CN104619340B - 含有抗pcsk9抗体的稳定制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的抗体来治疗或预防胆固醇相关疾病(如高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常)的方法。还描述了制剂及产生所述制剂的方法。

Description

含有抗PCSK9抗体的稳定制剂

相关申请

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参考序列表

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发明领域

本发明涉及使用针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的抗原结合蛋白(包括抗体)来治疗或预防胆固醇相关疾病(如高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常)的方法。还描述了药物制剂及产生所述制剂的方法。

背景

“胆固醇相关疾病”(其包括”血清胆固醇相关疾病”)包括以下任何一种或多种：高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管疾病、阿兹海默症(Alzheimer's disease)以及(一般来说)血脂异常，其可表现为例如总血清胆固醇升高、LDL升高、甘油三酯升高、VLDL升高和/或低HDL。实际上，高胆固醇血症为人类冠心病(CHD)的一个已确定的风险因素。降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)会使心血管风险降低并且是针对CHD的药物疗法的主要目标。他汀类(Statin)(羟甲基戊二酰基辅酶A[HMG CoA]还原酶抑制剂)为当前用于高胆固醇血症治疗的首选。然而，新出现的数据指示更积极的高胆固醇血症治疗伴有更低的CHD事件风险。此外，一部分患者不耐受他汀类疗法或不对他汀类疗法充分起反应。因此，可单独或与现有药剂组合使用来更有效地降低LDL-C的新型疗法可能有用。

充分确定的是肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)的再循环通过调控血浆LDL-C水平而在维持细胞和全身胆固醇平衡方面起关键作用。更近来，已经显示前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)在LDLR的再循环及调控方面起重要作用。PCSK9为丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶家族的成员并且主要在肝脏中表达。在分泌之后，它通过涉及直接结合LDLR的机制使肝细胞表面LDLR发生转译后下调。肝LDLR的下调又致使循环的LDL-C的水平增加。因此，PCSK9可以代表高胆固醇血症背景下新型治疗剂所抑制的目标。所述方法的强有力的理论依据可以从临床前模型的研究并且从以下研究结果获得：具有PCSK9功能丧失型突变的人的胆固醇水平低于正常且CHD的发病率降低。

各种实施方案的概述

在一些方面，本发明包括一种降低患者的血清LDL胆固醇水平的方法。所述方法包括以约10mg至约1400mg的剂量向有需要的患者施用至少一种如本文描述的抗PCSK9抗体。在一些实施方案中，剂量为约10mg至约70mg的至少一种抗PCSK9抗体，每周施用一次(QW)。在一些实施方案中，剂量为约14mg至约45mg的至少一种抗PCSK9抗体，每周施用一次。在一些实施方案中，剂量为约14mg至约35mg的至少一种抗PCSK9抗体，每周施用一次。在一些实施方案中，剂量为约70mg至约420mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约70mg至约350mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约105mg至约350mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约140mg至约280mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约250mg至约480mg的至少一种抗PCSK9抗体，每4周施用一次(Q4W)。在一些实施方案中，剂量为约280mg至约420mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约350mg至约420mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q4W)。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％。

在一些方面，本发明包括降低患者的血清LDL胆固醇水平的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是按照选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(Q2W)至少约70mg的量；(4)每两周(Q2W)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每两周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％。

在一些方面，本发明包括一种降低患者的PCSK9值的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是根据选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(Q2W)至少约70mg的量；(4)每两周(Q2W)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每隔一周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，所述血清PCSK9值降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约90％。

在一些方面，本发明包括一种降低患者的总胆固醇水平的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是根据选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(QW)至少约70mg的量；(4)每隔一周(QW)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每隔一周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，所述总胆固醇水平降低了至少约20％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约25％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约60％。

在一些方面，本发明包括一种降低患者的非HDL胆固醇水平的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是根据选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(QW)至少约70mg的量；(4)每隔一周(QW)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每隔一周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，所述非HDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约85％。

在一些方面，本发明包括一种降低患者的ApoB水平的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是根据选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(QW)至少约70mg的量；(4)每隔一周(QW)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每隔一周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，所述ApoB水平降低了至少约20％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约25％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约75％。

在一些方面，本发明包括一种降低患者的脂蛋白A(“Lp(a)”)水平的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是根据选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(QW)至少约70mg的量；(4)每隔一周(QW)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每隔一周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，所述Lp(a)水平降低了至少约10％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约15％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约20％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约25％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约65％。

在一些方面，本发明包括一种治疗或预防患者的胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用约10mg至约480mg剂量的至少一种本文所述的抗PCSK9抗体。在一些实施方案中，剂量为约10mg至约70mg的至少一种抗PCSK9抗体，每周施用一次(QW)。在一些实施方案中，剂量为约14mg至约35mg的至少一种抗PCSK9抗体，每周施用一次。在一些实施方案中，剂量为约70mg至约420mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约70mg至约350mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约105mg至约350mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约140mg至约280mg的至少一种抗PCSK9抗体，每2周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约250mg至约480mg的至少一种抗PCSK9抗体，每四周施用一次(Q4W)。在一些实施方案中，剂量为约280mg至约420mg的至少一种抗PCSK9抗体，每两周施用一次(Q2W)。在一些实施方案中，剂量为约350mg至约420mg的至少一种抗PCSK9抗体，每两周施用一次(Q4W)。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％。在一些实施方案中，胆固醇相关疾病是高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常。

在一些方面，本发明包括一种治疗或预防患者的胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一定剂量的至少一种抗PCSK9抗体，并且其中所述剂量的抗PCSK9抗体是根据选自由以下组成的组的日程安排施用：(1)每周(QW)至少约14mg；(2)每周(QW)至少约35mg的量；(3)每隔一周(QW)至少约70mg的量；(4)每隔一周(QW)至少约105mg的量；(5)每隔一周(Q2W)至少约140mg的量；(6)每隔一周(Q2W)至少约280mg的量；和(7)每四周(Q4W)至少约280mg的量；(8)每四周(Q4W)至少约350的量；(9)每四周(Q4W)至少约420mg的量。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％。

在一些实施方案中，抗PCSK9抗体为21B12、26H5、31H4、8A3、11F1和/或8A1。

在一些实施方案中，所述胆固醇相关疾病是高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常。

在一些方面，本发明包括药物制剂，其包含至少一种选自由21B12、26H5、31H4、8A3、11F1及8A1组成的组的抗PCSK9抗体。

本发明的其它实施方案将易于根据本文提供的公开显而易知。

附图简述

图1A描述PCSK9的成熟形式的氨基酸序列，其中前结构域加下划线。

图1B₁-1B₄描述PCSK9的氨基酸和核酸序列，其中前结构域加下划线且信号序列用粗体表示。

图2A-2D为不同抗原结合蛋白的各种轻链的序列比较表。图2C接续图2A中开始的序列。图2D接续图2B上开始的序列。

图3A-3D为不同抗原结合蛋白的各种重链的序列比较表。图3C接续图3A中开始的序列。图3D接续图3B上开始的序列。

图3E-3JJ描述抗原结合蛋白的一些实施方案的可变域的氨基酸和核酸序列。

图3KK描述各种恒定域的氨基酸序列。

图3LL-3BBB描述抗原结合蛋白的一些实施方案的可变域的氨基酸和核酸序列。

图3CCC-3JJJ为抗原结合蛋白的一些实施方案的各种重链及轻链的序列比较表。

图4A为抗原结合蛋白与人类PCSK9的结合曲线。

图4B为抗原结合蛋白与人类PCSK9的结合曲线。

图4C为抗原结合蛋白与食蟹猕猴PCSK9的结合曲线。

图4D为抗原结合蛋白与食蟹猕猴PCSK9的结合曲线。

图4E为抗原结合蛋白与小鼠PCSK9的结合曲线。

图4F为抗原结合蛋白与小鼠PCSK9的结合曲线。

图5A描述涉及PCSK9及不同抗原结合蛋白的SDS PAGE实验的显示蛋白质的相对纯度和浓度的结果。

图5B和5C描述21B12的来自Biacore溶液平衡测定的图。

图5D描述来自Biacore捕捉测定的动力学的图。

图5E描述描绘3种ABP的分级(binning)结果的柱状图。

图6A为体外PCSK9:LDLR结合测定中针对PCSK9的抗原结合蛋白31H4IgG2的抑制曲线。

图6B为体外PCSK9:LDLR结合测定中针对PCSK9的抗原结合蛋白31H4IgG4的抑制曲线。

图6C为体外PCSK9:LDLR结合测定中针对PCSK9的抗原结合蛋白21B12IgG2的抑制曲线。

图6D为体外PCSK9:LDLR结合测定中针对PCSK9的抗原结合蛋白21B12IgG4的抑制曲线。

图7A为细胞LDL摄取测定中抗原结合蛋白31H4IgG2的抑制曲线，其显示ABP降低PCSK9的LDL摄取阻断效应的作用。

图7B为细胞LDL摄取测定中抗原结合蛋白31H4IgG4的抑制曲线，其显示ABP降低PCSK9的LDL摄取阻断效应的作用。

图7C为细胞LDL摄取测定中抗原结合蛋白21B12IgG2的抑制曲线，其显示ABP降低PCSK9的LDL摄取阻断效应的作用。

图7D为细胞LDL摄取测定中抗原结合蛋白21B12IgG4的抑制曲线，其显示ABP降低PCSK9的LDL摄取阻断效应的作用。

图8A为描述ABP 31H4在小鼠中降低血清胆固醇的能力的图，其中变化是相对于IgG对照治疗的小鼠(*p<0.01)。

图8B为描述ABP 31H4在小鼠中降低血清胆固醇的能力的图，其中变化是相对于时间＝0小时(#p，0.05)。

图8C为描述ABP 31H4对C57Bl/6小鼠的HDL胆固醇水平的影响的图(*p<0.01)。

图8D为描述ABP 31H4对C57Bl/6小鼠的HDL胆固醇水平的影响的图(#p<0.05)。

图9描述在各个时间点之后ABP 31H4增加存在的肝脏LDLR蛋白的量的能力的蛋白质印迹分析。

图10A为描述抗原结合蛋白31H4降低野生型小鼠的总血清胆固醇的能力(相对值)的图。

图10B为描述抗原结合蛋白31H4降低野生型小鼠的HDL的能力的图。

图10C为描述不同抗原结合蛋白31H4和16F12降低血清胆固醇的能力的图。

图11A描述用于测试抗原结合蛋白降低血清胆固醇的持续时间及能力的注射方案。

图11B为描述图11A中的方案的结果的图。

图12A描述HepG2细胞中响应于他汀类与ABP 21B12的组合的LDLR水平。

图12B描述HepG2细胞中响应于他汀类与ABP 31H4的组合的LDLR水平。

图12C描述HepG2细胞中响应于他汀类与ABP 25A7.1(一种非中和性抗体)(与中和性抗体“25A7”不同)的组合的LDLR水平。

图12D描述过度表达PCSK9的HepG2细胞中响应于他汀类与ABP 21B12的组合的LDLR水平。

图12E描述过度表达PCSK9的HepG2细胞中响应于他汀类与ABP 31H4的组合的LDLR水平。

图12F描述过度表达PCSK9的HepG2细胞中响应于他汀类与ABP 25A7.1(一种非中和性抗体)(与中和性抗体“25A7”不同)的组合的LDLR水平。

图13A描述针对PCSK9的不同ABP的各种轻链氨基酸序列。点(.)指示无氨基酸。

图13B描述针对PCSK9的不同ABP的轻链支序图。

图13C描述针对PCSK9的不同ABP的各种重链氨基酸序列。点(.)指示无氨基酸。

图13D描述针对PCSK9的不同ABP的重链树状图。

图13E描述轻链CDR和重链CDR的比较以及对产生共有序列的群组的指定。

图13F描述群组1和2的共有序列。

图13G描述群组3和4的共有序列。

图13H描述群组1和2的共有序列。点(.)指示一致残基。

图13I描述群组2的共有序列。点(.)指示一致残基。

图13J描述群组3和4的共有序列。点(.)指示一致残基。

图14为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患者的LDL-c水平降低的图。

图15为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的服用低至中等及高剂量他汀类的患者的LDL-c水平降低的图。

图16为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患者的ApoB水平降低的图。

图17为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的服用低至中等及高剂量他汀类的患者的脂蛋白a(“Lp(a)”)水平降低的柱状图。

图18为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患有杂合子家族性高胆固醇血症(“HeFH”)的患者的LDL-c水平降低的图。

图19为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患有杂合子家族性高胆固醇血症(“HeFH”)的患者的PCSK9水平降低的图。

图20为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患有杂合子家族性高胆固醇血症(“HeFH”)的患者的总胆固醇水平降低的图。

图21为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患有杂合子家族性高胆固醇血症(“HeFH”)的患者的非HDL胆固醇水平降低的图。

图22为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患有杂合子家族性高胆固醇血症(“HeFH”)的患者的ApoB水平降低的图。

图23为展示接受多剂量的抗PCSK9抗体(21B12)的患有杂合子家族性高胆固醇血症(“HeFH”)的患者的脂蛋白a(“Lp(a)”)降低的柱状图。

图24A为展示与患者的LDL-C降低相关的集合数据的图，所述患者来自实施例22-25中所述的四个研究且历经12周每隔一周(Q2W)接受不同剂量的抗PCSK9抗体(21B12)。

图24B为展示与患者的LDL-C降低相关的集合数据的图，所述患者来自实施例22-25中所述的四个研究且历经12周每四周(Q4W)接受不同剂量的抗PCSK9抗体(21B12)。

图25A为展示与患者的Lp(a)降低相关的集合数据的柱状图，所述患者来自实施例22-25中所述的四个研究且历经12周每隔一周(Q2W)或每4周(Q4W)接受不同剂量的抗PCSK9抗体(21B12)。

图25B为展示与患者的HDL-C降低相关的集合数据的柱状图，所述患者来自实施例22-25中所述的四个研究且历经12周每隔一周(Q2W)或每4周(Q4W)接受不同剂量的抗PCSK9抗体(21B12)。

图25C为展示与患者的甘油三酯降低相关的集合数据的柱状图，所述患者来自实施例22-25中所述的四个研究且历经12周每隔一周(Q2W)或每4周(Q4W)接受不同剂量的抗PCSK9抗体(21B12)。

图25D为展示与患者的VLDL-C降低相关的集合数据的柱状图，所述患者来自实施例22-25中所述的四个研究且历经12周每隔一周(Q2W)或每4周(Q4W)接受不同剂量的抗PCSK9抗体(21B12)。

图26为展示含有不同稳定剂/赋形剂的抗PCSK9抗体(21B12)制剂的粘度的柱状图。

图27为展示稳定剂/赋形剂脯氨酸能够降低具有高蛋白质浓度的抗PCSK9抗体(21B12)制剂的粘度的图。

图28A为展示不同浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图28B为展示不同浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下，相较于在包含10mM乙酸钠、125mM精氨酸及3％蔗糖(pH5.0)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图28C为展示不同浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下，相较于在包含10mM乙酸钠、100mM蛋氨酸及4％蔗糖(pH5.0)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图28D为展示不同浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下，相较于在包含10mM乙酸钠及250mM脯氨酸(pH 5.0)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图29A为展示历经6个月10μm粒子在抗PCSK9抗体(即21B12)制剂的不同制剂中的数目的柱状图。

图29B为展示历经6个月25μm粒子在抗PCSK9抗体(即21B12)制剂的不同制剂中的数目的柱状图。

图30A为展示历经4个月10μm粒子在抗PCSK9抗体(即11F1)制剂的不同制剂中的数目的柱状图。

图30B为展示历经4个月25μm粒子在抗PCSK9抗体(即11F1)制剂的不同制剂中的数目的柱状图。

图31为说明竞争测定中11F1与PCSKP、PCSK2、PCSK1、PCSK7及弗林蛋白酶的结合特异性的图，其中OD₄₅₀绘制在垂直轴上且PCSK9的浓度(ug/ml)绘制在水平轴上。

图32为展示竞争测定中11F1抑制LDLR:D374Y PCSK9结合的剂量反应曲线的图，其中OD₄₅₀绘制在垂直轴上且Log[11F1](pM)绘制在水平轴上。

图33为描述竞争测定中11F1抑制LDLR:WT PCSK9结合的剂量反应曲线的图，其中OD₄₅₀绘制在垂直轴上且Log[11F1](pM)绘制在水平轴上。

图34为描述11F1阻断HepG2细胞中由人类D374YPCSK9介导的LDL摄取降低的能力的剂量反应曲线的图，其中相对荧光单位(×10⁴)绘制在垂直轴上且Log[11F1](nM)绘制在水平轴上。

图35为描述11F1阻断HepG2细胞中由人类WT PCSK9介导的LDL摄取降低的能力的剂量反应曲线的图，其中相对荧光单位绘制(×10⁴)在垂直轴上且Log[11F1](nM)绘制在水平轴上。

图36为描述11F1和8A3对由AAV表达人类PCSK9的小鼠的血清非HDL胆固醇的影响的柱状图，其中非HDL-C血清浓度(mg/ml)绘制在垂直轴上且注射后时间(天)绘制在水平轴上。

图37为描述11F1和8A3对由AAV表达人类PCSK9的小鼠的血清总胆固醇的影响的柱状图，其中血清总胆固醇(mg/ml)绘制在垂直轴上且注射后时间(天)绘制在水平轴上。

图38为描述11F1和8A3对由AAV表达人类PCSK9的小鼠的血清HDL胆固醇(HDL-C)的影响的柱状图，其中HDL-C(mg/ml)绘制在垂直轴上且注射后时间(天)绘制在水平轴上。

图39为描述由AAV表达人类PCSK9的小鼠的IgG2、8A3及11F1抗体浓度概况的图，其中血清抗体浓度(ng/mL)绘制在垂直轴上且以天计的注射后时间绘制在水平轴上。

图40为概述由AAV表达人类PCSK9的小鼠的IgG2、11F1及8A3的PK参数的表。

图41为描述单次皮下施用抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1对食蟹猕猴的血清LDL浓度(LDL-C)的影响的图，其中LDL-C(mg/dl)绘制在垂直轴上且以天计的施用后时间在水平轴上。

图42为描述单次皮下施用抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1对食蟹猕猴的血清总胆固醇的影响的图，其中总胆固醇浓度(mg/dl)绘制在垂直轴上且以天计的施用后时间在水平轴上。

图43为描述单次皮下施用抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1对食蟹猕猴的血清HDL胆固醇的影响的图，其中HDL-C(mg/dl)绘制在垂直轴上且以天计的施用后时间在水平轴上。

图44为描述单次皮下施用抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1对食蟹猕猴的血清甘油三酯的影响的图，其中血清甘油三酯浓度(mg/dl)绘制在垂直轴上且以天计的施用后时间在水平轴上。

图45为描述单次皮下施用抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1对食蟹猕猴的载脂蛋白B(ApoB)的影响的图，其中APOB浓度(mg/dl)绘制在垂直轴上且以天计的施用后时间在水平轴上。

图46为描述抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1在食蟹猕猴中的平均药物动力学概况的图，其中抗体浓度(ng/ml)绘制在垂直轴上且以天计的施用后时间在水平轴上。

图47为概述抗KLH抗体(对照)、21B12、8A3及11F1在食蟹猕猴中的PK参数的表。

某些示例性实施方案的详述

本文公开了结合PCSK9的抗原结合蛋白(如抗体及其功能性结合片段)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白以不同方式结合PCSK9并阻止PCSK9起作用。在一些实施方案中，抗原结合蛋白阻断或降低PCSK9与其它物质相互作用的能力。举例来说，在一些实施方案中，抗原结合蛋白以防止或降低PCSK9将结合LDLR的可能性的方式结合PCSK9。在其它实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK9但不阻断PCSK9与LDLR相互作用的能力。在一些实施方案中，抗原结合蛋白为人类单克隆抗体。

如本领域技术人员应了解，根据本公开，改变PCSK9与LDLR之间的相互作用可增加可用于结合LDL的LDLR的量，这又会降低受试者的血清LDL的量，从而使受试者的血清胆固醇水平降低。因而，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗血清胆固醇水平升高、处于血清胆固醇水平升高的风险中或可能受益于其血清胆固醇水平降低的受试者的各种方法和制剂中。因此，本文还描述了用于降低血清胆固醇、维持血清胆固醇或防止血清胆固醇增加的各种方法和技术。在一些实施方案中，抗原结合蛋白允许PCSK9与LDLR之间的结合，但抗原结合蛋白防止或降低PCSK9对LDLR的不利活性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白防止或降低PCSK9与LDLR的结合。

为了方便起见，以下章节总体上概述本文所用术语的各种含义。根据此论述，论述关于抗原结合蛋白的总体方面，之后为显示抗原结合蛋白的各种实施方案的性质及其可如何采用的具体实施例。

定义和实施方案

应了解上文一般描述与下文详细描述均仅具有示例性和说明性而不限制所要求的本发明。在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。在本申请中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其它形式，如“包括(includes)”及“包括(included)”不具有限制性。此外，除非另外明确陈述，否则如“要素”或“组分”的术语涵盖构成一个单元的要素和组分以及构成一个以上亚单位的要素和组分。此外，使用术语“部分”可包括某一部分的一部分或整个部分。

本文中使用的章节标题仅出于组织目的且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍及论文，皆据此出于任何目的以引用的方式明确整体并入本文。如根据本公开所使用，除非另外指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：

术语“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin型9”或“PCSK9”是指如SEQ ID NO:1和/或3所示的多肽或其片段、以及相关多肽，包括(但不限于)等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体，包括添加N端蛋氨酸、融合多肽及种间同源物。在某些实施方案中，PCSK9多肽包括末端残基，如(但不限于)前导序列残基、靶向残基、氨基端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。“PCSK9”还被称为FH3、NARC1、HCHOLA3、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9及神经细胞凋亡调控的转化酶1。PCSK9基因编码属于分泌性枯草杆菌酶(subtilase)家族的蛋白酶K次家族的前蛋白转化酶蛋白。术语“PCSK9”表示前蛋白与在前蛋白的自催化之后生成的产物两者。当仅提及自催化的产物(如对于选择性结合裂解的PCSK9的抗原结合蛋白)时，所述蛋白可被称为“成熟”、“裂解的”、“加工的”或“活性”PCSK9。当仅提及非活性形式时，所述蛋白可被称为“非活性”、“原形式”或“未加工的”形式的PCSK9。如本文所用的术语PCSK9还包括天然存在的等位基因，如突变D374Y、S127R及F216L。术语PCSK9还涵盖并有PCSK9氨基酸序列的转译后修饰的PCSK9分子，如已经糖基化、聚乙二醇化的PCSK9序列、信号序列已经裂解的PCSK9序列、前结构域已从催化域裂解但未与催化域分离的PCSK9序列(例如图1A和1B)。

术语“PCSK9活性”包括PCSK9的任何生物效应。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9与底物或受体相互作用或结合的能力。在一些实施方案中，PCSK9活性由PCSK9结合LDL受体(LDLR)的能力表示。在一些实施方案中，PCSK9结合LDLR并催化涉及LDLR的反应。在一些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9改变(例如降低)LDLR的可用性的能力。在一些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9增加受试者的LDL的量的能力。在一些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低可用于结合LDL的LDLR的量的能力。在一些实施方案中，“PCSK9活性”包括由PCSK9信号传导所引起的任何生物活性。示例性活性包括(但不限于)PCSK9结合LDLR、裂解LDLR或其它蛋白质的PCSK9酶活性、PCSK9结合除LDLR以外的促进PCSK9作用的蛋白质、PCSK9改变APOB分泌(Sun X-M等，“Evidence for effect of mutant PCSK9onapoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominanthypercholesterolemia”,Human Molecular Genetics 14:1161-1169,2005及Ouguerram K等，“Apolipoprotein B100metabolism in autosomal-dominant hypercholesterolemiarelated to mutations in PCSK9”,Arterioscler thromb Vasc Biol.24:1448-1453,2004)、PCSK9在肝脏再生及神经元细胞分化中的作用(SeidahNG等，“The secretoryproprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1(NARC-1):Liverregeneration and neuronal differentiation”PNAS 100:928-933,2003)、以及PCSK9在肝葡萄糖代谢中的作用(Costet等，“Hepatic PCSK9expression is regulated bynutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein1c”J.Biol.Chem.281(10):6211-18,2006)。

如本文所用的术语“高胆固醇血症”是指胆固醇水平升高到所要水平以上的病状。在一些实施方案中，这表示血清胆固醇水平升高。在一些实施方案中，所要水平虑及本领域技术人员已知(且在本文中描述或提及)的各种“风险因素”。

术语“聚核苷酸”或“核酸”包括单链核苷酸聚合物与双链核苷酸聚合物两者。构成聚核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰的形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，如2',3'-二脱氧核糖；及核苷酸间键修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷酰氨酸酯。

术语“寡核苷酸”意指包含200个或200个以下核苷酸的聚核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可为例如用于构建突变基因的单链或双链寡核苷酸。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记，以用于检测测定。寡核苷酸可例如用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。

“分离的核酸分子”意指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其某种组合，其不与在自然界中发现分离的聚核苷酸的聚核苷酸的全部或一部分缔合，或其连接于其在自然界中不连接的聚核苷酸。出于本公开的目的，应了解“包含具体的核苷酸序列的核酸分子”不包括完整的染色体。除指定序列之外，“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子还可包括多达10种或甚至多达20种其它蛋白质或其部分的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调控序列，和/或可包括载体序列。

除非另外指定，否则本文论述的任何单链聚核苷酸序列的左手端为5'端；双链聚核苷酸序列的左手方向称为5'方向。5'至3'添加初生RNA转录物的方向被称为转录方向；在具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上5'至RNA转录物的5'端的序列区域被称为“上游序列”；在具有与RNA转录物相同的序列的DNA链上3'至RNA转录物的3'端的序列区域被称为“下游序列”。

术语“控制序列”是指可影响其所连接的编码序列的表达和加工的聚核苷酸序列。所述控制序列的性质可取决于宿主生物体。在具体的实施方案中，原核生物的控制序列可包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列。举例来说，真核生物的控制序列可包括包含一个或多个转录因子的识别位点的启动子、转录增强子序列及转录终止序列。“控制序列”可包括前导序列和/或融合配偶体序列。

术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。

术语“表达载体”或“表达构建体”是指适于转化宿主细胞且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括(但不限于)影响或控制与其可操作地连接的编码区的转录、转译且如果存在内含子，则影响所述编码区的RNA剪接的序列。

如本文所用，“可操作地连接”意指所述术语所应用的组分呈允许其在适合条件下执行其固有功能的关系。举例来说，载体中“可操作地连接”于蛋白质编码序列的控制序列与其连接以便在与控制序列的转录活性相容的条件下达成蛋白质编码序列的表达。

术语“宿主细胞”意指已用或能够用核酸序列转化并且进而表达目标基因的细胞。所述术语包括亲本细胞的子代，不管子代在形态或基因组成方面是否与原始亲本细胞一致，只要存在相关基因即可。

术语“转染”意指细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA已引入细胞膜内部时，细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域中为熟知的且在本文中加以公开。参见例如Graham等，1973,Virology52:456；Sambrook等，2001,Molecular Cloning:ALaboratoryManual，同上；Davis等，1986,BasicMethods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等，1981,Gene13:197。所述技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入适合的宿主细胞中。

术语“转化”是指细胞遗传特征的变化，并且当细胞已被修饰成含有新的DNA或RNA时，细胞已被转化。举例来说，当细胞通过经由转染、转导或其它技术引入新的遗传物质而自其天然状态被遗传修饰时，所述细胞被转化。在转染或转导之后，转化的DNA可通过物理整合至细胞的染色体中来与细胞的DNA重组，或可以游离型元件形式短暂维持而不复制，或可以质粒形式独立复制。当转化的DNA随细胞分裂复制时，细胞被视为已经“稳定转化的”。

术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质(即，由天然存在及非重组细胞产生的蛋白质)的氨基酸序列的大分子；或其由遗传改造或重组细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或缺失天然序列的一个或多个氨基酸、在天然序列中添加一个或多个氨基酸和/或取代天然序列的一个或多个氨基酸的分子。所述术语还包括一个或多个氨基酸为相应的天然存在的氨基酸及聚合物的化学类似物的氨基酸聚合物。术语“多肽”及“蛋白质”明确涵盖PCSK9抗原结合蛋白、抗体或缺失抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸、在抗原结合蛋白中添加一个或多个氨基酸和/或取代抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的序列。术语“多肽片段”是指相较于全长天然蛋白质，具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。相较于天然蛋白质，所述片段还可含有修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段的长度为约5个至500个氨基酸。举例来说，片段的长度可为至少5个、6个、8个、10个、14个、20个、50个、70个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。适用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段，包括结合域。在PCSK9结合抗体的情况下，适用的片段包括(但不限于)CDR区、重链和/或轻链的可变域、抗体链的一部分或其仅包括两个CDR的可变区及其类似物。

所提及的术语“分离的蛋白质”意指主题蛋白质(1)不含至少一些通常将与其一起存在的其它蛋白质，(2)基本上不含来自同一来源，例如来自同一物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的在自然界中与其缔合的聚核苷酸、脂质、碳水化合物或其它物质分离，(5)可操作地与在自然界中不与其缔合的多肽缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(6)不存在于自然界中。通常，“分离的蛋白质”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA或其任何组合可编码所述分离的蛋白质。优选地，分离的蛋白质实质上不含见于其自然环境中的会干扰其治疗、诊断、防治、研究或其它用途的蛋白质或多肽或其它污染物。

术语“氨基酸”包括其在本领域中的通常含义。

多肽(例如抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包含以下氨基酸序列：其中相对于另一多肽序列，在所述氨基酸序列中插入、缺失和/或取代有一个或多个氨基酸残基。变体包括融合蛋白。

术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定。“同一性百分比”意指所比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比并且是基于所比较的分子中最小分子的大小来计算。对于这些计算，优选通过具体的数学模型或计算机程序(即“算法”)处理比对中的空位(如果存在的话)。可用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括以下文献中所述的方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford UniversityPress；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,NewYork:Academic Press；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,SequenceAnalysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence AnalysisPrimer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；以及Carillo等，1988,SIAM J.Applied Math.48:1073。

在计算同一性百分比时，通常以产生序列间最大匹配的方式比对所比较的序列。可用于测定同一性百分比的计算机程序的一个实例为包括GAP的GCG程序包(Devereux等，1984,Nucl.AcidRes.12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。计算机算法GAP是用于比对有待测定序列同一性百分比的两个多肽或聚核苷酸。将序列进行比对以实现其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配(如通过算法所测定的“匹配跨度”)。算法联合使用空位开放罚分(其根据3×平均对角线来计算，其中“平均对角线”为所用判断矩阵的对角线的平均值；“对角线”为由具体判断矩阵指定给各完全氨基酸匹配的分值或数值)；及空位扩展罚分(通常为1/10×空位开放罚分)以及判断矩阵(如PAM 250或BLOSum 62)。在某些实施方案中，算法还使用标准判断矩阵(对于PAM 250判断矩阵，参见Dayhoff等，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；对于BLOSum62判断矩阵，参见Henikoff等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。

可用于使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的实例为以下参数：

●算法：Needleman等，1970,J.Mol.Biol.48:443-453

●判断矩阵：BLOSum 62，来自Henikoff等，1992，同上

●空位罚分：12(但无末端空位罚分)

●空位长度罚分：4

●类似性阈值：0

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案仅可使两个序列的较短区域匹配，并且这个小比对区域可具有极高序列同一性，即使两个全长序列之间不存在显著关系。因此，如果需要产生跨越目标多肽的至少50个或其它数目的连续的氨基酸的比对，那么可调整所选的比对方法(GAP程序)。

如本文所用，20种常规(例如天然存在)的氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology--A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编，Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其出于任何目的以引用的方式并入本文。20种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸(如α,α-双取代的氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规的氨基酸也可为本发明多肽的适合组分。非常规的氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其它类似氨基酸及亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽记法中，根据标准用法及惯例，左手方向为氨基端方向而右手方向为羧基端方向。

类似地，除非另外指定，否则单链聚核苷酸序列的左手端为5'端；双链聚核苷酸序列的左手方向称为5'方向。5'至3'添加初生RNA转录物的方向称为转录方向；在具有与RNA相同的序列的DNA链上5'至RNA转录物的5'端的序列区域被称为“上游序列”；在具有与RNA相同的序列的DNA链上3'至RNA转录物的3'端的序列区域被称为“下游序列”。

保守性氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过于生物系统中合成而并入。这些包括肽模拟物及氨基酸部分的其它逆向或反向形式。

天然存在的残基可基于共同侧链性质进行分类：

1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

3)酸性：Asp、Glu；

4)碱性：His、Lys、Arg；

5)影响链定向的残基：Gly、Pro；以及

6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

举例来说，非保守性取代可涉及这些类别中的一类的成员交换成另一类的成员。所述取代的残基可例如引入人类抗体的与非人类抗体同源的区域中或引入分子的非同源区域中。

在根据某些实施方案对抗原结合蛋白或PCSK9蛋白作出变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。已基于各氨基酸的疏水性及电荷特征对其指定亲水指数。它们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

本领域中了解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可被取代成具有类似亲水指数或分值的其它氨基酸且仍然保留类似的生物活性。在某些实施方案中，在基于亲水指数作出变化时，包括亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括亲水指数在±1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水指数在±0.5内的氨基酸的取代。

本领域中还应了解，类似氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行，尤其在由此产生的生物功能性蛋白质或肽旨在用于免疫学实施方案中时，如在本发明的情况下。在某些实施方案中，蛋白质的如受其邻近氨基酸的亲水性管控的最大局部平均亲水性与其免疫原性及抗原性相关，即与蛋白质的生物性质相关。

以下亲水性值已指定给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值作出变化时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括亲水性值在±1内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代。还可基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域又被称为“表位核心区”。

示例性氨基酸取代列举于表1中。

表1

氨基酸取代

术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代以外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，包括(但不限于)与聚合物、脂质或其它有机或无机部分进行化学键结。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白的循环半衰期可长于未化学修饰的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白对所要细胞、组织和/或器官的靶向能力可得以改进。在一些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白被共价修饰成包括一个或多个水溶性聚合物连接物，包括(但不限于)聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如以下美国专利号：4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192及4,179,337。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，包括(但不限于)单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它碳水化合物基聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇、以及所述聚合物的混合物。

