养，获得稳定表达荧光蛋白的细胞株。
3、利用普利莱线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒分离线粒体：
（1）用PBS洗涤细胞一次，以6000rpm离心5min，弃去上清液；
（2）收集管底的细胞沉淀，以1.5ml冰预冷的Mito-Cyto buffer重悬为细胞悬液，充分混匀，例如用特小号针头的5ml注射器来回抽吸细胞悬液约40次，得细胞匀浆物；
（3）将上述细胞匀浆物转移到离心管，以800×g在4℃下离心5min，此步骤可使细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等沉积在管底；
（4）弃去沉淀，将上清液转移到新的离心管中，再次以800×g在4℃下离心5min；
（5）弃去沉淀，将上清液转移到新的离心管，以12,000×g在4℃下离心10min，此时线粒体空壳沉淀在管底。
4、将上述所得的线粒体空壳沉淀，用200μLRAW264.7细胞培养基重悬，均匀加入分好的培养皿中，在37℃，水饱和密闭培养箱，5%CO2下培养，经过内吞后，12小时后即可观察，所得结果如图1所示。
实施例2
本实施例是向小鼠线粒体DNA中通过基因导入，即插入GFP和Linker序列，引物合成、DNA拼接来获得设计序列的环状线粒体DNA，即含GFP-COX-I融合基因的环状线粒体DNA。
1、设计新的人工环状线粒体DNA：
本实施例是向小鼠线粒体DNA中通过基因导入，即插入GFP和Linker序列来获得环状线粒体DNA，具体来说，基于已知的野生型C57 BL/6J小鼠的线粒体DNA序列（序列来源：NCBI GenBank:EF108336）并在其5328位点插入了GFP基因和Linker的序列（具体如Seq.ID No.1所示），设计得到5Kb左右的含GFP-COX-I融合基因的环状线粒体DNA。
2、根据上述设计后的环状线粒体DNA的具体组成，利用普通引物合成方法，获得多个待拼接的50bp～60bp的DNA片段。
3、DNA拼接：
（1）根据现有技术，采用Gibson等温一步法进行DNA拼接，所用Gibson等温一步法的酶体系为：取320μl 5X ISO buffer（25%PEG-8000、500mM Tris-HClpH7.5、50mM MgCl2、50mM DTT、4种dNTPs各1mM、5mM NAD）、0.64μl10U/μl T5外切酶Epicentre、20μl 2U/μl Phusion聚合酶、160μl 40U/μl Taq连接酶并混合，加无菌水至1.2ml，分装后-20℃保存备用；
（2）采用Gibson等温一步法，将待拼接片段按等比例混匀，终浓度为2ng/μl；取5μl混合物，15μl上述酶体系，混匀，在50℃孵育1小时，即可获得拼接正确的片段。
4、DNA的收集、纯化，并通过测序，测定拼接的片段为上面所设计的环状线粒体DNA。
实施例3
本实施例描述将实施例2中所获得的环状线粒体DNA与NIH3T3 Rho0细胞的线粒体空壳进行体外组装，制成人工合成线粒体的过程，以及对人工合成线粒体的RNA和DNA的提取和鉴定过程。图2所示为人工合成线粒体中检测到正确的转录产物（图2A）和DNA复制（图2B）。
一、不含线粒体DNA的Rho0细胞的培养：
1、向NIH3T3细胞培养基中加入1.5μg/mL地特氯胺（ditercalinium）或250ng/mL溴化乙锭、50μg/mL的尿嘧啶核苷（Sigma公司）以及110μg/mL丙酮酸钠；
2、按照常规方法，连续培养一个月；
3、用NIH3T3 Rho0培养基（高糖DMEM，10%胎牛血清，50μg/mL的尿嘧啶核苷，110μg/mL丙酮酸钠，青霉素和链霉素双抗）培养；
4、收集细胞，即获得不含线粒体DNA的NIH3T3 Rho0细胞。
二、Rho0细胞线粒体空壳的分离：
1、利用普利莱线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒分离线粒体：
（1）用PBS洗涤细胞一次，以6000rpm离心5min，弃去上清液；
（2）收集管底的细胞沉淀，以1.5ml冰预冷的Mito-Cyto buffer重悬为细胞悬液，充分混匀，例如用特小号针头的5ml注射器来回抽吸细胞悬液约40次，得细胞匀浆物；
（3）将上述细胞匀浆物转移到离心管，以800×g在4℃下离心5min，此步骤可使细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等沉积在管底；
（4）弃去沉淀，将上清液转移到新的离心管中，再次以800×g在4℃下离心5min；
（5）弃去沉淀，将上清液转移到新的离心管，以12,000×g在4℃下离心10min，此时线粒体空壳沉淀在管底。
三、线粒体空壳与DNA序列的组装（电击转化）：
（1）用50μl电转buffer（0.33M蔗糖，10%甘油）重悬线粒体空壳沉淀；
（2）向管内加入10μg线粒体基因组（空白组加入10μl TE buffer），混匀;
（3）将混匀的悬液放入1mm电击杯中，加以电击一次（参数：电场强度：12～16Kv/cm，电容：25μF，电阻：400Ω）；
（4）电击后，立即往电击杯内加入1ml Incubation buffer 1（40mM Tri-HCl7.4；25mM NaCl；5mM MgCl2；10%甘油），用移液枪吹打混匀；
（5）转移至新的2ml离心管中，以21000g/min在4℃下离心10min，弃去上清液;
