CN114344460A - 含有抗pcsk9抗体的稳定制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有高浓度抗PCSK9抗体的稳定的制剂，该制剂包括治疗有效剂量的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段、药学上可接受的缓冲剂、渗透压调节剂和/或表面活性剂，所述的制剂具有长期稳定性。当所述制剂为液体制剂或冻干制剂复溶后的液体制剂时，其具有低粘度和长期稳定性。本发明还提供了所述制剂的制备方法，及其在制备治疗、预防和/或改善任何与PCSK9相关疾病或症状的药物中的用途。

Description

含有抗PCSK9抗体的稳定制剂及其制备方法和用途

本申请主张2020.10.13日提交的中国申请号为CN202011092207.8、发明名称为含有抗PCSK9抗体的稳定制剂及其制备方法和用途的优先权。

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体的，本发明涉及一种含有抗PCSK9抗体的稳定制剂及其制备方法，以及该稳定制剂在用于治疗、预防或改善与PCSK9活性相关疾病的药物中的用途。

背景技术

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)，也称作神经细胞凋亡调节转化酶1(NARC-1)，是丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(S8)家族中的激素原- 前蛋白转化酶，其表达于具有增殖和分化能力的细胞中，包括肝细胞、肾间质细胞、回肠与结肠上皮细胞和胚胎端脑神经元等。研究发现PCSK9在肝细胞和神经细胞的分化中发挥作用，其不仅可以特异性作用于胆固醇生物合成或摄取，而且循环PCSK9可以直接与肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，与LDLR一起被肝细胞吞噬，促进LDLR在肝细胞中降解，阻碍LDLR的循环使用，从而增加血浆中 LDL胆固醇(LDL-C)的含量，而LDL-C表达升高与人类血脂异常及心血管相关疾病密切相关。由此可见，PCSK9是胆固醇稳态和循环低密度脂蛋白(LDL)水平的关键调节因子。此外，PCSK9具有多种突变体，包括S127R、N157K、F216L、R218S及D374Y，其中S127R、F216L及D374Y与常染色体显性高胆固醇血症(ADH)相关，该病症是遗传性代谢紊乱，其特征为血浆中LDL浓度和胆固醇水平显著增加，从而导致早发性心血管疾病。当PCSK9功能被抑制后，肝细胞表面的LDLR数量增加，以清除更多的循环LDL，并且血浆胆固醇水平也相应降低。因此，抑制PCSK9作用可有效降低血浆LDL水平，由此，PCSK9成为了治疗动脉粥样硬化、冠心病、高胆固醇血症及血脂异常等疾病的潜在靶标。

抗PCSK9单克隆抗体可特异性靶向结合PCSK9，通过抑制PCSK9与肝细胞表面的LDLR相互作用，减少LDLR的内吞和降解，可显著降低循环LDL-C的浓度。抗PCSK9单抗具有特异性强、安全性好、用药方便等优势，在治疗高胆固醇血症、高血脂及其相关的心血管疾病等领域中具有重要的临床应用前景。

CN201710816808.0公开了一种新颖的针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型(PCSK9)的单克隆抗体。

治疗性抗PCSK9抗体与其他大分子治疗剂一样，不仅需要配制为适合于给药的药物溶液，而且需要在制造、储存以及之后的使用过程中保持其稳定性。但是治疗性抗体溶液在制造或储存过程中会受到物理和化学不稳定因素(例如聚集、变性、交联、脱酰胺化、异构化、氧化和剪切等)的影响。因此，在配制抗体液体制剂的稳定性不仅取决于制剂中辅料的类型，还取决于有效治疗成分与辅料以及辅料之间的相对用量和比例。

心血管相关病症作为慢性疾病，其患者若能够在家自行用药的话，抗体药物皮下注射便成为其首选的给药方式。

由于细胞外基质的存在，药物流动性受到限制，通常情况下皮下注射体积一般限定在1-2mL，抗体制剂浓度需达到100mg/mL以上才能满足临床用药剂量的要求，但是高浓度抗体蛋白一方面会增加可溶性和不溶性蛋白质-蛋白质聚集体和颗粒沉淀物，从而导致制剂稳定性差，同时蛋白构象的不稳定也会引起化学性质，如电荷异质性的显著变化，对下游工艺(例如，超滤和无菌过滤)和储存期间质量稳定性产生不良影响；另一方面，高浓度蛋白由于蛋白质作为大分子物质以及分子间相互作用，会导致蛋白粘度增加，限制了蛋白药物递送装置的选择以及对药物通过注射装置皮下给药所带来的诸如不易推注、注射疼痛和灼热感等诸多问题，从而影响了患者用药的依从性；第三方面，对于期望用于皮下施用的高浓度蛋白的液体制剂，需要添加高浓度的稳定剂(例如糖类、多元醇、氨基酸、络合剂、表面活性剂等)，以实现蛋白质长期稳定性。但是所得到的溶液制剂通常会因为组织损害而引起注射疼痛。

CN201380035382.5公开了一种稳定的制剂，其包含：至少一种特异性结合PCSK9的单克隆抗体，其中PCSK9包含所述发明专利SEQ ID NO.1的氨基酸，所述单克隆抗体的量为约40mg/ml至约 300mg/ml；及量为约0.05mM至约40mM的药学上可接受的缓冲剂；及量为约0.01％w/v至约20％w/v 的药学上可接受的表面活性剂；及约0.5％w/v至约10％w/v的至少一种药学上可接受的稳定剂，其中所述稳定的制剂的pH在约4.0至约6.0之间。

CN201280037861.6公开了一种医药配制剂，含有：(i)一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(人PCSK9)特异性结合的抗体；(ii)一种pH值为6.0±0.3的缓冲剂；(iii)一种非离子型去污剂；以及(iv)一种稳定剂。

CN201710816808.0所记载的抗体由于物质特性与现有技术CN201380035382.5和CN201280037861.6 的抗体存在较大不同，采用相应制剂方案难以解决前述皮下注射液体制剂所存在的问题。

因此，亟需开发一种高浓度、低粘度、等渗、具有长期稳定性、制备工艺简单、易于质量控制以及方便患者皮下给予使用的抗PCSK9抗体制剂。

发明内容

本发明从解决现有技术的不足出发，提供了一种含有抗PCSK9抗体的稳定制剂，该制剂具有适于皮下注射给药的低粘度的高浓度抗体、具有长期稳定性以及患者依从性高等特点。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

一方面，本发明提供一种含有抗PCSK9抗体的稳定的制剂，其包含：

(1)浓度为50-200mg/mL抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；和

(2)浓度为1-50mmol/L(mM)的药学上可接受的缓冲剂；和

(3)浓度为0-0.1％w/w的药学上可接受的表面活性剂；和

(4)浓度为100-400mmol/L(mM)或1-10％w/w的一种以上其他药学上可接受的赋形剂。

所述制剂可以是液体制剂，也可以是冻干等可以复溶为液体的制剂剂型；优选为液体制剂。

所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段可特异性结合至PCSK9蛋白，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选可以规模化生产具有均质性的单克隆抗体。所述的单克隆抗体不限于人、鼠、兔、绵羊、骆驼、猴等的单克隆抗体，也可以是嵌合抗体、人源化抗体、全人源单克隆抗体等重组型抗体，优选全人源单克隆抗体，所述的全人源单克隆抗体由宿主细胞或转基因动物生产。

具体地，本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区(HCDRs)和轻链互补决定区(LCDRs)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列包含与SEQ IDNO:1,2和3所示的氨基酸序列具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或 100％的同一性；LCDR1、LCDR2和LCDR3包含与SEQ ID NO:4，5和6所示的氨基酸序列具有至少 85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性。

所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％,99％或100％的同一性；轻链可变区包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％,86％, 87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性。