在某些实施方案中，衍生物被聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰。在某些实施方案中，在衍生物的一个或多个特定位置处，例如在氨基端处键结一个或多个水溶性聚合物。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物随机连接至衍生物的一个或多个侧链。在某些实施方案中，PEG用于改进抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG用于改进人源化抗体的治疗能力。某些此类方法例如论述于美国专利号6,133,426中，其据此出于任何目的以引用的方式并入本文。

肽类似物通常作为性质类似于模板肽的非肽药物用于药物产业中。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptide mimetic)”或“肽仿真物(peptidomimetic)”。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986)；Veber和Freidinger,TINS，第392页(1985)；及Evans等，J.Med.Chem.,30:1229(1987)，其出于任何目的以引用的方式并入本文。所述化合物常借助于计算机化分子建模来开发。在结构上类似于治疗上适用的肽的肽模拟物可用于产生类似的治疗或防治效应。一般来说，肽仿真物在结构上类似于范式多肽(即具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，如人类抗体，但一个或多个肽键任选地通过本领域中熟知的方法由选自以下的键置换：--CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂-CH₂--、--CH＝CH-(顺式和反式)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--及--CH₂SO--。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于某些实施方案中以生成更稳定的肽。此外，可通过本领域中已知的方法(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.,61:387(1992)，出于任何目的以引用的方式并入本文中)产生包含共有序列或大致上相同的共有序列变化的限制性肽；例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基。

如说明书通篇中关于生物物质(如多肽、核酸、宿主细胞及其类似物)使用的术语“天然存在的”是指物质可见于自然界中或为物质的可见于自然界中的某一形式。

如本文所用的“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指结合指定的目标抗原的任何蛋白质。在本申请中，指定的目标抗原为PCSK9蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括(但不限于)抗体及其结合部分，如免疫功能性片段。肽体为抗原结合蛋白的另一实例。如本文所用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能性片段”(或简称为“片段”)为一种抗原结合蛋白，其包含抗体的缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍然能够特异性结合抗原的部分(不考虑那个部分如何获得或合成)。所述片段具有生物活性，因为其结合目标抗原并且可与其它抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定的表位。在一些实施方案中，片段为中和性片段。在一些实施方案中，片段可阻断或降低LDLR与PCSK9之间相互作用的可能性。在一方面，所述片段将保留至少一个CDR存在于全长轻链或重链中，并且在一些实施方案中，将包含单一重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生，或可通过酶促或化学裂解抗原结合蛋白(包括完整抗体)而产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限于)Fab、双抗体(位于同一条多肽上的重链可变域与轻链可变域经由短肽接头连接，所述肽接头过短以致于不允许同一条链上的两个结构域之间的配对)、Fab'、F(ab')₂、Fv、结构域抗体及单链抗体，且可源于任何哺乳动物来源，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、骆驼科或兔。进一步预期本文公开的抗原结合蛋白的功能性部分(例如一个或多个CDR)可共价结合于第二蛋白质或小分子以生成针对体内具体目标、具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期的治疗剂。如本领域技术人员应了解，抗原结合蛋白可包括非蛋白质组分。在本公开的一些章节中，本文利用“数字/字母/数字”(例如25A7)描述ABP的实例。在这些情况下，确切名称表示具体抗体。即，名为25A7的ABP不一定与名为25A7.1的抗体相同(除非其在说明书中明确教导为相同的，例如25A7和25A7.3)。如本领域技术人员应了解，在一些实施方案中，LDLR不为抗原结合蛋白。在一些实施方案中，LDLR的结合子区段(subsection)不为抗原结合蛋白，例如EGFa。在一些实施方案中，PCSK9进行体内信号传导所经由的其它分子不为抗原结合蛋白。所述实施方案将如此被明确鉴定。

本文所述的某些抗原结合蛋白为抗体或源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是基于抗体，包括(但不限于)单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，ABP包含高亲和性多聚体(avimer)(紧密结合肽)或由所述高亲和性多聚体组成。本文进一步描述这些不同的抗原结合蛋白。

“Fc”区包含两个重链片段，其包含抗体的C_H1及C_H2域。这两个重链片段由两个或更多个二硫键及由C_H3域的疏水性相互作用固持在一起。

“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的C_H1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。

“Fab'片段”包含一条轻链以及一条重链的含有VH域和C_H1域及C_H1域与C_H2域之间的区域的部分，由此可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')₂分子。

“F(ab')₂片段”含有两条轻链以及含有C_H1域与C_H2域之间的一部分恒定区的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')₂片段由经两条重链之间的二硫键固持在一起的两个Fab'片段构成。

“Fv区”包含来自重链与轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。

“单链抗体”为Fv分子，其中重链和轻链可变区已由柔性接头连接以形成单一多肽链，所述多肽链形成抗原结合区。单链抗体详细论述于国际专利申请公布号WO 88/01649及美国专利号4,946,778及5,260,203中，其公开以引用的方式并入本文。

“域抗体”为仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个V_H区通过肽接头共价连接以产生二价域抗体。二价域抗体的两个V_H区可靶向相同或不同的抗原。

“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白及二价抗体可具有双特异性，参见下文。在某些实施方案中，除“多特异性”或“多功能性”抗体以外的二价抗体通常应理解为其结合位点的每一者相同。

“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”为靶向一种以上抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。

“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体分别为具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白及抗体为一种多特异性抗原结合蛋白抗体并且可通过包括(但不限于)杂交瘤融合或连接Fab'片段的多种方法产生。参见例如Songsivilai和Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等，1992,J.Immunol.148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合可驻留于相同或不同蛋白质目标上的两个不同的表位。

当解离常数(K_d)≤10^-7M时，抗原结合蛋白被称为“特异性结合”其目标抗原。当K_d≤5×10^-9M时，ABP以“高亲和力”特异性结合抗原，并且当K_d≤5×10^-10M时，ABP以“极高亲和力”特异性结合抗原。在一个实施方案中，ABP的K_d≤10^-9M。在一个实施方案中，解离速率<1×10^-5M。在其它实施方案中，ABP结合人类PCSK9的K_d将介于约10^-9M与10^-13M之间，并且在另一实施方案中，ABP结合的K_d将≤5×10^-10M。如本领域技术人员应了解，在一些实施方案中，任何或所有抗原结合片段皆可特异性结合PCSK9。

当抗原结合蛋白结合一种目标比其结合第二目标更紧密时，其具有“选择性”。

“抗原结合区”意指特异性结合指定抗原(例如互补位)的蛋白质或蛋白质的一部分。举例来说，抗原结合蛋白的含有与抗原相互作用且赋予抗原结合蛋白以对抗原的特异性及亲和力的氨基酸残基的那部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区。“CDR”为促成抗原结合特异性及亲和力的氨基酸序列。“框架”区可有助于维持CDR的适当构形以促进抗原结合区与抗原之间的结合。在结构上，框架区可位于抗体中的CDR之间。框架区及CDR区的实例展示于图2A-3D、3CCC-3JJJ中。在一些实施方案中，抗体3B6的轻链的CDR的序列如下：CDR1TLSSGYSSYEVD(SEQ ID NO:279)；CDR2VDTGGIVGSKGE(SEQ ID NO:280)；CDR3GADHGSGTNFVVV(SEQ ID NO:281)，并且FR如下：FR1QPVL TQPLFASASLGASVTLTC(SEQ ID NO:282)；FR2WYQQ RPGKGPRFVMR(SEQ ID NO:283)；FR3GIPDRFSVLGS GLNRYLTIKNIQEEDESDYHC(SEQ ID NO:284)；及FR4FGGGTKLTVL(SEQ ID NO:285)。

在某些方面，提供结合PCSK9(例如人类PCSK9)的重组抗原结合蛋白。在此情形下，“重组抗原结合蛋白”为使用重组技术，即经由表达如本文所述的重组核酸制备的蛋白质。产生重组蛋白质的方法和技术在本领域中为熟知的。

术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合目标抗原的片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人类抗体及双特异性抗体。“抗体”为一种抗原结合蛋白。完整抗体通常将包含至少两个全长重链及两个全长轻链，但在一些情况下可包括较少链，如天然存在于骆驼科中的可仅包含重链的抗体。抗体可仅源于单一来源，或可为“嵌合”抗体，即抗体的不同部分可源于两种不同抗体，如下文进一步描述。可通过重组DNA技术于杂交瘤中，或通过酶促或化学裂解完整抗体来产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。除非另外指示，否则术语“抗体”除包含两个全长重链及两个全长轻链的抗体之外还包括其衍生物、变体、片段及突变蛋白(mutein)，其实例在下文中描述。此外，除非明确排除，否则抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，术语还涵盖肽体。

天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。所述四聚体通常各由两对相同的多肽链构成，每一对具有一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)及一条全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70kDa)。每条链的氨基端部分通常包括具有约100至110个或更多个氨基酸的通常负责抗原识别的可变区。每条链的羧基端部分通常界定可负责效应子功能的恒定区。人类轻链通常分类为κ及λ轻链。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干子类，包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有包括(但不限于)IgM1及IgM2的子类。IgA类似地再分成包括(但不限于)IgA1及IgA2的子类。在全长轻链及重链内，可变区及恒定区通常由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，同时重链还包括具有另外约10个氨基酸的“D”区。参见例如FundamentalImmunology，第7章(Paul,W.编，第2版Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的以全文引用的方式并入本文)。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

可变区通常展现相对保守的框架区(FR)由三个高变区(又称为互补决定区或CDR)连接的相同一般结构。来自各对的两条链的CDR通常由框架区对准，这可使得能够结合特定表位。自N端至C端，轻链可变区与重链可变区两者通常均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。通常根据Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987及1991))；或Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等，Nature,342:878-883(1989)的定义将氨基酸指定给各结构域。

在某些实施方案中，抗体重链在不存在抗体轻链下结合抗原。在某些实施方案中，抗体轻链在不存在抗体重链下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在不存在抗体轻链下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在不存在抗体重链下结合抗原。在某些实施方案中，单个可变区在不存在其它可变区下特异性结合抗原。

在某些实施方案中，通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来达成定义性描述CDR及鉴定构成抗体的结合位点的残基。在某些实施方案中，可通过本领域技术人员已知的多种技术的任一种，如X射线结晶学来达成这个目的。在某些实施方案中，各种分析方法可用于鉴定或粗略估计CDR区。所述方法的实例包括(但不限于)Kabat定义、Chothia定义、AbM定义及接触定义。

Kabat定义为用于编号抗体中的残基的标准且通常用于鉴定CDR区。参见例如Johnson和Wu,Nucleic Acids Res.,28:214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义虑及某些结构环区的位置。参见例如Chothia等，J.Mol.Biol.,196:901-17(1986)；Chothia等，Nature,342:877-83(1989)。AbM定义使用由Oxford Molecular Group出品的模型化抗体结构的计算机程序集成套件。参见例如Martin等，Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272(1989)；“AbM^TM,A Computer Program for Modeling VariableRegions of Antibodies”,Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库与从头计算(ab initio)方法的组合从一级序列模型化抗体的三级结构，所述从头计算方法如由Samudrala等，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchical Approach”,PROTEINS,Structure,Function and Genetics增刊,3:194-198(1999)所述。接触定义是基于分析可用复合物晶体结构。参见例如MacCallum等，J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。

按照惯例，重链中的CDR区通常称为H1、H2及H3并且沿从氨基端至羧基端的方向依序编号。轻链中的CDR区通常称为L1、L2及L3并且沿从氨基端至羧基端的方向依序编号。

术语“轻链”包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包括可变区结构域V_L及恒定区结构域C_L。轻链的可变区结构域在多肽的氨基端处。轻链包括κ链和λ链。

术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包括可变区结构域V_H以及三个恒定区结构域C_H1、C_H2及C_H3。V_H结构域在多肽的氨基端处，且C_H结构域在羧基端处，其中C_H3最靠近多肽的羧基端。重链可为任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM及IgE。

双特异性或双功能性抗体通常为具有两个不同重链/轻链对及两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法，包括(但不限于)杂交瘤融合或连接Fab'片段来产生。参见例如Songsivilai等，Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。

一些哺乳动物物种还产生仅具有单一重链的抗体。

各单个免疫球蛋白链通常由若干“免疫球蛋白结构域”构成，所述“免疫球蛋白结构域”各自由大约90至110个氨基酸组成并且具有特征性折叠样式。这些结构域为构成抗体多肽的基本单元。在人类中，IgA及IgD同种型含有四条重链及四条轻链；IgG及IgE同种型含有两条重链及两条轻链；并且IgM同种型含有五条重链及五条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。举例来说，IgG重链含有三个C区结构域，称为C_H1、C_H2及C_H3。提供的抗体可具有这些同种型及亚型中的任一种。在本发明的某些实施方案中，抗PCSK9抗体为IgG2或IgG4亚型。

术语“可变区”或“可变域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包括重链中大致氨基端120至130个氨基酸及轻链中约100至110个氨基端氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区的氨基酸序列广泛不同，即便在同一物种的抗体间也是如此。抗体的可变区通常决定具体抗体对其目标的特异性。

术语“中和性抗原结合蛋白”或“中和性抗体”分别是指结合配体并且防止或降低那个配体的生物效应的抗原结合蛋白或抗体。这可例如通过直接阻断配体上的结合位点或通过结合配体并经由间接手段(如使配体发生结构或能量改变)改变配体的结合能力来完成。在一些实施方案中，所述术语还可表示阻止其所结合的蛋白质执行生物功能的抗原结合蛋白。在评估抗原结合蛋白，例如抗体或其免疫功能性片段的结合和/或特异性时，当过量抗体使结合配体的结合配偶体的量降低至少约1-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-98％、98-99％或99％以上(如在体外竞争性结合测定中所测量)时，抗体或片段可实质上抑制配体与其结合配偶体的结合。在一些实施方案中，在PCSK9抗原结合蛋白的情况下，所述中和性分子可减弱PCSK9结合LDLR的能力。在一些实施方案中，经由竞争测定来表征和/或描述中和能力。在一些实施方案中，利用IC₅₀或EC₅₀值描述中和能力。在一些实施方案中，ABP 27B2、13H1、13B5及3C4为非中和性ABP，3B6、9C9及31A4为弱中和剂，并且表2中的其余ABP为强中和剂。在一些实施方案中，抗体或抗原结合蛋白通过结合PCSK9并阻止PCSK9结合LDLR(或降低PCSK9结合LDLR的能力)进行中和。在一些实施方案中，抗体或ABP通过结合PCSK9且仍然允许PCSK9结合LDLR由此防止或降低PCSK9介导的LDLR降解来进行中和。因此，在一些实施方案中，中和性ABP或抗体可仍然允许PCSK9/LDLR结合，但将防止(或降低)后续涉及PCSK9的LDLR降解。

术语“目标”是指能够由抗原结合蛋白结合的分子或分子的一部分。在某些实施方案中，目标可具有一个或多个表位。在某些实施方案中，目标为抗原。在词语“抗原结合蛋白”中使用“抗原”仅表示构成抗原的蛋白质序列可由抗体结合。在此情形下，不需要蛋白质为外来的或其能够诱导免疫反应。

术语“竞争”在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和性抗原结合蛋白或中和性抗体)的情形下使用时意指抗原结合蛋白之间的竞争，如通过所测试的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫功能性片段)阻止或抑制(例如降低)参照抗原结合蛋白(例如配体或参照抗体)与共同抗原(例如PCSK9或其片段)的特异性结合的测定所测定。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心式竞争测定(参见例如Stahli等，1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等，1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心式测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press)；使用I-125标记进行的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung等，1990,Virology176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等，1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，所述测定涉及使用与固体表面或携带这些固体表面的任一个的细胞结合的纯化的抗原、未标记的测试抗原结合蛋白及标记的参照抗原结合蛋白。通过在测试抗原结合蛋白存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常所述测试抗原结合蛋白是过量存在的。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)包括与参照抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白及结合充分接近由参照抗原结合蛋白结合的表位的邻近表位以产生位阻的抗原结合蛋白。关于测定竞争性结合的方法的其它详情提供于本文实施例中。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，其将使参照抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制(例如降低)了至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或75％以上。在一些情况下，结合抑制了至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或97％以上。

术语“抗原”是指能够由选择性结合剂，如抗原结合蛋白(包括例如抗体或其免疫功能性片段)结合的分子或分子的一部分。在一些实施方案中，抗原能够在动物中用于产生能够结合那个抗原的抗体。抗原可具有一个或多个能够与不同抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。

术语“表位”包括能够由抗原结合蛋白(如抗体)结合或结合至T细胞受体的任何决定簇。表位为抗原的由靶向那个抗原的抗原结合蛋白结合的区域，并且当抗原为蛋白质时，包括直接接触抗原结合蛋白的特定氨基酸。最经常地，表位驻留于蛋白质上，但在一些情况下可驻留于其它种类的分子，如核酸上。表位决定簇可包括分子的化学活性表面群组(如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，且可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。一般来说，对具体目标抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的目标抗原上的表位。

如本文所用，“实质上纯的”意指所述分子物质种类为存在的主要物质种类，即以摩尔计，其含量大于同一混合物中的任何其它单个物质种类。在某些实施方案中，实质上纯的分子为组合物，其中目标物质种类占存在的所有大分子物质种类的至少50％(以摩尔计)。在其它实施方案中，实质上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物质种类的至少80％、85％、90％、95％或99％。在其它实施方案中，目标物质种类被纯化以达成基本均质性，其中通过常规检测方法不能检测出组合物中有污染性物质种类且因此组合物是由单一可检测的大分子物质种类组成。

术语“试剂”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制得的提取物。

如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指并入可检测的标记物，例如通过并入放射性标记的氨基酸或连接于具有可通过标记的抗生物素蛋白(例如含有可通过光学方法或比色方法检测的荧光标记物或酶促活性的抗生物素蛋白链霉亲和素(streptavidin))检测的生物素部分的多肽。在某些实施方案中，标记或标记物还可具有治疗性。标记多肽及糖蛋白的各种方法在本领域中为已知的且可使用。用于多肽的标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由二次报道体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)。在某些实施方案中，标记由各种长度的间隔臂连接以降低潜在位阻。

如本文所用的术语“生物样品”包括(但不限于)任何量的来自生物(livingthing)或先前为生物的物质。所述生物包括(但不限于)人类、小鼠、猴、大鼠、兔及其它动物。所述物质包括(但不限于)血液、血清、尿、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴结及皮肤。

如本文所用的术语“药物剂组合物”(或药剂或药物)是指当适当施用于患者时能够诱导所要治疗效应的化合物、组合物、药剂或药物。其不一定需要一种以上类型的成分。

术语“治疗有效量”是指所确定的可在哺乳动物中产生治疗反应的PCSK9抗原结合蛋白的量。所述治疗有效量易于由本领域的一般技术人员确定。

如本文所用的术语“调节剂”为变化或改变分子的活性或功能的化合物。举例来说，调节剂可致使分子的某一活性或功能的量值相较于在不存在所述调节剂下所观测到的活性或功能的量值增加或降低。在某些实施方案中，调节剂为降低分子的至少一种活性或功能的量值的抑制剂。分子的某些示例性活性及功能包括(但不限于)结合亲和力、酶促活性及信号转导。某些示例性抑制剂包括(但不限于)蛋白质、肽、抗体、肽体、碳水化合物或小有机分子。肽体描述于例如美国专利号6,660,843(对应于PCT申请号WO 01/83525)中。

术语“患者”及“受试者”可互换使用且包括人类及非人类动物受试者以及疾病经正式诊断者、疾病未经正式认定者、接受医学关注者、处于显现疾病的风险中者等。

术语“治疗(treat)”及“治疗(treatment)”包括治疗性治疗、防治性治疗及降低受试者将显现疾病的风险或其它风险因素的应用。治疗不需要完全治愈疾病并且涵盖减轻症状或降低潜伏风险因素的实施方案。

术语“预防”不需要100％消除事件的可能性。而是，其表示在化合物或方法的存在下，发生事件的可能性已降低。

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。酶促反应及纯化技术可根据制造商说明书或如本领域中通常所完成或如本文所述来执行。前述技术及程序可通常根据本领域中熟知的常规方法且如本说明书通篇所引用及论述的各种一般性及更具体的参考文献中所述来执行。参见例如Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989))，其出于任何目的以引用的方式并入本文。除非提供特定定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学及医学及药物化学使用的命名法及本文所述的分析化学、合成有机化学及医学及药物化学的实验室程序及技术为本领域中熟知的并且通常使用的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送，以及治疗患者。

针对PCSK9的抗原结合蛋白

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)为一种牵涉于调控低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白的水平的丝氨酸蛋白酶(Horton等，2007；Seidah和Prat,2007)。PCSK9为丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(S8)家族中的一种前激素-前蛋白转化酶(Seidah等，2003)。示例性的人类PCSK9氨基酸序列呈现为图1A中的SEQ ID NO:1(加下划线表示蛋白质的“前”结构域)及图1B中的SEQ ID NO:3(用粗体表示信号序列且加下划线表示前结构域)。示例性的人类PCSK9编码序列呈现为SEQ ID NO:2(图1B)。如本文所述，PCSK9蛋白还可包括全长PCSK9蛋白的片段。PCSK9蛋白的结构由两个小组解析(Cunningham等，NatureStructural&Molecular Biology,2007，及Piper等，Structure,15:1-8,2007)，所述两篇文献的全文均以引用的方式并入本文。PCSK9包括信号序列、N端前结构域、枯草杆菌蛋白酶样催化域及C端结构域。

本文提供结合PCSK9(包括人类PCSK9)的抗原结合蛋白(ABP)。在一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白为包含一个或多个如本文所述的互补决定区(CDR)的多肽。在一些抗原结合蛋白中，CDR包埋入“框架”区中，所述框架区使CDR定向以便达成CDR的适当抗原结合性质。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白可干扰、阻断、降低或调节PCSK9与LDLR之间的相互作用。所述抗原结合蛋白表示为“中和性”抗原结合蛋白。在一些实施方案中，PCSK9与LDLR之间的结合仍会发生，即使抗原结合蛋白具有中和性且与PCSK9结合。举例来说，在一些实施方案中，ABP防止或降低PCSK9对LDLR的不利影响而不阻断PCSK9上的LDLR结合位点。因此，在一些实施方案中，ABP调节或改变PCSK9引起LDLR降解的能力，而不必阻止PCSK9与LDLR之间的结合相互作用。所述ABP可特别描述为“非竞争性中和性”ABP。在一些实施方案中，中和性ABP以阻止PCSK9结合LDLR的定位和/或方式结合PCSK9。所述ABP可特别描述为“竞争性中和性”ABP。以上两种中和剂均可使受试者中存在更大量的游离LDLR，由此引起更多的LDLR结合LDL(进而降低受试者中的LDL的量)。反过来，这使受试者中存在的血清胆固醇的量降低。

在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白能够抑制PCSK9介导的活性(包括结合)。在一些实施方案中，结合这些表位的抗原结合蛋白尤其抑制PCSK9与LDLR之间的相互作用及由PCSK9介导的其它生理效应。在一些实施方案中，抗原结合蛋白为针对PCSK9的人类抗体，如完全人类抗体。

在一些实施方案中，ABP结合PCSK9的催化域。在一些实施方案中，ABP结合成熟形式的PCSK9。在一些实施方案中，ABP结合于PCSK9的前结构域中。在一些实施方案中，ABP选择性结合成熟形式的PCSK9。在一些实施方案中，ABP以使PCSK9不能结合或不能高效结合LDLR的方式结合催化域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化域的c端。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化域的n端。在一些实施方案中，ABP不结合PCSK9蛋白的n端或c端。在一些实施方案中，ABP结合由本文论述的抗体结合的任一表位。在一些实施方案中，这可通过本文公开的抗体与其它抗体之间的竞争测定确定。在一些实施方案中，ABP结合由表2中所述的一种抗体结合的表位。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合特定构象状态的PCSK9以便阻止PCSK9与LDLR相互作用。在一些实施方案中，ABP结合PCSK9的V结构域。在一些实施方案中，ABP结合PCSK9的V结构域并且阻止(或降低)PCSK9结合LDLR。在一些实施方案中，ABP结合PCSK9的V结构域，而其不阻止(或降低)PCSK9结合LDLR，ABP防止或降低经由PCSK9介导的对LDLR的不利活性。

本文公开的抗原结合蛋白具有多种效用。举例来说，一些抗原结合蛋白适用于特异性结合测定中、亲和纯化PCSK9(具体来说人类PCSK9)或其配体及用以鉴定具有PCSK9活性的其它拮抗剂的筛选测定中。一些抗原结合蛋白适用于抑制PCSK9与LDLR的结合，或抑制PCSK9介导的活性。

抗原结合蛋白可用于如本文所说明的多种治疗性应用中。举例来说，在一些实施方案中，PCSK9抗原结合蛋白适用于治疗与PCSK9相关的病状，如胆固醇相关疾病(或“血清胆固醇相关疾病”)，如高胆固醇血症，如本文进一步所述。抗原结合蛋白的其它用途包括例如诊断PCSK9相关疾病或病状及用以确定存在或不存在PCSK9的筛选测定。本文所述的一些抗原结合蛋白适用于治疗与PCSK9活性相关的后果、症状和/或病变。

在一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白包含一个或多个CDR(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)多肽结构及(b)一个或多个插入和/或连接至所述多肽结构的CDR。多肽结构可采用多种不同形式。举例来说，其可为或包含天然存在的抗体或其片段或变体的框架，或在本质上可为完全合成的。以下进一步描述各种多肽结构的实例。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构为抗体或源于抗体，包括(但不限于)单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)及上述每种抗体各自的部分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白为抗体的免疫片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂或scFv)。本文进一步描述并定义各种结构。

本文提供的某些抗原结合蛋白特异性和/或选择性结合人类PCSK9。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性和/或选择性结合具有SEQ ID NO:3的残基153-692和/或由SEQID NO:3的残基153-692组成的人类PCSK9蛋白。在一些实施方案中，ABP特异性和/或选择性结合具有SEQ ID NO:3的残基31-152和/或由SEQ ID NO:3的残基31-152组成的人类PCSK9。在一些实施方案中，ABP选择性结合如图1A中所述的人类PCSK9蛋白(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合PCSK9蛋白的至少一个片段和/或有或无信号序列的全长PCSK9蛋白。

在抗原结合蛋白用于治疗性应用的实施方案中，抗原结合蛋白可抑制、干扰或调节PCSK9的一或多种生物活性。在一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合人类PCSK9和/或使人类PCSK9与LDLR的结合大致上抑制了至少约20％-40％、40-60％、60-80％、80-85％或85％以上(例如通过在体外竞争性结合测定中测量结合所得)。本文提供的一些抗原结合蛋白为抗体。在一些实施方案中，ABP具有的K_d小(结合更紧密)于10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13M。在一些实施方案中，ABP阻断LDLR与PCSK9的结合(D374Y，高亲和力变体)的IC₅₀为小于1μM、1000nM至100nM、100nM至10nM、10nM至1nM、1000pM至500pM、500pM至200pM、小于200pM、200pM至150pM、200pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM。

本发明的抗PCSK9抗体的IgG2重链恒定域的一个实例具有如图3KK的SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列。

本发明的抗PCSK9抗体的IgG4重链恒定域的一个实例具有如图3KK的SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列。

抗PCSK9抗体的κ轻链恒定域的一个实例具有如图3KK的SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列。

抗PCSK9抗体的λ轻链恒定域的一个实例具有如图3KK的SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列。

免疫球蛋白链的可变区通常展现相同的总体结构，包含相对保守的框架区(FR)由三个高变区(更通常称为“互补决定区”或CDR)连接。来自以上提及的各重链/轻链对的两条链的CDR通常由框架区对准以形成与目标蛋白质(例如PCSK9)上的特定表位特异性结合的结构。从N端至C端，天然存在的轻链可变区与重链可变区两者通常均遵循这些元件的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已设计用于对占据这些结构域的每一个中的位置的氨基酸指定编号的编号系统。这个编号系统定义于Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987及1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等，1989,Nature342:878-883中。

各种重链及轻链可变区在本文中提供且描述于图2A-3JJ及3LL-3BBB中。在一些实施方案中，这些可变区各自可连接于以上重链及轻链恒定区以分别形成完整的抗体重链及轻链。另外，如此生成的重链及轻链序列各自可组合以形成完整的抗体结构。

提供的抗体的轻链及重链的一些可变区及其相应氨基酸序列的具体实例概述于表2中。

表2：示例性重链及轻链可变区

此外，表2中所列的示例性可变重链各自可与表2中所示的任何示例性可变轻链组合以形成抗体。表2展示见于本文公开的若干抗体中的示例性轻链及重链对。在一些情况下，抗体包括来自表2中所列的至少一条可变重链及一条可变轻链。在其它情况下，抗体含有两条相同轻链及两条相同重链。举例来说，抗体或抗原结合蛋白可包括一条重链及一条轻链、两条重链、或两条轻链。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含(和/或由以下组成)来自表2中所列的至少一个序列的1个、2个和/或3个重链CDR和/或轻链CDR(序列的CDR概述于图2A-3D、及图3CCC-3JJJ及图15A-15D中的其它实施方案中)。在一些实施方案中，所有6个CDR(来自轻链的CDR1-3(CDRL1、CDRL2、CDRL3)及来自重链的CDR1-3(CDRH1、CDRH2及CDRH3))皆为ABP的一部分。在一些实施方案中，1个、2个、3个、4个、5个或更多个CDR包括在ABP中。在一些实施方案中，来自表2中的序列中的CDR的一个重链CDR及一个轻链CDR包括在ABP中(表2中的序列的CDR概述于图2A-3D中)。在一些实施方案中，其它区段(例如如图2A-2D、图3A-3D以及图3CCC-3JJJ及图15A-15D中的其它实施方案中所描述)也包括在ABP中。表2中指示的重链及轻链的CDR及FR的实例概述于图2A-3D(及图3CCC-3JJJ及图15A-15D中的其它实施方案)中。任选的轻链可变序列(包括CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3及FR4)可选自以下序列：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44、46、421、425、429、433、437、441、445、449、453、457、461、465、469、473、477、481及485。任选的重链可变序列(包括CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3及FR4)可选自以下序列：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81、60、419、423、427、431、435、439、443、447、451、455、459、463、467、471、475、479及483。在图2A-3D中的一些条目中，鉴定CDR及FR的序列的变化或替代性边界。这些替代物用在ABP名称之后的“v1”加以鉴定。因为大多数这些替代物在性质上为次要的，所以在表中仅显示具有差异的区段。应了解轻链或重链的其余区段与其它图块中对于基础ABP所示的相同。因此，举例来说，图2C中的19H9v1与图2A中的19H9具有相同的FR1、CDR1及FR2，唯一差异指示于图2C中。对于三个核酸序列(ABP 26E10、30B9及31B12)，其它替代性核酸序列提供于图中。如本领域技术人员应了解，实际上需要至多一个所述序列用于生成抗体或ABP。实际上，在一些实施方案中，仅需要存在特定重链或轻链核酸中的一个或两个均无需存在。

在一些实施方案中，ABP由可编码表2中的任何蛋白质序列的核酸序列编码。

在一些实施方案中，ABP选择性结合PCSK9的结合LDLR的形式(例如分子的自催化形式)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化域的c端(例如最c端5.5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-40个氨基酸)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化域的n端(例如最n端5.5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-40个氨基酸)。在一些实施方案中，ABP结合PCSK9的成熟形式的氨基酸1-100内的氨基酸。在一些实施方案中，ABP结合以下氨基酸内的氨基酸(和/或由以下氨基酸组成的氨基酸序列)：氨基酸31-100、100-200、31-152、153-692、200-300、300-400、452-683、400-500、500-600、31-692、31-449和/或600-692。在一些实施方案中，ABP结合催化域。在一些实施方案中，中和性和/或非中和性ABP结合前结构域。在一些实施方案中，ABP结合催化域与前结构域两者。在一些实施方案中，ABP结合催化域以便阻隔催化域上与前结构域相互作用的区域。在一些实施方案中，ABP结合至催化域中与前结构域相互作用的位置或表面，如Piper等(Structure 15:1-8(2007)，其全文据此以引用的方式并入本文，包括其中的结构表示形式)中所概述。在一些实施方案中，ABP结合催化域且限制前结构域的运动性。在一些实施方案中，ABP结合催化域而不结合前结构域。在一些实施方案中，ABP结合催化域，而不结合前结构域，同时阻止前结构域再定向以允许PCSK9结合LDLR。在一些实施方案中，ABP结合于与围绕Piper等中的前结构域的残基149-152的表位相同的表位中。在一些实施方案中，ABP结合V结构域上的凹槽(如Piper等中所概述)。在一些实施方案中，ABP结合接近V结构域上的凹槽的富含组氨酸的区块(patch)。在一些实施方案中，(结合V结构域的)所述抗体不具有中和性。在一些实施方案中，结合V结构域的抗体具有中和性。在一些实施方案中，中和性ABP阻止PCSK9与LDLR结合。在一些实施方案中，中和性ABP尽管防止PCSK9降解LDLR，但不阻止PCSK9与LDLR结合(例如ABP 31A4)。在一些实施方案中，ABP结合或阻断Piper等论文的图4中所述的至少一个组氨酸。在一些实施方案中，ABP阻断PCSK9中的催化三联体。

在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9，抗体选择性结合变异的PCSK9蛋白(例如D374Y)。在一些实施方案中，这些抗体对变体的结合强度为对野生型的结合强度的至少两倍，且优选对突变体的结合强度为对野生型的结合强度的2-5倍、5-10倍、10-100倍、100-1000倍、1000-10,000倍或10,000倍以上(如经由K_d所度量)。在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9与LDLR相互作用的能力，抗体选择性抑制变异的D374YPCSK9与LDLR相互作用。在一些实施方案中，这些抗体对变体结合LDLR的能力的阻断强度大于对野生型的能力的阻断强度，例如强度为对野生型的至少两倍，且优选对突变体的阻断强度为对野生型的阻断强度的2-5倍、5-10倍、10-100倍、100-1000倍或1000倍以上(如经由IC₅₀所度量)。在一些实施方案中，抗体以类似程度结合并中和野生型PCSK9与PCSK9的变异形式(如D374Y)两者。在一些实施方案中，抗体结合PCSK9以阻止LDLR的变体结合PCSK9。在一些实施方案中，LDLR的变体与人类LDLR至少50％相同。应注意，LDLR的变体为本领域技术人员所知(例如Brown MS等，“Calcium cages,acid baths andrecycling receptors”Nature 388:629-630,1997)。在一些实施方案中，ABP可提升杂合子家族性高胆固醇血症(其中存在LDLR的功能丧失型变体)中的有效LDLR的水平。