（6）用1ml Incubation buffer 1洗涤沉淀两次。
四、人工合成线粒体的RNA的提取、反转录和鉴定：
1、人工合成线粒体RNA的初步提取：
（1）用50μl Incubation buffer 2（40mM Tri-HCl 7.4；25mM NaCl；5mMMgCl2；10%甘油；1mM丙酮酸盐；1mM ATP；1mg/ml BSA）重悬沉淀，在37℃下孵育3h；
（2）加入1ml Incubation buffer 2，洗涤三次，在4℃下以1000g/min,10min离心；
（3）用移液枪尽量吸尽上清液后，加入10μl Roche DNase I、5μl 10×DNaseI buffer（110mM Tris-HCl 7.4；32.5mM MgCl2）以及35μl Incubation buffer 2，重悬，在37℃下孵育30min；
（4）用1ml washing buffer（10%甘油；10mM Tri-HCl 7.4；150mM NaCl；1mM EDTA）洗涤三次，在4℃下1000g/min,10min离心。
2、用Qiagen RNA提取试剂盒提取人工合成线粒体RNA：
（1）加入700μl QIAzol Lysis Reagent，用移液枪吹打重悬，室温放置5min；
（2）加入140μl氯仿，充分震荡15s，室温放置2～3min；
（3）以12000g转速，在4℃下离心15min；
（4）转移上清液至新的EP离心管内（RNase free），加入1.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；
（5）将混匀后的溶液加入离心柱内（柱容量为700μl，余下的可分次加入），以大于8000g转速在室温下离心15s；
（6）加入700μl Buffer RWT，以大于8000g转速在室温下离心15s；
（7）加入500μl Buffer RPE，以大于8000g转速在室温下离心15s；
（8）加入500μl Buffer RPE，以大于8000g转速在室温下离心2min；
（9）换一个2ml收集管，21000g/min,室温离心1min；
（10）将离心柱转移至一个新的1.5mlEP管中，加入40μl的无RNase水，以大于8000g转速在室温下离心1min；
（11）将EP管内洗脱下来的RNA重新上柱，以大于8000g转速在室温下离心1min；
3、人工合成线粒体RNA的体外反转录：
（1）消化RNA中的DNA：以Promega DNase I在37℃下消化30min，消化体系如下：
10X DNase I buffer 1μl
DNase I 1μl
RNA 8μl
（2）消化后，加入1μl stop buffer，在65℃下处理10min；
（3）RNA的反转录：取消化后的RNA，在65℃下处理5min，处理体系如下：
消化后的RNA 8μl
随机引物 1μl
10mM dNTP 1μl
处理结束后，立即取出放置冰上冷却；
（4）加入以下试剂并吹打混匀：
依次进行下列温度处理：
25℃ 10min
50℃ 50min
85℃ 5min
处理结束后，立即取出放置冰上冷却；
（5）加入1μl RNase H，混匀，37℃孵育20min，得到的cDNA于-20℃保存。
4、用PrimeSTAR酶鉴定cDNA中转录产物:
（1）PCR反应体系如下：
反应条件：
98℃ 10sec
55℃ 12sec
72℃ 1min
循环数：30个循环。
（2）对PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并拍照检测，所得结果如图1A所示，其中“阳性”泳道为NIH3T3细胞中分离线粒体RNA反转的cDNA为模板的PCR产物，“组装”泳道为电转后分离获得的cDNA的PCR产物，“阴性”泳道为只用水做模板的PCR产物。
五、人工合成线粒体DNA的体外复制检测：
1、将电转后的线粒体沉淀用50μl Incubation buffer 2重悬，加入含1μCialpha-32p-dCTP的dNTP，37℃下孵育3h；
2、用天根细胞总DNA提取试剂盒收集总DNA；
3、用BstUI限制性内切酶65℃下酶切过夜；
4、以酶切产物进行5%丙烯酰胺凝胶电泳，结束后取出凝胶，在通风橱中晾干，用放射自显影曝光检测，所得结果如图1B所示，图中“阳性”泳道为NIH3T3细胞中分离线粒体的线粒体DNA同位素掺入后的产物，“组装”泳道为电转后的线粒体DNA同位素掺入后的产物，“阴性”泳道为只用水做的同位素掺入后的产物。
实施例4
本实施例是含GFP-COX-I融合基因的人工合成线粒体经内吞进入小鼠巨噬细胞系的过程，所得结果如图3所示。
（1）小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞培养基（高糖DMEM（购自Hyclone，货号：SH30022.01B），10%胎牛血清（购自GIBCO，货号：16000-044），双抗（含10000U/ml青霉素和10000μg/ml链霉素，1:100稀释使用，购自GIBCO，货号：15140-122）），按照常规方法，分盘培养；
（2）将实施例3中电击转化后所得
的人工合成线粒体沉淀，用200μLRAW264.7细胞培养基重悬，均匀加入分好的培养皿中，在37℃，水饱和密闭培养箱，5%CO2下培养，经过内吞后，12小时后即可观察到表达绿色荧光蛋白的含有外源线粒体的小鼠巨噬细胞，培养12小时后换液，再培养12小时后，观察鉴定，所得结果如图3所示。