所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含通过二硫键连接的重链和轻链，所述重链包含通重链可变区和重链恒定区，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，所述重链可变区的C末端连接至重链恒定区的N末端，所述轻链可变区的C末端连接至轻链恒定区的N末端，所述重链可变区和轻链可变区包含上文所述的氨基酸序列。所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，优选地，IgG1 或IgG4恒定区，更优选的是IgG4恒定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述轻链恒定区选自人κ轻链恒定区或λ轻链恒定区，优选κ轻链恒定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含两条重链和两条轻链或由两条重链和两条轻链组成，其中，每条重链包含上述的重链恒定区、重链可变区或CDR序列，且每条轻链包含上述的轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列。所述抗体还可以是单链可变片段(scFv)抗体、或抗体片段(例如Fab或F(ab’)₂片段)。优选地，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的重链具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为50-200mg/mL。在另一个实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为70-200mg/mL。在另一个实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为70mg/mL。在一个具体的实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为70mg/mL。在一个具体的实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为140mg/mL。在一个具体的实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为 200mg/mL。

所述的药学上可接受的缓冲剂选自：组氨酸、醋酸盐、琥珀酸盐、或谷氨酸盐。

作为本发明的优选技术方案，所述的缓冲剂是组氨酸缓冲剂。在一个具体的实施方式中，所述的缓冲剂是由L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂，所述的L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐的浓度 (摩尔)比为0.2∶1-3∶1。在一个实施方式中，所述的缓冲剂是醋酸盐缓冲剂。在一个具体的实施方式中，所述的缓冲剂是由醋酸和醋酸钠组成的醋酸盐缓冲剂。当选择磷酸盐和柠檬酸盐作为缓冲剂应用于本发明制剂在皮下注射时容易引起疼痛反应，患者用药的依从性因此受到较为明显影响。

所述的药学上可接受的缓冲剂浓度为1-50mmol/L。在一个实施方式中，所述的缓冲剂浓度为 5-50mmol/L。在一个实施方式中，所述的缓冲剂浓度为10-30mmol/L。在一个具体的实施方式中，所述的缓冲剂浓度为20mmol/L。

所述的稳定的液体制剂的pH值为4.5-6.5。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂的pH值为 4.5-5.5。在一个具体的实施方式中，所述的稳定的液体制剂的pH值为4.5，5.0或6.0。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂的pH值为5.0-6.0。在一个具体的实施方式中，所述的稳定的液体制剂的pH 值为5.0，5.5或6.0。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂的pH值为5.5-6.5。在一个具体的实施方式中，所述的稳定的液体制剂的pH值为5.5，6.0，6.2，6.3或6.5。

组氨酸分子结构中含有一个咪唑基，其pKa在6.0左右具有pH敏感性，当环境pH＜6.0时，可发生质子化作用，表现为亲水性；当环境pH＞6.0时，发生去质子化作用，表现为疏水性。

尽管组氨酸具有pH敏感性且易于氧化，但是本发明人惊奇地发现当本发明的制剂使用L-组氨酸/L- 组氨酸盐酸盐作为缓冲体系且pH值维持在5.5-6.5之间时具有很好的依从性和质量稳定性，比如，相对于使用pH值较低的醋酸盐缓冲体系(pKa为4.76)来说，在皮下注射给药时可以显著降低患者的疼痛感，而对于需要长期用药的慢性疾病患者来说，使用L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐的液体制剂可提高患者用药的依从性；此外，当选用L-组氨酸/L-组氨酸盐酸盐缓冲体系且pH值为5.5-6.5时，还可以降低本发明液体制剂的抗体粘度至15cp以下，甚至是10cp以下，并且可降低抗体在储存过程中的降解率，具有更优的稳定性。然而，当选择pH＜5.5时，酸催化的水解加速导致水解物形成速度加快。

所述的稳定的液体制剂的其他赋形剂选自脯氨酸、蔗糖、海藻糖、氯化钠、山梨醇、甘露醇、或盐酸精氨酸中的任意一种或其组合。在一个具体的实施方式中，所述的其他赋形剂是蔗糖，其浓度为1％-10％ (w/w)，优选5％-10％(w/w)，更优选6％(w/w)。作为本发明的优选技术方案，所述的其他赋形剂是脯氨酸。在一个具体的实施方式中，所述的其他赋形剂是脯氨酸，其浓度为100-400mmol/L，优选 200-300mmol/L，更优选250mmol/L。

所述的稳定的液体制剂渗透压为220-370mOsmol/kg。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂渗透压为250～350mOsm/Kg。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在25℃的渗透压为300-330 mOsm/Kg。

本发明通过大量的实验发现：当选用脯氨酸作为本发明赋形剂之一时，不仅由于脯氨酸具有生物相容性可以将本发明液体制剂的渗透压维持在250-350mOsm/Kg，而且还可以在所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段表面形成水化层来稳定抗体蛋白而不会破坏其结构，并且还可以防止抗体蛋白自身的相互作用或其它物质对其作用，以降低所述液体制剂中高浓度抗体的粘度和变性作用，从而有利于提高液体制剂的稳定性和流动性，以及患者皮下给药时的依从性。脯氨酸作为本发明制剂的最适宜的赋形剂之一，其能够避免给药时发生溶血或刺激性，有效保证了注射制剂的使用安全性和稳定性。

所述的稳定的液体制剂的表面活性剂是非离子型表面活性剂，选自聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(例如聚山梨酯80、聚山梨酯60、聚山梨酯40、或聚山梨酯20)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(例如泊洛沙姆，Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)。作为本发明的优选技术方案，优选聚山梨酯80 或聚山梨酯20，更优选聚山梨酯80。所述的表面活性剂浓度为0-1％(w/w)，优选0.01-0.05％(w/w)，更优选0.01％(w/w)、0.02％(w/w)和0.04％(w/w)。本发明中，采用所述使用量的非离子型表面活性剂可以通过降低界面相互作用防止蛋白质吸附和蛋白质之间的相互作用以及防止蛋白质于包材内表面相互作用，从而在制备和储存过程中达到稳定抗体的目的。

本发明通过大量的实验发现：当选用聚山梨酯80或聚山梨酯20作为本发明液体制剂的表面活性剂时，可以降低本发明抗PCSK9抗体或其抗原结合片段在搅动和摇晃过程中发生聚集，防止所述抗体吸附到容器表面，满足本发明的液体制剂皮下注射给药的要求。此外，聚山梨酯80还因为其结构里有双键，使其具有凝固点低(其它常温下都是结固状态)便于使用的特点。此外，聚山梨酯80或聚山梨酯20稳定抗体的能力还与其浓度相关。在本发明的液体制剂中聚山梨酯80或聚山梨酯20的浓度高于0.01％(w/w) 时能够抑制由振摇所引起的抗体聚集，低于所述浓度的聚山梨酯80或聚山梨酯20则不能降低由振摇所引起的蛋白不稳定，而高于0.05％(w/w)则不能显著提高抗体的稳定性。

本发明选用上述赋形剂种类和浓度时，所述的稳定的液体制剂在25℃的粘度约为1～20厘泊(cp)。作为本发明的优选技术方案，所述的稳定的液体制剂在25℃的粘度小于15cp。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在25℃的粘度约为5～15cp。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在25℃的粘度约为6～14cp。在一个具体的实施方式中，所述的稳定的液体制剂在25℃的粘度约为6.0cp、8.0cp、9.0cp、 10.0cp、11.0cp、12.0cp。在一个具体的实施方式中，所述的稳定的液体制剂在25℃的粘度约为9.0cp。