在一些实施方案中，ABP结合(但不阻断)与图1A和/或图1B中所述的PCSK9形式具有至少50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％或99％以上同一性百分比的PCSK9变体。在一些实施方案中，ABP结合(但不阻断)与图1A和/或图1B中所述的PCSK9的成熟形式具有至少50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95、95-99％或99％以上同一性百分比的PCSK9变体。在一些实施方案中，ABP结合并阻止与图1A和/或图1B中所述的PCSK9形式具有至少50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％或99％以上同一性百分比的PCSK9变体与LDLR相互作用。在一些实施方案中，ABP结合并阻止与图1B中所述的PCSK9的成熟形式具有至少50％、50-60％、60-70、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％或99％以上同一性百分比的PCSK9变体与LDLR相互作用。在一些实施方案中，PCSK9的变体为人类变体，如在位置474、E620G和/或E670G处的变体。在一些实施方案中，在位置474处的氨基酸为缬氨酸(如其它人类中)或苏氨酸(如猕猴及小鼠中)。鉴于本文提供的交叉反应性数据，据信本发明抗体将易于结合以上变体。

在一些实施方案中，ABP结合由表2中所述的一种抗体结合的表位。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合特定构象状态的PCSK9以便阻止PCSK9与LDLR相互作用。

人源化抗原结合蛋白(例如抗体)

如本文所述，针对PCSK9的抗原结合蛋白可包含人源化抗体和/或其部分。所述策略的一项重要实际应用为小鼠体液免疫系统的“人源化”。

在某些实施方案中，人源化抗体在人类中实质上无免疫原性。在某些实施方案中，人源化抗体对目标的亲和力与来自所述人源化抗体所源于的另一物种的抗体大致上相同。参见例如美国专利5,530,101；美国专利5,693,761；美国专利5,693,762；美国专利5,585,089。

在某些实施方案中，鉴定抗体可变域的可被修饰而不减弱抗原结合域的天然亲和力，同时降低其免疫原性的氨基酸。参见例如美国专利号5,766,886及5,869,619。

在某些实施方案中，通过本领域中已知的方法对抗体进行的修饰通常被设计以达成对目标的结合亲和力增加和/或降低抗体在接受者中的免疫原性。在某些实施方案中，人源化抗体被修饰以消除糖基化位点以便增加抗体对其同源抗原的亲和力。参见例如Co等，Mol.Immunol.,30:1361-1367(1993)。在某些实施方案中，使用如“重构”、“超嵌合”或“镶饰/表面重修”的技术产生人源化抗体。参见例如Vaswami等，Annals of Allergy,Asthma,&Immunol.81:105(1998)；Roguska等，Prot.Engineer.,9:895-904(1996)；及美国专利号6,072,035。在某些所述实施方案中，所述技术通常通过减少外来残基的数目来降低抗体免疫原性，但不阻止在重复施用抗体之后的抗独特型反应及抗异型反应。降低免疫原性的某些其它方法例如描述于Gilliland等，J.Immunol.,62(6):3663-71(1999)中。

在某些情况下，使抗体人源化会导致抗原结合能力损失。在某些实施方案中，人源化抗体被“回复突变”。在某些所述实施方案中，人源化抗体被突变成包括一个或多个见于供体抗体中的氨基酸残基。参见例如Saldanha等，Mol Immunol 36:709-19(1999)。

在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的轻链及重链可变区的互补决定区(CDR)可移植至来自相同或另一物种的框架区(FR)中。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的轻链及重链可变区的CDR可移植至共有人类FR中。为生成共有人类FR，在某些实施方案中，比对来自若干人类重链或轻链氨基酸序列的FR以鉴定共有氨基酸序列。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的重链或轻链的FR被来自不同重链或轻链的FR置换。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的重链及轻链的FR中的稀有氨基酸不被置换，而其余的FR氨基酸被置换。稀有氨基酸为在其通常不见于FR中的位置中的特定氨基酸。在某些实施方案中，来自针对PCSK9的抗体的移植的可变区可与不同于针对PCSK9的抗体的恒定区的恒定区一起使用。在某些实施方案中，移植的可变区为单链Fv抗体的一部分。CDR移植例如描述于美国专利号6,180,370、6,054,297、5,693,762、5,859,205、5,693,761、5,565,332、5,585,089及5,530,101中及Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988)；Winter,FEBS Letts.,430:92-94(1998)中，其据此出于任何目的以引用的方式并入本文。

人类抗原结合蛋白(例如抗体)

如本文所述，结合PCSK9的抗原结合蛋白可包含人类(即完全人类)抗体和/或其部分。在某些实施方案中，提供编码重链及轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列及构成重链及轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列，尤其对应于可变区的序列。在某些实施方案中，提供对应于互补决定区(CDR)的序列，特别是来自CDR1至CDR3的序列。根据某些实施方案，提供表达所述免疫球蛋白分子的杂交瘤细胞系。根据某些实施方案，提供表达所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，杂交瘤细胞系是选自表2中所述的至少一种细胞系，例如21B12、16F12及31H4。在某些实施方案中，提供针对人类PCSK9的纯化的人类单克隆抗体。

可用人类Ig基因座的大片段改造小鼠抗体产生有缺陷的小鼠品系预期使所述小鼠将在不存在小鼠抗体下产生人类抗体。大的人类Ig片段可保留大的可变基因多样性以及对抗体产生及表达的适当调控。通过利用小鼠达成抗体多样化及选择以及对人类蛋白质缺乏免疫耐受性的机构，在这些小鼠品系中再生的人类抗体谱系可产生针对任何相关抗原(包括人类抗原)的高亲和力完全人类抗体。使用杂交瘤技术，可产生并选择具有所要特异性的抗原特异性人类MAb。某些示例性方法描述于WO 98/24893、美国专利号5,545,807、EP546073及EP546073中。

在某些实施方案中，可使用来自除人类以外的物种的恒定区以及人类可变区。

能够在酵母人工染色体(YAC)中克隆并再构建百万碱基大小的人类基因座且将其引入小鼠种系中提供一种阐明极大或粗略定位的基因座的功能性组分以及产生适用的人类疾病模型的方法。此外，利用所述技术使得小鼠基因座被其人类等效物取代可提供对在发育期间人类基因产物的表达及调控、其与其它系统的通讯(communication)、及其在疾病诱发及进展中的牵连的理解。

人类抗体避免一些与具有鼠类或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的问题。存在所述鼠类或大鼠源性蛋白质可导致抗体的快速清除或可导致患者产生针对抗体的免疫反应。为避免利用鼠类或大鼠源性抗体，可经由将功能性人类抗体基因座引入啮齿动物、其它哺乳动物或动物中以使得所述啮齿动物、其它哺乳动物或动物产生完全人类抗体来产生完全人类抗体。

人源化抗体为尽管最初开始含有不为人类的抗体氨基酸序列，但这些非人类抗体氨基酸序列中的至少一些已被人类抗体序列置换的那些抗体。这不同于抗体由人类具有的基因编码(或能够由其编码)的人类抗体。

抗原结合蛋白变体

提供的其它抗体为以上所列的通过表2中所示的可变重链及可变轻链的组合或子部分形成的ABP的变体并且包含各自与表2中的序列的氨基酸序列(整个序列或序列的子部分，例如一个或多个CDR)具有至少50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或99％以上同一性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，所述抗体包括至少一条重链及一条轻链，而在其它情况下，变异形式含有两条相同轻链及两条相同重链(或其子部分)。在一些实施方案中，图2A-3D(及图13A-13J，以及图15A-15D中的其它实施方案)中的序列比较可用于通过观测影响结合的那些变化及似乎不影响结合的那些变化来鉴定可被修饰的抗体区段。举例来说，通过比较类似序列，可鉴定可被修饰的那些区段(例如具体氨基酸)及可如何对其进行修饰而仍然保留(或改进)ABP的功能性。在一些实施方案中，ABP的变体包括图13A、13C、13F、13G、13H、13I和/或13J中所述的那些共有组及序列且在图中鉴定为可变的位置允许变化。图13A、13C、13F、及13G中所示的CDR是基于Chothia方法(基于结构环区的位置，参见例如“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Bissan Al-Lazikani,Arthur M.Lesk和Cyrus Chothia,Journal of Molecular Biology,273(4):927-948,11月7日(1997))与Kabat方法(基于序列可变性，参见例如Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版NIH出版号91-3242,Kabat等，(1991))的混合组合加以限定。通过任一种方法确定的各残基包括在最终CDR残基清单中(且呈现于图13A、13C、13F和13G中)。图13H、13I及13J中的CDR通过单独Kabat方法获得。除非另外规定，否则图13H-13J中的已限定的共有序列、CDR及FR将限定并控制图13中参照的ABP的所指示CDR及FR。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含有可变区的重链，所述可变区包含与选自以下至少一种序列的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含有可变区的重链，所述可变区包含与选自以下至少一种序列的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含有可变区的重链，所述可变区包含与选自以下至少一种序列的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与来自以下至少一种序列中的CDR的一个或多个CDR至少90％、90-95％和/或95-99％相同的序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在一些实施方案中，存在1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR(各自与以上序列至少90％、90-95％和/或95-99％相同)。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与来自以下至少一种序列中的FR的一个或多个FR至少90％、90-95％和/或95-99％相同的序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在一些实施方案中，存在1个、2个、3个或4个FR(各自与以上序列至少90％、90-95％和/或95-99％相同)。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含有可变区的轻链，所述可变区包含与选自以下至少一种序列的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含有可变区的轻链，所述可变区包含与选自以下至少一种序列的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含有可变区的轻链，所述可变区包含与选自以下至少一种序列的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与来自以下至少一种序列中的CDR的一个或多个CDR至少90％、90-95％和/或95-99％相同的序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在一些实施方案中，存在1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR(各自与以上序列至少90％、90-95％和/或95-99％相同)。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含与来自以下至少一种序列中的FR的一个或多个FR至少90％、90-95％和/或95-99％相同的序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在一些实施方案中，存在1个、2个、3个或4个FR(各自与以上序列至少90％、90-95％和/或95-99％相同)。

根据本公开，熟练技术人员将能够使用熟知技术确定如本文阐述的ABP的适合变体。在某些实施方案中，本领域技术人员可通过靶向据信对活性不重要的区域来鉴定分子的可被改变而不破坏活性的适合区域。在某些实施方案中，可鉴定分子的在类似多肽之间保守的残基及部分。在某些实施方案中，甚至可对生物活性或结构来说重要的区域也可经受保守性氨基酸取代而不破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。

另外，本领域技术人员可回顾鉴定类似多肽中对活性或结构来说重要的残基的结构-功能研究。鉴于所述比较，可预测蛋白质中与类似蛋白质中对活性或结构来说重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可选择化学上类似的氨基酸取代所述被预测为重要的氨基酸残基。

本领域技术人员还可相对于类似ABP中的结构分析三维结构及氨基酸序列。鉴于此信息，本领域技术人员可预测抗体的氨基酸残基相对于所述抗体的三维结构的比对。在某些实施方案中，本领域技术人员可选择不对预测在蛋白质表面上的氨基酸残基进行根本变化，因为所述残基可牵涉于与其它分子的重要相互作用中。此外，本领域技术人员可产生在各所要氨基酸残基处含有单一氨基酸取代的测试变体。然后可使用本领域技术人员已知的活性测定筛选变体。所述变体可用于收集关于适合变体的信息。举例来说，如果发现具体氨基酸残基的变化导致活性受破坏、不合乎需要地降低或不适合，那么可避免具有所述变化的变体。换句话说，基于从所述常规实验收集的信息，本领域技术人员可易于确定应避免单独或与其它突变组合进行进一步取代的氨基酸。

许多科学出版物已致力于预测二级结构。参见Moult J.,Curr.Op.in Biotech.,7(4):422-427(1996)；Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974)；Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47:45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.,47:251-276及Chou等，Biophys.J.,26:367-384(1979)。此外，计算机程序当前可用于辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源模型化。举例来说，序列同一性大于30％或类似性大于40％的两个多肽或蛋白质常具有类似结构拓扑。蛋白质结构数据库(PDB)的新近发展已提供增强的二级结构可预测性，包括多肽或蛋白质结构内的潜在折叠数目。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.,27(1):244-247(1999)。已提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.,7(3):369-376(1997))，给定多肽或蛋白质中的折叠数目有限并且一旦已解析临界数目的结构，结构预测即将变得明显更准确。

预测二级结构的其它方法包括“穿线法(threading)”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377-87(1997)；Sippl等，Structure,4(1):15-19(1996))、“概况分析”(Bowie等，Science，253:164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.,183:146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,84(13):4355-4358(1987))、及“进化关联(evolutionary linkage)”(参见Holm，同上(1999)及Brenner，同上(1997))。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白变体包括糖基化变体，其中相较于亲本多肽的氨基酸序列，糖基化位点的数目和/或类型已经改变。在某些实施方案中，相较于天然蛋白质，蛋白质变体包含更大或更小数目的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点由Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列表征，其中指定为X的氨基酸残基可为除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。用以生成这个序列的氨基酸残基的取代提供用于添加N-连接的碳水化合物链的潜在新位点。或者，消除这个序列的取代将移除现有N-连接的碳水化合物链。还提供N-连接的碳水化合物链的重排，其中消除一个或多个N-连接的糖基化位点(通常为天然存在的那些位点)且生成一个或多个新的N-连接位点。其它优选抗体变体包括半胱氨酸变体，其中相较于亲本氨基酸序列，一个或多个半胱氨酸残基缺失或被取代成另一氨基酸(例如丝氨酸)。当抗体如在分离不溶性包涵体之后必须再折叠成生物活性构象时，半胱氨酸变体可为适用的。半胱氨酸变体通常含有比天然蛋白质少的半胱氨酸残基，且通常具有偶数个半胱氨酸残基以使由未配对半胱氨酸所致的相互作用最小。

根据某些实施方案，氨基酸取代为以下取代：(1)降低对蛋白水解的敏感性的取代，(2)降低对氧化的敏感性的取代，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力的取代，(4)改变结合亲和力的取代，和/或(4)赋予或改变所述多肽的其它物理化学或功能性质的取代。根据某些实施方案，单一或多个氨基酸取代(在某些实施方案中为保守性氨基酸取代)可于天然存在的序列中进行(在某些实施方案中，在多肽的形成分子间接触的结构域外部的部分中进行)。在某些实施方案中，保守性氨基酸取代通常不能实质上改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应倾向于打断亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构)。领域公认的多肽二级及三级结构的实例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编，W.H.Freeman and Company,NewYork(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden及J.Tooze编，GarlandPublishing,New York,N.Y.(1991))；及Thornton等，Nature,354:105(1991)中，其各自以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，变体为本文公开的ABP的核酸序列的变体。本领域技术人员应了解以上论述可用于鉴定、评价及/产生ABP蛋白质变体以及用于可编码那些蛋白质变体的核酸序列。因此，涵盖编码那些蛋白质变体的核酸序列(以及编码表2中的ABP但不同于本文明确公开的核酸序列)。举例来说，ABP变体可与SEQ ID NO:152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151中所述的至少一个核酸序列或由SEQ ID NO:152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150及151中的核酸序列编码的至少一至六个(及其各种组合)CDR具有至少80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或99％以上同一性。

在一些实施方案中，如果编码特定ABP的核酸序列(或核酸序列本身)可在严格条件下与编码表2中的蛋白质的任何核酸序列(如(但不限于)SEQ ID NO:152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150及151)选择性杂交，那么抗体(或编码其的核酸序列)为变体。在一个实施方案中，适合的中等严格条件包括于5×SSC；0.5％SDS；1.0mM EDTA(pH 8:0)中预洗涤；用5×SSC在50℃-65℃下杂交过夜或如果存在交叉物种同源性，那么用0.5×SSC在45℃下杂交；随后在65℃下持续20分钟用含有0.1％SDS的2×SSC、0.5×SSC及0.2×SSC的每一种洗涤两次。所述杂交DNA序列也在本发明的范围内，归因于密码简并性，编码由杂交DNA序列编码的抗体多肽的核苷酸序列及由这些核酸序列编码的氨基酸序列也在本发明的范围内。在一些实施方案中，CDR的变体包括与以上指示的序列内的一个或多个CDR(单个CDR可易于根据图2A-3D及图3CCC-3JJJ及图15A-15D中的其它实施方案确定)杂交的核酸序列及由那些序列编码的氨基酸序列。在此情形下提及的词语“选择性杂交”意指可检测及选择性地结合。本发明的聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在使与非特异性核酸的可检测结合的可观量最小的杂交及洗涤条件下与核酸链选择性杂交。高严格性条件可用于实现如本领域中已知及本文论述的选择性杂交条件。一般来说，本发明的聚核苷酸、寡核苷酸及片段与相关核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80％，且更通常具有优选递增的同源性，即至少85％、90％、95％、99％及100％。如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，那么这两个氨基酸序列是同源的。举例来说，85％同源性意指当比对两个序列以达成最大匹配时，有85％的氨基酸相同。在最大化匹配中允许存在空位(在所匹配的两个序列的任一个中)；空位长度优选为5或5以下，其中2或2以下更优选。或者并且优选地，使用具有突变数据矩阵的程序ALIGN及6或6以上的空位罚分，如果两个蛋白质序列(或源于其的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)具有5以上的比对分值(以标准偏差单位计)，那么其为同源的，如此术语在本文中所使用。参见Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein Sequence and Structure，第101-110页(第5卷，NationalBiomedical Research Foundation(1972))及此卷的增刊2，第1-10页。更优选地，当使用ALIGN程序进行最佳比对时，如果两个序列或其部分的氨基酸同一性大于或等于50％，那么这两个序列或其部分同源。术语“对应于”在本文中用于意指聚核苷酸序列与参照聚核苷酸序列的全部或一部分同源(即，是相同的，不是严格地进化相关)，或意指多肽序列与参照多肽序列相同。相比而言，术语“与…互补”在本文中用于意指互补序列与参照聚核苷酸序列的全部或一部分同源。举例来说，核苷酸序列“TATAC”对应于参照序列“TATAC”并且与参照序列“GTATA”互补。

制备抗原结合蛋白(例如抗体)

在某些实施方案中，抗原结合蛋白(如抗体)是通过用抗原(例如PCSK9)进行免疫而产生的。在某些实施方案中，抗体可通过用全长PCSK9、可溶形式的PCSK9、单独催化域、图1A中所示的成熟形式的PCSK9、剪接变异形式的PCSK9或其片段进行免疫而产生。在某些实施方案中，本发明抗体可为多克隆或单克隆抗体，和/或可为重组抗体。在某些实施方案中，本发明抗体为例如通过对能够产生人类抗体的转基因动物进行免疫所制备的人类抗体(参见例如PCT公布的申请号W093/12227)。

在某些实施方案中，某些策略可用于操纵抗体的固有性质，如抗体对其目标的亲和力。所述策略包括(但不限于)使用编码抗体的聚核苷酸分子的位点特异性突变发生或随机突变发生以生成抗体变体。在某些实施方案中，所述生成之后筛选展现所要变化，例如亲和力增加或减小的抗体变体。

在某些实施方案中，突变发生策略中所靶向的氨基酸残基为CDR中的那些氨基酸残基。在某些实施方案中，靶向可变域的框架区中的氨基酸。在某些实施方案中，所述框架区已显示有助于某些抗体的目标结合性质。参见例如Hudson,Curr.Opin.Biotech.,9:395-402(1999)及其中的参考文献。

在某些实施方案中，较小且更有效筛选的抗体变体文库是通过将随机或定点突变发生限制于CDR中的高突变位点而产生，所述位点为对应于在体细胞亲和力成熟过程期间倾向于突变的区域的位点。参见例如Chowdhury和Pastan,Nature Biotech.,17:568-572(1999)及其中的参考文献。在某些实施方案中，某些类型的DNA元件可用于鉴定高突变位点，包括(但不限于)某些直接及反向重复序列、某些共有序列、某些二级结构及某些回文序列。举例来说，可用于鉴定高突变位点的所述DNA元件包括(但不限于)依次包含嘌呤(A或G)、鸟嘌呤(G)、嘧啶(C或T)、腺苷或胸苷(A或T)的四碱基序列(即A/G-G-C/T-A/T)。可用于鉴定高突变位点的DNA元件的另一实例为丝氨酸密码子A-G-C/T。

制备完全人类ABP(例如抗体)

在某些实施方案中，使用噬菌体展示技术来生成单克隆抗体。在某些实施方案中，所述技术产生完全人类单克隆抗体。在某些实施方案中，编码单一Fab或Fv抗体片段的聚核苷酸在噬菌体粒子的表面上表达。参见例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等，J Mol Biol 222:581(1991)；美国专利号5,885,793。在某些实施方案中，“筛选”噬菌体以鉴定对目标具有亲和力的那些抗体片段。因此，某些所述过程经由在丝状噬菌体的表面上展示抗体片段谱系，且随后根据噬菌体与目标的结合选择噬菌体来模拟免疫选择。在某些所述程序中，分离高亲和力的功能性中和性抗体片段。在某些所述实施方案(以下更详细地论述)中，通过从外周血淋巴细胞克隆天然重排的人类V基因来生成人类抗体的完整基因谱系。参见例如Mullinax等，Proc Natl Acad Sci(USA),87:8095-8099(1990)。

根据某些实施方案，利用转基因小鼠制备本发明抗体，所述转基因小鼠已嵌入相当多部分的产生人类抗体的基因组但在内源性鼠类抗体的生产上有缺陷。所述小鼠因而能够产生人类免疫球蛋白分子及抗体且在鼠类免疫球蛋白分子及抗体的生产上有缺陷。用于达成这个结果的技术公开于本文说明书中公开的专利、申请及参考文献中。在某些实施方案中，可采用如PCT公布申请号WO 98/24893或Mendez等，Nature Genetics,15:146-156(1997)中公开的方法，所述申请及文献据此出于任何目的以引用的方式并入本文。

一般来说，对PCSK9具有特异性的完全人类单克隆ABP(例如抗体)可如下产生。用相关抗原(例如PCSK9)免疫接种含有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，从所述小鼠获得表达抗体的淋巴细胞(如B细胞)。所述回收的细胞与骨髓型细胞系融合，以制备永生杂交瘤细胞系，且筛选并选择所述杂交瘤细胞系，以鉴定产生对相关抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，提供可产生对PCSK9具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系的制法。

在某些实施方案中，通过在体外将人类脾细胞(B细胞或T细胞)暴露于抗原，接着将暴露的细胞于免疫功能受损的小鼠(例如SCID或nod/SCID)中重建，来产生完全人类抗体。参见例如Brams等，J.Immunol.160:2051-2058(1998)；Carballido等，Nat.Med.,6:103-106(2000)。在某些所述方法中，将人类胎儿组织移植入SCID小鼠(SCID-hu)中会引起长期血细胞生成及人类T细胞发育。参见例如McCune等，Science,241:1532-1639(1988)；Ifversen等，Sem.Immunol.,8:243-248(1996)。在某些情况下，所述嵌合小鼠中的体液免疫反应依赖于动物中人类T细胞的共同发育。参见例如Martensson等，Immunol.,83:1271-179(1994)。在某些方法中，将人类外周血淋巴细胞移植入SCID小鼠中。参见例如Mosier等，Nature,335:256-259(1988)。在某些所述实施方案中，当所述移植细胞用致敏剂(primingagent)(如葡萄球菌肠毒素A(SEA))或抗人类CD40单克隆抗体处理时，检测到更高的B细胞产量。参见例如Martensson等，Immunol.,84:224-230(1995)；Murphy等，Blood,86:1946-1953(1995)。

因此，在某些实施方案中，完全人类抗体可通过在宿主细胞中表达重组DNA或通过在杂交瘤细胞中表达来产生。在其它实施方案中，可使用本文所述的噬菌体展示技术产生抗体。

经由利用如本文所述的

技术制备本文所述的抗体。所述小鼠因而能够产生人类免疫球蛋白分子及抗体且在鼠类免疫球蛋白分子及抗体的产生上有缺陷。用于达成上述目的的技术公开于本文背景章节中公开的专利、申请及参考文献中。然而，具体来说，转基因产生小鼠及由其产生抗体的一个优选实施方案公开于以下文献中：1996年12月3日提交的美国专利申请号08/759,620及1998年6月11日公布的国际专利申请号WO 98/24893及2000年12月21日公布的WO 00/76310中，其公开据此以引用的方式并入本文。还参见Mendez等，Nature Genetics,15:146-156(1997)，其公开据此以引用的方式并入本文。

经由使用所述技术，已产生针对多种抗原的完全人类单克隆抗体。基本上，小鼠的

品系用相关抗原(例如PCSK9)免疫，从超免疫的小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)，且使回收的淋巴细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系。筛选并选择这些杂交瘤细胞系以鉴定产生对相关抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供产生会产生对PCSK9具有特异性的抗体的多个杂交瘤细胞系的方法。另外，本文提供对由所述细胞系产生的抗体的表征，包括所述抗体的重链及轻链的核苷酸及氨基酸序列分析。

小鼠的

品系的产生进一步论述及描述于以下文献中：1990年1月12日提交的美国专利申请号07/466,008、1990年11月8日提交的美国专利申请号07/610,515、1992年7月24日提交的美国专利申请号07/919,297、1992年7月30日提交的美国专利申请号07/922,649、1993年3月15日提交的美国专利申请号08/031,801、1993年8月27日提交的美国专利申请号08/112,848、1994年4月28日提交的美国专利申请号08/234,145、1995年1月20日提交的美国专利申请号08/376,279、1995年4月27日提交的美国专利申请号08/430,938、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/464,584、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/464,582、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/463,191、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/462,837、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/486,853、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/486,857、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/486,859、1995年6月5日提交的美国专利申请号08/462,513、1996年10月2日提交的美国专利申请号08/724,752、1996年12月3日提交的美国专利申请号08/759,620、2001年11月30日提交的美国公布2003/0093820以及美国专利号6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181及5,939,598、以及日本专利号3 068 180 B2、3 068 506 B2及3 068 507 B2。还参见1996年6月12日授权公布的欧洲专利号EP 0463 151 B1、1994年2月3日公布的国际专利申请号WO 94/02602、1996年10月31日公布的国际专利申请号WO 96/34096、1998年6月11日公开的WO 98/24893、2000年12月21日公布的WO 00/76310。以上引用的专利、申请及参考文献各自的公开据此以全文引用的方式并入本文。

在一种替代性方法中，包括GenPharm International,Inc.在内的其他人利用“小基因座(minilocus)”方法。在小基因座方法中，经由纳入来自Ig基因座的片段(单个基因)来模拟外源性Ig基因座。因此，一个或多个V_H基因、一个或多个D_H基因、一个或多个J_H基因、μ恒定区及通常第二恒定区(优选γ恒定区)形成为插入动物中的构建体。这个方法描述于以下文献中：属于Surani等的美国专利号5,545,807；及皆属于Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299及6,255,458；属于Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669及6,023.010；属于Berns等的美国专利号5,612,205、5,721,367及5,789,215；以及属于Choi和Dunn的美国专利号5,643,763；及1990年8月29日提交的GenPharm国际美国专利申请号07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、1992年6月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,741，其公开据此以引用的方式并入本文。还参见欧洲专利号0 546073B1、国际专利申请号WO 92/03918、WO92/22645、WO 92/22647、WO92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852及WO 98/24884及美国专利号5,981,175，其公开据此以全文引用的方式并入本文。进一步参见Taylor等，1992；Chen等，1993；Tuaillon等，1993；Choi等，1993；Lonberg等，(1994)；Taylor等，(1994)；及Tuaillon等，(1995)；Fishwild等，(1996)，其公开据此以全文引用的方式并入本。

Kirin也已证明可由已经由微细胞融合引入染色体的较大片段或整个染色体的小鼠生成人类抗体。参见欧洲专利申请号773288及843961，其公开据此以引用的方式并入本文。另外，已产生KM^TM小鼠，其为Kirin的Tc小鼠与Medarex的小基因座(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人类IgH转染色体及Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等，Cloning Stem Cells,(2002)4:91-102)。

人类抗体还可通过体外方法获得。适合实例包括(但不限于)噬菌体展示(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(先前为Proliferon)、Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示及类似方法。

在一些实施方案中，本文所述的抗体具有人类IgG4重链以及IgG2重链。抗体也可为其它人类同种型，包括IgG1。抗体具有高亲和力，当通过各种技术测量时，通常具有约10^-6至约10^-13M或10^-13M以下的Kd。

如应了解，抗体可于除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适合的哺乳动物宿主细胞。可通过将聚核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法进行转化，包括例如将聚核苷酸包装于病毒中(或包装于病毒载体中)并且用病毒(或载体)或通过本领域中已知的转染程序转导宿主细胞，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455所例示(所述专利据此以引用的方式并入本文)。所用转化程序取决于有待转化的宿主。用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域中为熟知的且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沈淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将聚核苷酸囊封于脂质体中以及将DNA直接显微注射于核中。

可用作供表达用的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中为熟知的且包括许多可自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)获得的永生化细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人类上皮肾293细胞以及许多其它细胞系。经由确定哪些细胞系具有高表达水平并且产生具有组成性PCSK9结合性质的抗体来选择特别优选的细胞系。

在某些实施方案中，通过至少一种以下杂交瘤产生抗体和/或ABP：21B12、31H4、16F12、表2中列出或实施例中公开的任何其它杂交瘤。在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK9的解离常数(K_D)为小于约1nM，例如1000pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM、和/或1pM至0.1pM或0.1pM以下。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含以下至少一种同种型的免疫球蛋白分子：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD及IgM同种型。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人类κ轻链和/或人类重链。在某些实施方案中，重链为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型。在某些实施方案中，抗原结合蛋白已被克隆以便在哺乳动物细胞中表达。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含除以下同种型的任一个恒定区以外的恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD及IgM同种型。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人类λ轻链及人类IgG2重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人类λ轻链及人类IgG4重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人类λ轻链及人类IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在其它实施方案中，抗原结合蛋白包含人类κ轻链及人类IgG2重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人类κ轻链及人类IgG4重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人类κ轻链及人类IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含抗体的可变区连接于既不为IgG2同种型的恒定区也不为IgG4同种型的恒定区的恒定区。在某些实施方案中，抗原结合蛋白已被克隆以便在哺乳动物细胞中表达。

在某些实施方案中，对来自杂交瘤株系21B12、31H4及16F12中的至少一种的抗体的重链及轻链进行保守性修饰(及对编码核苷酸进行相应修饰)将产生功能及化学特征类似于来自杂交瘤株系21B12、31H4及16F12的抗体的针对PCSK9的抗体。相反，在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的功能和/或化学特征的实质性修饰可通过选择重链及轻链的氨基酸序列中的取代来实现，所述取代对维持(a)取代区域中的分子骨架的结构，例如呈薄片或螺旋构象；(b)分子在目标位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链体积的影响显著不同。

举例来说，“保守性氨基酸取代”可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基以使对那个位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有极少影响或无影响。此外，多肽中的任何天然残基还可被丙氨酸取代，如先前对于“丙氨酸扫描突变发生”所述。

所要氨基酸取代(无论保守或非保守)可由本领域技术人员在需要所述取代时确定。在某些实施方案中，氨基酸取代可用于鉴定针对PCSK9的抗体的重要残基或增加或减小如本文所述的抗体对PCSK9的亲和力。

在某些实施方案中，本发明抗体可于除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。在某些实施方案中，编码特定抗体的序列可用于转化适合的哺乳动物宿主细胞。根据某些实施方案，可通过将聚核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法进行转化，包括例如将聚核苷酸包装于病毒中(或包装于病毒载体中)且用病毒(或载体)或通过本领域中已知的转染程序转导宿主细胞，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455所例示(所述专利据此出于任何目的以引用的方式并入本文)。在某些实施方案中，所用转化程序可取决于有待转化的宿主。用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域中为熟知的并且包括(但不限于)葡聚糖介导的转染、磷酸钙沈淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将聚核苷酸囊封于脂质体中以及将DNA直接显微注射于核中。

可用作供表达用的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中为熟知的且包括(但不限于)许多可从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得的永生化细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)及许多其它细胞系。在某些实施方案中，可经由确定哪些细胞系具有高表达水平且产生具有组成性HGF结合性质的抗体来选择细胞系。适用于哺乳动物宿主细胞的表达载体为熟知的。

在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含一种或多种多肽。在某些实施方案中，多种表达载体/宿主系统的任一种可用于表达编码包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽的聚核苷酸分子。所述系统包括(但不限于)微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘质粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜嵌纹病毒(cauliflower mosaic virus)、CaMV、烟草嵌纹病毒(tobacco mosaic virus)TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

在某些实施方案中，包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽于酵母中重组表达。某些所述实施方案遵循制造商说明书使用可商购获得的表达系统，例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen,San Diego,CA)。在某些实施方案中，所述系统依赖于前原α序列来指导分泌。在某些实施方案中，插入物的转录是由醇氧化酶(AOX1)启动子在由甲醇诱导后驱动。

在某些实施方案中，包含一种或多种ABP组分或ABP本身的分泌型多肽是从酵母生长培养基中纯化的。在某些实施方案中，用于从酵母生长培养基中纯化多肽的方法与用于从细菌及哺乳动物细胞上清液中纯化多肽的方法相同。

在某些实施方案中，将编码包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽的核酸克隆入杆状病毒表达载体，如pVL1393(PharMingen,San Diego,CA)。在某些实施方案中，所述载体可根据制造商说明书(PharMingen)用于在sF9无蛋白质培养基中感染草地粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞并且产生重组多肽。在某些实施方案中，使用肝素-琼脂糖管柱(Pharmacia)从所述培养基纯化并浓缩多肽。

在某些实施方案中，包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽于昆虫系统中表达。用于多肽表达的某些昆虫系统为本领域技术人员所熟知。在一个所述系统中，加洲苜蓿夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)用作在草地粘虫细胞中或在粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因的载体。在某些实施方案中，编码多肽的核酸分子可插入病毒的非必需基因中，例如插入多角体蛋白(polyhedrin)基因内，且置于启动子对那个基因的控制下。在某些实施方案中，成功插入核酸分子将致使非必需基因不活化。在某些实施方案中，那种不活化会产生可检测的特征。举例来说，多角体蛋白基因的不活化导致产生的病毒缺乏外壳蛋白。

在某些实施方案中，重组病毒可用于感染草地粘虫细胞或粉纹夜蛾幼虫。参见例如Smith等，J.Virol.,46:584(1983)；Engelhard等，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),91:3224-7(1994)。