该结果清晰的表明我们设计的GFP-COX I融合基因能正确的在线粒体中表达。图3中，图3A为线粒体特异性染料Mitotracker Red染色的结果。图3B为GFP检测结果。图3C为DAPI染色，指示细胞核位置。图3D为三色叠加效果。
本实施例通过设计的GFP-COX I融合基因证实其在巨噬细胞中能稳定表达。当然，分离得到的未经过基因改造的线粒体（例如分离得到的线粒体，或者是人工合成线粒体，其DNA序列为野生型的哺乳动物线粒体DNA），也可以通过吞噬作用，进入巨噬细胞，从而在巨噬细胞中稳定表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (18)
1.含有外源线粒体的哺乳动物细胞，所述细胞具有内吞功能。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，其特征是，所述外源线粒体是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体。
3.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞，其特征是，所述外源DNA是人工合成的线粒体DNA。
4.根据权利要求3所述的哺乳动物细胞，其特征是，所述人工合成的线粒体DNA是经过人工基因改造的哺乳动物细胞线粒体DNA。
5.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，其特征是，所述外源线粒体是分离得到的哺乳动物细胞线粒体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的哺乳动物细胞，其特征是，所述细胞是巨噬细胞。
7.权利要求1所述的含有外源线粒体的哺乳动物细胞的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
将所得外源线粒体加入到培养有具有内吞功能的哺乳动物细胞的细胞培养体系中，继续培养，即得含有外源线粒体的细胞。
8.根据权利要求7中所述的制备方法，其特征是，
所述具有内吞功能的哺乳动物细胞是巨噬细胞；
所述培养条件：36-38℃，水饱和密闭培养箱，4.5-5.5%CO2。
9.一种人工合成线粒体，其特征是，其是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的。
10.权利要求9所述的人工合成线粒体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）得到外源DNA；
（2）制备到线粒体空壳或分离得到线粒体；
（3）将所述外源DNA电击转化导入所述线粒体空壳或分离到的线粒体中，即得人工合成线粒体。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是，
所述外源DNA为分离得到的野生型DNA；
或所述外源DNA是人工合成线粒体DNA，所述人工合成线粒体DNA制备包括以下步骤：
（1）参照哺乳动物线粒体DNA序列，根据需求，通过基因导入、基因敲除、定点突变和基因重排中的至少一种基因改造方式，设计新的DNA序列组成；或得到野生型DNA序列组成；
（2）根据DNA序列的组成，合成50bp～60bp的DNA片段，通过Gibson等温一步法拼接而成，获得人工合成线粒体DNA。
12.一种外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）得到外源线粒体；
（2）将所得外源线粒体加入到培养有具有内吞功能的哺乳动物细胞的细胞培养体系中，继续培养，得到含有外源线粒体的细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征是，所述外源线粒体是分离得到的哺乳动物细胞线粒体。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征是，所述外源线粒体是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线粒体。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征是，所述外源DNA是分离得到的野生型DNA。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征是，所述外源DNA是人工合成线粒体DNA，所述人工合成线粒体DNA制备包括以下步骤：
（1）参照哺乳动物线粒体DNA序列，根据需求，通过基因导入、基因敲除、定点突变和基因重排中的至少一种基因改造方式，设计新的DNA序列组成；或得到野生型DNA序列组成；
（2）根据DNA序列的组成，合成50bp～60bp的DNA片段，通过Gibson等温一步法拼接而成，获得人工合成线粒体DNA。
17.根据权利要求12-16任一项所述的方法，其特征是，所述哺乳动物细胞是巨噬细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征是，所述培养条件：36-38℃，水饱和密闭培养箱，4.5-5.5%CO2。
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