所述的稳定的液体制剂在约5℃至约40℃条件下可以储存至少2周至36个月，例如约5℃、约25℃或约40℃条件下储存至少2周、至少4周、至少8周、至少12周、至少6个月、至少9个月、至少12 个月、至少18个月、至少24个月或36个月。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在2-8℃条件下储存至少4周、至少8周、至少12周、至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少 18个月、至少24个月、至少36个月，或更长时间后，或在约25℃储存至少2周、至少4周、至少12 周，或更长时间后，或在40℃储存至少2周、至少4周或更长时间后，用SEC-HPLC法检测，抗PCSK9 抗体或其抗原结合片段的聚集体增加不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、2％、1.3％、1.2％、1.1％、 1.0％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.1％，抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的降解物(例如片段)增加不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、2％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.1％。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在2-8℃条件下储存至少4周、至少8周、至少12 周、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月，或更长时间后，或在约25℃储存至少2周、至少4周、至少12周，或更长时间后，或在40℃储存至少2周、至少 4周或更长时间后，用还原型CE-SDS法(rCE-SDS)和非还原型CE-SDS(nrCE-SDS)检测，抗PCSK9 抗体或其抗原结合片段的纯度降低不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、2％、1.0％、0.5％、0.2％或0.1％。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在2-8℃条件下储存至少4周、至少8周、至少12 周、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月，或更长时间后，或在约25℃储存至少2周、至少4周、至少12周，或更长时间后，或在40℃储存至少2周或更长时间后，用CEX-HPLC法检测，抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的酸碱电荷异质体不超过50％，其中碱性抗体不超过约30％，例如不超过约29％、25％或22％，酸性抗体不超过20％，例如不超过19％、17％、 15％或10％。在一个实施方式中，所述的稳定的液体制剂在约25℃或约40℃条件下储存至少2周或4周后，用非还原性Caliper检测，抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的纯度下降不超过5％，例如不超过5％、 4％、3％、2％、1％或0.5％。

所述的稳定的制剂为液体药物制剂，优选注射剂，更优选的是皮下注射剂或肌肉内注射剂，最优选的是皮下注射剂。

在一个优选的实施方式中，本发明的稳定的液体制剂包含：

(1)浓度为70-200mg/mL抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；及

(2)由浓度(摩尔)比为0.2∶1-3∶1的L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂；及

(3)浓度为0-0.05％w/w聚山梨酯80或聚山梨酯20；

(4)浓度为200-300mmol/L脯氨酸。

所述缓冲剂的浓度为1-50mmol/L(mM)，液体制剂的pH值为5.5-6.5。

其中所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的LCDR3。

更为具体地，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个更优选的实施方式中，本发明的稳定的液体制剂包含：

(1)浓度为70mg/mL或140mg/mL抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；及

(2)浓度为20mmol/L由L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂；及

(3)浓度为0.01-0.04％w/w聚山梨酯80或聚山梨酯20；及

(4)浓度为250mmol/L脯氨酸。

所述液体制剂的pH值为5.5-6.5。另一方面，本发明提供一种含有抗PCSK9抗体的稳定的液体制剂制备方法，其包括以下步骤：

a)提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；

b)加入缓冲剂和渗透压调节剂；

c)加入表面活性剂；

d)除菌过滤；

e)分装。

其中，所述步骤a)中的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段是经细胞培养制备并通过分离纯化得到的抗体蛋白原液。

所述步骤b)中的缓冲剂和渗透压调节剂是以超滤液的形式加入到步骤a)中的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段中，并对所述的抗体或其抗原结合片段进行超滤浓缩，直至所述的抗体或其抗原结合片段置换完全。在所述步骤c)之前，调整置换后的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度。

所述步骤c)中的表面活性剂以水溶液的形式提供。

所述步骤e)分装的储存装置是预灌封注射器。所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段、缓冲剂、渗透压调节剂和表面活性剂如前文所述，其用量和/浓度如前文所述或可适当确定。

在一个实施方式中，本发明的稳定的液体制剂的制备方法包含以下步骤：

a)将培养制备的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段收获液经分离纯化后得到抗体蛋白原液，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段如前文所述；

b)加入由缓冲剂和渗透压调节剂组成的超滤液进行超滤浓缩，直至所述的抗体蛋白置换完全，所述的缓冲剂和所述的渗透压调节剂的种类、浓度和pH值如前文所述，优选的缓冲剂是由L-组氨酸和L- 组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂，优选的渗透压调节剂是脯氨酸；

c)调整置换后的抗体蛋白浓度到本发明的稳定的液体制剂所定义的浓度范围；

d)加入表面活性剂水溶液，所述的表面活性剂及其浓度如前文所述，优选的表面活性剂是聚山梨酯80或聚山梨酯20。

e)除菌过滤步骤d)的溶液；

f)分装至预灌封注射器，得到本发明的稳定的液体制剂。

第三方面，本发明提供一种含有抗PCSK9抗体的稳定的液体制剂在制备用于治疗、预防或改善任何与PCSK9相关的疾病或症状的药物中的用途和治疗方法。

本发明进一步提供了一种预灌封注射器，所述预灌封注射器中装载有前述的稳定的制剂，所述制剂是液体制剂。

在一个方面，本发明提供了一种在受试者中治疗与PCSK9相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，通过施用本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段来调节PCSK9结合至LDLR的活性。在一些实施方式中，在受试者中使用他汀 (statin)类药物治疗或预防的疾病或病症也可以通过施用本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段来治疗或预防。在一些实施方式中，通过防止胆固醇合成或提高 LDLR表达来治疗的疾病或病症也可以通过施用本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段来治疗。本发明还提供了一种含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗与PCSK9相关的疾病或症状的药物中的用途。

在一个方面，本发明提供了一种降低受试者胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段。所述的胆固醇包括总胆固醇、LDL-C和非高密度脂蛋白(HDL)胆固醇。在一个实施方式中，本发明涉及降低受试者LDL-C水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的含有抗PCSK9 抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段。在施用了所述的液体制剂或所述的抗体或其抗原结合片段后，所述的LDL-C水平降低。在一个具体的实施方式中，本发明涉及降低受试者血清LDL-C 水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段。在施用了所述的液体制剂或所述的抗体或其抗原结合片段后，所述血清LDL-C水平降低。在一个实施方式中，本发明涉及降低受试者总胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗体或其抗原结合片段。在施用了所述的液体制剂或所述的抗体或其抗原结合片段后，所述的总胆固醇水平降低。本发明还提供了一种含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备用于降低受试者胆固醇水平的药物中的用途。

在一个方面，本发明提供了一种在受试者中治疗和/预防胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。所述胆固醇相关疾病包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管病、阿尔茨海默氏病和血脂异常(例如，高水平的总血清胆固醇、高水平的LDL、高水平的甘油三酯、高水平的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低水平的高密度脂蛋白 (HDL))。在一些实施方式中，本发明涉及在受试者中治疗和/预防高胆固醇血症和/或血脂异常的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了一种含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防胆固醇相关疾病的方法。

在一个方面，本发明提供了一种本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗 PCSK9抗体或其抗原结合片段与其它治疗剂联合施用的方法。在一些实施方式中，在施用至少一种其它治疗剂之前施用有效剂量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，在施用至少一种其它治疗剂的同时施用有效剂量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。一些实施方式中，在施用至少一种其它治疗剂之后施用有效剂量的本发明所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。所述的其他治疗剂包括但不限于至少一种降低胆固醇水平(包括血清LDL-C和总胆固醇)或提高LDLR表达水平的药物，例如他汀类药物(选自：阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀 (pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗舒伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)任意一种或其任意组合)。在一些实施方式中，所述的其它治疗剂可用于治疗和/或高胆固醇血症和/或血脂异常。在一些实施方式中，所述的其它治疗剂可用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或心血管疾病和/或降低复发性的心血管事件。在一些实施方式中，所述的其它治疗剂可用于提高HDL胆固醇水平。

以上所述的含有抗PCSK9抗体的液体制剂或本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的有效剂量范围包括约0.5-50mg/kg。

第四方面，本发明提供了编码本发明抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的核苷酸。在一些实施方式中，本发明提供了包括所述核苷酸的载体，所述载体包括表达载体。在一些实施方式中，本发明还提供了制备所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，所述的宿主细胞是真核细胞，选自哺乳动物细胞、酵母细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞，优选哺乳动物细胞，其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞和293细胞。