在某些实施方案中，于细菌细胞中制备的包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽在细菌中以不溶性包涵体形式产生。在某些实施方案中，包含所述包涵体的宿主细胞通过离心来收集；于0.15M NaCl、10mM Tris(pH 8)、1mM EDTA中洗涤；且用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma,St.Louis,MO)在室温下处理15分钟。在某些实施方案中，通过超声处理使溶解产物澄清，且通过在12,000×g下离心10分钟来沉淀细胞碎片。在某些实施方案中，将含有多肽的沉淀重悬于50mM Tris(pH 8)及10mM EDTA中；经50％甘油层化；且在6000×g下离心30分钟。在某些实施方案中，那个沉淀可重悬于不含Mg⁺⁺及Ca⁺⁺的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。在某些实施方案中，通过使重悬的沉淀于变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中份化来进一步纯化多肽(参见例如Sambrook等，同上)。在某些实施方案中，所述凝胶可浸泡于0.4MKCl中以观测蛋白质，其可被切除并于缺乏SDS的凝胶操作缓冲液中进行电洗脱。根据某些实施方案，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白于细菌中以可溶性蛋白质形式产生。在某些实施方案中，使用GST纯化组件(Pharmacia)纯化所述GST融合蛋白。

在某些实施方案中，需要“再折叠”某些多肽，例如包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽。在某些实施方案中，所述多肽是使用本文论述的某些重组系统产生。在某些实施方案中，多肽被“再折叠”和/或氧化以形成所要三级结构和/或生成二硫键。在某些实施方案中，所述结构和/或键与多肽的某一生物活性相关。在某些实施方案中，再折叠是使用本领域中已知的许多程序中的任一种完成。示例性方法包括(但不限于)在离液剂存在下将溶解的多肽试剂暴露于通常超过7的pH下。一种示例性离液剂为胍。在某些实施方案中，再折叠/氧化溶液还含有还原剂及那种还原剂的氧化形式。在某些实施方案中，还原剂及其氧化形式以将产生允许进行二硫化物改组的特定氧化还原电位的比率存在。在某些实施方案中，所述改组允许形成半胱氨酸桥。示例性氧化还原偶包括(但不限于)半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫基双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT、及2-巯基乙醇(bME)/二硫-bME。在某些实施方案中，使用共溶剂来提高再折叠效率。示例性共溶剂包括(但不限于)甘油、各种分子量的聚乙二醇、及精氨酸。

在某些实施方案中，实质上纯化包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽。某些蛋白质纯化技术为本领域技术人员所知。在某些实施方案中，蛋白质纯化涉及多肽部分与非多肽部分的粗略份化。在某些实施方案中，使用色谱和/或电泳技术纯化多肽。示例性纯化方法包括(但不限于)用硫酸铵沉淀；用PEG沉淀；免疫沉淀；热变性之后离心；色谱，包括(但不限于)亲和色谱(例如蛋白质-A-琼脂糖)、离子交换色谱、排阻色谱及逆相色谱；凝胶过滤；羟基磷灰石色谱；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；以及所述及其它技术的组合。在某些实施方案中，通过快速蛋白质液相色谱或通过高压液相色谱(HPLC)纯化多肽。在某些实施方案中，纯化步骤可加以变化或某些步骤可省略，并且仍然获得适于制备实质上纯化的多肽的方法。

在某些实施方案中，定量多肽制剂的纯化程度。定量纯化程度的某些方法为本领域技术人员所知。某些示例性方法包括(但不限于)通过SDS/PAGE分析测定制剂的特异性结合活性并评估制剂内的多肽的量。用于评估多肽制剂的纯化量的某些示例性方法包括计算制剂的结合活性并将其与初始提取物的结合活性比较。在某些实施方案中，所述计算的结果表述为“纯化倍数”。用于表示结合活性的量的单位取决于所进行的具体测定。

在某些实施方案中，部分纯化包含一种或多种ABP组分或ABP本身的多肽。在某些实施方案中，部分纯化可通过使用较少的纯化步骤或通过利用相同的通用纯化方案的不同形式来完成。举例来说，在某些实施方案中，利用HPLC装置进行的阳离子交换管柱色谱将通常产生大于利用低压色谱系统的相同技术的“纯化倍数”。在某些实施方案中，产生较低纯化程度的方法可在多肽的总回收率或维持多肽的结合活性方面具有优势。

在某些情况下，多肽的电泳迁移在不同SDS/PAGE条件下有时可显著不同。参见例如Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,76:425(1977)。应了解在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的多肽的表观分子量可不同。

示例性表位

提供抗PCSK9抗体所结合的表位。在一些实施方案中，由当前公开的抗体结合的表位特别适用。在一些实施方案中，结合由本文所述的抗体结合的任何表位的抗原结合蛋白为适用的。在一些实施方案中，由表2及图2和图3中列出的任何抗体结合的表位尤其适用。在一些实施方案中，表位在PCSK9催化域上。

在某些实施方案中，PCSK9表位可用于阻止(例如降低)抗PCSK9抗体或抗原结合蛋白与PCSK9的结合。在某些实施方案中，PCSK9表位可用于降低抗PCSK9抗体或抗原结合蛋白与PCSK9的结合。在某些实施方案中，PCSK9表位可用于实质上抑制抗PCSK9抗体或抗原结合蛋白与PCSK9的结合。

在某些实施方案中，PCSK9表位可用于分离结合PCSK9的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，PCSK9表位可用于产生结合PCSK9的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，PCSK9表位或包含PCSK9表位的序列可用作产生结合PCSK9的抗体或抗原结合蛋白的免疫原。在某些实施方案中，PCSK9表位可向动物施用，随后可从所述动物获得结合PCSK9的抗体。在某些实施方案中，PCSK9表位或包含PCSK9表位的序列可用于干扰正常PCSK9介导的活性，如PCSK9与LDLR的缔合。

在一些实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白特异性结合N端前结构域、枯草杆菌蛋白酶样催化域和/或C端结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK-9的底物结合凹槽(于Cunningham等中描述，所述文献以引用的方式整体并入本文)。

在一些实施方案中，含有与抗体接触或由抗体嵌埋的残基的结构域/区域可通过使PCSK9(例如野生型抗原)中的特定残基突变并确定抗原结合蛋白是否可结合突变的或变异的PCSK9蛋白来鉴定。通过进行许多单个突变，可鉴定在结合中起直接作用或足够紧靠抗体以使得突变可影响抗原结合蛋白与抗原之间的结合的残基。根据对这些氨基酸的认识，可阐明抗原的含有与抗原结合蛋白接触或由抗体覆盖的残基的结构域或区域。所述结构域可包括抗原结合蛋白的结合表位。这种通用方法的一个具体实例利用精氨酸/谷氨酸扫描方案(参见例如Nanevicz,T.等，1995,J.Biol.Chem.,270:37,21619-21625及Zupnick,A.等，2006,J.Biol.Chem.,281:29,20464-20473)。一般来说，精氨酸及谷氨酸取代(通常单个地取代)野生型多肽中的氨基酸，因为这些氨基酸带电荷且体积较大且因此有可能在引入突变的抗原区域中破坏抗原结合蛋白与抗原之间的结合。存在于野生型抗原中的精氨酸被谷氨酸置换。获得多种所述单个突变体并且分析收集的结合结果以确定哪些残基影响结合。

抗原结合蛋白与如本文所用的变异PCSK9之间的结合的改变(例如降低或增加)意味着结合亲和力(例如如通过已知方法(如以下在实施例中所述的Biacore测试或基于珠粒的测定)所测量)、EC₅₀存在变化和/或抗原结合蛋白的总结合能力存在变化(例如降低)(例如如由抗原结合蛋白浓度对抗原浓度的绘图中的Bmax降低所证实)。结合的显著改变指示突变的残基直接牵涉于与抗原结合蛋白的结合中或当结合蛋白与抗原结合时紧靠结合蛋白。

在一些实施方案中，结合的显著降低意味着相对于抗原结合蛋白与野生型PCSK9(例如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:303所示)之间的结合，抗原结合蛋白与突变PCSK9抗原之间的结合亲和力、EC50和/或能力降低了大于10％、大于20％、大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合降低至可检测的极限以下。在一些实施方案中，当抗原结合蛋白与变异PCSK9蛋白的结合小于在抗原结合蛋白与野生型PCSK9蛋白(例如具有SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:303的蛋白质)之间观测的结合的50％(例如小于40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时表明结合显著降低。所述结合测量可使用本领域中已知的多种结合测定进行。

在一些实施方案中，提供展现对野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:303)中的残基由精氨酸或谷氨酸取代的变异PCSK9蛋白的结合显著较低的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，抗原结合蛋白对具有任何一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或244个)以下突变的变异PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R、E582R、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。在此处使用的简写记法中，格式为：野生型残基:多肽中的位置:突变残基，其中残基的编号如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303中所示。

在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，抗原结合蛋白对在如SEQ ID NO:1所示的以下位置处具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或5个以上)突变的突变PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，抗原结合蛋白对在如SEQ ID NO:1所示的以下位置处具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或5个以上)突变的突变PCSK9蛋白的结合降低或增加：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，抗原结合蛋白对在SEQ ID NO:1内的以下位置处具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或5个以上)突变的突变PCSK9蛋白的结合实质上降低或增加：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。

在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，ABP对在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303内具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个等)以下突变的突变PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R、E582R、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。

在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，ABP对在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303内具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个等)以下突变的突变PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及E582R。在一些实施方案中，结合降低。在一些实施方案中，结合的降低被观测为EC50的变化。在一些实施方案中，EC50的变化为EC50的数值增加(且因此为结合降低)。

在一些实施方案中，相较于野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)，ABP对在SEQ ID NO:1内具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个等)以下突变的突变PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。在一些实施方案中，结合降低。在一些实施方案中，结合的降低被观测为Bmax的变化。在一些实施方案中，Bmax的位移为由ABP生成的最大信号降低。在一些实施方案中，对于将为表位的一部分的氨基酸，Bmax降低了至少10％，例如降低至少任何以下量可在一些实施方案中指示残基为表位的一部分：20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。

尽管刚才所列的变异形式是关于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303中所示的野生型序列而提及，但应了解在PCSK9的等位基因变体中，在所指示位置处的氨基酸可不同。还涵盖显示对PCSK9的所述等位基因形式的结合显著较低的抗原结合蛋白。因此，在一些实施方案中，任何以上实施方案皆可与等位基因序列，而非仅与图1A中所示的野生型序列进行比较。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白对野生型PCSK9蛋白中所选位置处的残基突变成任何其它残基的变异PCSK9蛋白的结合显著降低。在一些实施方案中，本文所述的精氨酸/谷氨酸置换用于所鉴定的位置。在一些实施方案中，丙氨酸用于所鉴定的位置。

如上所指示，可根据扫描结果鉴定直接牵涉于结合中或由抗原结合蛋白覆盖的残基。因此，这些残基可指示SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:303或SEQ ID NO:3)的含有抗原结合蛋白所结合的结合区的结构域或区域。如从实施例39中概述的结果可见，在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个以下氨基酸的结构域：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个以下氨基酸的区域：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个以下氨基酸的区域：162、164、167、207和/或208。在一些实施方案中，一个以上(例如2个、3个、4个或5个)鉴定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在一些实施方案中，ABP与ABP21B12竞争。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个氨基酸185的区域。在一些实施方案中，ABP与ABP 31H4竞争。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个以下氨基酸的区域：439、513、538和/或539。在一些实施方案中，一个以上(例如2个、3个或4个)鉴定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在一些实施方案中，ABP与ABP 31A4竞争。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个以下氨基酸的区域：123、129、311、313、337、132、351、390和/或413。在一些实施方案中，一个以上(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)鉴定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在一些实施方案中，ABP与ABP 12H11竞争。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的至少一个以下氨基酸的区域：582、519、521和/或554。在一些实施方案中，一个以上(例如2个、3个或4个)鉴定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在一些实施方案中，ABP与ABP 3C4竞争。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的片段或全长序列内的前述区域。在其它实施方案中，抗原结合蛋白结合由这些区域组成的多肽。提及“SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303”表示这些序列的一个或两个可被采用或相关。所述词语不表示应仅采用一个。

如上所指示，以上描述参照SEQ ID NO:1提及特定氨基酸位置。然而，在说明书通篇中通常提及在SEQ ID NO:3提供的位置31处开始的Pro/Cat结构域。如下所指示，SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:303缺乏PCSK9的信号序列。因而，这些不同公开之间的任何比较皆应考虑此编号差异。具体来说，SEQ ID NO:1中的任何氨基酸位置皆将对应于向SEQ ID NO:3中的蛋白质中再增加30个氨基酸的氨基酸位置。举例来说，SEQ ID NO:1的位置207对应于SEQID NO:3(全长序列，且通常为用于本说明书中的编号系统)的位置237。表39.6概述参照SEQID NO:1(和/或SEQ ID NO:303)的以上指示位置如何对应于SEQ ID NO:3(其包括信号序列)。因此，关于SEQ ID NO:1(和/或SEQ ID NO:303)所述的任何以上指示的实施方案皆通过指示的相应位置参照SEQ ID NO:3加以描述。

在一些实施方案中，ABP 21B12结合包括残基162-167(例如SEQ ID NO:1的残基D162-E167)的表位。在一些实施方案中，ABP 12H11结合包括残基123-132(例如SEQ ID NO:1的S123-T132)的表位。在一些实施方案中，ABP 12H11结合包括残基311-313(例如SEQ IDNO:1的A311-D313)的表位。在一些实施方案中，ABP可结合包括这些序列链的任一条的表位。

竞争性抗原结合蛋白

另一方面，提供与所例示的一种结合本文所述的表位的抗体或功能性片段竞争特异性结合PCSK9的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白还可与本文所例示的一种抗原结合蛋白结合相同表位或重叠表位。预期与所例示的抗原结合蛋白竞争或结合相同表位的抗原结合蛋白及片段会显示类似的功能性质。所例示的抗原结合蛋白及片段包括以上所述的那些，包括具有表2和/或图2-3中包括的重链和轻链、可变区结构域及CDR的那些。因此，作为一个具体实例，提供的抗原结合蛋白包括与具有以下的抗体或抗原结合蛋白竞争的那些：

(a)对于图2-3中列出的抗体所列的所有6个CDR；

(b)对于表2中列出的抗体所列的VH及VL；或

(c)如对于表2中列出的抗体所指定的两条轻链及两条重链。

治疗性药物制剂及施用

本发明提供含有针对PCSK9的抗原结合蛋白的药物制剂。如本文所用，“药物制剂”为药学活性药物(即至少一种针对PCSK9的抗原结合蛋白)的无菌组合物，其适于胃肠外施用(包括(但不限于)静脉内、肌肉内、皮下、雾化、肺内、鼻内或鞘内施用)于有需要的患者且包括仅药学上可接受的赋形剂、稀释剂及由联邦药物管理局(Federal DrugAdministration)或其他外国国家管理局视为安全的其它添加剂。药物制剂包括可直接施用的液体(例如水性)溶液、及可在施用之前通过添加稀释剂而复原成溶液的冻干粉末。术语“药物制剂”的范围内明确排除用于表面施用于患者的组合物、用于经口摄取的组合物及用于胃肠外给养的组合物。

在某些实施方案中，药物制剂为稳定的药物制剂。如本文所用，词语“稳定的药物制剂”、“稳定的制剂”或“药物制剂为稳定的”是指相较于对照配方样品，当在2-8℃下储存至少1个月或2个月或3个月或6个月或1年或2年时，展现聚集增加和/或生物活性损失降低不超过5％的生物活性蛋白质的药物制剂。制剂稳定性可易于由本领域技术人员使用许多标准测定来测定，包括(但不限于)尺寸排阻HPLC(“SEC-HPLC”)、阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)、通过光遮蔽进行的在显微镜下才可见的粒子检测(“HIAC”)和/或目视检查。

在某些实施方案中，药物制剂包含表2及图2和/或图3中所述的针对PCSK9的任何抗原结合蛋白。在一些实施方案中，药物制剂包含21B12、26H5、31H4、8A3、11F1或8A1中的任一种。

在一些实施方案中，药物制剂包含一种以上针对PCSK9的不同抗原结合蛋白。在某些实施方案中，药物制剂包含一种以上针对PCSK9的抗原结合蛋白，其中针对PCSK9的抗原结合蛋白结合一个以上表位。在一些实施方案中，不同抗原结合蛋白将不彼此竞争结合PCSK9。在一些实施方案中，表2及图2和/或图3中所述的任何抗原结合蛋白皆可一起组合于药物制剂中。

在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白和/或治疗分子连接于本领域中已知的延长半衰期的媒介物。所述媒介物包括(但不限于)聚乙二醇、糖原(例如ABP的糖基化)、以及葡聚糖。所述媒介物例如描述于美国申请号09/428,082(现为美国专利号6,660,843)及公布的PCT申请号WO 99/25044中，其据此出于任何目的以引用的方式并入本文。

在某些实施方案中，可接受的配制材料优选地在所采用的剂量及浓度下对接受者无毒。在一些实施方案中，配制材料是用于皮下(s.c.)和/或静脉内(I.V.)施用。在某些实施方案中，药物制剂包含用于改变、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的配制材料。

在某些实施方案中，适合的配制材料包括(但不限于)氨基酸(如脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、牛磺酸、甘氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、磷酸钠(“NaOAC”)、Tris-HCl、Tris缓冲剂、柠檬酸盐、磷酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲盐水(即PBS缓冲液)或其它有机酸)；膨胀剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；错合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；及其它碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、海藻糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂及稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐相对离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如普洛尼克(pluronics)、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、曲通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛帕(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编，MackPublishing Company(1995)。

在某些实施方案中，最佳药物制剂将由本领域技术人员根据例如预定施用途径、递送形式及所要剂量而确定。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在某些实施方案中，所述制剂可影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率及体内清除速率。

一方面，药物制剂包含高浓度的针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，ABP浓度在约70mg/ml至约250mg/ml的范围内，例如约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约210mg/ml、约220mg/ml、约230mg/ml、约240mg/ml或约250mg/ml，并且包括介于之间的所有值。在一些实施方案中，21B12、26H5或31H4的浓度在约100mg/ml至约150mg/ml的范围内，例如100mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。在一些实施方案中，8A3、11F1或8A1的浓度在约140mg/ml至约220mg/ml的范围内，例如140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约210mg/ml、约220mg/ml或约250mg/ml。

另一方面，药物制剂包含至少一种缓冲剂，如乙酸钠、氯化钠、磷酸盐、磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)和/或pH为约7.0-8.5的Tris缓冲液。缓冲剂用于维持生理上适合的pH。此外，缓冲剂可用于增强药物制剂的等张性及化学稳定性。在某些实施方案中，缓冲剂在约0.05mM至约40mM的范围内，例如约0.05mM、约0.1mM、约0.5mM、约1.0mM、约5.0mM、约10mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100nM缓冲剂，包括介于之间的所有值。在某些实施方案中，缓冲剂为NaOAC。药物制剂的示例性pH包括约4至约6、或约4.8至约5.8、或约5.0至约5.2、或约5、或约5.2。

在某些实施方案中，药物制剂为等张的，其中重量摩尔渗透压浓度在介于约250至约350毫渗摩/公斤(miliosmol/kg)之间的范围内，例如约250mOsm/kg、约260mOsm/kg、约270mOsm/kg、约280mOsm/kg、约290mOsm/kg、约300mOsm/kg、约310mOsm/kg、约320mOsm/kg、约330mOsm/kg、约340mOsm/kg或约350mOsm/kg，并且包括介于之间的所有值。如本文所用，“重量摩尔渗透压浓度”为溶质与体积流体的比率的量度。换句话说，其为每公斤溶液的分子及离子(或分子)的数目。重量摩尔渗透压浓度可在称为渗压计的分析仪器，如AdvancedInstruments 2020多样品渗压计(Norwood,MA)上测量。Advanced Instrumetns 2020多样品渗压计通过使用凝固点下降(Freezing Point Depression)法来测量重量摩尔渗透压浓度。溶液中的渗透溶质增加，溶液将凝固的温度则下降。也可使用本领域中已知的任何其它方法且在本领域中已知的任何其它装置中，如使用线性外插法来测量重量摩尔渗透压浓度。

又一方面，药物制剂包含至少一种表面活性剂，包括(但不限于)聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40及聚山梨醇酯-20。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度在制剂的约0.004％至约10％重量/体积(“w/v”)的范围内的表面活性剂，例如制剂的约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约5％或约10％w/v表面活性剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度在制剂的约0.004％至约0.1％w/v的范围内的聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度在制剂的约0.004％至约0.1％w/v的范围内的聚山梨醇酯20。

在某些实施方案中，药物制剂包含至少一种稳定剂，如多羟基烃(包括(但不限于)山梨糖醇、甘露糖醇、甘油及半乳糖醇)和/或二糖(包括(但不限于)蔗糖、乳糖、麦芽糖及海藻糖)和/或氨基酸(包括(但不限于)脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸及牛磺酸)和或苯甲醇；所述多羟基烃和/或二糖和/或氨基酸和/或苯甲醇的总量为制剂的约0.5％至约10％w/v。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％蔗糖的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为约5％蔗糖的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％山梨糖醇的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为约9％山梨糖醇的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和/或牛磺酸的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度介于约2-3％脯氨酸之间的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％苯甲醇的稳定剂。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度介于约1-2％苯甲醇之间的稳定剂。

一方面，药物制剂具有小于约30厘泊(cP)的粘度，如在室温下(即25C)所测量。如本文所用，“粘度”为流体的抗流动性，且可用单位厘泊(cP)或毫帕斯卡-秒(mPa-s)度量，其中在给定剪切速率下，1cP＝1mPa-s。粘度可通过使用粘度计，例如BrookfieldEngineering LVT型表盘式粘度计来测量。粘度还可使用本领域中已知的任何其它方法且在本领域中已知的任何其它装置中测量(例如绝对、运动或动态粘度或绝对粘度)。在某些实施方案中，药物制剂的粘度水平小于约25cP、约20cP、约18cP、约15cP、约12cP、约10cP、约8cP、约6cP、约4cP、约2cP、或约1cP。

一方面，如通过本领域技术人员已知的至少一种稳定性测定，如检查生物活性蛋白质随时间的生物物理或生物化学特征的测定所测量，药物制剂为稳定的。如上所提及，本发明的稳定的药物制剂为相较于对照配方样品，当在2-8℃下储存至少1个月或2个月或3个月或6个月或1年或2年时，展现聚集增加和/或生物活性损失降低不超过5％的生物活性蛋白质的药物制剂。在某些实施方案中，使用尺寸排阻HPLC(“SEC-HPLC”)测量药物制剂稳定性。SEC-HPLC基于蛋白质的流体动力学体积的差异分离蛋白质。流体动力学蛋白质体积较大的分子早于体积较小的分子洗脱。在SEC-HPLC的情况下，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现高分子量物质种类增加不超过约5％。在某些其它实施方案中，相较于对照样品，药物制剂应展现高分子量物质种类增加不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％、不超过约0.5％。

在某些实施方案中，使用阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)测量药物制剂稳定性。CEX-HPLC基于蛋白质的表面电荷的差异分离蛋白质。在设定pH下，在阳离子交换管柱上分离抗PCSK9ABP的带电荷同工型并使用盐梯度洗脱。通过紫外吸光度监测洗脱液。通过测定各同工型的峰面积占总峰面积的百分比来评价带电荷的同工型分布。在CEX-HPLC的情况下，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现主要同工型峰减少不超过约5％。在某些其它实施方案中，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现主要同工型峰减少不超过约3％至约5％。在某些实施方案中，相较于对照样品，药物制剂应展现主要同工型峰减少不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％、不超过约0.5％。

在某些实施方案中，使用通过光遮蔽进行的在显微镜下才可见的粒子检测 (“HIAC”)测量药物制剂稳定性。含有光遮蔽传感器(HIAC/Royco HRLD-150或等效物)以及液体取样器的电子液载粒子计数系统(HIAC/Royco 9703或等效物)可定量给定测试样品中的粒子数目及其尺寸范围。当液体中的粒子穿过光源与检测器之间时，其减弱或“遮蔽”落在检测器上的光束。当粒子的浓度处于传感器的正常范围内时，这些粒子逐个被检测。各粒子穿过检测区域会减少光检测器上的入射光并且光检测器的电压输出量瞬间降低。电压的变化记录为电脉冲，其由仪器转换成存在的粒子数目。所述方法为非特异性的且测量不管何种来源的粒子。监测的粒度通常为10um及25um。在HIAC的情况下，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现每个容器(或单位)不超过6000个10μm粒子。在某些实施方案中，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现每个容器(或单位)不超过5000个、不超过4000个、不超过3000个、不超过2000个、不超过1000个10μm粒子。在其它实施方案中，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现每个容器(或单位)不超过600个25μm粒子。在某些实施方案中，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现每个容器(或单位)不超过500个、不超过400个、不超过300个、不超过200个、不超过100个、不超过50个25μm粒子。

在某些实施方案中，使用目视评估测量药物制剂稳定性。目视评估为一种用于描述样品的可见物理特征的定性方法。视所评价的特征(例如颜色、澄清度、粒子或外来物质的存在)而定，相对于检查室的黑色和/或白色背景观察样品。还相对于乳白色参照标准物及颜色参照标准物来观察样品。在目视评估的情况下，相较于对照样品，稳定的药物制剂应展现在颜色、澄清度、粒子或外来物质的存在方面无显著变化。

本发明的一方面为一种药物制剂，其包含：(i)约70mg/ml至约250mg/ml针对PCSK9的抗原结合蛋白；(ii)约0.05mM至约40mM缓冲剂，如乙酸钠(“NaOAC”)充当缓冲剂；(iii)约1％至约5％脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸或牛磺酸(又称为2-氨基乙烷磺酸)和/或0.5％至约5％苯甲醇充当稳定剂；以及(iv)制剂的约0.004％至约10％w/v的非离子表面活性剂(包括(但不限于)聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40及聚山梨醇酯-20)；其中所述制剂的pH在约4.0至6.0的范围内。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约70mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml的抗PCSK9抗体；(ii)约10mM NAOAC；(iii)约0.01％聚山梨醇酯80；以及(iv)约2％-3％脯氨酸(或约250mM至约270mM脯氨酸)，其中制剂的pH为约5。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约70mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约140mg/ml的抗PCSK9抗体21B12、26H5和/或31H4；(ii)约10mMNAOAC；(iii)约0.01％聚山梨醇酯80；以及(iv)约2％-3％脯氨酸(或约250mM至约270mM脯氨酸)，其中制剂的pH为约5。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml的抗PCSK9抗体8A3、11F1和/或8A1；(ii)约10mMNAOAC；(iii)约0.01％聚山梨醇酯80；以及(iv)约2％-3％脯氨酸(或约250mM至约270mM脯氨酸)，其中制剂的pH为约5。

本发明的一方面为一种药物制剂，其包含(i)至少约70mg/ml至约250mg/ml的抗PCSK9抗体；(ii)约5mM至约20mM的缓冲剂，如NAOAC；(iii)制剂的约1％至约10％w/v的多羟基烃(如山梨糖醇)或二糖(如蔗糖)；以及(iv)制剂的约0.004％至约10％w/v的表面活性剂，如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；其中所述制剂的pH在约4.8至5.8的范围内；并且其中药物制剂任选地包含约80mM至约300mM脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸或牛磺酸和/或0.5％至约5％苯甲醇用于降低粘度。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约70mg/ml至约250mg/ml的抗PCSK9抗体；(ii)约10mM NAOAC；(iii)约9％蔗糖；以及(iv)约0.004％聚山梨醇酯20，其中制剂的pH为约5.2。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约70mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约140mg/ml、约160mg/ml、约180mg/ml、约200mg/ml的抗PCSK9抗体；(ii)约15mMNAOAC；(iii)约9％蔗糖；以及(iv)约0.01％聚山梨醇酯20，其中制剂的pH为约5.2。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约70mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约140mg/ml、约160mg/ml、约180mg/ml、约200mg/ml的抗PCSK9抗体；(ii)约20mM NAOAC；(iii)约9％蔗糖；以及(iv)约0.01％聚山梨醇酯20，其中制剂的pH为约5.2。在某些其它实施方案中，本发明的药物制剂包含(i)至少约70mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约140mg/ml、约160mg/ml、约180mg/ml、约200mg/ml的抗PCSK9抗体；(ii)约10mMNAOAC；(iii)约9％蔗糖；(iv)约0.01％聚山梨醇酯80；以及(v)约250mM脯氨酸，其中制剂的pH为约5。

本发明的药物制剂可以组合疗法(即与其它药剂组合)施用。在某些实施方案中，组合疗法包含能够结合PCSK9的抗原结合蛋白与至少一种抗胆固醇药剂组合。药剂包括(但不限于)体外合成制备的化学制剂、抗体、抗原结合区及其组合和缀合物。在某些实施方案中，药剂可充当激动剂、拮抗剂、变构调节剂或毒素。在某些实施方案中，药剂可起抑制或刺激其目标的作用(例如受体或酶活化或抑制)，且从而促进LDLR的表达增加或降低血清胆固醇水平。

在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白可在用胆固醇(血清和/或总胆固醇)降低剂治疗之前、同时及之后施用。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白可防治性施用以预防或减缓高胆固醇血症、心脏病、糖尿病和/或任何胆固醇相关疾病的发作。在某些实施方案中，可施用针对PCSK9的抗原结合蛋白用于治疗现有高胆固醇血症病状。在一些实施方案中，ABP延迟疾病和/或与疾病相关的症状的发作。在一些实施方案中，向不存在任一种胆固醇相关疾病或其子组的任何症状的受试者提供ABP。

在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白与具体治疗剂一起用于治疗各种胆固醇相关疾病，如高胆固醇血症。在某些实施方案中，鉴于病状及所要治疗程度，可施用两种、三种或更多种药剂。在某些实施方案中，所述药剂可通过包括在同一制剂中一起提供。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂与针对PCSK9的抗原结合蛋白可通过包括在同一制剂中一起提供。在某些实施方案中，所述药剂可单独配制且通过包括在治疗试剂盒中一起提供。在某些实施方案中，所述药剂及针对PCSK9的抗原结合蛋白可单独配制且通过包括在治疗试剂盒中一起提供。在某些实施方案中，所述药剂可单独提供。

在某些实施方案中，包含针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂的制剂可通过混合具有所要纯度的所选制剂与任选的配制剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，同上)以冻干饼块或水溶液形式制备以供储存。另外，在某些实施方案中，包含针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂的制剂可使用适当赋形剂配制成冻干物。

在某些实施方案中，当预期胃肠外施用时，治疗制剂可呈无热原质、胃肠外可接受的水溶液形式，其包含针对PCSK9的所要抗原结合蛋白连同或不连同其它治疗剂一起于药学上可接受的媒介物中。在某些实施方案中，用于胃肠外注射的媒介物为针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂一起于其中配制成经过适当防腐的无菌等张溶液的无菌蒸馏水。在某些实施方案中，制备可涉及所要分子与可使产品控制或持续释放因而所述产品可经由贮库式注射递送的试剂，如可注射微球体、生物可侵蚀粒子、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体一起配制。在某些实施方案中，还可使用透明质酸，且其可具有促进在循环中的持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入的药物递送装置可用于引入所要分子。

在某些实施方案中，可配制用于吸入的药物制剂。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白可连同或不连同至少一种其它治疗剂一起配制成用于吸入的干燥粉末。在某些实施方案中，包含针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂的吸入溶液可与推进剂一起配制以用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可被雾化吸入。经肺施用进一步描述于PCT申请号PCT/US94/001875中，所述申请描述经肺递送化学修饰的蛋白质。

在某些实施方案中，药物制剂可涉及有效量的针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂一起与适于制造片剂的无毒赋形剂混合。在某些实施方案中，通过将片剂溶解于无菌水或另一适当媒介物中，可制备呈单位剂量形式的溶液。在某些实施方案中，适合的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

本领域技术人员将显而易知其它药物制剂，包括呈持续或控制递送制剂形式的涉及针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂的制剂。在某些实施方案中，用于配制多种其它持续或控制递送工具(delivery means)，如脂质体载体、生物可侵蚀性微粒或多孔珠粒及贮库式注射剂的技术也为本领域技术人员所知。参见例如PCT申请号PCT/US93/00829，其描述用于递送药物制剂的多孔聚合微粒的控制释放。在某些实施方案中，持续释放制剂可包括呈成形物品形式的半渗透聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸交酯(U.S.3,773,919及EP 058,481)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)及Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，同上)或聚-D(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。在某些实施方案中，持续释放制剂还可包括脂质体，其可通过本领域中已知的若干方法中的任一种制备。参见例如Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949。

有待于体内施用的药物制剂通常无菌。在某些实施方案中，这可通过经无菌滤膜过滤来完成。在某些实施方案中，当制剂被冻干时，使用这种方法灭菌可在冻干及复原之前或之后进行。在某些实施方案中，用于胃肠外施用的制剂可以冻干形式或以溶液形式储存。在某些实施方案中，通常将胃肠外制剂置放入具有无菌接取口的容器，例如具有可用皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。

在某些实施方案中，一旦药物制剂已被配制，其即可以溶液、混悬液、凝胶剂、乳液、固体形式或以脱水或冻干粉末形式储存于无菌小瓶中。在某些实施方案中，所述制剂可以即用形式或以在施用之前复原的形式(例如冻干形式)储存。

在某些实施方案中，一旦药物制剂已被配制，其即可以呈即用形式的溶液或混悬液形式储存于预填充的注射器中。

在某些实施方案中，提供用于产生单一剂量施用单元的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可含有具有干燥的蛋白质的第一容器与具有水性制剂的第二容器两者。在某些实施方案中，包括含有单腔室及多腔室的预填充注射器(例如液体注射器及溶解注射器(lyosyringe))的试剂盒。

在某些实施方案中，有待在治疗上采用的包含针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不连同至少一种其它治疗剂的药物制剂的有效量将例如取决于治疗情形及对象。本领域技术人员应了解根据某些实施方案的适当治疗剂量水平因此将部分地根据所递送的分子、针对PCSK9的抗原结合蛋白所针对的适应症、使用或不使用至少一种其它治疗剂、施用途径、及患者的尺寸(体重、体表或器官尺寸)和/或状况(年龄及总体健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医师可滴定剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效果。

在某些实施方案中，制剂可经由植入上面已吸附或囊封有所要分子的膜、海绵或另一适当材料来局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可植入任何适合的组织或器官中，且所要分子的递送可经由扩散、定时释放推注或连续施用来达成。

剂量及给药方案

表2及图2和/或图3中所述的任何针对PCSK9的抗原结合蛋白皆可根据本发明方法施用于患者。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白包括21B12、26H5、31H4、8A3、11F1或8A1。

根据本发明方法施用于患者的针对PCSK9的抗原结合蛋白(例如抗PCSK9抗体)的量通常为治疗有效量。ABP的量可用抗体毫克数(即mg)或每公斤患者体重的抗体毫克数(即mg/kg)表示。在某些实施方案中，PCSK9抗原结合蛋白的典型剂量可在约0.1μg/kg直至约100mg/kg或100mg/kg以上针对PCSK9的抗原结合蛋白的范围内。在某些实施方案中，剂量可在以下范围内：0.1μg/kg直至约100mg/kg；或1μg/kg直至约100mg/kg；或5μg/kg直至约100mg/kg针对PCSK9的抗原结合蛋白；或1mg/kg至约50mg/kg针对PCSK9的抗原结合蛋白；或2mg/kg至约20mg/kg针对PCSK9的抗原结合蛋白；或2mg/kg至约10mg/kg针对PCSK9的抗原结合蛋白。

在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白的量(或剂量)可在以下范围内：至少约10mg至约1400mg；或约14mg至约1200mg；或约14mg至约1000mg；或约14mg至约800mg；或约14mg至约700mg；或约14mg至约480mg；或约20mg直至约480mg；或约70mg直至约480mg；或约80mg至约480mg；或约90mg至约480mg；或约100mg至约480mg；或约105mg至约480mg；或约110mg至约480mg；或约115mg至约480mg；或约120mg至约480mg；或约125mg至约480mg；或约130mg至约480mg；或约135mg至约480mg；或约140mg至约480mg；或约145mg至约480mg；或约150mg至约480mg；或约160mg至约480mg；或约170mg至约480mg；或约180mg至约480mg；或约190mg至约480mg；或约200mg至约480mg；或约210mg至约480mg；或约220mg至约480mg；或约230mg至约480mg；或约240mg至约480mg；或约250mg至约480mg；或约260mg至约480mg；或约270mg至约480mg；或约280mg至约480mg；或约290mg至约480mg；或约300mg至约480mg；或约310mg至约480mg；或约320mg至约480mg；或约330mg至约480mg；或约340mg至约480mg；或约350mg至约480mg；或约360mg至约480mg；或约370mg至约480mg；或约380mg至约480mg；或约390mg至约480mg；或约400mg至约480mg；或约410mg至约480mg；或约420mg至约480mg；或约430mg至约480mg；或约440mg至约480mg；或约450mg至约480mg；或约460mg至约480mg；或约470mg至约480mg针对PCSK9的抗原结合蛋白。

在某些实施方案中，给药频率将虑及所用制剂中针对PCSK9的抗原结合蛋白和/或任何其它治疗剂的药物动力学参数。在某些实施方案中，临床医师将施用制剂直至达到实现所要效果的剂量。在某些实施方案中，因此，可施用单剂制剂，或随时间施用两剂、三剂、四剂或四剂以上(其可能含有或可能不含有相同量的所要分子)制剂，或经由植入装置或导管以连续输注形式施用制剂。也可用标准针及注射器皮下或静脉内递送制剂。此外，对于皮下递送，笔递送装置以及自动注射器递送装置可应用于递送本发明的药物制剂。适当剂量的进一步细化由一般技术人员按常规进行且处于由其常规进行的任务范围内。在某些实施方案中，可经由使用适当剂量-反应数据确定适当剂量。在一些实施方案中，施用的量及频率可虑及有待获得的所要胆固醇水平(血清和/或总体)及受试者的当前胆固醇水平、LDL水平和/或LDLR水平，其皆可通过本领域技术人员熟知的方法获得。

在某些实施方案中，一周一次(QW)向有需要的患者施用以下剂量的针对PCSK9的抗原结合蛋白：至少约10mg；或多达约14mg；或多达约20mg；或多达约35mg；或多达约40mg；或多达约45mg；或多达约50mg；或多达约70mg。

在一些其它实施方案中，每隔一周(或每两周)一次(Q2W)向有需要的患者施用以下剂量的针对PCSK9的抗原结合蛋白：至少约70mg；或多达约100mg；或多达约105mg；或多达约110mg；或多达约115mg；或多达约120mg；或多达约140mg；或多达约160mg；或多达约200mg；或多达约250mg；或多达280mg；或多达300mg；或多达350mg；或多达400mg；或多达420mg。

在某些其它实施方案中，每四周一次(或一个月一次)向有需要的患者施用以下剂量的针对PCSK9的抗原结合蛋白：至少约250mg；或多达约280mg；或多达约300mg；或多达约350mg；或多达约400mg；或多达约420mg；或多达约450mg；或多达480mg。

在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约35％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约45％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约65％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28、或至少约31天的时段。

在一些实施方案中，所述血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％，并且相对于给药前水平，所述降低持续至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约14天、至少约21天、至少约25天、至少约28天、或至少约31天的时段。

某些治疗应用

如本领域技术人员所应了解，与以下相关、涉及以下或可受以下影响的疾病可由本发明中所述的针对PCSK9的抗原结合蛋白处理：变化的胆固醇、LDL、LDLR、PCSK9、VLDL-C、脱辅基蛋白B(“ApoB”)、脂蛋白A(“Lp(a)”)、甘油三酯、HDL-C、非HDL-C及总胆固醇水平。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与血清胆固醇水平升高相关或血清胆固醇水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与PCSK9值升高相关或PCSK9值升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与总胆固醇水平升高相关或总胆固醇水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与非HDL胆固醇水平升高相关或非HDL胆固醇水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与ApoB水平升高相关或ApoB水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与Lp(a)水平升高相关或Lp(a)水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与甘油三酯水平升高相关或甘油三酯水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防和/或降低与VLDL-C水平升高相关或VLDL-C水平升高有重大意义的疾病的风险的方法中。

一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节患者的血清LDL胆固醇水平。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使血清LDL胆固醇的量从异常高的水平或甚至正常水平降低。在某些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约30％。在某些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约35％。在某些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约40％。在某些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约45％。在某些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约50％。在某些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清LDL胆固醇水平降低了至少约90％。

一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节患者的血清PCSK9值。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白具有中和性。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使PCSK9值从异常高的水平或甚至正常水平降低。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约60％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约65％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约70％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约75％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约80％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约85％。在一些实施方案中，血清PCSK9值降低了至少约90％。

一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节患者的总胆固醇水平。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白具有中和性。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使总胆固醇的量从异常高的水平或甚至正常水平降低。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约20％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约25％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，总胆固醇水平降低了至少约60％。

一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节患者的非HDL胆固醇水平。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白具有中和性。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使非HDL胆固醇从异常高的水平或甚至正常水平降低。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约75％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约80％。在一些实施方案中，非HDL胆固醇水平降低了至少约85％。

一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节患者的ApoB水平。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白具有中和性。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使ApoB的量从异常高的水平或甚至正常水平降低。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约25％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约65％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约70％。在一些实施方案中，ApoB水平降低了至少约75％。

一方面，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节患者的Lp(a)水平。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白具有中和性。在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使Lp(a)的量从异常高的水平或甚至正常水平降低。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约5％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约10％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约15％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约20％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约25％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约30％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约35％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约40％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约45％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约50％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约55％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约60％。在一些实施方案中，Lp(a)水平降低了至少约65％。

如本领域技术人员所应了解，本发明的针对PCSK9的抗原结合蛋白可在治疗上适用于治疗和/或预防胆固醇相关疾病。在一些实施方案中，“胆固醇相关疾病”(其包括“血清胆固醇相关疾病”)包括以下任何一种或多种：家族性高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、高脂血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管疾病、阿兹海默症及通常血脂异常，其可表现为例如总血清胆固醇升高、LDL升高、甘油三酯升高、VLDL升高和/或低HDL。可使用单独或与一种或多种其它药剂组合的ABP治疗的原发性及继发性血脂异常的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病、家族性混合型高脂血症、家族性高甘油三酯血症、家族性高胆固醇血症(包括杂合子高胆固醇血症、纯合子高胆固醇血症)、家族性载脂蛋白B-100缺陷症、多基因性高胆固醇血症、残粒移去障碍病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺乏症、继发于以下任一种的血脂异常：饮食不慎重、甲状腺功能低下、药物(包括雌激素及孕酮疗法、β-阻断剂及噻嗪利尿剂)、肾病综合征、慢性肾衰竭、库欣氏综合征(Cushing's syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、糖原贮积病、肝癌、胆汁淤积、肢端肥大症、胰岛瘤、单纯性生长激素缺乏症及酒精诱发的高甘油三酯血症。ABP还可适用于预防或治疗动脉粥样硬化疾病，例如像心血管性死亡、非心血管性死亡或全因死亡、冠心病、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、中风(缺血性及出血性)、心绞痛或脑血管疾病及急性冠状动脉综合征、心肌梗塞及不稳定型心绞痛。在一些实施方案中，ABP适用于降低以下的风险：致命性及非致命性心脏病发作、致命性及非致命性中风、某些类型的心脏手术、住院治疗心脏衰竭、患有心脏病的患者的胸痛、和/或归因于已确认的心脏病的心血管事件(如先前心脏病发作、先前心脏手术和/或伴有动脉堵塞迹象的胸痛)和/或移植相关血管疾病。在一些实施方案中，ABP适用于预防或降低归因于CRP或hsCRP升高的心血管风险。在一些实施方案中，ABP及方法可用于降低复发性心血管事件的风险。

如本领域技术人员所应了解，通常可经由使用他汀类处理(可治疗或可预防)的病症或疾病也可受益于应用本发明抗原结合蛋白。此外，在一些实施方案中，可受益于阻止胆固醇合成或LDLR表达增加的疾病或病症也可用抗原结合蛋白的各种实施方案来治疗。此外，如本领域技术人员所应了解，使用抗PCSK9抗体可尤其适用于治疗糖尿病。不仅糖尿病为冠心病的风险因素，而且胰岛素也会使PCSK9的表达增加。即，糖尿病人具有升高的血浆脂质水平(其可与高PCSK9水平相关)且可受益于降低那些水平。这总体上更详细地论述于Costet等(“Hepatic PCSK9Expression is Regulated by Nutritional Status viaInsulin and Sterol Regulatory Element-binding Protein 1C”,J.Biol.Chem.,281:6211-6218,2006)中，其全文以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，向患有糖尿病、腹主动脉瘤、动脉粥样硬化和/或周围血管疾病者施用抗原结合蛋白以使其血清胆固醇水平降低至更安全的范围。在一些实施方案中，向处于显现本文所述的任何疾病的风险中的患者施用抗原结合蛋白。在一些实施方案中，向吸烟或过去吸烟(即，曾吸烟者)、具有高血压或家族性早期心脏病发作史的受试者施用ABP。

在一些实施方案中，根据2004NCEP治疗目标，如果受试者处于中度或更高风险中，那么向受试者施用ABP。在一些实施方案中，如果受试者的LDL胆固醇水平大于160mg/dl，那么向受试者施用ABP。在一些实施方案中，如果受试者LDL胆固醇水平大于130(并且根据2004NCEP治疗目标，其具有中度或中度高的风险)，那么施用ABP。在一些实施方案中，如果受试者LDL胆固醇水平大于100(并且根据2004NCEP治疗目标，其具有高或极高风险)，那么施用ABP。在一些实施方案中，如果受试者LDL胆固醇水平大于80mg/dL，那么施用ABP。在一些实施方案中，如果受试者LDL胆固醇水平大于70mg/dL，那么施用ABP。

医师将能够根据具体患者的个体概况选择适当的治疗适应症及目标脂质水平。指导治疗高脂血症的一种充分接受的标准为国家胆固醇教育计划(NCEP)专家组关于成人的高血液胆固醇的检测、评价及治疗最终报告的第三次报告(成人治疗组III)(the ThirdReport of the National Cholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel onDetection,Evaluation,and Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults(Adult Treatment Panel III)Final Report),National Institutes of Health,NIH出版号02-5215(2002)，其印刷出版内容据此以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于治疗或预防高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常和/或制备用于高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常和/或其它胆固醇相关疾病(如本文所指示的那些)的药剂。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于治疗或预防PCSK9活性正常的病状，如高胆固醇血症。在所述病状中，例如PCSK9活性降低至正常活性以下可提供治疗作用。

组合疗法

在某些实施方案中，提供治疗胆固醇相关疾病，如高胆固醇血症、高脂血症或血脂异常的方法，其包括施用治疗有效量的一种或多种针对PCSK9的抗原结合蛋白及另一治疗剂。在某些实施方案中，在施用至少一种其它治疗剂之前施用针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，与施用至少一种其它治疗剂同时施用针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，在施用至少一种其它治疗剂之后施用针对PCSK9的抗原结合蛋白。

治疗剂(除抗原结合蛋白之外)包括(但不限于)至少一种其它胆固醇(血清和/或全身胆固醇)降低剂。在一些实施方案中，药剂增加LDLR的表达、已观测到增加血清HDL水平、降低LDL水平或降低甘油三酯水平。示例性药剂包括(但不限于)他汀类(阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗素他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin))、烟碱酸(Nicotinicacid)(烟酸(Niacin))(尼克尔(NIACOR)、尼斯潘(NIASPAN)(缓慢释放型烟酸)、斯洛-尼克因(SLO-NIACIN)(缓慢释放型烟酸)、克达匹(CORDAPTIVE)(拉罗匹仑(laropiprant)))、纤维酸(洛脂(LOPID)(吉非罗齐(Gemfibrozil))、曲科(TRICOR)(非诺贝特(fenofibrate)))、胆汁酸螯合剂(曲斯群(QUESTRAN)(消胆胺(cholestyramine))、考来维仑(colesevelam)(维尔克尔(WELCHOL))、考来替德(COLESTID)(考来替泼(colestipol)))、胆固醇吸收抑制剂(艾泽庭(ZETIA)(依泽替米贝(ezetimibe)))、烟碱酸与他汀类组合(阿地维科(ADVICOR)(洛伐他汀(LOVASTATIN)及尼斯潘))、他汀类与吸收抑制剂组合(维妥力(VYTORIN)(左科(ZOCOR)及艾泽庭))和/或脂质调节剂。在一些实施方案中，ABP与PPARγ激动剂、PPARα/γ激动剂、鲨烯合酶抑制剂、CETP抑制剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂(如磺酰脲、胰岛素、GLP-1类似物、DDPIV抑制剂，例如甲福明(metaformin))、ApoB调节剂(如米普莫森(mipomersan))、MTP抑制剂和/或动脉硬化阻塞症(arteriosclerosis obliterans)治疗组合。在一些实施方案中，ABP与增加受试者的LDLR蛋白水平的药剂，如他汀类、某些细胞激素样制瘤素M、雌激素和/或某些草本成分(如小檗碱(berberine))组合。在一些实施方案中，ABP与增加受试者的血清胆固醇水平的药剂(如某些抗精神病药剂、某些HIV蛋白酶抑制剂、膳食要素(如高果糖、蔗糖、胆固醇或某些脂肪酸)及RXR、RAR、LXR、FXR的某些核受体激动剂和拮抗剂)组合。在一些实施方案中，ABP与增加受试者的PCSK9水平的药剂，如他汀类和/或胰岛素组合。两者的组合可使其它药剂的不合需要的副作用由ABP缓和。

在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白可与至少一种用于炎症的治疗剂一起使用。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白可与至少一种用于免疫疾病的治疗剂一起使用。用于炎症及免疫疾病的示例性治疗剂包括(但不限于)1型环氧酶(COX-1)及2型环氧酶(COX-2)抑制剂；38kDa促分裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的小分子调节剂；炎症通路中涉及的细胞内分子的小分子调节剂，其中所述细胞内分子包括(但不限于)jnk、IKK、NF-κB、ZAP70及lck。用于炎症的某些示例性治疗剂例如描述于C.A.Dinarello和L.L.Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in RheumatoidArthritis:A Primer for Clinicians第3版(2001)Amgen Inc.Thousand Oaks,CA中。

诊断应用

在一些实施方案中，ABP用作诊断工具。ABP可用于分析样品和/或受试者中存在的PCSK9的量。如本领域技术人员所应了解，所述ABP无需为中和性ABP。在一些实施方案中，诊断用ABP不为中和性ABP。在一些实施方案中，诊断用ABP结合的表位不同于中和性ABP所结合的表位。在一些实施方案中，两种ABP不彼此竞争。

在一些实施方案中，本文公开的ABP用于或提供于用于检测哺乳动物组织或细胞中的PCSK9的分析试剂盒和/或方法中以筛选/诊断与PCSK9的水平变化相关的病症或疾病。试剂盒包含结合PCSK9的ABP及指示ABP与PCSK9的结合(如果存在)及任选地PCSK9蛋白水平的工具。可使用指示ABP的存在的各种工具。举例来说，荧光团、其它分子探针或酶可连接于ABP且可以多种方式观测ABP的存在。筛选所述疾病的方法可涉及使用试剂盒，或仅使用一种公开的ABP并确定ABP是否结合样品中的PCSK9。如本领域技术人员所应了解，高或升高的PCSK9水平将导致更大量的ABP与样品中的PCSK9结合。因此，ABP结合程度可用于确定样品中存在多少PCSK9。PCSK9的量大于预定量(例如不患有PCSK9相关疾病的人士将具有的量或范围)的受试者或样品可表征为患有PCSK9介导的疾病。在一些实施方案中，向服用他汀类的受试者施用ABP以确定他汀类是否已使受试者的PCSK9的量增加。

在一些实施方案中，ABP为非中和性ABP且用于测定接受ABP和/或他汀类治疗的受试者的PCSK9的量。

实施例

以下实施例，包括进行的实验及达成的结果，仅出于说明目的提供且不应被解释为限制本发明。

实施例1

免疫及滴定

生成抗PCSK9抗体及杂交瘤

于为含有人类免疫球蛋白基因的小鼠的

小鼠(Abgenix,Fremont,CA)中产生针对成熟形式的PCSK9(描述为图1A中的序列，其中前结构域加下划线)的抗体。两组

小鼠(组1及组2)用于产生针对PCSK9的抗体。组1包括XMG2-KL品系

小鼠，其产生完全人类IgG2_κ及IgG2λ抗体。组1小鼠用人类PCSK9免疫。使用基因库序列作为参照(NM_174936)，利用标准重组技术制备PCSK9。组2包括XMG4-KL品系

小鼠，其产生完全人类IgG4_κ及IgG4λ抗体。组2小鼠也用人类PCSK9免疫。

两组小鼠均根据表3中的日程安排用抗原注射11次。在初次免疫时，各小鼠用总计10μg抗原注射，腹膜内递送至腹部中。随后用5ug剂量加强且注射方法在腹膜内注射至腹部中与在尾巴根部皮下注射之间交错。对于腹膜内注射，抗原用

金(Sigma,目录号T2684)制备成乳液，且对于皮下注射，抗原与矾(磷酸铝)及CpG寡聚物混合。在第2至8次及第10次注射时，各小鼠用于佐剂矾凝胶中的总计5μg抗原注射。每只小鼠5μg抗原的末次注射于磷酸盐缓冲盐水中递送且递送至2个部位中，50％IP至腹部中且50％SQ在尾巴根部。免疫规划概述于以下所示的表3中。

表3

用于滴定XenoMouse动物的方案如下：Costar 3368中结合力板用中性链亲和素(neutravadin)以8ug/ml(50ul/孔)涂布且在4℃下于1×PBS/0.05％叠氮化物中孵育过夜。使用TiterTek 3循环洗涤法用RO水洗涤这些板。各板使用250ul 1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育至少30分钟。使用TiterTek 3循环洗涤法，用RO水洗去阻断物。接着捕捉于每孔50ul 1×PBS/1％牛乳/10mM Ca2+(测定稀释剂)中的2ug/ml的b-人类PCSK9且在室温下孵育1小时。接着使用TiterTek 3循环洗涤法，用RO水洗涤。对于一抗，一式两份从1:100开始以1:3滴定血清。这是在每孔50ul测定稀释剂中进行且在室温下孵育1小时。接着使用TiterTek 3循环洗涤法，用RO水洗涤。二抗为于每孔50ul测定稀释剂中的400ng/ml的山羊抗人类IgGFc HRP。将其在室温下孵育1小时。其接着使用TiterTek 3循环洗涤法、用RO水洗涤且用纸巾拍干。对于底物，使用一步TMB溶液(Neogen,Lexington,Kentucky)(50ul/孔)且使其在室温下显色30分钟。

ELISA测定中遵循的方案如下：对于包含无V5His标签的b-PCSK9的样品，采用以下方案：采用Costar 3368中结合力板(Corning Life Sciences)。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的8μg/ml的中性链亲和素(50μl/孔)涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek M384板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用250μl 1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用M384板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。捕捉物为无V5标签的b-hu PCSK9，并且在1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中以2μg/ml添加(40μl/孔)。各板接着在室温下孵育1小时。进行3循环洗涤。一式两份从1:100开始以1:3滴定血清，且H行是空白的血清。于测定稀释剂中以每孔50μl的体积进行滴定。在室温下孵育各板1小时。接着，进行3循环洗涤。添加于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的100ng/ml(1:4000)的山羊抗人类IgG Fc HRP(50μl/孔)至板中且在室温下孵育1小时。使用3循环洗涤法，再次洗涤各板。各板接着用纸巾拍干。最终，添加1步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)(50μl/孔)至板中且在室温下30分钟之后用1N盐酸(50μl/孔)淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。

用以检测板结合的PCSK9的阳性对照为可溶性LDL受体(R&D Systems，目录号2148LD/CF)及一式两份于测定稀释剂中从3μg/ml开始以1:3滴定的多克隆兔抗PCSK9抗体(Caymen Chemical#10007185)。LDLR用山羊抗LDLR(R&D Systems，目录号AF2148)及兔抗山羊IgGFc HRP在400ng/ml的浓度下检测；兔多克隆抗体用山羊抗兔IgGFc于测定稀释剂中在400ng/ml的浓度下检测。阴性对照为一式两份于测定稀释剂中从1:100开始以1:3滴定的天然XMG2-KL及XMG4-KL血清。

对于包含具有V5His标签的b-PCSK9的样品，采用以下方案：采用Costar 3368中结合力板(Corning Life Sciences)。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的8μg/ml的中性链亲和素(50μl/孔)涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek M384板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用250μl 1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用M384板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。捕捉物为具有V5标签的b-hu PCSK9，并且在1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中以2μg/ml添加(40μl/孔)。各板接着在室温下孵育1小时。进行3循环洗涤。一式两份从1:100开始以1:3滴定血清，且H行是空白的血清。于测定稀释剂中以每孔50μl的体积进行滴定。在室温下孵育各板1小时。接着，使用利用3循环洗涤法操作的M384板洗涤器洗涤各板。添加50μl/孔于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的400ng/ml的山羊抗人类IgGFc HRP至板中且在室温下孵育板1小时。使用3循环洗涤法，再次洗涤各板。各板接着用纸巾拍干。最终，添加1步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)(50μl/孔)至板中且板在室温下30分钟的后用1N盐酸(50μl/孔)淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。

阳性对照为LDLR、一式两份于测定稀释剂中从3μg/ml开始以1:3滴定的兔抗PCSK9。LDLR用山羊抗LDLR(R&D Systems，目录号AF2148)及兔抗山羊IgG Fc HRP在400ng/ml的浓度下检测；兔多克隆抗体用山羊抗兔IgG Fc于测定稀释剂中在400ng/ml的浓度下检测。人类抗His 1.2,3及抗V51.7.1一式两份于测定稀释剂中从1μg/ml开始以1:3滴定；两者均用山羊抗人类IgG Fc HRP于测定稀释剂中在400ng/ml的浓度下检测。阴性对照为一式两份于测定稀释剂中从1:100开始以1:3滴定的天然XMG2-KL及XMG4-KL血清。

通过ELISA测定测试如所述用可溶性抗原免疫的小鼠的针对人类PCSK9的抗体的效价。表4概述ELISA数据并且指示有一些小鼠似乎对PCSK9具有特异性。参见例如表4。因此，在免疫规划结束时，选择10只小鼠(表4中用粗体表示)加以收获，且如本文所述，分别从脾及淋巴结分离脾细胞及淋巴细胞。

表4

ELISA结果的概述

实施例2

回收淋巴细胞、B细胞分离、融合及生成杂交瘤

这个实施例概述如何回收免疫细胞以及如何生成杂交瘤。所选免疫过的小鼠通过颈椎脱位术处死且收获并汇合来自各组的引流淋巴结。通过于DMEM中研磨来使B细胞从淋巴组织解离以便从组织释放细胞，并且将细胞悬浮于DMEM中。对细胞计数，且添加每1亿个淋巴细胞0.9ml DMEM至细胞沉淀中以温和但完全重悬细胞。

淋巴细胞与购自ATCC的目录号为CRL 1580的非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(Kearney等，(1979)J.Immunol.123,1548-1550)以1:4的比率混合。通过在400×g下离心4分钟来温和沉淀细胞混合物。在倾析上清液之后，使用1ml移液管温和地混合细胞。在温和搅拌下经1分钟缓慢添加预加热的来自Sigma的PEG/DMSO溶液(目录号P7306)(每百万个B细胞1ml)，随后混合1分钟。然后在温和搅拌下经2分钟添加预加热的IDMEM(每百万个B细胞2ml)(无谷氨酰胺的DMEM、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、MEM非必需氨基酸(皆来自Invitrogen))。最终经3分钟添加预加热的IDMEM(每10⁶个B细胞8ml)。

融合细胞在400×g下短暂离心6分钟且重悬于每百万个B细胞20ml选择培养基(DMEM(Invitrogen)、15％FBS(Hyclone)，补充有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、MEM非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-巯基乙醇(皆来自Invitrogen)、HA-重氮丝氨酸次黄嘌呤及OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐、牛胰岛素)(均来自Sigma)及IL-6(Boehringer Mannheim))中。细胞在37C下孵育20-30分钟，然后重悬于200ml选择培养基中且于T175烧瓶中培养3-4天，随后进行96孔接种。因此，产生可产生针对PCSK9的抗原结合蛋白的杂交瘤。

实施例3

选择PCSK9抗体

本实施例概述如何表征及选择各种PCSK9抗原结合蛋白。评估分泌抗体(由在实施例1及2中产生的杂交瘤产生)与PCSK9的结合。基于结合数据及对PCSK9与LDLR结合的抑制以及亲和力来选择抗体。如下所述，通过ELISA分析与可溶性PCSK9的结合。使用

(表面等离振子共振)定量结合亲和力。

初级筛选

对结合野生型PCSK9的抗体进行初级筛选。对两个收获物进行初级筛选。初级筛选包括ELISA测定且使用以下方案进行：

采用Costar 3702中结合力384孔板(Corning Life Sciences)。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的4μg/ml浓度的中性链亲和素以每孔40μl的体积涂布。各板在4℃下孵育过夜。然后使用Titertek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用90μl1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。然后洗涤各板。再次进行3循环洗涤。捕捉样品为无V5标签的生物素化的PCSK9，并且在1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中以0.9μg/ml以每孔40μl的体积添加。各板接着在室温下孵育1小时。接着，使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。将10μl上清液转移至40μl1×PBS/1％牛乳/10mMCa²⁺中且在室温下孵育1.5小时。再次使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。添加40μl/孔的于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的100ng/ml(1:4000)浓度的山羊抗人类IgG Fc POD至板中且在室温下孵育1小时。使用3循环洗涤法，再次洗涤各板。最终，添加40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)至板中且在室温下30分钟之后用40μl/孔的1N盐酸进行淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。

初级筛选产生从两个收获物鉴定的总计3104个抗原特异性杂交瘤。基于最高ELISA OD，进一步推出每个收获物1500个杂交瘤以达成总计3000个阳性物。

确证性筛选

接着针对与野生型PCSK9的结合再筛选3000个阳性物以确认产生稳定的杂交瘤。如下进行筛选：采用Costar 3702中结合力384孔板(Corning Life Sciences)。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的3μg/ml的中性链亲和素以每孔40μl的体积涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用90μl 1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用M384板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。捕捉样品为无V5标签的b-PCSK9，并且在1×PBS/1％牛乳/10mMCa²⁺中以0.9μg/ml以每孔40μl的体积添加。各板接着在室温下孵育1小时。接着，使用3循环洗涤法洗涤各板。将10μl上清液转移至40μl1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中且在室温下孵育1.5小时。再次使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。添加40μl/孔的于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的100ng/ml(1:4000)的浓度的山羊抗人类IgG Fc POD至板中，且在室温下孵育板1小时。再次使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。最终，添加40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)至板中且在室温下30分钟之后用40μl/孔的1N盐酸淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。在第二筛选中，重现总计2441个阳性物。这些抗体接着用于后续筛选中。

小鼠交叉反应性筛选

接着针对与小鼠PCSK9的交叉反应性筛选所述组的杂交瘤以确定抗体可结合人类PCSK9与小鼠PCSK9两者。使用以下方案进行交叉反应性筛选：采用Costar 3702中结合力384孔板(Corning Life Sciences)。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的3μg/ml下的中性链亲和素以每孔40μl的体积涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用90μl 1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。捕捉样品为生物素化的小鼠PCSK9，并且在1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中以1μg/ml以每孔40μl的体积添加。各板接着在室温下孵育1小时。接着，使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。将50μl上清液转移至各板中且在室温下孵育1小时。再次使用3循环洗涤法洗涤各板。添加40μl/孔的于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的100ng/ml(1:4000)浓度的山羊抗人类IgG Fc POD至板中且在室温下孵育板1小时。使用3循环洗涤法，再次洗涤各板。最终，添加40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)至板中且在室温下30分钟之后用40μl/孔的1N盐酸淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。观测到579个抗体与小鼠PCSK9交叉反应。这些抗体接着用于后续筛选中。

D374Y突变体结合筛选

人类群体中的PCSK9中的D374Y突变已有文献记载(例如Timms KM等，“A mutationin PCSK9causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree”,Hum.Genet.114:349-353,2004)。为确定抗体是否对野生型具有特异性或也结合PCSK9的D374Y形式，接着针对与包含突变D374Y的突变PCSK9序列的结合筛选样品。筛选方案如下：使用Costar 3702中结合力384孔板(Corning Life Sciences)进行筛选。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的4μg/ml的中性链亲和素以每孔40μl的体积涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用90μl 1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的1μg/ml浓度的生物素化的人类PCSK9D374Y涂布且在室温下孵育1小时。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。晚期衰竭的杂交瘤培养上清液于PBS/牛乳/Ca²⁺中1:5(10ml加40ml)稀释且在室温下孵育1小时。接着，将40μl/孔的于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的1ug/ml的兔抗人类PCSK9(Cayman Chemical)及人类抗His 1.2.3(1:2)滴定于各板上，接着在室温下孵育各板1小时。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。添加40μl/孔的于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的100ng/ml(1:4000)浓度的山羊抗人类IgG Fc HRP至板中且在室温下孵育板1小时。添加40μl/孔的于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中的100ng/ml(1:4000)浓度下的山羊抗兔IgG Fc HRP至板中且在室温下孵育板1小时。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。最终，添加40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)至板中且在室温下30分钟之后用40μl/孔的1N盐酸淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。超过96％的关于野生型PCSK9的阳性命中物(hit)也结合突变PCSK9。

大规模受体配体阻断筛选

为筛选阻断PCSK9结合LDLR的抗体，开发一种使用D374Y PCSK9突变体进行的测定。所述突变体用于这个测定是因为其对LDLR具有更高的结合亲和力，从而允许开发灵敏性更高的受体配体阻断测定。使用以下方案进行受体配体阻断筛选：使用Costar 3702中结合力384孔板(Corning Life Sciences)进行筛选。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的2μg/ml的山羊抗LDLR(R&D目录号AF2148)以每孔40μl的体积涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用90μl的1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。捕捉样品为LDLR(R&D，目录号2148LD/CF)，并且在1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中以0.4μg/ml以每孔40μl的体积添加。各板接着在室温下孵育1小时又10分钟。同时，20ng/ml的生物素化的人类D374Y PCSK9与15微升杂交瘤衰竭上清液一起于Nunc聚丙烯板中孵育且衰竭上清液浓度以1:5稀释。各板接着在室温下预孵育约1小时又30分钟。接着，使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。将50μl/孔的预孵育混合物转移至经LDLR涂布的ELISA板上且在室温下孵育1小时。为检测LDLR结合的b-PCSK9，添加40μl/孔的于测定稀释剂中的500ng/ml的抗生物素蛋白链霉亲和素HRP至各板中。在室温下孵育各板1小时。再次使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。最终，添加40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)至板中且在室温下30分钟之后用40μl/孔的1N盐酸淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。筛选鉴定出384个抗体充分阻断PCSK9与LDLR之间的相互作用，100个抗体强烈阻断相互作用(OD<0.3)。这些抗体使PCSK9与LDLR的结合相互作用受到大于90％的抑制(大于90％抑制)。

关于阻断剂子组的受体配体结合测定

接着使用突变酶对在第一大规模受体配体抑制测定中鉴定的384个成员的中和剂子组重复进行受体配体测定。在384个成员的阻断剂子组筛选测定中采用与大规模受体配体阻断筛选中执行的方案相同的方案。这个重复筛选验证初始筛选数据。

对384个成员的子组的此筛选鉴定出85个抗体使PCSK9突变酶与LDLR之间的相互作用受到大于90％的阻断。

结合野生型PCSK9但不结合D374Y突变体的阻断剂的受体配体结合测定

在含3000个供应物(sup)的初始组中，有86个抗体显示特异性结合野生型PCSK9但不结合huPCSK9(D374Y)突变体。测试这86个供应物阻断野生型PCSK9结合LDLR受体的能力。采用以下方案：使用Costar 3702中结合力384孔板(Corning Life Sciences)进行筛选。各板用于1×PBS/0.05％叠氮化物中的10μg/ml的抗His 1.2.3以每孔40μl的体积涂布。各板在4℃下孵育过夜。接着使用Titertek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤各板。进行3循环洗涤。各板用90μl1×PBS/1％牛乳阻断且在室温下孵育约30分钟。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。LDLR(R&D Systems#2148LD/CF或R&D Systems#2148LD)于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca²⁺中以5μg/ml以每孔40μl的体积添加。各板接着在室温下孵育1小时。接着，使用利用3循环洗涤法操作的Titertek板洗涤器洗涤各板。同时，生物素化的人类野生型PCSK9与杂交瘤衰竭上清液一起于Nunc聚丙烯板中预孵育。将22μl杂交瘤上清液转移至33ul于1×PBS/1％牛乳/10mM Ca2+中的583ng/ml浓度的b-PCSK9中，从而产生最终b-PCSK9浓度＝350ng/ml及最终稀释度为1:2.5的衰竭上清液。各板在室温下预孵育约1小时又30分钟。将50μl/孔的预孵育混合物转移至捕捉LDLR的ELISA板上且在室温下孵育1小时。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。添加40μl/孔的于测定稀释剂中的500ng/ml的抗生物素蛋白链霉亲和素HRP至各板中。在室温下孵育各板1小时。接着使用Titertek板洗涤器洗涤各板。进行3循环洗涤。最终，添加40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)至板中且在室温下30分钟之后用40μl/孔的1N盐酸淬灭。使用Titertek板读取器在450nm下即刻读取OD值。