在另一个方面，本发明还提供了制备本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含将编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸插入可操作性地连接至表达载体中，使得所述表达载体内的转录和翻译控制元件可以调控所述抗体或其抗原结合片段核苷酸的转录和翻译功能，然后将编码抗体或其抗原结合片段的表达载体转染到宿主细胞中进行培养，以及分离纯化所述宿主细胞所制备的抗体或其抗原结合片段。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

(1)、提供了一种含有高浓度抗PCSK9抗体的液体制剂，具有低粘度的特性，不仅满足临床用药剂量的要求，而且满足在环境温度下使用注射器皮下递送所需的抗体粘度限度，尤其适合皮下注射或肌肉注射施用给药；

(2)、提供了一种含有高浓度抗PCSK9抗体的液体制剂，具有高的物理和化学稳定性，长期存放(如 1年以上，尤其是储存2年或3年)时不易产生聚集体和颗粒沉淀物以及电荷异质体，由此可见本发明提供的液体制剂不仅适于长期储存，而且能够保证抗体的生物学活性，以及所述液体制剂制备为临床药品的质量安全性、有效性和高度一致性；

(3)、提供了一种含有高浓度抗PCSK9抗体的液体制剂，具有成分简单且安全无毒、聚集体和颗粒沉淀物少、生物活性高，且生产方法简单易行，易于质量控制；

(4)、提供了一种含有高浓度抗PCSK9抗体的液体制剂，不仅具有高浓度抗体和低粘度的特性，而且pH值维持在5.5-6.5(尤其是6.0-6.5)之间，适于皮下注射给药，不仅满足慢性疾病患者在家自行用药的需求，而且在施药过程中能够将给药疼痛降至较低值，提高患者用药依从性。

发明详述

本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。

定义

本发明中所使用的术语具有如下所列定义。如果在文中没有给出定义，则本发明中所使用的术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

本发明中所用的术语“约”，当用于列出的某一具体数值或数值范围时，意为该数值可在与所列具体数值±20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，这些变化适于进行所公开的方法。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(Proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9，PCSK9)”、“PCSK9”或“NARC-1”，属于分泌性枯草杆菌蛋白酶家族的蛋白酶K亚家族的天然的人前蛋白转化酶。 PCSK9作为溶酶原被合成，在内质网中经历自催化型分子内处理，并被认为作为前蛋白转化酶起作用。当该术语用于本申请中时是指任何天然存在的PCSK9，优选来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人))和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PCSK9。人PCSK9代表性的氨基酸序列及其编码的代表性核酸序列分别由GenBank登记号NP_777596.2和FJ525880.1公开，或者人PCSK9的氨基酸序列如本申请SEQ ID NO:21所示。术语“PCSK9”涵盖“全长”未加工的PCSK9以及由细胞内加工产生的任何形式的PCSK9或其任何片段。该术语还包括天然存在的PCSK9的变体，例如，剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体或等位基因变体，例如突变体D374Y、S127R 和F216L。

术语“抗体”包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一个可变区(VH) 和三个恒定区(分别为CH1、CH2和CH3)组成，其中，CH1和CH2之间具有铰链区；每条轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的CH2和CH3组成，其通过铰链区的二硫键结合；“Y”型结构的每条臂包括其中一条重链的可变区和CH1，其与一条轻链的可变区和CL 通过二硫键连接。轻链和重链的可变区决定抗体与抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区 (hypervariable region，HVR)，称互补决定区(Complementarity-Determining Region,CDR)，其中，轻链 (L)的CDR区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3。本发明中公开的抗体或其抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact编号系统/方法定义或识别。(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)； Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc.等，Nucleic Acids Research, 1998,Vol.26,No.1 297–303)。三个CDR由被称为框架区(Framework Region，FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，例如，根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体： IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)或IgG4(γ4重链)等。

其中，每个重链互补决定区和/或每个轻链互补决定区根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和 Chothia定义的组合、IMGT定义、AbM定义或CDR的接触定义来定义；优选地，每个CDR根据Kabat 的CDR定义或Chothia的CDR定义或二者的组合来定义。

术语“抗原结合片段”，指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段可以与完整抗体一样结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个CDR，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。抗原结合片段包括不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、 (dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scFv)、 scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、骆驼化单域抗体(camelized single domainantibody)、纳米抗体、域抗体和双功能抗体(diabody)。例如，抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括轻链可变区和轻链恒定区)与一条重链的可变区和CH1经二硫键结合起来的抗体片段。“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。抗体的“Fc”片段，是由重链的CH2 和CH3经二硫键连接而成的抗体片段。抗体的Fc片段负责多种不同的效应功能，如决定抗体在体内血清的半衰期、介导免疫反应，例如，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、激活补体依赖的细胞毒性(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)或抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(Antibody Dependent Cellular Phagocytosis，ADCP)，但不参与抗原的结合。抗体的“Fv”段，是指含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。“单链Fv抗体(scFv)”，是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程化抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988))。“(dsFv)2”含有三条肽链：是指两个VH基团间通过一条多肽衔接物相连，并通过二硫键与两个VL基团结合。“双特异性ds双功能抗体”含有VL1-VH2(由一个多肽衔接物相连)和VH1-VL2(也是由一个多肽衔接物相连)，两者在VH1 和VL1间通过二硫键结合。“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”含有三条多肽链：VH1-VH2片段，其中两者的重链通过多肽衔接物(如：长的弹性衔接物)相连，并通过二硫键分别与VL1和VL2片段结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)片段，其中一个片段的VH与另一个片段的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原结合表位)或不同抗原(或抗原结合表位)。在另一些实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，含有相互连接的VL1-VH2 (由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接)，其中VH1和VL1协作，VH2和VL2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。“单链抗体Fv-Fc(scFv-Fc)”，是指scFv与抗体Fc片段组成的工程化抗体。“骆驼化单域抗体(Camelized singledomain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb (Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个VH域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和 Muyldermans S.,J ImmunolMethods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun； 74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.Patent No.6,005,079)。重链抗体最初是在驼科(包括骆驼、单峰驼和美洲驼)中发现的。虽然缺失轻链，但骆驼化抗体(camelizedantibodies)具有抗原结合的全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chain antibodies in Camelidae：a caseof evolutionary innovation,”Immunogenetics.Apr； 54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH 域)是目前已知的最小的获得性免疫所产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov； 21(13):3490-8.Epub 2007Jun 15(2007))。“纳米抗体”是由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成的一种抗体片段。“域抗体”是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个VH域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗体。双价域抗体的两个VH 域可靶向作用于相同或不同的抗原。“双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(如VH-VL或VL-VH)(Holliger P.等，ProcNatl Acad Sci USA.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原结合表位)。

术语“全人源抗体或抗原结合片段”，是指所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序列。在一些实施方式中，全人源抗体不包含来源于非人抗体的氨基酸残基(特别是抗原结合残基)。在一些实施方式中，使用重组方法制备所述全人源抗体。例如，可以制备转基因动物如小鼠，使其携带人源免疫球蛋白基因的转基因或转染色体，并因此在用适宜的抗原如人源PCSK9免疫后能够生产全人源抗体。全人源抗体可以从所述的转基因动物中分离，或另选地，可以通过杂交瘤技术制备，将所述转基因动物的脾细胞与永生细胞系融合以生成分泌所述全人源抗体的杂交瘤细胞。示例性的转基因动物包括但不限于Omni大鼠，其内源性大鼠免疫球蛋白基因被敲除而表达失活，同时通过基因工程化以包含功能性的重组人源免疫球蛋白基因座；Omni小鼠，其内源性小鼠免疫球蛋白基因被敲除而表达失活，同时通过基因工程化以包含具有J-基因座缺失和C-kappa突变的重组人源免疫球蛋白基因座；OmniFilc，为转基因大鼠，其内源性大鼠免疫球蛋白基因被敲除而表达失活，同时通过基因工程化以包含具有单个共有的、重组的VkJk轻链和功能性重链的重组人源免疫球蛋白基因座(Osborn M.et al,Journal ofImmunology,2013,190:1481-90；Ma B.et al,Journal of Immunological Methods 400-401(2013)78-86；Geurts A.et al,Science,2009,325:433；美国专利US8,907,157；欧洲专利EP2152880B1；欧洲专利EP2336329B1)。也可使用其他适宜的转基因动物，例如，HuMab小鼠(Lonberg,N.et al.Nature368(6474):856-859(1994))、Xeno小鼠(Mendez et al.NatGenet.,1997,15:146-156)、TransChromo 小鼠(Ishida et al.Cloning Stem Cells,2002,4:91-102)、VelocImmune小鼠(Murphy et al.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111:5153-5158)、Kymouse转基因小鼠(Lee et al.Nat Biotechnol,2014,32:356-363)，或转基因兔(Flisikowska et al.PLoS One,2011,6:e21045)。