筛选结果

基于所述测定的结果，若干杂交瘤株系被鉴定为会产生与PCSK9发生所要相互作用的抗体。使用限制稀释法从各株系分离可处理数目的克隆。克隆由杂交瘤株系编号(例如21B12)及克隆编号(例如21B12.1)表示。一般来说，通过本文所述的功能性测定未检测到具体株系的不同克隆之间有差异。在少数情况下，从具体株系鉴定出在功能性测定中表达有差异的克隆，例如发现25A7.1不阻断PCSK9/LDLR但25A7.3(在本文中称为25A7)具有中和性。分离的克隆各自于50-100ml杂交瘤培养基中扩增且使其生长至衰竭(即细胞活力小于约10％)。如本文所述，通过ELISA并通过体外功能性测试测定那些培养物的上清液中的针对PCSK9的抗体的浓度及效能。由于本文所述的筛选，鉴定出针对PCSK9的抗体的效价最高的杂交瘤。所选杂交瘤展示于图2A-3D及表2中。

实施例4.1

从杂交瘤产生人类31H4IgG4抗体

这个实施例总体上描述如何从杂交瘤株系产生一种抗原结合蛋白。所用产生操作为产生50ml衰竭上清液，随后进行蛋白质A纯化。Integra产生用于按比例放大且在稍后进行。杂交瘤株系31H4在T75烧瓶中于20ml培养基(Integra培养基，表5)中生长。当杂交瘤在T75烧瓶中接近汇合时，将其转移至Integra烧瓶(Integra Biosciences,Integra CL1000，目录号90005)中。

Integra烧瓶为由膜分成两个腔室，即小腔室和大腔室的细胞培养烧瓶。将20-30ml体积的来自31H4杂交瘤株系的杂交瘤细胞于Integra培养基(关于Integra培养基的组分，参见表5)中，依每毫升1×10⁶个细胞的最小细胞密度放置在Integra烧瓶的小腔室中。将单独Integra培养基(1L)放置在Integra烧瓶的大腔室中。分隔两个腔室的膜可让小分子量的养分渗透，但杂交瘤细胞及由那些细胞产生的抗体则无法渗透。因此，杂交瘤细胞及由那些杂交瘤细胞产生的抗体保留在小腔室中。

一周后，从Integra烧瓶的两个腔室除去培养基且更换为新鲜的Integra培养基。分开保留从小腔室收集的培养基。在第二周生长之后，再次从小腔室收集培养基。从第1周收集的杂交瘤株系培养基与从第2周收集的杂交瘤株系培养基合并。离心所得收集的杂交瘤株系培养基样品，以除去细胞及碎片(在3000rpm下15分钟)且过滤(0.22μm)所得上清液。将经过澄清处理的条件培养基装载于蛋白质A-琼脂糖管柱上。任选地，培养基可先被浓缩，接着装载于蛋白质A琼脂糖管柱上。通过澈底PBS洗涤来除去非特异性结合物。通过从蛋白质A管柱标准酸性抗体洗脱(如50mM柠檬酸盐，pH 3.0)来回收结合于蛋白质A管柱上的抗体蛋白质。蛋白质A琼脂糖池中的聚集抗体蛋白质通过尺寸排阻色谱或于阴离子交换剂树脂(如Q琼脂糖树脂)上进行的结合离子交换色谱除去。用于31H4蛋白质的特定IEX条件为Q-琼脂糖HP，pH 7.8-8.0。用在25个管柱体积中10mM-500mM的NaCl梯度洗脱抗体。

表5

培养基组成

INTEGRA培养基
	HSFM
10％超低IgG血清
	2mmol/LL-谷氨酰胺
1％NEAA
	4g/L葡萄糖

实施例4.2

从转染的细胞产生重组31H4人类IgG2抗体

本实施例概述如何从转染的细胞产生31H4 IgG2抗体。用编码31H4重链及轻链的质粒转染用于短暂表达的293细胞及用于稳定表达的CHO细胞。通过除去细胞及细胞碎片来回收转染细胞的条件培养基。将经过澄清处理的条件培养基装载于蛋白质A-琼脂糖管柱上。任选地，培养基可先被浓缩接着装载于蛋白质A琼脂糖管柱上。通过澈底PBS洗涤来除去非特异性结合物。通过从蛋白质A管柱标准酸性抗体洗脱(如50mM柠檬酸盐，pH 3.0)回收结合于蛋白质A管柱上的抗体蛋白质。蛋白质A琼脂糖池中的聚集抗体蛋白质通过尺寸排阻色谱或于阴离子交换剂树脂(如Q琼脂糖树脂)上进行的结合离子交换色谱除去。用于31H4蛋白质的特定IEX条件为Q-琼脂糖HP，pH 7.8-8.0。用在25个管柱体积中10mM-500mM的NaCl梯度洗脱抗体。

实施例5

从杂交瘤产生人类21B12IgG4抗体

本实施例概述如何从杂交瘤产生抗体21B12IgG4。杂交瘤株系21B12在T75烧瓶中于培养基(Integra培养基，表5)中生长。当杂交瘤在T75烧瓶中接近汇合时，将其转移至Integra烧瓶(Integra Biosciences,Integra CL1000，目录号90005)中。

Integra烧瓶为由膜分成两个腔室，即小腔室和大腔室的细胞培养烧瓶。将20-30ml体积的来自31H4杂交瘤株系的杂交瘤细胞于Integra培养基(关于Integra培养基的组分，参见表5)中依每毫升1×10⁶个细胞的最小细胞密度放置在Integra烧瓶的小腔室中。将单独Integra培养基(1L)放置在Integra烧瓶的大腔室中。分隔两个腔室的膜可让小分子量的养分渗透但杂交瘤细胞及由那些细胞产生的抗体则无法渗透。因此，杂交瘤细胞及由那些杂交瘤细胞产生的抗体保留在小腔室中。

一周之后，从Integra烧瓶的两个腔室除去培养基且更换为新鲜的Integra培养基。分开保留从小腔室收集的培养基。在第二周生长之后，再次从小腔室收集培养基。从第1周收集的杂交瘤株系培养基与从第2周收集的杂交瘤株系培养基合并。离心所得收集的杂交瘤株系培养基样品以除去细胞及碎片(在3000rpm下15分钟)且过滤(0.22μm)所得上清液。将经过澄清处理条件培养基装载于蛋白质A琼脂糖管柱上。任选地，培养基先被浓缩接着装载于蛋白质A琼脂糖管柱上。通过澈底PBS洗涤来除去非特异性结合物。通过从蛋白质A管柱标准酸性抗体洗脱(如50mM柠檬酸盐，pH 3.0)回收结合于蛋白质A管柱上的抗体蛋白质。蛋白质A琼脂糖池中的聚集抗体蛋白质通过尺寸排阻色谱或于阴离子交换剂树脂(如Q琼脂糖树脂)上进行的结合离子交换色谱除去。用于21B12蛋白的特定IEX条件为Q-琼脂糖HP，pH 7.8-8.0。用在25个管柱体积中10mM-500mM的NaCl梯度洗脱抗体。

实施例6

从转染的细胞产生人类21B12IgG2抗体

本实施例概述如何从转染的细胞产生21B12IgG2抗体。用编码21B12重链及轻链的质粒转染细胞(用于短暂表达的293细胞及用于稳定表达的CHO细胞)。通过除去细胞及细胞碎片来回收杂交瘤细胞的条件培养基。将经过澄清处理的条件培养基装载于蛋白质A-琼脂糖管柱上。任选地，培养基可先被浓缩接着装载于蛋白质A琼脂糖管柱上。通过澈底PBS洗涤来除去非特异性结合物。通过从蛋白质A管柱标准酸性抗体洗脱(50mM柠檬酸盐，pH 3.0)回收结合于蛋白质A管柱上的抗体蛋白质。蛋白质A琼脂糖池中的聚集抗体蛋白质通过尺寸排阻色谱或于阳离子交换剂树脂(如SP-琼脂糖树脂)上进行的结合离子交换色谱除去。用于21B12蛋白的特定IEX条件为SP-琼脂糖HP，pH 5.2。用25个管柱体积的含有于20mM乙酸钠缓冲液中的10mM-500mM的NaCl梯度的缓冲液洗脱抗体。

实施例7

抗体重链及轻链的序列分析

然后通过Sanger(双脱氧)核苷酸测序来测定以上抗体的轻链及重链的核酸及氨基酸序列。接着针对核酸序列推断氨基酸序列。可变域的核酸序列描述于图3E-3JJ中。

测定31H4、21B12及16F12的λ轻链可变区的cDNA序列且分别公开为SEQ ID NO:153、95及105。

测定31H4、21B12及16F12的重链可变区的cDNA序列且分别公开为SEQ ID NO:152、94及104。

λ轻链恒定区(SEQ ID NO:156)及IgG2及IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:154及155)展示于图3KK中。

确定从那些cDNA序列的每个所预测的多肽序列。预测31H4、21B12及16F12的λ轻链可变区的预测多肽序列且分别公开为SEQ ID NO:12、23及35，预测λ轻链恒定区(SEQ IDNO:156)，预测31H4、21B12及16F12的重链可变区且分别公开为SEQ.ID NO 67、49及79。IgG2及IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:154及155)。

FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4划分展示于图2A-3D中。

基于序列数据，确定各重链或轻链可变区所源于的生殖系基因。在图2A-3D中，指示生殖系基因的身分紧邻于相应的杂交瘤株系且各自由独特的SEQ ID NO表示。图2A-3D还描述对表征的其它抗体确定的氨基酸序列。

实施例8

表征抗体与PCSK9的结合

在已鉴定许多结合PCSK9的抗体后，使用若干种方法来定量并进一步表征结合性质。在研究的一个方面中，进行Biacore亲和力分析。在研究的另一方面中，进行

亲和力分析。这些研究中采用的样品及缓冲液呈现于下表6中。

表6

亲和力测量

根据制造商说明书对针对PCSK9的21B12抗体进行这个实施例中所述的

(表面等离振子共振装置，Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)亲和力分析。

简单来说，使用Biacore 2000光学生物传感器(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)进行表面等离振子共振实验。各单个抗PCSK9抗体通过胺偶合以产生不超过200个共振单位(RU)的最大分析物结合反应(Rmax)的程度固定于研究级CM5生物传感器芯片。PCSK9蛋白的浓度以2倍间隔变化(分析物)且注射于固定的抗体表面上(以100μl/min的流速持续1.5分钟)。补充有0.01％BSA的新鲜HBS-P缓冲液(pH 7.4，0.01MHepes、0.15MNaCl、0.005％表面活性剂P-20，Biacore)用作结合缓冲液。在各别实验中在pH 7.4下测量各抗PCSK9抗体针对人类、小鼠及食蟹猕猴PCSK9蛋白的结合亲和力(所用浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125及0nM)。

此外，还用补充有0.01％BSA的pH 6.0HBS-P缓冲液(pH 6.0，0.01MHepes、0.15MNaCl、0.005％表面活性剂P-20，Biacore)，在pH 6.0下测量抗体对人类PCSK9的结合亲和力。所得结合信号与溶液中的游离PCSK9成正比。由使用双重曲线单位点均质结合模型对竞争曲线进行非线性回归分析(

软件，Sapidyne Instruments Inc.,Boise,ID)(对于6.0pH操作，n＝1)来获得解离平衡常数(K_D)。令人感兴趣的是抗体似乎在较低pH下显示更紧密的结合亲和力(其中31H4、21B12及16F12的Kd分别为12.5、7.3及29pM)。

使用BIA评价3.1计算机程序(BIAcore,Inc.Piscataway,NJ)确定抗体结合动力学参数，包括k_a(缔合速率常数)、k_d(解离速率常数)及K_D(解离平衡常数)。较低的解离平衡常数指示抗体对PCSK9的亲和力更大。通过

亲和力分析确定的K_D值呈现于以下所示的表7.1中。

表7.1

抗体	hPCSK9	CynoPCSK9	mPCSK9
				31H4	210pM	190pM	6nM
21B12	190pM	360pM	460nM
				16F12	470pM	870pM	6.4nM

表7.2描述k_on及k_off速率。

表7.2

-	<u>K<sub>on</sub>(M-1s-1)</u>	<u>K<sub>off</sub>(s-1)</u>	<u>K<sub>D</sub></u>
				31H4.1，pH7.4	2.45e+5	5.348e-5	210pM

-	<u>K<sub>on</sub>(M-1s-1)</u>	<u>K<sub>off</sub>(s-1)</u>	<u>K<sub>D</sub></u>
				31H4.1，pH6	5.536e+6	6.936e-5	12.5pM
21B12.1，pH7.4	3.4918e+4	6.634e-6	190pM
				21B12.1，pH6	2.291e+6	1.676e-5	7.3pM
16F12.1，pH7.4	1.064e+5	4.983e-5	470pM
				16F12.1，pH6	2.392e+6	7.007e-5	29pM

亲和力测量

根据制造商说明书对16F12及31H4进行

(Sapidyne Instruments,Inc.,Boise,ID)亲和力分析。简单来说，Reacti-Gel^TM(6×)(Pierce)用人类PCSK9蛋白、经V5标记的食蟹猕猴PCSK9蛋白或经His标记的小鼠PCSK9蛋白中的一种预涂布且用BSA阻断。10或100pM抗体31H4及一种PCSK9蛋白接着在室温下在PCSK9蛋白的各种浓度(0.1pM-25nM)下一起孵育8小时，随后穿过经PCSK9涂布的珠粒。通过经荧光(Cy5)标记的山羊抗人类IgG(H+L)抗体(Jackson Immuno Research)定量珠粒结合的31H4的量。结合信号与在结合平衡下的游离31H4的浓度成正比。由使用单位点均质结合模型对两组竞争曲线进行非线性回归来获得平衡解离常数(K_D)。使用

Pro软件进行分析。这项分析中生成的结合曲线呈现为图4A-4F。

16F12抗体与31H4抗体两者均显示对人类PCSK9及食蟹猕猴PCSK9具有类似亲和力，但对小鼠PCSK9的亲和力约为1/250-1/10。在使用

系统测试的两个抗体中，抗体31H4显示对人类PCSK9与食蟹猕猴PCSK9两者的亲和力均更高，K_D分别为3及2pM。16F12显示略微较弱的亲和力，对于人类PCSK9的K_D为15pM且对于食蟹猕猴PCSK9的K_D为16pM。

亲和力分析的结果概述于以下所示的表8.1中。

表8.1

此外，操作SDS PAGE以检查样品的质量及数量且展示于图5A中。cPCSK9显示在凝胶上以及根据由

测定计算的活性结合浓度减少约50％。因此，mAb对cPCSK9的K_D调整为当前活性cPCSK9的50％。

使用BIAcore溶液平衡结合测定测量ABP 21B12的Kd值。使用KinExA测定，21B12.1显示极少信号，因此，应用biacore溶液平衡测定。因为未观测到关于抗体与固定PCSK9表面结合的显著结合，所以使用胺偶合以约7000RU的密度将21B12抗体固定于CM5芯片的流槽4上。流槽3用作背景对照。将0.3、1及3nM的人类PCSK9或食蟹猕猴PCSK9与于PBS加0.1mg/mlBSA、0.005％P20中连续稀释的21B12.1抗体样品(在0.001至25nM的范围内)混合。通过注射于21B12.1抗体表面上来测量混合溶液中的游离PCSK9的结合。在溶液中不存在mAb下测定21B12.1表面上的100％PCSK9结合信号。PCSK9结合反应随mAb的浓度增加而降低指示PCSK9与溶液中的mAb结合，这阻断PCSK9结合固定的肽体表面。将PCSK9结合信号相对于mAb浓度绘图，于KinExAPro^TM软件中使用单位点均质结合模型由三组曲线(0.3、1及3nM固定PCSK9浓度)计算K_D。尽管从KinExA测定及SDS-凝胶观测到cPCSK9具有较低的蛋白质浓度，但此处不调整其浓度，因为cPCSK9的浓度不用于计算K_D。结果显示于下表8.2及图5B-5D中。图5B描述在3种不同hPCSK9浓度下进行的针对hPCSK9的溶液平衡测定的结果。图5C描述针对mPCSK9的一组类似结果。图5D描述以上biacore捕捉测定的结果。

表8.2

实施例9

31H4及21B12阻断D374Y PCSK9/LDLR结合的功效

这个实施例提供两种抗体阻断PCSK9 D374Y结合LDLR的能力的IC50值。透明384孔板(Costar)用2微克/毫升的于缓冲液A(100mM二甲胂酸钠，pH 7.4)中稀释的山羊抗LDL受体抗体(R&D Systems)涂布。各板用缓冲液A充分洗涤，然后用缓冲液B(含1％牛乳的缓冲液A)阻断2小时。在洗涤之后，各板与0.4微克/毫升的于缓冲液C(补充有10mM CaCl2的缓冲液B)中稀释的LDL受体(R&D Systems)一起孵育1.5小时。与此孵育同时，20ng/ml生物素化的D374Y PCSK9与各种浓度的于缓冲液A中稀释的31H4 IgG2、31H4 IgG4、21B12IgG2或21B12IgG4抗体、或单独缓冲液A(对照)一起孵育。洗涤含有LDL受体的板且将生物素化的D374YPCSK9/抗体混合物转移至其中并在室温下孵育1小时。通过依次与于缓冲液C中500ng/ml的抗生物素蛋白链霉亲和素-HRP(Biosource)、及TMB底物(KPL)一起孵育来检测生物素化的D374Y与LDL受体的结合。信号用1N HCl淬灭且在450nm下读取吸光度。

这项结合研究的结果展示于图6A-6D中。概括来说，确定各抗体的IC₅₀值且得知其为31H4 IgG2 199pM(图6A)、31H4 IgG4 156pM(图6B)、21B12 IgG2 170pM(图6C)、及21B12IgG4 169pM(图6D)。

在这项测定中，抗体还阻断野生型PCSK9与LDLR的结合。

实施例10

细胞LDL摄取测定

这个实施例证明各种抗原结合蛋白降低细胞摄取LDL的能力。人类HepG2细胞于补充有10％FBS的DMEM培养基(Mediatech,Inc)中以每孔5×10⁵个细胞的浓度接种于黑色透明底部的96孔板(Costar)中且在37℃(5％CO2)下孵育过夜。为形成PCSK9与抗体的复合物，2μg/ml D374Y人类PCSK9与各种浓度的于摄取缓冲液(含1％FBS的DMEM)中稀释的抗体或单独摄取缓冲液(对照)一起在室温下孵育1小时。在用PBS洗涤细胞之后，将D374Y PCSK9/抗体混合物转移至细胞中，随后转移于摄取缓冲液中稀释的最终浓度为6μg/ml的LDL-BODIPY(Invitrogen)。在37℃(5％CO2)下孵育3小时之后，细胞用PBS充分洗涤且通过Safire^TM(TECAN)在480-520nm(激发)及520-600nm(发射)下检测细胞荧光信号。

细胞摄取测定的结果展示于图7A-7D中。概括来说，确定各抗体的IC₅₀值且得知其为31H4 IgG2 16.7nM(图7A)、31H4 IgG4 13.3nM(图7B)、21B12 IgG2 13.3nM(图7C)、及21B12 IgG4 18nM(图7D)。这些结果证明所施用的抗原结合蛋白可降低PCSK9(D374Y)阻断细胞摄取LDL的效应。在这项测定中，抗体还阻断野生型PCSK9的效应。

实施例11

6天研究中31H4抗体的血清胆固醇降低效应

为评估经由针对PCSK9蛋白的抗体疗法在野生型(WT)小鼠中达成的总血清胆固醇(TC)降低，执行以下程序。

在整个实验持续时间中，向从Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)获得的雄性WT小鼠(C57BL/6品系，9-10周龄，17-27g)喂以正常食物(Harland-Teklad，膳食2918)。在T＝0时经由小鼠的尾静脉以10mg/kg的水平向小鼠施用抗PCSK9抗体31H4(2mg/ml于PBS中)或对照IgG(2mg/ml于PBS中)。还另设首次接受实验的小鼠作为首次接受实验对照组。给药组及处死时间展示于表9中。

表9

在表9中所示的预定时间点用CO2窒息法处死小鼠。经由腔静脉将血液收集至eppendorf管中且使其在室温下凝结30分钟。样品接着于台式离心机中在12,000×g下短暂离心10分钟以分离血清。使用Hitachi 912临床分析仪及Roche/Hitachi TC和HDL-C试剂盒测量血清总胆固醇及HDL-C。

实验的结果展示于图8A-8D中。概括来说，抗体31H4所施用的小鼠显示历经实验过程血清胆固醇水平降低(图8A及图8B)。此外，应注意小鼠还显示HDL水平降低(图8C及图8D)。对于图8A及图8C，变化百分比是相对于相同时间点的对照IgG(*P<0.01，#P<0.05)。对于图8B及图8D，变化百分比是相对于在t＝0小时时测量的首次接受实验的动物中的总血清胆固醇及HDL水平(*P<0.01，#P<0.05)。

就HDL水平降低来说，应注意，本领域技术人员应了解小鼠的HDL降低不指示HDL降低将发生在人类中且仅另外反映生物体中的血清胆固醇水平已降低。应注意小鼠转运高密度脂蛋白(HDL)粒子中的大多数血清胆固醇，这不同于人类，人类运载LDL粒子上的大多数血清胆固醇。在小鼠中，总血清胆固醇的测量结果最接近类似于血清HDL-C的水平。小鼠HDL含有载脂蛋白E(apoE)，其为LDL受体(LDLR)的配体且使LDL被LDLR清除。因此，在小鼠中，检查HDL为本实施例的适当指标(应了解并不预期人类的HDL降低)。举例来说，相反，人类HDL不含apoE且不为LDLR的配体。因为PCSK9抗体使小鼠中的LDLR表达增加，所以肝脏可清除更多HDL且因此降低血清HDL-C水平。

实施例12

6天研究中抗体31H4对LDLR水平的效应

本实施例证明如所预测，抗原结合蛋白会随时间改变受试者的LDLR的水平。进行蛋白质印迹分析以确定抗体31H4对LDLR水平的效应。从实施例13中所述的处死的小鼠获得的50-100mg肝脏组织于0.3ml含有完全蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(Santa CruzBiotechnology Inc.)中均质化。组织匀浆在冰上孵育30分钟且离心以沉淀细胞碎片。使用BioRad蛋白质测定试剂(BioRad laboratories)测量上清液中的蛋白质浓度。使100μg蛋白质在70℃下变性10分钟且于4-12％Bis-Tris SDS梯度凝胶(Invitrogen)上分离。将蛋白质转移至0.45μm PVDF膜(Invitrogen)中且在室温下于含有5％脱脂牛乳的洗涤缓冲液(50mMTris(PH 7.5)、150mMNaCL、2mM CaCl₂及0.05％吐温20(Tween 20))中阻断1小时。接着在室温下用1:2000山羊抗小鼠LDLR抗体(R&D system)或1:2000抗β肌动蛋白(actin)(sigma)探测印迹1小时。简短洗涤印迹且与1:2000牛抗山羊IgG-HRP(Santa Cruz BiotechnologyInc.)或1:2000山羊抗小鼠IgG-HRP(Upstate)一起孵育。在室温下孵育1小时之后，充分洗涤印迹且使用ECL plus试剂盒(Amersham biosciences)检测免疫反应性条带。蛋白质印迹显示在抗体31H4存在下，LDLR蛋白水平增加，如图9中所述。

实施例13

13天研究中抗体31H4的血清胆固醇降低效应

为评估在13天研究中经由针对PCSK9蛋白的抗体疗法在野生型(WT)小鼠中达成的总血清胆固醇(TC)降低，执行以下程序。

在整个实验持续时间中，向从Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)获得的雄性WT小鼠(C57BL/6品系，9-10周龄，17-27g)喂以正常食物(Harland-Teklad，膳食2918)。在T＝0时经由小鼠的尾静脉以10mg/kg的水平向小鼠施用抗PCSK9抗体31H4(2mg/ml于PBS中)或对照IgG(2mg/ml于PBS中)。还另设首次接受实验的小鼠作为首次接受实验对照组。

给药组及处死时间展示于表10中。处死动物且如实施例13中一般提取并制备肝脏。

表10

当将6天实验扩展至13天研究时，在6天研究中观测到的相同血清胆固醇降低效应在13天研究中也被观测到。更具体来说，以10mg/kg给药的动物显示在第3天血清胆固醇降低31％，截至第13天，其逐渐返回至给药前水平。图10A描述这项实验的结果。图10C描述用10mg/kg剂量的31H4及用也为10mg/kg的另一抗体16F12重复以上程序的结果。给药组及处死时间展示于表11中。

表11

如图10C中所示，在仅单次剂量之后，16F12与31H4两者均致使总血清胆固醇显著且实质性降低并且持续超过一周(10天或10天以上)提供益处。重复的13天研究的结果与首个13天研究的结果一致，其中观测到在第3天血清胆固醇水平降低26％。对于图10A及图10B，变化百分比是相对于相同时间点时的对照IgG(*P<0.01)。对于图10C，变化百分比是相对于相同时间点时的对照IgG(*P<0.05)。

实施例14

13天研究中抗体31H4对HDL水平的效应

还检查实施例15中的动物的HDL水平。小鼠的HDL水平降低。更具体来说，以10mg/kg给药的动物显示在第3天HDL水平降低33％，截至第13天，其逐渐返回至给药前水平。图10B描述实验的结果。在第3天，HDL水平降低34％。图10B描述重复的13天实验的结果。

如本领域技术人员所应了解，尽管抗体将降低小鼠HDL，但不预期会发生在人类中，因为人类与其它生物体(如小鼠)中存在HDL差异。因此，小鼠HDL的降低不指示人类HDL的降低。

实施例15

重复施用抗体会产生持续的抗原结合肽益处

为验证以上实施例中获得的结果可用其它剂量延长以达成进一步益处，用图11A中所述的给药日程安排重复实施例15及16中的实验。结果呈现于图11B中。如在图11B中的图表可见，尽管因为所有小鼠皆接受初始31H4抗原结合蛋白注射，两组小鼠均显示总血清胆固醇的显著降低，但接受额外31H4ABP注射的小鼠显示持续的总血清胆固醇降低，而仅接受对照注射的那些小鼠最终显示其总血清胆固醇增加。对于图11，变化百分比是相对于在t＝0小时时的首次接受实验的动物(*P<0.01，**P<0.001)。

这个实施例的结果证明不同于重复用药会由于受试者的生物调整而导致功效降低的其它胆固醇治疗方法，本发明方法在检查的时期内似乎不遭受这个问题。此外，这表明在先前实施例中观测的总血清胆固醇或HDL胆固醇水平返回至基线并非归因于受试者所显现的某种治疗抗性，而是归因于受试者中抗体可用性的消除。

实施例16

PCSK9抗体治疗胆固醇相关疾病的用途

向展现胆固醇相关疾病(其中胆固醇(如血清胆固醇)降低可有益)的人类患者施用治疗有效量的PCSK9抗体31H4(或例如21B12)。在治疗期间定时监测患者以确定疾病的症状是否已减弱。在治疗之后，发现相较于未治疗的患者，经受用PCSK9抗体治疗的患者的血清胆固醇水平降低。

实施例17

PCSK9抗体治疗高胆固醇血症的用途

向展现高胆固醇血症的症状的人类患者施用治疗有效量的PCSK9抗体，如31H4(或例如21B12)。在治疗期间定时监测人类患者以确定血清胆固醇水平是否已降低。在治疗之后，发现相较于未接受治疗的关节炎患者，接受用PCSK9抗体治疗的患者的血清胆固醇水平降低。

实施例18

PCSK9抗体预防冠心病和/或复发性心血管事件的用途

鉴定处于显现冠心病的风险中的人类患者。向患者单独、与他汀类(例如辛伐他汀)并行或依序施用治疗有效量的PCSK9抗体，如31H4(或例如21B12)。在治疗期间定时监测人类患者以确定患者的总血清胆固醇水平是否变化。在整个预防性治疗中，发现相较于未接受治疗的患者，接受用PCSK9抗体治疗的患者的血清胆固醇降低，进而降低其冠心病或复发性心血管事件的风险。

实施例19

PCSK9抗原结合蛋白预防高胆固醇血症的用途

经由家族病史分析和/或生活方式和/或当前胆固醇水平来鉴定展现显现高胆固醇血症的风险的人类患者。向受试者定期施用(例如每周一次)治疗有效量的PCSK9抗体31H4(或例如21B12)。在治疗期间定时监测患者以确定血清胆固醇水平是否已降低。在治疗之后，发现相较于未治疗的受试者，经受用PCSK9抗体预防性治疗的受试者的血清胆固醇水平降低。

实施例20

用以评价人类抗PCSK9抗体在健康受试者中的安全性、耐受性、药物动力学及药效学的1期、随机、双盲、安慰剂对照的、递升单次剂

量研究

这项研究为用以评价人类抗PCSK9抗体(单克隆抗体21B12)在健康受试者中的安全性、耐受性、PK、药效学(PD)(LDL-C)及免疫原性的随机、双盲、安慰剂对照的、递升单次剂量研究。受试者以3:1比率(21B12:安慰剂；每剂量组8个受试者，7组总计56个受试者)随机分组以接受7、21、70、210或420mg SC剂量的21B12、或相应安慰剂；或21或420mg IV剂量的21B12、或相应安慰剂。

56个受试者被随机分组且接受研究性产品(42个21B12、14个安慰剂)；40个受试者(30个21B12、10个安慰剂)通过SC施用途径接受研究性产品，且16个受试者(12个21B12、4个安慰剂)通过IV途径接受研究性产品。接受研究性产品的56个受试者中的53个(95％)完成所述研究。接受21B12的3个受试者撤消完全同意书且未完成研究。

研究群体主要由男性(54[96％])构成且平均年龄为31.2(范围：20至45)岁。86％的受试者为白人，继而为9％西班牙人/拉丁美洲人、4％黑人及1％其他人种。治疗组之间的平均基线LDL-C值类似且在113至143mg/dL的范围内。

在这项研究中，在单次剂量≥70mg SC下，21B12使LDL-C降低了平均55％至60％，其中效应的持续时间随剂量而变。在给药2周内观测到LDL-C最低点。在单次剂量≥70mg SC下观测到对PCSK9的完全抑制，这与所见的对循环LDL-C的效应良好相关。

PK分析显示21B12展现非线性(随浓度而变)消除。平均t_max在4至6天的范围内。如所预期，最高中值最大观测浓度(C_max)及从时间0至∞的浓度-时间曲线下面积(AUC_0-∞)出现在420mg IV组中且分别为139μg/mL及1550天·微克/毫升。

报道接受任何剂量的21B12的42个受试者中的29个(69％)及接受安慰剂的14个受试者中的10个(71％)有治疗突发性不良事件。受试者不良事件发生率与21B12的剂量之间、或受试者不良事件发生率与21B12的施用途径(SC对IV)之间无明显关联。

无不良事件被报道为严重不良事件，且无受试者由于不良事件而中止研究。不存在与研究有关的死亡。

报道接受21B12的42个受试者中的18个(43％)及接受安慰剂的14个受试者中的10个(71％)有治疗相关不良事件。受试者治疗相关不良事件发生率与21B12的剂量之间、或受试者治疗相关不良事件发生率与21B12的施用途径(SC对IV)之间无明显关联。

无趋势指示21B12对所选实验室变量、心电图(ECG)或生命征象具有临床重要影响。

在这项研究中，在高达420mg的单次SC及IV剂量下，21B12似乎被良好耐受。

测试来自这项研究中招募的受试者的血清样品中抗21B12抗体的存在(基线)或显现(治疗后)。来自接受21B12的所有42个受试者的样品皆为抗21B12抗体阴性。

实施例21

用以评价人类抗PCSK9抗体在服用稳定剂量的他汀类的患有高脂血症的受试者中的安全性、耐受性、药物动力学及药效学的1期、随机、

双盲、安慰剂对照的、递升多次剂量研究

这项研究为使用人类抗PCSK9抗体(单克隆抗体21B12)在当前服用稳定剂量的他汀类的高血脂(例如高胆固醇)受试者中进行的1b期、随机、双盲、安慰剂对照的、递升多次剂量研究。所述研究具有7个组。所有组的目标皆包括表征21B12的安全性、耐受性及免疫原性以及表征PK和PD(LDL-C及PCSK9)。研究的组1至5表示在服用稳定低至中等剂量的他汀类的高胆固醇受试者中进行的21B12剂量递增部分。组1至5中的服用稳定每日罗素他汀<40mg、阿托伐他汀<80mg或辛伐他汀20-80mg历时≥1个月的具有LDL-C(70-200mg/dL)的受试者(n＝每组8个受试者)以3:1比率随机分组以分别接受5种21B12SC剂量中的一种(14或35mg QW，6次；或140mg或280mg Q2W，3次；或420mg Q4W，2次)或相应安慰剂。于服用高剂量的他汀类(阿托伐他汀80mg或罗素他汀40mg)的高胆固醇受试者中执行组6。这组中的受试者(n＝12)服用罗素他汀40mg或阿托伐他汀80mg并且以3:1比率随机分组以分别接受21B12(140mg SC Q2W，3次)或相应安慰剂。于患有杂合子家族性高胆固醇血症(使用WHO标准进行鉴定)的受试者中执行组7；这组中的受试者(n＝6)以2:1比率随机分组以分别接受21B12(140mg SC Q2W，3次)或相应安慰剂。