术语“人源化抗体或抗原结合片段”，是指包括来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区的抗体或抗原结合片段。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有降低的免疫原性，可用作人的治疗剂。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，抗体的其它部分基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，所述来源于人的FR区可以包括与其来自的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包括一些氨基酸改变，例如，不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2 或1个氨基酸改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或同时存在于两个链中。

术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物例如小鼠的可变区。

术语“特异性结合”，是指抗体和抗原间的反应。在一些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与大鼠、人和/或猴PCSK9特异性结合，并且其结合亲和力(K_D)≤10^-6M(如：≤5×10^-7M，优选≤ 1.0×10^-8M，更优选1.0×10^-9M)。本申请中的K_D是指解离速度与结合速度的比值(k_off/k_on)，可通过表面等离子共振的方法测定，例如使用Biacore的仪器测定。

术语“同种型抗体”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别。例如，“IgG同种型抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG1形式的抗体是指其重链恒定区Ig结构域为IgG1的Ig结构域。

术语“百分比序列同一性”，是指在进行氨基酸序列(或核酸序列)比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN,BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见， Altschul S.F.等、J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、 ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见，Higgins D.G.等，Methods inEnzymology， 266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN 或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。

术语“LDL受体(LDLR)”是细胞表面嵌合蛋白，其具有839个氨基酸(去除21个氨基酸的信号肽后)，介导LDL-C的内吞并从血液中移除LDL-C。人LDL-R的代表性氨基酸序列及其编码的mRNA 核酸序列分别由GenBank登记号P01130.1和NM_000527.4公开。当PCSK9与LDL受体结合时，所述抗体被破坏且不能将LDL-C从血液中移除。相反，当PCSK9被阻断时，在肝脏表面会有更多的LDL受体且会从血液中移除更多的LDL胆固醇。本申请使用的“抗PCSK9抗体”是指能够特异性结合PCSK9 (例如人或猴PCSK9)的抗体，其具有足以提供诊断和/或治疗用途的亲和性。

术语“载体”，是指可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达，这样的载体在本申请中也被称为“表达载体”。载体包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。

术语“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本申请中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。优选地，哺乳动物宿主细胞，例如，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))、幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、猴肾细胞 (CV1ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(HepG 2，HB 8065)、小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、 TRI细胞(Ma the r等，Anna ls N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5细胞、FS4细胞、或人肝癌细胞系(Hep G2)。

术语“LDL-C”是指低密度脂蛋白胆固醇。“HDL-C”是指高密度脂蛋白胆固醇。LDL和HDL属于 5个主要的脂蛋白群组：乳糜微粒，极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白 (LDL)和高密度脂蛋白(HDL)(顺序为从大颗粒到最密集的/最小的粒子)。LDL(又称为含有颗粒的“坏”的胆固醇)能够运输脂质/固醇分子，如胆固醇(即LDL-C)至动脉壁，吸引巨噬细胞，因此诱发动脉粥样硬化。相反，HDL(又称含有颗粒的“好”的胆固醇)能够从动脉壁上的巨噬细胞移除脂质分子，如胆固醇(即HDL-C)。因此，高水平的LDL-C是心血管疾病(CVD)的主要风险，如外周动脉疾病、冠状动脉疾病(CAD，如心绞痛、心肌梗塞(俗称心脏病)、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症)、动脉粥样硬化、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌炎、主动脉瘤、周围动脉疾病、肥胖、肝胆疾病、肾病综合征、甲状腺功能减退症和静脉血栓形成。

对某种疾病或症状的“治疗”是指减轻某种疾病或症状，降低某种疾病或症状兴起或发展的速度，减少发展出某种疾病或症状的风险，或延迟与某种疾病或症状相关的症状发展，减少或终止与某种疾病或症状相关的症状，产生某种疾病或症状的完全或部分的逆转，治愈某种疾病或症状，或以上的组合。

“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有家族病史的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在病征或症状发生前，特别是在具有风险的受试者中发生前的药物施用。

“与PCSK9相关疾病或症状”是指通过PCSK9的变化引起或表征的疾病或症状，如表达水平、活性的改变，和/或PCSK9的变体或突变的存在。与PCSK9相关疾病或症状的例子包括但不限于、高脂蛋白血症、高脂血症；血脂异常(例如升高的总胆固醇、升高的LDL、升高的甘油三酯、升高的VLDL和/或降低的HDL)；高胆固醇血症、心脏病、中风、冠心病、动脉粥样硬化、周围血管病、跛行、II型糖尿病、高血压、心血管疾病或症状、炎症或自身免疫性疾病。鉴定/诊断上述疾病或症状的方法在本领域是已知的。

术语“受试者”包括任何人类或非人类的动物。“非人类的动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物(包括但不限于家养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(如猴)、兔、以及啮齿类动物 (例如，小鼠和大鼠))和非哺乳动物(如家禽、两栖动物和爬行动物)。在一些实施方案中，受试者是人。

术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现预防或改善与疾病或病症有关的症状和/或减轻疾病或病症严重程度的剂量或浓度。本发明的制剂、抗体或其抗原结合片段或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也可被认为是制剂、抗体或其抗原结合片段或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。

术语“制剂”是指适合于向动物优选哺乳动物(包括人)施用的包含至少一种活性成分和至少一种非活性成分的组合物。“液体制剂”是指液体形式的制剂。本发明的液体制剂包含(1)抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；(2)缓冲剂；(3)渗透压调节剂；和/或(4)表面活性剂。本发明的制剂的组成可如前文所述的液体制剂实施方案中所示。本发明的液体制剂优选为注射剂，更优选为皮下注射剂或肌肉注射剂，最优选的是皮下注射剂。

术语“缓冲剂”是指pH缓冲剂。优选地，所述缓冲剂能够使本发明的液体制剂的pH保持在约4.5-6.5，优选约5.5-6.5。缓冲剂在液体制剂中的浓度为约1-50mmol/L，优选的浓度是5-50mmol/L，更优选的浓度是10-30mmol/L。所述的缓冲剂选自组氨酸、醋酸盐、琥珀酸盐、或谷氨酸盐，优选的缓冲剂是组氨酸缓冲剂。

“组氨酸缓冲剂”是指包含组氨酸的缓冲剂。组氨酸缓冲剂包括组氨酸盐酸盐、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐。在一个实施方式中，所述的组氨酸缓冲剂由L-组氨酸和L-盐酸组氨酸组成， L-组氨酸和L-盐酸组氨酸的浓度比为0.2∶1-3∶1。

术语“赋形剂”是指可以向制剂添加以提供所需特性(例如稠度、提高的稳定性)和/或调节渗透压的非治疗试剂，所述的非治疗试剂添加到制剂中能够稳定活性成分的理化和生物特性。常用赋形剂的实例包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。

术语“渗透压调节剂”是一种促成溶液的克分子渗透压浓度的分子。本发明的“渗透压调节剂”是指能够调整、改变或优化所述本发明的抗PCSK9抗体液体制剂的渗透度，优选地，本发明所述的液体制剂的克分子渗透压浓度被调节，不仅维持液体制剂的等渗性，而且可以最大限度地提高本发明抗PCSK9 抗体或其抗原结合片段的稳定性，同时也将给药时患者的不适度降低至最低。适用于改变克分子渗透压浓度的渗透压调节剂的实施例包括但不限于，氨基酸(脯氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸等)、盐类(氯化钠、氯化钾、氯化钙等)和/或糖类(蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及其类似物)，优选的渗透压调节剂是脯氨酸或蔗糖，更优选的是脯氨酸。

术语“表面活性剂”是指加入少量后能使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质。例如，能保护蛋白质(例如抗体)免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力影响，从而减少蛋白质的聚集或制剂中颗粒物的形成。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨酯80、聚山梨酯60、聚山梨酯40或聚山梨酯20)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)。本发明优选的表面活性剂是非离子型表面活性剂，例如聚山梨酯80或聚山梨酯20。表面活性剂在液体制剂中的浓度0.001-1％(w/w)，优选0.01-0.05％(w/w)，更优选0.01％(w/w)、0.02％(w/w)和0.04％(w/w)。

术语“粘度”可以是“运动粘度”或“绝对粘度”。“运动粘度”是对流体在重力影响下所产生的抵抗性流动的一种测量指标。当两种相同体积的流体被分别置入两个相同的毛细管粘度计并靠重力流动时，粘性流体流过毛细管所需的时间比粘度较低的流体所需的时间为长。“绝对粘度”，有时称为动态粘度或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积(绝对粘度＝运动粘度×密度)。运动粘度的量纲是L²/T(其中， L是长度，T是时间)。通常，运动粘度以厘沲(cSt)表示。运动粘度的国际单位制单位是mm²/s(即lcSt)。绝对粘度以厘泊(cP)单位表示。绝对粘度的国际单位制单位是毫帕斯卡-秒(mPa-s)，其中1cP＝lmPa-s。

术语“低水平粘度”是指低于约15cp的绝对粘度。“中等水平粘度”是指介于约15cp和约35cp之间的绝对粘度。本发明使用标准粘度测量技术测量时，本发明的抗体液体制剂的绝对粘度为约6.0cp、约 8.0cp、约9.0cp、约10.0cp、约11.0cp、或约12.0cp，表明本发明的液体制剂具有“低水平粘度”。在一些实施方式中，本申请的发明人惊奇地发现，脯氨酸不仅可以作为渗透压调节剂，而且与抗PCSK9抗体和缓冲剂一起配制时还可以减少本发明的抗体液体制剂的粘度。

术语“等渗”是指液体制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂一般具有约250～350mOsm 的渗透压。可使用蒸汽压或冰点下降式的渗透压计测量等渗性。

术语“溶媒”是指用于混合、分散、溶解受试物或对照物而不影响试验结果的物质。可用于本发明的溶媒包括但不限于注射用水、盐类(如生理盐水)、糖类(如葡萄糖注射液)、注射用有机溶剂(包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等)，或其组合。

“稳定的”抗体制剂是指抗体在生产制造过程中和/或储存期间基本保持其物理化学稳定性和/或生物学活性的制剂。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100％的物理化学特性或生物功能，抗体制剂也可以被认为是稳定的。例如，经过一定时间储存后，该制剂能维持90％以上的抗体结构或功能，也可以视为是“稳定的”制剂。稳定性的标准例如，液体制剂肉眼观察无色、或澄清至轻度乳白色；制剂的抗体浓度、pH值和渗透压变化不超过±10％；抗体生物学活性为参照抗体的60～140％，优选80～120％；制剂的抗体单体降解不超过10％，优选5％；制剂中形成的聚集物不超过10％，优选5％；或制剂中形成的水解物不超过10％，优选5％。

如果肉眼观察制剂的颜色和/或澄清度，或经差示扫描量热法(DSC)、尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC) 和动态光散射(DLS)检测，制剂中抗体的聚集、沉淀和/或变性无显著增加，表明所述制剂中的抗体“保持了其物理稳定性”。如果所述制剂中的抗体没有发生显著的化学变化，其化学结构保持了完整性，则表明所述抗体“保持了其化学稳定性”。大部分化学稳定性的破坏可归因于蛋白的共价修饰(例如，共价聚集物、降解物或电荷异构体)和蛋白的非共价修饰(例如，非共价聚集物)的形成。可以使用本领域技术人员已知的方法来测定抗体蛋白化学结构发生的变化(例如不同分子量或电荷的变体)。所述方法包括但不限于，使用SEC-HPLC和十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳(CE-SDS)等方法来检测抗体的水解物，使用非还原性Caliper检测抗体的降解片段以及分子量小于抗体的其它蛋白分子，或使用阳离子交换色谱法(CE-HPLC)检测抗体的电荷异构体。如果在储存期间内，制剂中抗体的生物学活性仍在该制剂制备时显示的生物学活性范围内，表明该抗体“保持了其生物学活性”。抗体生物学活性的检测方法包括但不限于抗原结合ELISA实验或抗体的细胞活性实验。

“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与受试者相兼容。

抗PCSK9抗体

包含在本发明的液体制剂内的示例性抗PCSK9抗体在公开的专利申请CN201710816808.0中已详细阐述，其公开内容通过引用整体并入本申请中。本发明的抗PCSK9抗体优选全人源抗体，优选地，重组方法制备所述的抗体。在一个实施方式中，采用人源PCSK9蛋白免疫含有人源免疫球蛋白可变区基因的转基因大鼠

(OMT)以获得全人源抗体。在本发明实施例中所用的非限制性、示范性抗体被称为“抗体A”，其是与人PCSK9特异性结合的全人源抗体，其CDR区、重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示，其中表1-1中CDR区是采用kabat方法定义的，表1-2展示的是不同定义方法所定义的CDR区氨基酸序列：

表1-1抗PCSK9抗体(抗体A)CDR区、重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列及其序列号

表1-2不同定义方法定义的CDR区氨基酸序列

在一个实施方式中，本发明所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。在一个实施方式中，本发明所述的抗PCSK9抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中 VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。在一些实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含一个或多个CDR序列，这些序列具有与表1所列出的CDR序列至少 85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性，并且同时保留了与其亲本抗体(例如抗体A)相似或甚至高于亲本抗体与人PCSK9的结合亲和力，所述亲本抗体具有基本相同的序列，但其相应的CDR序列与表1所列的序列具有100％序列同一性。在一些实施方式中，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段具有与表1所列出的VH或VL序列至少85％,86％,87％,88％,89％, 90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的同一性，并且同时保留了与其亲本抗体相似或甚至高于亲本抗体与人PCSK9的结合亲和力。

抗PCSK9抗体的制备及纯化

本发明还提供了编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在一些实施方式中，所述的多核苷酸包含一个或多个如表1所示的核苷酸序列，其编码如表1所示的CDR区序列、重链可变区序列和/或轻链可变区序列。

在一些实施方式中，所述的编码重链可变区的多核苷酸序列与表1所示的SEQ IDNO:19具有至少 85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％，99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述的编码轻链可变区的多核苷酸序列与表1所示的SEQ ID NO:19具有至少85％,86％, 87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％，99％或100％的同一性。在一些实施方式中，所述一致性的百分比是源自遗传密码的简并性，而编码的蛋白序列保持不变。

在一些实施方式中，使用本领域公知的重组技术，可以将包括编码所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段(例如表1所示的序列)的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆(扩增DNA)或基因表达。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可通过本领域公知的同源重组的方法制得。编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA可以通过常规的方法分离和测序，例如可以使用寡核苷酸探针，该探针可特异性与编码所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的基因结合。如前文所述有多种载体可供选择。载体元件通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强序列、启动子(例如：SV40、CMV或EF-1α)、转录序列和终止序列。在一些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。所述质粒包括但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、 pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、 pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2等可从实验室获得或市售的载体。