从已被招募且随机分组以接受21B12或安慰剂的40个受试者获得初步结果。在这40个受试者中，28个受试者已接受≥1剂的研究性产品(21B12或安慰剂)且因此表示初步安全性分析组(对治疗不知情)。对于皆来自组1至4的这28个受试者可获得初步盲法安全性数据。尚未报道死亡、严重不良事件、或归因于不良事件的早期退出。总体来说，已报道已接受≥1剂的研究性产品的28个受试者中的15个(54％)有至少1起不良事件。大多数不良事件(对治疗不知情)是针对单一受试者报道，其中疲劳、关节痛、便秘及病毒性上呼吸道感染除外，报道28个受试者中的2个(7％)有以上每一种。

对于组1、2及3可获得初步药效学结果(对治疗不知情)。观测到服用稳定中等剂量的他汀类的受试者的循环LDL-C以随21B12剂量而变的方式降低。在初始给药2周内观测到LDL-C最低点且在组3(140mg Q2W SC，3次)中，所述最低点在降低60％至80％的范围内。在组3中观测到对PCSK9的近乎完全抑制，这与所见的对循环LDL-C的效应良好相关。

在最终结果中，组1-6中的受试者(N＝51)被随机分组以接受21B12(N＝39)或安慰剂(N＝12)；26个受试者(51％)为男性；平均(SD)年龄为58(7)岁。未报道死亡或严重不良事件(AE)且无受试者由于AE而中止研究。未检测到针对21B12的中和性抗体。

组1-5中的服用低至中等剂量的他汀类的受试者的平均LDL-C降低为最大降低多达81％(相对于安慰剂)，且在3次每两周一次21B12SC给药之后，在给药间隔结束时(即在第6周时)降低为75％(相对于安慰剂)，且在2次每4周SC给药之后，在给药间隔结束时(即在第8周时)降低为66％(相对于安慰剂)。组1-5中的服用低至中等剂量的他汀类的受试者的最大LDL-C降低为最大降低多达81％(相对于安慰剂)；且在给药间隔结束时降低为75％(相对于安慰剂)(图14)。效应的量值及持续时间随剂量而变。在更高剂量下，不可检测到血浆PCSK9。类似地，在3次每两周一次给药之后，在给药间隔结束时，服用高剂量他汀类的受试者(组6)的平均LDL-C降低为63％(相对于安慰剂)，且最大LDL-C降低为73％(相对于安慰剂)(图15)。

这些数据显示取决于给药方案，历经6周重复21B12SC给药使服用低至中等或高剂量他汀类的受试者的循环LDL-C降低多达81％(相对于安慰剂)，且无严重AE。高剂量他汀类组与低至中等他汀类剂量组之间21B12的LDL-C降低效应类似。

在给药间隔结束时，组1-5中的服用低至中等剂量的他汀类的受试者的平均PCSK9水平降低多达94％(相对于安慰剂)，数据未示出。在给药间隔结束时，组1-5中的服用低至中等剂量的他汀类的受试者的平均ApoB降低多达54％(相对于安慰剂)，并且在研究期间最大降低多达59％(相对于安慰剂)(图16)。此外，在给药间隔结束时，组1-6中的服用低至中等及高剂量的他汀类的受试者的平均Lp(a)降低多达43％(相对于安慰剂)(图17)。

在给药间隔结束时(即第6周，在第三次每两周一次21B12SC给药之后2周)，组7中的heFH受试者的平均LDL-C降低为65％(相对于安慰剂)，且最大LDL-C降低为70％(相对于安慰剂)(图18)。在给药间隔期间的LDL-C降低与在不患有heFH的受试者中观测到的LDL-C降低类似。在21B12治疗之后，在heFH受试者中不可检测到循环PCSK9。

在给药间隔结束时(即第6周，在第三次每两周一次21B12SC给药之后2周)，组7中的heFH受试者的平均血清PCSK9值降低为78％(相对于安慰剂)(图19)。在给药间隔结束时(即第6周，在第三次每两周一次21B12SC给药之后2周)，组7中的heFH受试者的平均总胆固醇降低多达42％(相对于安慰剂)，且最大总胆固醇降低为47％(相对于安慰剂)(图20)。在给药间隔结束时(即第6周，在第三次每两周一次21B12SC给药之后2周)，组7中的heFH受试者的平均非HDL胆固醇降低为61％(相对于安慰剂)，且最大非HDL胆固醇降低为67％(相对于安慰剂)(图21)。在给药间隔结束时(即第6周，在第三次每两周一次21B12SC给药之后2周)，组7中的heFH受试者的平均ApoB水平降低多达47％(相对于安慰剂)，且最大ApoB降低为57％(相对于安慰剂)(图22)。在给药间隔结束时(即第6周，在第三次每两周一次21B12SC给药之后2周)，组7中的heFH受试者的平均脂蛋白a(Lp(a))降低为50％(相对于安慰剂)(图23)。

在组7中，21B12使正在接受照护标准疗法的患有heFH及高脂血症的受试者的未结合的PCSK9水平降低且大致上降低其循环LDL-C水平。测试的每两周一次给药使heFH受试者的LDL-C降低，这与非heFH受试者的LDL-C降低类似。未报道严重AE。

实施例22

用以评价人类抗PCSK9抗体在患有杂合子家族性高胆固醇血症的患

者中的耐受性及功效的双盲、随机、安慰剂对照研究

这项研究的目标在于相较于安慰剂评价12周皮下(SC)注射人类抗PCSK9抗体(单克隆抗体21B12)对患有杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)的受试者的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)相对于基线的变化百分比的影响。

这项研究为评价单克隆抗体21B12在诊断有HeFH的受试者中的安全性、耐受性及功效的双盲、随机、分层、安慰剂对照的临床试验。计划总计招募150个受试者。满足所有纳入/排除标准的受试者将以相等分配量随机分成3个治疗组：单克隆抗体21B12，350mg或420mg Q4W SC(每4周一次，皮下)或安慰剂Q4W SC。将通过筛选LDL-C水平(<130mg/dL[3.4mmol/L]对≥130mg/dL)及在基线状态下的依泽替米贝使用(是对否)来对随机分组分层。随机分组应在用于确定合格性的筛选LDL-C评估的5-10天内进行。将对单克隆抗体21B12及安慰剂不知情。研究随访在第2、4、8及12周。末次施用单克隆抗体21B12或安慰剂在第8周。研究结束(EOS)随访及末次脂质评价在第12周。

≥18至≤75岁且通过Simon Broome Register Group(SBRG)的诊断标准诊断有杂合子家族性高胆固醇血症的男性及女性适于这项研究。对于招募，受试者在LDL-C筛选之前必须持续至少4周以针对所有允许的脂质调控药物的稳定剂量服用核准的他汀类(例如依泽替米贝、胆汁酸螯合树脂、甾烷醇或法规核准且销售的烟酸(例如尼斯潘或尼克尔))且在研究者看来，无需上调剂量(uptitration)。在筛选时，通过中心实验室所测定，空腹LDL-C必须≥100mg/dL(2.6mmol/L)且空腹甘油三酯≤400mg/dL(4.5mmol/L)。

初步数据(数据未示出)显示用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C最小平方(LS)平均降低百分比为38.46％，且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为45.68％。用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为21.69％，且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为28.23％。用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为15.39％，且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为6.77％。用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为17.16％，且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为18.49％。用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为17.24％，且用420mg21B12治疗的受试者相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为4.56％。用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL胆固醇LS平均降低百分比为36.16％，且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的非HDL胆固醇LS平均降低百分比为41.81％。最后，用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为24.82％，且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为29.45％。(数据未示出)

图24为表示以下21B12剂量所引起的LDL-C降低数据的图：70mg、105mg及140mg(Q2W或每两周一次给药)及280mg、350mg及420(Q4W或一个月一次给药)。这数据为实施例22-25中所述的研究的集合数据。简单来说，集合数据显示140mg Q2W使得在第12周时LDL-C相较于基线降低约60％且LDL-C降低得以平稳维持。此外，这数据显示420mg Q4W使得在第12周时LDL-C相较于基线降低约56％且在给药间隔结束时LDL-C回弹较小。

图25A-25D分别为展示21B12剂量对Lp(a)、HDL-C、甘油三酯及VLDL-C的有益效应的条形图，从实施例22-25中所述的研究的集合数据获得。此外，观测到以下物质相较于基线的降低随剂量而变：总胆固醇(25-37％，p值<0.001)、非HDL-C(36-53％，p值<0.001)及ApoB(36-53％，p值<0.001)(数据未示出)。

实施例23

用以评价人类抗PCSK9抗体相较于依泽替米贝在不能耐受有效剂量的HMG-Co-A还原酶抑制剂的高胆固醇患者中的耐受性及对LDL-C的功效的随机研究

这项研究的目标在于评价12周皮下(SC)注射人类抗PCSK9抗体(单克隆抗体21B12)相较于依泽替米贝对不能耐受有效剂量的HMG-CoA还原酶抑制剂的高胆固醇受试者的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)相较于基线的变化百分比的影响。

这项研究为人类抗PCSK9抗体单克隆抗体21B12的随机、分层、平行组临床试验。计划招募150个受试者。满足所有纳入/排除标准的受试者将以相等分配量随机分成5个治疗组：单克隆抗体21B12，280mg、350mg或420mg Q4W SC(每4周一次，皮下)；依泽替米贝(10mg每日(QD)经口(PO))连同单克隆抗体21B12(420mg Q4W SC)一起；或依泽替米贝(10mg QDPO)连同安慰剂(Q4W SC)一起。将通过筛选LDL-C水平(<130mg/dL[3.4mmol/L]对≥130mg/dL)及在基线状态下的他汀类使用(是对否)来对随机分组分层。随机分组应在用于确定合格性的筛选LDL-C评估的5-10天内进行。将对单克隆抗体21B12及安慰剂不知情。不对依泽替米贝不知情。研究随访在第2、4、8及12周。末次施用单克隆抗体21B12或安慰剂在第8周。研究结束随访及末次脂质评价在第12周。

≥18至≤75岁的男性及女性适于这项研究。受试者必须已尝试至少1种他汀类且归因于肌痛或肌病变已不能耐受任何剂量或超过以下总每周最大剂量的他汀类剂量增加：阿托伐他汀≤70mg，辛伐他汀≤140mg，普伐他汀≤140mg，罗素他汀≤35mg，洛伐他汀≤140mg，氟伐他汀≤280mg。对于未列的他汀类，最大总每周剂量不应超过最小可用片剂量的7倍。当他汀类中止或剂量降低时，症状必须已消退。如果接受他汀类(不超过以上规定的最大剂量)、胆汁酸螯合树脂和/或甾烷醇疗法，那么在LDL-C筛选之前剂量必须稳定持续至少4周。如果受试者在筛选开始时在服用依泽替米贝，那么在LDL-C筛选之前依泽替米贝必须中止≥4周。取决于受试者的风险种类(基于NCEP ATP III治疗目标)，在筛选时受试者必须满足以下空腹LDL-C(由中心实验室来测定)标准：对于被诊断患有冠心病(CHD)或CHD风险等效物的受试者，≥100mg/dL(2.6mmol/L)；对于没有被诊断CHD或风险等效物及2个或更多个风险因素的受试者，≥130mg/dL(3.4mmol/L)；对于没有被诊断CHD或风险等效物且具有1个风险因素或不具有风险因素的受试者，≥160mg/dL(4.1mmol/L)。空腹甘油三酯必须≤400mg/dL(4.5mmol/L)，如在筛选时通过中心实验室分析所测定。

初步数据(数据未示出)显示用280mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为38.79％；用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为40.01％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为50.63％。初步数据显示用280mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为27.38％；用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为16.04％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为23.84％。初步数据显示用280mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为8.62％；用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为4.62％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为7.55％。初步数据显示用280mg21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为31.02％；用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为38.14％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为37.27％。初步数据显示用280mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为15.35％；用350mg21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为19.22％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为19.55％。初步数据显示用280mg21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为31.03％；用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为34.46％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为42.23％。初步数据显示用280mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为39.92％；用350mg 21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为42.86％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为53.49％。

实施例24

用以评价人类抗PCSK9抗体在10年弗雷明汉(Framingham)风险分值为10％或10％以下的高胆固醇患者中的耐受性及对LDL-C的功效的随机、安慰剂及依泽替米贝对照的剂量范围研究

这项研究的目标在于相较于安慰剂评价12周皮下(SC)注射人类抗PCSK9抗体(单克隆抗体21B12)(每2周(Q2W)或每4周(Q4W))在用作单药疗法时对10年弗雷明汉风险分值为10％或10％以下的高胆固醇受试者的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)相较于基线的变化百分比的影响。

这项研究为人类抗PCSK9抗体单克隆抗体21B12的随机、分层、安慰剂及依泽替米贝对照的平行组剂量范围临床试验，招募411个受试者。满足所有纳入/排除标准的受试者将以相等分配量随机分成9个治疗组：单克隆抗体21B12的6个剂量方案中的一个(70mg、105mg或140mg Q2W SC、或280mg、350mg或420mg Q4W SC(每4周一次，皮下))、安慰剂连同Q2W或Q4W SC施用一起、或依泽替米贝连同每日(QD)经口(PO)施用一起。通过筛选LDL-C水平(<130mg/dL[3.4mmol/L]对>130mg/dL)来对随机分组分层。随机分组在用于确定合格性的筛选LDL-C评价的5-10天内进行。不管受试者是否接受Q2W SC或Q4W治疗剂或依泽替米贝，研究随访皆每2周进行。3个Q2W单克隆抗体21B12剂量组及1个Q2W安慰剂组对彼此不知情，且3个Q4W剂量组及1个Q4W安慰剂组对彼此不知情。不对依泽替米贝不知情。研究结束随访及末次脂质估算对于采用Q4W IP日程安排或服用依泽替米贝的受试者在第12周且对于采用Q2W IP日程安排的受试者在第14周。

≥18至≤75岁的男性及女性适于这项研究。在筛选时，由中心实验室所测定，空腹LDL-C为≥100mg/dL(2.6mmol/L)且<190mg/dL(4.9mmol/L)且空腹甘油三酯≤400mg/dL(4.5mmol/L)。受试者的国家胆固醇教育组成人治疗组III(NCEP ATP III)弗雷明汉风险分值为10％或10％以下。

主要终点为在第12周时LDL-C相较于基线的变化百分比。次要终点包括载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白(a)(Lp(a))及总胆固醇与高密度脂蛋白(HDL)-C的比率的变化百分比。还评价耐受性及安全性。

初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C平均降低百分比为41.21％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C平均降低百分比为45.44％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的LDL-C平均降低百分比为51.56％(数据未示出)。

初步数据显示用280mg 21B12(Q4W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C平均降低百分比为37.53％；用350mg21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C平均降低百分比为42.16％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的LDL-C平均降低百分比为47.52％(数据未示出)。

最终数据显示在第12周时，接受21B12的受试者相较于基线的LDL-C最小平方(LS)平均降低百分比多达51％(表12)；依泽替米贝达成的相较于基线的变化百分比为14％。21B12达成的从基线至第12周的变化比安慰剂所达成者大多达72mg/dL。接受21B12的受试者相较于基线的LDL-C降低比安慰剂大37％-53％且比依泽替米贝大37％。21B12达成的相较于基线的ApoB平均降低(多达44％)、Lp(a)平均降低(多达29％)及总胆固醇/HDL比率平均降低(多达38％)大于安慰剂所达成者。

表12：

第12周相较于基线的LDL-C变化百分比：SC 21B12对依泽替米贝或安慰剂

SC：皮下Q2W：每2周；Q4W：每4周或一个月一次；QD：每日*P<0.001

实施例25

用以评价人类抗PCSK9抗体与HMG-Co-A还原酶抑制剂组合在高胆固醇患者中的耐受性及对LDL-C的功效的双盲、随机、安慰剂对照的剂量范围研究

这项研究的目标在于相较于安慰剂评价12周皮下(SC)人类抗PCSK9抗体(单克隆抗体21B12)(每2周(Q2W)或每4周(Q4W))在组合HMG-Co-A还原酶抑制剂(例如他汀类)使用时对高胆固醇血症受试者的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)相较于基线的变化百分比的影响。

这项研究为人类抗PCSK9抗体单克隆抗体21B12的双盲、随机、分层、安慰剂对照的平行组剂量范围临床试验，招募631个受试者。连同或不连同依泽替米贝一起服用稳定剂量的他汀类疗法至少4周且满足所有纳入/排除标准的受试者将以相等分配量随机分成8个治疗组：单克隆抗体21B12皮下(SC)(70mg Q2W，105mg Q2W，140mgQ2W，280mg Q4W，350mg Q4W及420mg Q4W，安慰剂Q2W SC，或安慰剂Q4W SC)。将通过筛选LDL-C水平(<130mg/dL[3.4mmol/L]对≥130mg/dL)及在基线状态下的依泽替米贝使用(是对否)来对随机分组分层。随机分组应在用于确定合格性的筛选LDL-C评估的5-10天内进行。不管受试者是否接受Q2W SC或Q4W治疗剂，研究随访皆每2周进行。3个Q2W单克隆抗体21B12剂量组及1个Q2W安慰剂组将对彼此不知情，且3个Q4W剂量组及1个Q4W安慰剂组将对彼此不知情。研究结束随访及末次脂质估算对于采用Q4W IP日程安排的受试者在第12周且对于采用Q2W IP日程安排的受试者在第14周。

≥18至≤80岁的男性及女性适于这项研究。对于招募，受试者在LDL-C筛选之前必须连同或不连同依泽替米贝一起以稳定剂量服用他汀类至少4周且无需上调剂量。在筛选时，空腹LDL-C必须≥85mg/dL(2.2mmol/L)。对筛选空腹LDL-C在≥85mg/dL(2.2mmol/L)且<100mg/dL(2.6mmol/L)范围内的受试者的招募将限于不超过总计划招募数的约20％。空腹甘油三酯必须≤400mg/dL(4.5mmol/L)，如在筛选时通过中心实验室分析所测定。

初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为39.22％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为56.38％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为68.76％(数据未示出)。初步数据显示用70mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为21.17％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为33.41％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为33.87％(数据未示出)。初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为21.17％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为6.80％；且用140mg21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为8.43％(数据未示出)。初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-CLS平均降低百分比为14.84％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为12.75％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为45.14％(数据未示出)。初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为7.20％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为5.65％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为17.60％(数据未示出)。初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为36.20％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为51.20％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为64.61％(数据未示出)。初步数据显示用70mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为26.33％；用105mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为36.91％；且用140mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为46.17％(数据未示出)。

初步数据显示用280mg 21B12(Q4W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为42.62％；用350mg21B12治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为56.84％；且用420mg 21B12治疗的受试者相较于基线的LDL-C LS平均降低百分比为52.19％(数据未示出)。初步数据显示用280mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为22.54％；用350mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为29.43％；且用420mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的Lp(a)LS平均降低百分比为23.29％(数据未示出)。初步数据显示用280mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为2.17％；用350mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为6.92％；且用420mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的HDL-C LS平均增加百分比为7.42％(数据未示出)。初步数据显示用280mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为18.12％；用350mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为20.89％；且用420mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的VLDL-C LS平均降低百分比为28.66％(数据未示出)。初步数据显示用280mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为6.75％；用350mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为9.17％；且用420mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的甘油三酯LS平均降低百分比为11.13％(数据未示出)。初步数据显示用280mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为38.89％；用350mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为50.83％；且用420mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的非HDL-C LS平均降低百分比为48.54％(数据未示出)。初步数据显示用280mg 21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为28.08％；用350mg21B12(Q2W)治疗的受试者在给药间隔结束时相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为36.04％；且用420mg 21B12(Q2W)治疗的受试者相较于基线的总胆固醇LS平均降低百分比为42.76％(数据未示出)。

实施例26

PCSK9ABP在他汀类存在下进一步上调LDLR

这个实施例证明所产生的针对PCSK9的ABP在他汀类存在下使用时会进一步增加LDLR可用性，从而显示可通过组合使用两者来达成进一步益处。

将HepG2细胞接种于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中且生长至约90％汇合。细胞于含3％FBS的DMEM中用指定量的莫维诺林(mevinolin)(一种他汀类，Sigma)及PCSK9ABP(图12A-12C)处理48小时。制备总细胞溶解产物。通过凝胶电泳分离50mg总蛋白质且转移至PVDF膜中。使用兔抗人类LDL受体抗体(Fitzgerald)或兔抗人类b-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。增强的化学发光结果展示于图12A-12C的顶部版面中。通过ImageJ软件定量条带的强度且根据b-肌动蛋白加以归一化。LDLR的相对水平展示于图12A-12C的下部版面中。ABP21B12及31H4为PCSK9中和性抗体，而25A7.1为非中和性抗体。

还生成HepG2-PCSK9细胞。这些细胞为用人类PCSK9转染的稳定HepG2细胞系。将细胞接种于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中且生长至约90％汇合。细胞于含3％FBS的DMEM中用指定量的莫维诺林(Sigma)及PCSK9ABP(图12D-12F)处理48小时。制备总细胞溶解产物。通过凝胶电泳分离50mg总蛋白质且转移至PVDF膜中。使用兔抗人类LDL受体抗体(Fitzgerald)或兔抗人类b-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。增强的化学发光结果展示于顶部版面中。通过ImageJ软件定量条带的强度且根据b-肌动蛋白加以归一化。

如在图12A-12F中所述的结果中可见，递增量的中和性抗体及递增量的他汀类通常引起LDLR的水平增加。ABP水平增加所致的此有效性增加在图12D-12F中尤其明显，其中细胞也用PCSK9转染，从而允许ABP在更大程度上显示其有效性。

感兴趣的是，如由图12D-12F与图12A-12C的结果比较所证明，当PCSK9由细胞产生时，ABP浓度对LDLR水平的影响显著增加。此外，明显的是中和性ABP(21B12及31H4)引起的LDLR水平增加大于25A7.1ABP(一种非中和剂)，甚至在他汀类存在下也如此，从而显示可通过使用他汀类与针对PCSK9的ABP两者来达成额外益处。

实施例27

共有序列

使用对应于抗PCSK9ABP的V_H及V_L的CDR的标准系统发生分析来确定共有序列。通过保持CDR在对应于V_H或V_L的相同序列内相连来确定共有序列。简单来说，对应于V_H或V_L的整个可变域的氨基酸序列转换成FASTA格式以便于处理比较比对物并推断系统发生。接着，这些序列的框架区用人工接头序列(“bbbbbbbbbb”占位符，非特异性核酸构建体)置换以使得对单独CDR的检查可在不引入归因于重合事件(例如偶然共有共同生殖系框架遗传性的无关抗体)的任何氨基酸位置权重偏差下进行同时仍然保持CDR在对应于V_H或V_L的相同序列内相连。接着使用采用标准ClutalW样算法的程序对这种形式的V_H或V_L序列进行序列类似性比对查询(参见Thompson等，1994,Nucleic Acids Res.22:4673-4680)。空位产生罚分8.0连同空位扩展罚分2.0一起采用。这个程序也使用UPGMA(使用算术平均值的未加权配对群组方法)或邻近联接方法(参见Saitou和Nei,1987,Molecular Biology and Evolution 4:406-425)基于序列类似性比对结果产生系统发生图(系统发生树图解)以经由分支长度比较及分组来建立及说明序列群组的类似性及差别。两种方法产生类似结果但最终使用UPGMA衍生的树，因为所述方法采用一组更简单且更保守的假设。产生UPGMA衍生的树，其中类似序列群组被定义为在群组内的单个序列中每100个残基具有少于15个取代(参见树图解中的标度图例)，且将UPGMA衍生的树用于定义共有序列集合。比较的结果描述于图13A-13J中。在图13E中，选择群组以使得轻链中分枝的序列也为重链中的分枝序列且具有少于15个取代。

实施例28

制备PCSK9ABP制剂

UF/DF-超滤/渗滤方法

用使用Millipore Pellicon XL过滤器、50cm²尺寸(再生纤维素，30,000分子量截断值)膜的小型Millipore TFF UF/DF系统使原料药(例如抗体21B12及抗体11F1)缓冲液交换至包括稳定剂的制剂缓冲液中。进行渗滤步骤直到至少10体积的渗滤缓冲液被交换。一旦完成渗滤步骤，UF/DF系统即切换至超滤模式且各制剂被浓缩至目标浓度水平。

在完成UF/DF步骤之后，从1.0％(w/w)新鲜制备的聚山梨醇酯(“PS”)储备溶液添加适当量的聚山梨醇酯20或80至各制剂中以达到所要聚山梨醇酯浓度。

在填充主要容器之前，各制剂在层流罩下并使用0.2微米过滤器进行无菌过滤。填充也是无菌进行并且手动或使用适当填充仪器自动进行。

实施例29

粘度较低的高浓度PCSK9ABP制剂

为评价不同赋形剂对高蛋白质浓缩物的粘度的影响，使用粘度、稳定性及溶解性筛选测定来探究用于高浓度蛋白质制剂的赋形剂粘度调节剂。具体来说，所有样品(例如抗体21B12样品)制备皆在层流罩下无菌进行。将待测试的样品冻干允许使用简单方法达成高蛋白质浓度。将1.5mL 70mg/mL蛋白质(例如21B12)吸移至3cc玻璃小瓶中以进行冻干。使用通用冻干循环在VirTis实验室规模冻干机上进行冻干。冻干缓冲液为10mM L-谷氨酸盐及1.0％蔗糖，pH 4.8。冻干的样品(例如冻干的21B12样品)用约0.65mL下表13中所示的赋形剂缓冲液单个地复原至最终蛋白质浓度150-200mg/mL。复原的样品静置过夜以使得完全溶解。接着如下所述测量粘度。

表13

粘度、稳定性、溶解性筛选的结果展示在添加各种赋形剂之后的21B12粘度变化(图26)。并非所有用于筛选目的的赋形剂皆致使溶液粘度降低；相较于对照样品，添加L-丙氨酸、甘油、硫酸钠、蔗糖及氯化锌致使粘度高很多。用于筛选中的若干赋形剂似乎为良好的粘度调节候选物，例如L-精氨酸、肉碱、肌酸酐、L-蛋氨酸及牛磺酸。

为评价不同制剂对特定PCSK9ABP的粘度的影响，以下表29.2中所示的6种不同制剂配制21B12的组合物。所有制剂中的21B12的浓度皆为134mg/ml。组合物以最终体积1.0ml填充于小瓶中。在室温下(即25℃)孵育组合物。

透析及浓缩21B12

经由透析通过向Pierce Slide-A-Lyzer(Rockford,IL)透析盒中添加约10mL21B12并在4℃下相对于2L缓冲液透析3个循环(2小时×2及16小时×1)以达成完全缓冲液交换来实现从最初于10mM乙酸钠、9.0％(w/v)蔗糖中的21B12除去蔗糖。透析用缓冲液含有pH 5.0的10mM乙酸钠(由乙酸制得)。所有样品随后皆使用Millipore Amicon UltraPrep装置(Billerica,MA)，于在3000rpm下旋转的Beckman Coulter Allegra 6R离心机(Fullerton,California)中浓缩直至样品体积略微小于为所要浓度所需的体积。

接着通过使用Agilent 8453分光光度计(Santa Clara,California)在A280下测量吸光度来进行浓度测定。使用适当的消光系数计算蛋白质浓度。接着添加适量缓冲液至样品中以将其稀释回所要浓度并且再进行A280测量以获得实验的最终浓度。

添加也可用于降低粘度的稳定剂：

测试如脯氨酸、苯甲醇、肌酸酐、蛋氨酸、牛磺酸等赋形剂以试图降低粘度。这些赋形剂单个地添加至来自高浓度储备溶液的21B12制剂样品中。

粘度测量

使用具有CPE-40轴的Brookfield LV-DVII锥板式粘度计(Middleboro,Massachusetts)，在匹配样品杯温度由循环水浴调控在恒定25C下的情况下测量粘度。用正位移移液器添加500ul样品至样品杯中。在固定样品杯之后，逐渐增加轴的旋转速度直至达成约80％扭矩。此时停止旋转速度且由Rheocalc软件生成粘度读数。

表14

结果显示L-脯氨酸、苯甲醇、肌酸酐、蛋氨酸及牛磺酸在高浓度PCSK9ABP 21B12中皆具有显著粘度降低效应(参见表14)。

为进一步评价不同制剂对特定PCSK9ABP的影响，以下表15中所示的不同制剂配制21B12的组合物。制剂分成以下3组：(1)一组各种浓度的21B12于10mM乙酸钠缓冲液(pH5.2)中，(2)一组各种浓度的21B12于10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)中，3％(约261mM)L-脯氨酸掺加至各样品中，及(3)一组约117-134mg/mL浓度的21B12样品于不同pH水平(4.0至5.5)的10mM乙酸钠缓冲液中，掺加2个样品于添加有NaCl或L-蛋氨酸/苯甲醇组合的10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)中。

表15

结果显示L-脯氨酸在高浓度PCSK9ABP 21B12中具有显著粘度降低效应(参见图27)。

为更进一步评价不同制剂对特定PCSK9ABP的影响，以下表16中所示的不同制剂配制21B12的组合物。

表16

结果显示用1.5％或2.0％脯氨酸(约131nM-174mM脯氨酸)及1％苯甲醇配制的21B12制剂在高浓度PCSK9ABP 21B12中具有显著粘度降低效应。

为更进一步评价不同制剂对特定PCSK9ABP的影响，以下表17中所示的不同制剂配制21B12的组合物。

表17：

结果显示能够用具有特定稳定剂/赋形剂的制剂达成具有降低的粘度的高浓度21B12蛋白(参见图28A-28D)。具体来说，图28A为展示各种浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH 5.2)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图28B为展示各种浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下，相较于在包含10mM乙酸钠、125mM精氨酸及3％蔗糖(pH5.0)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图28C为展示各种浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下，相较于在包含10mM乙酸钠、100mM蛋氨酸及4％蔗糖(pH5.0)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

图28D为展示各种浓度的抗PCSK9抗体21B12在包含10mM乙酸钠及9％蔗糖(pH5.2)的制剂中在25℃及40℃下，相较于在包含10mM乙酸钠及250mM脯氨酸(pH 5.0)的制剂中在25℃及40℃下的粘度的图。

实施例30

高浓度11F1粘度研究

表30展示11F1抗体在摄氏25度下在各种抗体浓度下及于各种制剂中的粘度。

如以上实施例29中对于21B12所述类似地制备高浓度11F1储备溶液。然后通过使用Agilent 8453分光光度计(Santa Clara,California)在A280下测量吸光度来进行浓度测定。使用适当的消光系数计算蛋白质浓度。接着添加适量缓冲液至样品中以将其稀释回所要浓度且再进行A280测量以获得实验的最终浓度。将赋形剂单个地添加至由高浓度储备溶液获得的11F1制剂样品中。

使用具有CPE-40轴的Brookfield LV-DVII锥板式粘度计(Middleboro,Massachusetts)，在匹配样品杯温度由循环水浴调控在恒定25℃下的情况下测量粘度。用正位移移液器添加500μl样品至样品杯中。在固定样品杯之后，逐渐增加轴的旋转速度直至达成约80％扭矩。此时停止旋转速度且由Rheocalc软件生成粘度读数。

高浓度蛋白质制剂有时使用不同类型的粘度计，即具有CP50-1轴的Anton PaarPhysicaMCR300型粘度计测量。此仪器中使用600uL样品且使用Rheoplus软件3.4版计算溶液粘度。使用任一粘度计获得的测量结果不存在较大差异。

表30

表30中所示的结果显示能够以具有特定稳定剂/赋形剂的制剂达成具有相对较低粘度的高浓度11F1抗体。包含稳定剂蛋氨酸、脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸及丙氨酸的制剂展现尤其更低的粘度。

实施例31

高浓度PCSK9ABP制剂的稳定性研究

为评价稳定性对高蛋白质PCSK9ABP制剂的影响，以下表31.1中所示的不同制剂配制21B12的组合物。制剂于指定容器中在-30℃或4℃下孵育0周、1个月、2个月、3个月及6个月及1年。对于在各时间点的各制剂，从各包装移除样品以通过非变性尺寸排阻HPLC(SEC-HPLC)及通过光遮蔽进行的在显微镜下才可见的粒子检测(HIAC)监测抗体单体。

表311

SEC-HPLC:

SEC-HPLC基于蛋白质的流体动力学体积的差异分离蛋白质。流体动力学蛋白质体积较大的分子早于体积较小的分子洗脱。使用5μm粒度的TSK-GEL G3000SWXL 7.8mm×300mm管柱(Tosoh Bioscience)在具有可变波长检测器的Agilent HPLC上进行非变性SEC-HPLC。流动相为100mM磷酸钠，250mM氯化钠，pH 6.8±0.1。流速为0.5毫升/分钟。在280nm下监测管柱洗脱液。使用色谱图中的完整峰面积定量单体及高分子量物质种类的量。

表31.2：

表31.2展示对在X℃下孵育0周、1个月、2个月、3个月及6个月的表31.1中所列的21B12制剂的非变性SEC-HPLC分析的结果。“HMW％”反映样品中高分子量21B12单体的量。这些结果指示在6个月之后，未观测到制剂问题；然而，蛋氨酸制剂(即制剂2、5及8)中一些高分子量物质种类确实是增加了。

通过光遮蔽进行的在显微镜下才可见的粒子检测(HIAC)：

含有光遮蔽传感器(HIAC/Royco HRLD-150或等效物)以及液体取样器的电子液载粒子计数系统(HIAC/Royco 9703或等效物)可定量给定测试样品中的粒子数目及其尺寸范围。当液体中的粒子穿过光源与检测器之间时，其减弱或“遮蔽”落在检测器上的光束。当粒子的浓度处于传感器的正常范围内时，这些粒子逐个被检测。各粒子穿过检测区域会降低光检测器上的入射光并且光检测器的电压输出量瞬间降低。电压的变化记录为电脉冲，其由仪器转换成存在的粒子数目。所述方法为非特异性的且测量不管何种来源的粒子。所监测的粒度为10μm及25μm。

在这个实施例中，使用已在4℃下储存的样品进行HIAC分析。具体来说，表31.1中的21B12制剂的样品经受真空(又称为“脱气”)以除去在粒子计数系统中可检测为粒子的气泡。对于21B12样品，所述方法是使样品在75托(torr)下经受真空1至2小时。在完成脱气过程后的2小时内进行粒子计数。