可以将包括编码所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本发明中适用于克隆或表达所述载体中DNA的宿主细胞可以是原核细胞、酵母或前述的真核细胞，优选的是真核细胞，更优选的是哺乳动物宿主细胞。在一些优选的实施方式中，所述的宿主细胞是 CHO细胞或293细胞。

用上述的可用于抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的表达或克隆的载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。

本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如 Ham's F10(Sigma)、最低基本培液如MEM(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)或Dulbecco's Modified Eagle 's Medium(DMEM，Sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979), Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利US4,767,704、US4,657,866、US4,927,762、 US4,560,655或US5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195、或美国专利申请Re.30,985中说明的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。

在使用重组技术时，所述抗体或其抗原结合片段可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。文献Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约 30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体或其抗原结合片段分泌到细胞培养基中，则通常首先使用市售的蛋白过滤器浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。

从所述细胞中制得的抗体或其抗原结合片段可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A是否适合作为其亲和配体。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可采用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。

在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有目标抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。评价含有抗PCSK9抗体的液体制剂稳定性的分析方法。

本发明的抗体液体制剂含有高浓度的抗PCSK9抗体、药学上可接受的缓冲剂和赋形剂。配制抗体制剂时应保持抗体的理化性质和生物学活性。评价抗体制剂理化性质稳定性的方法包括但不限于DSC、 DLS、UV分光光度法、SEC-HPLC、CE-SDS、CEX-HPLC、和/或非还原性Caliper。其中，DSC(Pharm. Res.,15:200,1998；Pharm.Res.,9:109,1982)检测蛋白变性温度和玻璃化转变温度，以分析蛋白在自然(折叠)状态下的稳定性；DLS(AmericanLab.,Nov.1991)检测溶液的平均扩散系数，分析可溶性和不溶性聚集物的含量；UV分光光度法检测制剂在278nm处的吸光值，分析抗体蛋白的浓度；SEC-HPLC可将分子量较高的聚集物或分子量较低的降解物(如片段)从天然抗体中分离出来，分析天然抗体(或抗体单体)的百分比、可溶性水解物(或具有低分子量的降解物，例如片段)的百分比和聚集体的百分比(即根据天然抗体峰面积、水解物或聚集体的峰面积与所有抗体峰总面积相比的百分数来确定)；CE-SDS用于检测制剂中的水解物，其中，还原性CE-SDS(rCE-SDS)可检测抗体重链、非糖基化重链、轻链和降解片段；非还原性CE-SDS(nrCE-SDS)可检测抗体单体和降解片段；CEX-HPLC可用于将制剂中天然抗体的电荷异构体与天然抗体分离，比主峰(即主要荷电形式)更早时间从CEX-HPLC柱洗脱出来的峰是酸性峰，比主峰更晚时间从CEX-HPLC柱洗脱出来的峰是碱性峰。根据主峰、酸性峰和碱性峰的面积与所有抗体峰总面积比值的相对百分比的变化来确定天然抗体的电荷异构体，抗体的稳定性与酸性形式抗体的百分比成反比；非还原性Caliper检测制剂中抗体的降解片段以及分子量小于抗体的其它蛋白分子；评价抗PCSK9抗体的效价或生物学活性可通过其结合于抗原PCSK9的能力来测定，抗体与抗原的特异性结合能力可使用本领域技术人员已知的方法，例如ELISA(酶联免疫吸附法)等免疫检测法来定量检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

中英文缩写的含义：

DSC(Differential Scanning Calorimetry)：差示扫描量热法

DLS(Dynamic light scattering)：动态光散射

HPLC(High Performance Liquid Chromatography)：高效液相色谱

CEX(Cation-exchange)：阳离子交换

SEC(Size-Exclusion Chromatography)：分子排阻色谱

CEX-HPLC：阳离子交换色谱法

SEC-HPLC：尺寸排阻色谱法

CE(Capillary Electrophoresis)：毛细管电泳

SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)：十二烷基硫酸钠

CE-SDS：十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳

本发明实施例使用的抗PCSK9抗体采用公开专利CN201710816808.0实施例1-3中关于抗体18.156.8 的方法筛选得到，并构建能够稳定表达本发明抗PCSK9抗体的CHO细胞株，经细胞培养后取上清液，通过亲和层析、离子交换和超滤等步骤纯化得到本发明抗PCSK9抗体(在本发明中也称为抗体A)原液。

实施例1缓冲体系和pH值筛选实验

本发明按照表2的配方配制不同缓冲体系下的抗PCSK9抗体制剂，通过开展40±2℃高温加速稳定性实验，考察了70mg/mL抗PCSK9抗体(例如抗体A)分别在不同配比的醋酸/醋酸钠、组氨酸/盐酸组氨酸、以及琥珀酸/琥珀酸钠三种缓冲体系及其不同pH值下的稳定性，通过检测不同缓冲体系下抗PCSK9 抗体样品的外观、pH值、DSC、蛋白质含量、SEC-HPLC、CEX-HPLC、非还原性Caliper等，以筛选出适合本发明抗PCSK9抗体最优的缓冲体系。

配制不同缓冲体系下的抗PCSK9抗体制剂的方法为：将抗PCSK9抗体(抗体A)原液加入到超滤离心管中(截留分子量30K_D)，离心浓缩后加入表2所示的不同pH值的缓冲剂溶液，进行稀释后继续浓缩，如此反复3次以上，直至抗PCSK9抗体置换完全。将置换后的抗体浓度调整为70mg/ml，除菌过滤后分别灌装于西林瓶中，加塞轧盖，最终配制为F1-F7样品。

表2.不同缓冲体系下的抗PCSK9抗体制剂处方

将各样品放置在40±2℃下，分别在第0周、第2周和第4周取出并分析检测，具体检测项如表3 所示，考察蛋白是否因聚集物、降解和修饰引起其电荷性质发生改变，本发明采用SEC-HPLC检测天然形式(蛋白单体)与聚集形式抗PCSK9抗体所占的百分比；采用CEX-HPLC检测酸性与碱性形式抗体 (蛋白主峰)所占的百分比；采用非还原性Caliper检测抗PCSK9抗体与其降解片段和其他分子量小于抗体的蛋白分子所占的百分比。

SEC-HPLC法：采用凝胶色谱柱(5μm，7.8×300mm)，样品经稀释后进样20μl，进行等度洗脱。

CEX-HPLC法：采用弱阳离子色谱柱(10μm，4×250mm)，样品经稀释后进样100μl，以4mM 2-Methylpiperazine，4mM Imidazole，4mM Tris为流动相，进行pH梯度洗脱。

非还原性Caliper：采用PerkinElmer公司的LabChip GXII Touch HT仪器以及HTProtein Express LabChip对样品进行分析。样品经稀释并与样品变性液(含100mM NEM和10％SDS)混匀孵育10分钟，最后将样品转移至96孔板中上样分析。

表3不同缓冲体系下的抗PCSK9抗体样品检测项

(X表示检测项为外观、pH值、蛋白质含量、SEC-HPLC、CEX-HPLC、非还原性Caliper；Y表示检测项为DSC)。

表4不同缓冲体系下的抗PCSK9抗体样品在40±2℃的稳定性实验结果

检测结果如表4所示，当缓冲体系为组氨酸/盐酸组氨酸，pH值5.5-6.5(样品编号为F4-F6)时，在 40±2℃/75％±5％RH条件下放置4周后，通过SEC-HPLC检测发现，样品主峰含量均在94％以上，主峰含量下降约为1.5％；通过非还原性Caliper检测发现，抗PCSK9抗体纯度下降均在1.5％以内。与其它处方相比，当缓冲体系为组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液，pH值6.0(样品编号F5)时，在40±2℃/75％±5％ RH条件下放置4周后，样品的SEC-HPLC主峰(或蛋白单体)含量最高(约为94.8％)，主峰含量下降最少(约为1.5％)；非还原性Caliper纯度下降最少(约为0.9％)；此外，从DSC和CEX-HPLC的检测结果发现，F5的稳定性也较好。当选用琥珀酸/琥珀酸钠作为缓冲体系时，样品有轻微絮状物析出，并且在40±2℃条件下储存，SEC-HPLC主峰含量和CEX-HPLC主峰含量下降得最多(分别为约4.5％和5.0％左右)。当选用醋酸/醋酸钠作为缓冲体系时，样品在非还原性caliper纯度、DSC稳定性和SEC-HPLC蛋白单体含量均不及缓冲体系为组氨酸/盐酸组氨酸。基于这些结果，选择pH值为5.5-6.5的组氨酸/盐酸组氨酸缓冲剂作为本发明的抗PCSK9抗体液体制剂的缓冲体系。