图29A及29B展示对在容器中孵育0周、1个月、2个月、3个月及6个月的以上鉴定的制剂的HIAC测定的结果。计数10μm及25μm粒子。图29A及29B显示所有21B12制剂皆稳定，如用HIAC所测量。尽管玻璃注射器中的制剂(即制剂4-6)在各蛋白质浓度及制剂下显示更高的粒子含量，但那些粒子计数在各粒度(10μm及25μm)的USP限度以下。10μm粒子的USP限度为每个容器6000个粒子，且对于25μm粒子为每个容器600个粒子。

实施例32

11F1稳定性研究

为研究11F1的高浓度制剂(150mg/mL)，使用如下表32A中指示的候选赋形剂制备若干制剂。制剂于指示容器中在-30℃或4℃下储存至少6个月。

表32A：所研究的制剂

在-30℃及4℃下储存之后在下表32B中指示的时间点通过尺寸排阻HPLC评估HMW物质种类％。简单来说，尺寸排阻HPLC基于蛋白质的流体动力学体积的差异来分离蛋白质。流体动力学蛋白质体积较大的分子早于体积较小的分子洗脱。使用5μm粒度的TSK-GELG3000SWXL 7.8mm×300mm管柱(Tosoh Bioscience)在具有可变波长检测器的AgilentHPLC上进行非变性SEC-HPLC。流动相为100mM磷酸钠，250mM氯化钠，pH 6.8+/-0.1。流速为0.5毫升/分钟。在280nm下监测管柱洗脱液。使用色谱图中的完整峰面积定量单体及高分子量物质种类的量。

表32B

表32B展示对在4℃或-30℃下孵育0周、2个月、4个月或6个月的表32A中所列的11F1制剂的非变性SEC-HPLC分析的结果。“HMW％”反映样品中高分子量11F1的量。这些结果指示直至6个月，未观测到制剂问题；然而，在-30℃下储存的蛋氨酸制剂(即制剂3及6)中一些高分子量物质种类确实是增加了。

通过如下表32C中所指示于主要容器中制备制剂来评估其它高浓度11F1制剂的稳定性：

表32C

制剂在4℃下孵育一年。在下表32D中指示的时间点，从各容器移除样品且通过SEC-HPLC如对于上表32B所述加以分析。

表32D

在4℃下储存1年之后的尺寸排阻HMW形式％

在下表32E中指示的时间点，从各容器移除样品且通过阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)加以分析。阳离子交换HPLC基于蛋白质的表面电荷的差异来分离蛋白质。在设定pH下，在阳离子交换管柱上分离11F1的带电荷亚型并使用盐梯度洗脱。通过紫外吸光度监测洗脱液。通过测定各亚型的峰面积占总峰面积的百分比来评价带电荷亚型分布。

使用10μm粒度的Dionex G3000SWXL 4.0mm ID×250mm管柱(Tosoh Bioscience)在具有可变波长检测器的Agilent HPLC上进行非变性CEX-HPLC。流动相为线性梯度的20mMMES(pH 6.0+/-0.1)及含500mM氯化钠的相同缓冲液。流速为0.6毫升/分钟。在280nm下监测管柱洗脱液。使用色谱图中的完整峰面积定量带电荷不同的亚型的量。

表32E

在4℃下储存1年之后阳离子交换HPLC主要亚型峰％

表32D与表32E均显示在4℃下储存直至1年，所述11F1制剂展现HMW％增加小于5％(SEC-HPLC)或主要亚型峰变化小于3-5％(阳离子HPLC)。实际上，两种参数的变化极低，这指示制剂高度稳定。

通过光遮蔽进行的在显微镜下可见的粒子检测(HIAC)：

具有液体取样器的含有光遮蔽传感器(HIAC/Royco HRLD-150或等效物)的电子液载粒子计数系统(HIAC/Royco 9703或等效物)可定量给定测试样品中的粒子数目及其尺寸范围。当液体中的粒子穿过光源与检测器之间时，其减弱或“遮蔽”落在检测器上的光束。当粒子的浓度处于传感器的正常范围内时，这些粒子逐个被检测。各粒子穿过检测区域会降低光检测器上的入射光并且光检测器的电压输出量瞬间降低。电压的变化记录为电脉冲，其由仪器转换成存在的粒子数目。所述方法为非特异性的且测量不管何种来源的粒子。所监测的粒度为10μm及25μm。

在这个实施例中，使用已在4℃下储存的样品进行HIAC分析。具体来说，使表32a中的11F1制剂的样品经受真空(又称为“脱气”)以除去在粒子计数系统中可检测为粒子的气泡。对于11F1样品，方法是使样品在75托下经受真空1至2小时。在完成脱气过程后的2小时内进行粒子计数。

图30A及30B展示对在容器中孵育0周及4个月的以上鉴定的制剂的HIAC测定的结果。计数10μm及25μm粒子。图30A及30B显示所有11F1制剂皆稳定，如用HIAC所测量。所有制剂的粒子计数皆在各粒度(10μm及25μm)的USP限度以下。10μm粒子的USP限度为每个容器6000个粒子，且对于25μm粒子为每个容器600个粒子。

实施例33

11F1结合特异性

这项测定的结果显示11F1结合PCSK9而不结合PCSK1、PCSK2、PCSK7或弗林蛋白酶，从而证明11F1对PCSK9具有特异性。

使于缓冲液A(25mM Tris，150mMNaCl，0.1％BSA，0.05％吐温，pH 7.5)中稀释的生物素化的PCSK9以0.2μg/mL的浓度结合于经中性链亲和素涂布的96孔板，在室温下孵育1小时。单独地，0.4μg/mL 11F1与各种浓度(在0至20μg/mL的范围内)的PCSK1、PCSK2、PCSK7、PCSK9或弗林蛋白酶(R&D Systems,Minneapolis,MN)(于无吐温的缓冲液A中稀释)一起在室温下孵育1小时。4.5μg/mL的弗林蛋白酶抑制剂与所有含弗林蛋白酶的反应物一起包括在内。经PCSK9涂布的抗生物素蛋白链霉亲和素板用缓冲液A洗涤且添加抗体/前蛋白转化酶混合物至板中并在室温下孵育1小时。在洗涤之后，通过依次与山羊-α-人类Fc-HRP(160ng/mL，于缓冲液A中稀释)(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)及TMB底物一起孵育来检测结合的抗体。用1N HCl终止反应且在450nm波长下在Spectramax Plus 384分光光度计(Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA)上读取吸光度。

这项测定依赖于溶液中的前蛋白转化酶与11F1竞争结合板捕捉的PCSK9的能力。11F1与PCSK9在溶液中预孵育以随剂量而变的方式且强力降低结合板捕捉的PCSK9的11F1的量，检测为降低的OD450(图31)。所有结果皆表示为平均OD450值±标准偏差相对于前蛋白转化酶的浓度。11F1与PCSK1、PCSK2、PCSK7或弗林蛋白酶在溶液中预孵育不显著影响11F1结合板捕捉的PCSK9。因此，在所研究的蛋白质浓度下，11F1仅结合PCSK9并且不结合所测试的其它前蛋白转化酶家族成员。

实施例33

11F1抑制LDLR:PCSK9结合的功效

所述实施例证明毫微摩尔浓度的11F1可在这项测定的条件下抑制D374Y与野生型PCSK9两者结合LDLR。

简单来说，透明384孔板用2μg/mL于PBS中稀释的山羊抗LDL受体抗体(R&DSystems,Minneapolis,MN)涂布，随后在4℃下孵育过夜。各板用缓冲液A(100mM二甲胂酸钠，pH 7.5)充分洗涤，然后在室温下用缓冲液B(含1％脱脂奶粉[Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA]的缓冲液A)阻断2小时。在洗涤之后，各板与0.4μg/mL的于缓冲液C(补充有10mM CaCl2的缓冲液B)中稀释的LDL受体(R&D Systems,Minneapolis,MN)一起在室温下孵育1.5小时。与此孵育同时，将20ng/mL生物素化的D374YPCSK9或100ng/mL生物素化的WTPCSK9与各种浓度的于缓冲液A中稀释的抗PCSK9抗体11F1(对于D374Y PCSK9测定，最终浓度在6.0ng/mL至200ug/mL的范围内，或对于WT PCSK9测定，最终浓度在3.1ng/mL至25ug/mL的范围内)一起孵育。洗涤经LDLR涂布的板且添加生物素化的PCSK9/抗体混合物。LDLR板在室温下孵育1小时。通过依次与抗生物素蛋白链霉亲和素-HRP(500ng/mL于缓冲液C中)及TMB底物一起孵育来检测生物素化的PCSK9与LDLR的结合。用1N HCl终止反应且在450nm波长下在Spectramax Plus 384分光光度计(Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA)上读取吸光度。使用GraphPad Prism(4.01版)软件绘制抗体浓度的对数相对于OD450的曲线以通过非线性回归确定IC50值。

11F1抑制LDLR:PCSK9结合。在D374Y PCSK9测定中，11F1的IC50值在7.3nM至10.1nM的范围内，平均值(±SD)为9.1nM±1.5nM(n＝3)。在野生型PCSK9测定中，11F1的IC50值在4.4nM至8.1nM的范围内，平均值(±SD)为5.9nM±1.9nM(n＝3)。应注意这些IC50值取决于结合测定中使用的重组D374Y PCSK9或WT PCSK9的量。D374Y测定与野生型测定两者的代表性剂量反应曲线分别呈现于图32及图33中。

实施例34

11F1在阻断细胞LDL摄取方面的功效

11F1在体外阻断PCSK9与LDLR之间的相互作用并且可防止HepG2细胞中由PCSK9介导的LDL摄取降低。

简单来说，人类HepG2细胞于补充有10％FBS及1％抗生素-抗霉剂溶液(MediatechInc.,Herndon,VA)的DMEM(Mediatech Inc.,Herndon,VA)中以每孔5×104个细胞的密度接种于黑色透明底部96孔板(Fisher Scientific CO LLC,Santa Clara,CA)中。细胞在37℃(5％CO2)下孵育过夜。为形成D374Y PCSK9与抗体之间或WT PCSK9与抗体之间的复合物，于配制缓冲液(25mMHEPES(pH 7.5)，0.15M NaCL)中制备666.7nM至0.7nM(对于阻断D374YPCSK9)或3.3μm至3.3nM(对于阻断WT PCSK9)的11F1连续稀释液(1:2)。D374Y PCSK9(2μg/mL)或WT PCSK9(25μg/mL)于摄取缓冲液(含有1％FBS的DMEM)中稀释且与各种浓度的11F1或单独摄取缓冲液(阴性对照)一起在室温下在震荡下孵育1小时。BODIPY-LDL(Invitrogen,Carlsbad,CA)于摄取缓冲液中稀释至12μg/mL的浓度。在孵育过夜之后，HepG2细胞用DPBS(Mediatech Inc.,Herndon,VA)冲洗两次。添加25微升的D374YPCSK9或WTPCSK9与11F1的复合物及25μL稀释的BODIPY-LDL(Invitrogen,Carlsbad,CA)至细胞中且在37℃(5％CO2)下孵育3小时。细胞用DPBS洗涤5次且重悬于100μL DPBS中。使用Safire板读取器(Tecan Systems Inc.,San Jose,CA)在480至520nm(激发)及520至600nm(发射)下检测荧光信号且表示为相对荧光单位(RFU)。

使用GraphPad Prism(4.02版，GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)软件绘制抗体浓度的对数相对于RFU的曲线且通过使用S形剂量-反应(可变斜率)曲线拟合程序进行非线性回归来确定EC50值。

这个实施例显示11F1以随剂量而变的方式阻断HepG2细胞中由D374Y PCSK9或WTPCSK9介导的LDL摄取降低。添加重组纯化的D374Y PCSK9(2μg/mL)或WT PCSK9(25μg/mL)至HepG2细胞中分别使对BODIPY-LDL的摄取降低至未治疗细胞中所测量到的水平的约50至60％及约40％。抗体以随剂量而变的方式使LDL摄取恢复至未治疗细胞中所观测到的水平。11F1阻断D374Y PCSK9介导的LDL摄取降低的能力的平均(±SD)EC50值为35.3±9.1nM(n＝6，图34)。11F1阻断WT PCSK9介导的LDL摄取降低的能力的EC50值为124.2±28.5nM(n＝3，图35)。应注意这些EC50值随细胞测定中使用的重组D374Y PCSK9或WT PCSK9的量而变。针对D374Y PCSK9的EC50值低于针对WT PCSK9的EC50值，因为测定中使用较少D374Y PCSK9，原因为其对LDLR的结合亲和力为WT PCSK9对LDLR的结合亲和力的5至30倍(Cunningham等，2007；Fisher等，2007；Kwon等，2008)。

此处报道的EC50值代表由对11F1的3至6个各别测量结果获得的平均值。

实施例35

11F1及8A3阻断小鼠模型中经由腺相关病毒表达的人类PCSK9的功效

单一静脉内快速施用抗PCSK9抗体11F1或8A3致使由AAV表达人类PCSK9的小鼠中的血清非HDL-C及TC显著降低。这个实施例证明两种抗PCSK9抗体在体内阻断人类PCSK9的功能的有效性。

简单来说，通过用编码人类PCSK9的改造的腺相关病毒(AAV)感染来产生120只表达人类PCSK9的C57BL/6小鼠，从而使循环低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高。使用Cobas Integra 400plus化学分析仪(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)进行血清胆固醇分析。将动物随机分成非HDL-C(LDL-C及VLDL-C)、HDL-C及TC的水平类似的治疗组。在治疗第0天(T＝0)，对一子组小鼠施以安乐死且收集血清以确定当天的基线水平。然后经由尾静脉注射以30mg/kg向其余小鼠施用11F1、8A3或抗匙孔螺血氰蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)IgG2对照抗体。在注射之后第1至5天，对数个子组的小鼠施以安乐死且从腔静脉收集全血并使其在室温下凝结30分钟。在用台式离心机在12,000rpm下离心10分钟之后，收集血清。使用Cobas Integra 400plus化学分析仪进行血清胆固醇分析。

使用夹心式ELISA测定来测定血清PCSK9浓度。透明96孔板用2μg/ml于1×PBS中稀释的单克隆抗PCSK9抗体(31H4)涂布过夜。各板用1×PBS/.05％吐温充分洗涤，然后用3％BSA/1×PBS阻断2小时。在洗涤之后，各板与于通用测定稀释剂(ImmunochemistryTechnologies,Bloomington,MN)中稀释的血清一起孵育2小时。重组人类PCSK9(1ng/ml至500ng/ml)被并行分析且用于生成关于各ELISA板的标准曲线。以1ug/ml(于1％BSA/PBS中)添加兔多克隆生物素化的抗PCSK9抗体(D8773，Amgen Inc,CA)，随后以200ng/ml(于1％BSA/PBS中)添加中性链亲和素-HRP。通过与TMB底物一起孵育检测结合的PCSK9。以添加1NHCl终止反应且在450nm下在Spectra Max Plus384分光光度计(Molecular Devices Inc,Sunnyvale,CA)上测量吸光度。使用在重组人类PCSK9情况下生成的标准曲线(4参数逻辑拟合)确定血清样品中PCSK9的相应浓度。

使用夹心式ELISA测定来测定血清抗体浓度。多克隆山羊抗人类Fc IgG及HRP标记的山羊抗人类IgG Fcγ多克隆试剂(均来自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc,West Grove,PA)分别用作捕捉抗体及检测抗体。3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB)底物溶液与过氧化物反应，且在辣根过氧化物酶(HRP)存在下生成与由捕捉试剂结合的各别抗PCSK9抗体的量成正比的比色信号。使用微板读取器(Spectra Max Plus 384)在450nm减去650nm下测量颜色的强度(光学密度，OD)。使用Watson 7.0.0.01版(Thermo Scientific,Waltham,MA)数据简化套件连同对各别制作的标准曲线进行罗吉斯(Logistic)(自动估计)回归来分析数据。测定的定量下限(LLOQ)为34.4ng/mL。

计算AAV小鼠中的药物动力学参数

使用WinNonlin Enterprise 5.1.1版(Pharsight,St.Louis,MO)对各受试者在预定额定时间点的血清浓度进行非隔室分析(NCA)。通过目视检查浓度-时间概况来选择用于估计终末消除速率常数及半衰期的数据点。报道的NCA参数包括：表观半衰期(t1/2)、从零时间点至末次测量浓度的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)、及表观血清清除率(CL0-t)。使用线性对数-线性梯形法确定AUC0-t，且通过剂量/AUC0-t计算CL0-t。对于11F1、8A3及31H4抗体，研究后剂量溶液分析显示实际剂量在30mg/kg目标的20％内。然而，对于IgG2对照，分析显示实际剂量仅为预定目标的40％。因此，IgG2对照的CL0-t计算使用校正的剂量12mg/kg。参数报道至3位有效数字，半衰期除外，其报道至2位有效数字。

统计分析

所有胆固醇结果皆表示为平均值±平均值标准误差。所有药物动力学数据皆表示为平均值±标准偏差。由单因子ANOVA确定的p值0.05用作确定抗KLH IgG2对照抗体注射动物与在相同时间点用抗PCSK9抗体给药的那些动物之间的统计显著性的阈值。

抗PCSK9抗体对血清非HDL-C、HDL-C及TC的影响

为建立基线，在注射抗体之前对一子组表达人类PCSK9的小鼠施以安乐死并收集血液。这些动物的非HDL-C、HDL-C及TC水平分别为33±4、117±4及183±9mg/dL(平均值±SEM)。测定首次接受实验的动物的PCSK9的水平为4921ng/mL±2044ng/mL。

相较于用抗KLH IgG2对照抗体注射的小鼠(对照动物)，注射11F1在注射后第1、2及4天使得非HDL-C显著降低(最大值为59％)，而TC仅在第4天显著降低(降低了22％)(图36，图37)。在任何时间点皆未观测到显著的HDL-C降低(图38)。

相较于对照动物，注射8A3在注射后第1、2及4天使得非HDL-C显著降低(最大值为65％)，而TC仅在注射后第2天显著降低(最大值为24％)(图36，图37)。在任何时间点皆未观测到显著的HDL-C降低(图38)。

药物动力学

在30mg/kg的静脉内剂量下，11F1及8A3具有极类似的药物动力学特性(图39)。对于这两种分子，AUC0-t暴露量、估计的CL0-t及表观半衰期是相等的(图40的表)。抗KLHIgG2对照抗体的AUC0-t暴露量出乎意料地低于11F1及8A3，但这可能归因于施用的抗体的剂量低于预定剂量(12mg/kg对比于30mg/kg)；剂量溶液分析显示抗体浓度为目标的40％。当使用校正剂量计算时，抗KLH IgG2对照抗体CL0-t类似于11F1及8A3的CL0-t，并且抗KLHIgG2对照抗体的表观半衰期据估计为>120小时。这些数据表明当相较于在AAV模型中给药的其它抗体时，对于11F1及8A3，PCSK9配体对抗体处置的影响较不明显，因为11F1及8A3CL0-t值更类似于抗KLH IgG2对照抗体。

概述

在小鼠中由AAV表达人类PCSK9(约5μg/mL)产生约33mg/dL的血清非HDL-C水平。在30mg/kg注射11F1之后，在注射后第1、2及4天观测到血清非HDL-C的显著降低(相较于对照动物，最大值为59％)。仅在第4天观察到TC显著降低。注射8A3引起类似的非HDL-C降低样式，其中相较于对照动物，最大值为65％。然而，8A3施用仅在注射后第2天引起显著TC降低，其中最大值为24％。未观测到施用11F1或8A3的动物的HDL-C的显著降低。对11F1及8A3的血清抗体水平的分析显示与抗KLH IgG2对照抗体类似的概况。

实施例36

11F1、21B12及8A3的单次皮下给药对食蟹猕猴的血清脂质的影响

向食蟹猕猴单次SC施用11F1、8A3或21B12使得血清LDL-C及TC显著降低。这项研究证明了抗PCSK9抗体降低非人类灵长类动物的血清胆固醇的能力。

简单来说，在实验之前使首次接受实验的雄性食蟹猕猴适应其环境至少2周。动物基于其血清TC、HDL-C、LDL-C及甘油三酯水平及其体重的预筛选随机分入各治疗组。1周之后，使动物禁食过夜，且从周边血管结构(头静脉或隐静脉)采血以测量在指定为T＝0的时间点的基线血清脂质水平。然后用抗KLH IgG2对照抗体、11F1、21B12或8A3(皆于10mMNaOAc(pH 5.2)、9％蔗糖中)以0.5mg/kg(皆以每公斤体重0.4mL)SC注射动物。接着历经45天在指定的时间点从动物收集空腹血液样品。

实验设计

在指定时间点，在禁食过夜条件下从周边血管结构(头静脉或隐静脉)收集动物血液。使全血在室温下凝结30分钟。在3,000rpm下离心20分钟后，收集血清。使用CobasIntegra 400分析仪(Roche Diagnostics Inc,Indianapolis,IN)进行直接血清胆固醇分析。在指定时间点(第0、3、6、15、24及33天)用以下方法通过Anilytics(MD)测定载脂蛋白B血清水平。使用17μL样品的等分试样(不制备)利用Hitachi 717分析仪使用6点标准曲线进行分析。如果样品的初始值高于标准曲线线性，那么稀释样品并重复分析，结果乘以适当稀释因子。用于所述测定的试剂(APO-B试剂盒#86071、抗体套装#86060、对照套装#86103)是从DiaSorin(Stillwater,MN)获得。

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定血清中的抗体浓度，测定范围为34.4至3000ng/mL(34.4ng/mL为定量下限[LLOQ])。

使用

LIMS 7.0.0.01版(Thermo Scientific,Waltham,MA)对各受试者在预定额定时间点的血清浓度进行非隔室分析(NCA)。通过目视检查浓度-时间概况及最佳线性拟合来选择用于估计终末消除速率常数及半衰期的数据点(通常从360小时直至抗体浓度降低至定量下限以下)。报道的NCA参数包括：终末半衰期(t1/2，z)、最大血清浓度(Cmax)、从零时间点至∞的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-∞)、及表观血清清除率(CL/F)。使用线性对数-线性梯形法计算AUC0-∞。所有参数皆报道至3位有效数字，半衰期除外，其报道至2位有效数字。

统计分析

考虑基线为共变量且治疗组为固定效应的统计模型相对于LDL-C、HDL-C、TC及甘油三酯在各时间点时的对数变换反应进行拟合。应用塔基氏多重比较校正(Tukey'smultiple comparison correction)来调整在各时间点的成对比较。使用调整过的p值在α＝0.05下评价统计显著性。

11F1、21B12及8A3对血清LDL胆固醇的影响

在注射之后9天观测到11F1达成的最大LDL-C降低，相较于抗KLH IgG2对照抗体治疗的猴(对照动物)，LDL-C降低57％。直至第27天，LDL-C返回至与对照动物中观测到的水平类似的水平。在注射之后3天观测到21B12达成的最大LDL-C降低，相较于对照动物，LDL-C降低64％。直至第6天，LDL-C返回至与对照动物类似的水平。在注射之后4天观测到8A3达成的最大LDL-C降低，相较于对照动物，LDL-C降低54％。直至第27天，LDL-C返回至与对照动物中观测到的水平类似的水平(图41)。

11F1、21B12及8A3对血清总胆固醇的影响

在注射之后9天观测到11F1达成的最大TC降低，相较于抗KLH IgG2对照抗体治疗的猴(对照动物)，TC降低27％。直至第27天，TC返回至与对照动物中观测到的水平类似的水平。在注射之后3天观测到21B12达成的最大TC降低，相较于对照动物，TC降低20％。直至第4天，TC短暂返回至与媒介物治疗的猴中观测到的水平类似的水平，但在第14天与第18天之间(包括第14天及第18天)显著较低。在注射之后9天观测到8A3达成的最大TC降低，相较于对照动物，TC降低22％。直至第30天，TC返回至与对照动物中观测到的水平类似的水平(图42)。

11F1、21B12及8A3对血清HDL胆固醇及甘油三酯的影响

平均来说及在各时间点，用11F1或8A3治疗的动物的HDL-C或甘油三酯水平并不显著不同(基于α＝0.05显著性水平)于抗KLH IgG2对照抗体治疗的猴中所观测到的。然而，21B12在单一时间点(在注射后第18天)确实诱导HDL-C的统计显著变化(图43及图45)。

11F1、21B12及8A3对载脂蛋白B(ApoB)的影响

在注射后第3、6、15、24及33天测量血清ApoB水平。相较于抗KLH IgG2对照抗体治疗的猴，11F1及8A3在第3至24天使ApoB降低(图46)。21B12仅在第3天使ApoB水平发生统计显著降低。

11F1、21B12及8A3的药物动力学概况

由治疗达成的平均浓度-时间概况的概要图展示于748中。接受11F1、21B12、8A3及抗KLH IgG2对照抗体的动物的估计的平均药物动力学参数显示于图47的表中。

所有组中的抗体吸收皆一致且呈现皮下抗体施用的特征。21B12关于CL/F、Cmax及AUC0-∞的药物动力学特性与21B12在相同剂量下施用的先前研究中所观测到的一致。11F1及8A3的药物动力学显著不同于21B12，其中观测到CL/F较低(约为21B12CL/F的15％)且估计半衰期更长(约200小时，相较于21B12的40小时)。值得注意的是，11F1及8A3的药物动力学彼此之间以及与抗KLH IgG2对照抗体均无区别。鉴于11F1及8A3与对PCSK9无亲和力的抗KLH IgG2对照抗体具有相同暴露概况，这些数据表明11F1及8A3的处置受与PCSK9目标缔合影响的程度远小于21B12。

结果概述

历经45天研究过程，观测到相较于抗KLH IgG2对照抗体，施用11F1、21B12或8A3的动物的TC及LDL-C发生统计显著降低。从第2天至第24天(包括第2天及第24天)，11F1使LDL-C发生统计显著降低(相对于抗KLH IgG2对照抗体)。从第1天至第4天(包括第1天及第4天)，21B12显示LDL-C的统计显著降低(相对于抗KLH IgG2对照抗体)。从第1天至第24天(包括第1天及第24天)，8A3显示LDL-C的统计显著降低(相对于抗KLH IgG2对照抗体)。对于所有组，TC及ApoB的变化反映所观测到的LDL-C变化。11F1在注射后9天达成最大LDL-C降低(相对于在相同时间点的抗KLH IgG2对照抗体)(-57％)。21B12在注射后3天达成最大LDL-C降低(相对于在相同时间点的抗KLH IgG2对照抗体)(-64％)。8A3在注射后4天达成最大LDL-C降低(相对于在相同时间点的抗KLH IgG2对照抗体)(-54％)。21B12在单一时间点，即，在注射之后18天使HDL-C降低。在施用11F1或8A3之后，未观测到HDL-C水平的统计显著变化。在施用11F1、21B12或8A3之后，未观测到甘油三酯水平的统计显著变化。

以引用的方式并入

如果本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书及其类似参考文献及其中引用的参考文献尚未以引用的方式整体并入本文，那么其据此以引用的方式整体并入本文。如果以引用的方式并入的参考文献中提供的任何定义或术语不同于本文提供的术语及论述，那么以本文的术语及定义为准。

等效物

上述书面说明书被视为足以使本领域技术人员能够实施本发明。上述描述及实施例详述本发明的某些优选实施方案且描述发明者所预期的最佳方式。然而，应了解无论上述事项在文中可能如何详述，本发明皆可以许多方式实施且本发明应根据随附权利要求及其任何等效物加以解释。

Claims (20)

1.一种稳定的制剂，其包含：

特异性结合PCSK9的单克隆抗体，其中PCSK9包含SEQ ID NO 1的氨基酸，所述单克隆抗体的量为100 mg/ml至150 mg/ml；及

量为0.05 mM至40 mM的药学上可接受的缓冲剂；及

量为0.004% w/v至20% w/v的药学上可接受的表面活性剂；及

0.5% w/v至10% w/v的至少一种药学上可接受的稳定剂，其中所述药学上可接受的稳定剂选自脯氨酸、蛋氨酸、牛磺酸以及苯甲醇，且

所述稳定的制剂的pH在4.0至6.0之间，

其中所述单克隆抗体包含：

SEQ ID NO: 23中CDRL1序列的轻链互补决定区(CDR)、SEQ ID NO: 23中CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID NO: 23中CDRL3序列的CDRL3，以及SEQ ID NO: 49中CDRH1序列的重链互补决定区(CDR)、SEQ ID NO: 49中CDRH2序列的CDRH2和SEQ ID NO: 49中CDRH3序列的CDRH3。

2.一种稳定的制剂，其包含：

特异性结合PCSK9的单克隆抗体，其中PCSK9包含SEQ ID NO 1的氨基酸，所述单克隆抗体的量为100 mg/ml至150 mg/ml；及

量为0.05 mM至40 mM的药学上可接受的缓冲剂；及

量为0.004% w/v至20% w/v的药学上可接受的表面活性剂；及

0.5% w/v至10% w/v的至少一种药学上可接受的稳定剂，其中所述药学上可接受的稳定剂选自脯氨酸、蛋氨酸、牛磺酸以及苯甲醇，且

所述稳定的制剂的pH在4.0至6.0之间，且

其中所述单克隆抗体包含：

SEQ ID NO: 23中CDRL1序列的轻链互补决定区(CDR)、SEQ ID NO: 23中CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID NO: 23中CDRL3序列的CDRL3，以及SEQ ID NO: 49中CDRH1序列的重链互补决定区(CDR)、SEQ ID NO: 49中CDRH2序列的CDRH2和SEQ ID NO: 49中CDRH3序列的CDRH3，并且

其中所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO: 23具有至少97%同一性并且所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO: 49具有至少97%同一性。

3.如权利要求1或2所述的稳定的制剂，其中

a) 所述重链包含：包含SEQ ID NO: 308的CDR1、包含SEQ ID NO: 175的CDR2和包含SEQ ID NO: 180的CDR3；或

b) 所述重链包含：包含SEQ ID NO: 368的CDR1、包含SEQ ID NO: 175的CDR2和包含SEQ ID NO: 180的CDR3；和/或

c) 所述轻链包含：包含SEQ ID NO: 158的CDR1、包含SEQ ID NO: 162的CDR2和包含SEQ ID NO: 395的CDR3。

4.如权利要求1-2中任一项所述的稳定的制剂，其中每个CDR根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义的组合、AbM定义或CDR的接触定义来定义；优选地，每个CDR根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义来定义。

5.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述单克隆抗体包含：

包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的重链可变区。

6.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述单克隆抗体还包含：

(a) SEQ ID NO: 156的轻链恒定序列；

(b) SEQ ID NO: 157的轻链恒定序列；

(c) SEQ ID NO: 154的重链恒定序列；

(d) SEQ ID NO: 155的重链恒定序列；

(e) SEQ ID NO: 156的轻链恒定序列和SEQ ID NO: 154的重链恒定序列；

(f) SEQ ID NO: 157的轻链恒定序列和SEQ ID NO: 154的重链恒定序列；

(g) SEQ ID NO: 156的轻链恒定序列和SEQ ID NO: 155的重链恒定序列；或

(h) SEQ ID NO: 157的轻链恒定序列和SEQ ID NO: 155的重链恒定序列。

7.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述药学上可接受的缓冲剂选自由以下组成的组：谷氨酸盐、磷酸盐、磷酸盐缓冲盐水、乙酸钠、柠檬酸钠、以及三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(Tris buffer)。

8.如权利要求7所述的稳定的制剂，其中所述药学上可接受的缓冲剂为乙酸钠。

9.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述药学上可接受的缓冲剂以10-20 mM的量存在。

10.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述药学上可接受的表面活性剂为聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20；任选地，所述药学上可接受的表面活性剂以0.004% w/v至0.01% w/v的量存在。

11.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述稳定剂为

a) 牛磺酸，其以介于1%至2% w/v之间的量存在；或

b) 脯氨酸，其以介于2%至3% w/v之间的量存在；或

c) 苯甲醇，其以介于1%至3% w/v之间的量存在。

12.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中

a) 所述制剂的pH介于5.0至5.5之间；

b) 所述制剂包括在25℃下30 cP或更小的粘度；

c) 所述制剂包括在25℃下12 cP或更小的粘度；和/或

d) 所述制剂包括介于250 mOsmol/kg至350 mOsmol/kg之间的重量摩尔渗透压浓度。

13.如权利要求1-3中任一项所述的稳定的制剂，其中所述稳定的制剂保持稳定持续至少3、6、12或24个月。

14.如权利要求1所述的稳定的制剂，其包含：

(a) 量为100 mg/ml至150 mg/ml的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：

i) 包含与SEQ ID NO: 23的序列具有至少97%同一性的氨基酸序列的轻链可变区和包含与SEQ ID NO: 49的序列具有至少97%同一性的氨基酸序列的重链可变区，

ii) SEQ ID NO: 23中CDRL1序列的轻链互补决定区(CDR)、SEQ ID NO: 23中CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID NO: 23中CDRL3序列的CDRL3，以及SEQ ID NO: 49中CDRH1序列的重链互补决定区(CDR)、SEQ ID NO: 49中CDRH2序列的CDRH2和SEQ ID NO: 49中CDRH3序列的CDRH3，或

iii) 包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO: 49的氨基酸序列的重链可变区；

(b) 10-20 mM乙酸钠；

(c) 介于2.0%至3.0% w/v之间的脯氨酸；

(d) 0.01% w/v聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；和

(e) 5.0至5.5的pH。

15.如权利要求14所述的稳定的制剂，其包含：

(b) 20 mM乙酸钠；

(c) 介于2.0%至3.0% w/v之间的脯氨酸；

(d) 0.01% w/v聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；和

(e) 5.0的pH。

16.如权利要求15所述的稳定的制剂，其包含：(a) 120 mg/ml或(b) 140mg/ml的所述单克隆抗体。

17.如权利要求1-16中任一项所述的稳定的制剂在制备用于治疗或预防患者的胆固醇相关疾病的药物中的用途。

18.如权利要求17所述的用途，其中所述胆固醇相关疾病选自由以下组成的组：家族性高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、升高的脂蛋白(a)、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管疾病、阿兹海默症、外周动脉疾病、高脂血症和血脂异常。

19.如权利要求18所述的用途，其中所述家族性高胆固醇血症包括杂合子家族性高胆固醇血症和纯合子家族性高胆固醇血症。

20.如权利要求17-19中任一项所述的用途，其中，包括向患者施用以下剂量：

(a) 每两周一次(Q2W)的高达140 mg的所述抗体；

(b) 每两周一次(Q2W)的高达420 mg的所述抗体；或

(c) 每四周一次(Q4W)的高达420 mg的所述抗体。

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