实施例2赋形剂筛选实验

基于实施例1缓冲体系筛选的实验结果，本发明通过25±2℃室温和40±2℃高温加速实验，筛选了9种不同的辅料处方及其对高浓度抗PCSK9抗体的稳定性、粘度和渗透压等方面的影响进行了比较测试，具体的辅料处方及其相应检测项的信息项如表5所示。不同辅料处方的制备方法是将表5所示的不同辅料或其组合分别加入含有140mg/mL抗PCSK9抗体(抗体A)和20mM组氨酸/盐酸组氨酸缓冲剂 (pH 6.0)或醋酸/醋酸钠缓冲剂(pH 5.0)的溶液中，然后再在所述溶液中加入表5所述的表面活性剂，将制备得到的配制液分装到西林瓶中并加塞轧盖，分别放置于25℃和40℃条件下，在第2周、第4周取出分析检测抗体稳定性、配制液粘度、渗透压等。

采用ELISA测定生物学活性：用包被液将抗PCSK9抗体稀释至1.5μg/ml，100μl/孔加入至96孔酶标板中，2～8℃，包被过夜。洗板封闭后，标准品和供试品稀释成相同的一系列浓度，按100μl/孔加入到酶标板中，封板膜封闭，25℃，220rpm孵育1h。洗板按100μl/孔加辣根过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白到酶标板各反应孔中，封板膜封闭，25℃，220rpm孵育1h。洗板后加入TMB底物液显色，显色后用2M硫酸终止后测A₄₅₀。进行四参数曲线拟合，根据标准品和供试品的EC₅₀计算其生物学活性。检测结果如表5所示。

表5不同辅料筛选处方及其检测项 (X表示检测项为外观、pH值、蛋白质含量、SEC-HPLC、CEX-HPLC、非还原性Caliper、DLS；Y表示检测项为DSC，渗透压，黏度；Z表示检测项为活性；“[]”表示可选测项)

表6不同辅料处方的抗PCSK9抗体样品在25±2℃和40±2℃的稳定性实验结果

由表6所示，当赋形剂为脯氨酸时，不仅能将抗体液体制剂的渗透压维持在300～340mOsm/Kg范围内，而且能够显著降低制剂的粘度(＜15cp)、抗PCSK9抗体的平均粒径＜15d.nm，并且使得抗体具有较强的热稳定性，即液体制剂在40℃高温放置4周后，SEC-HPLC检测的抗体单体(或主峰)含量在94％以上，单体含量下降约为1.6～3.2％；CEX-HPLC检测的抗体电荷主峰含量在47％以上，电荷主峰含量下降约为0.2～0.5％；非还原性Caliper检测的抗体纯度在97％以上，纯度下降约为1.3～1.7％。当赋形剂为蔗糖时，抗体液体制剂的粘度、渗透压、胶塞滑动性能、抗体的平均粒径、在40℃高温放置4周后的 CEX-HPLC电荷主峰含量下降率、以及非还原性Caliper抗体纯度下降率都高于赋形剂为脯氨酸的制剂。

进一步，综合各项数据分析，当抗体液体制剂的赋形剂为脯氨酸，缓冲体系为组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液，pH 6.0时(即样品F13和F16的处方)，制剂的流动性及患者用药时的依从性最适宜且抗体的稳定性最强。具体地，液体制剂的渗透压约为330mOsm/Kg，抗体粘度＜10cp，抗体液体制剂40℃高温放置 4周后，SEC-HPLC抗体单体含量下降分别为约1.6％和2.2％，CEX-HPLC主峰含量下降分别为约0.3％和0.5％，以及非还原性Caliper纯度下降分别为约1.3％和1.5％。

再次，当抗体液体制剂的赋形剂为脯氨酸，缓冲体系为醋酸/醋酸钠缓冲液，pH5.0时(即样品F18 的处方)，制剂的粘度(约11.63cp)略高于F13和F16的粘度，胶塞滑动性能不及F13和F16，且在40℃高温放置4周后，SEC-HPLC抗体单体含量下降约为3.2％，高于F13和F16的抗体单体含量下降率，非还原性Caliper纯度下降率也略微高于F13和F16，表明酸催化可能是水解物形成的主要原因。此外，醋酸/醋酸钠缓冲液，pH 5.0的液体制剂会产生皮下注射疼痛，降低了患者用药时的依从性。

此外，当抗体液体制剂的赋形剂只含有脯氨酸，浓度为200～300mM，以及缓冲体系为组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液，L-组氨酸与L-盐酸组氨酸浓度比为0.2∶1—3∶1时，不仅可保证本发明液体制剂为等渗溶液，而且使液体制剂的pH值维持在5.5-6.5内，并且液体制剂中不再含有其他的稳定剂成分，使得本发明液体制剂辅料成分简单，易于质量控制。

由此可见，当本发明抗体液体制剂的赋形剂为脯氨酸时，脯氨酸不仅可作为稳定剂，还可以作为减粘剂和渗透压调节剂。特别地，当缓冲体系为组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液，赋形剂为脯氨酸时，既可以显著减少本发明高浓度的抗PCSK9抗体的降解和聚集，保证抗体的稳定性，又可以显著降低高浓度抗体的粘度，还可以保证本发明液体制剂为等渗溶液，以及抗体蛋白的均一分布，进而显著提高了患者用药时的依从性。

实施例3表面活性剂筛选实验

在前述的缓冲体系和赋形剂筛选基础上，本发明进一步开展了表面活性剂的筛选研究。按照表7所示的制剂处方，在含有20mM组氨酸/盐酸组氨酸(pH 6.0)、辅料(250mM脯氨酸或6％(w/w)蔗糖) 和140mg/mL的抗PCSK9抗体(抗体A)的配制液中分别加入0.01％(w/w)聚山梨酯80，或者不加入聚山梨酯80，并通过在-70±10℃低温和室温冻融循环实验检测分析抗体的稳定性，以考察本发明的抗体液体制剂是否需要添加表面活性剂。

表7表面活性剂筛选实验的抗体液体制剂处方

表8冻融循环实验考察表面活性剂对抗体稳定性影响的研究结果

如表8所示，样品F19-F21分别经过冻融循环3次和5次后在外观、蛋白质含量、pH值、SEC-HPLC 主峰纯度、非还原性Caliper纯度、CEX-HPLC电荷主峰纯度上与冻融前均无明显变化，且各样品间也无明显差异；经过冻融循环5次后F19、F20和F21的抗体活性均保持在80％～120％之间，样品间无明显差异；经5次冻融后，样品F20的不溶性微粒略少于处方F21。由此可见，本发明的抗体液体制剂处方中不含有表面活性剂也可以保证抗体的稳定性。由于本发明液体制剂含有高浓度的抗体，在本发明液体制剂中添加了表面活性剂可以保护本发明抗体在储存、运输过程中免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/ 表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或制剂中颗粒物的形成，更有利于提高抗体的稳定性。

此外，本发明还通过室温振摇稳定性实验对表面活性剂(如聚山梨酯80)的浓度进行了筛选和分析，即在室温、转速为300rpm的条件下，按照表9所示的处方配制，采用预灌封注射器对样品溶液进行灌装后振摇1天和3天，模拟储存和运输过程，取出各样品并进行测试分析，检测结果如表10所示。

表9含有不同浓度表面活性剂的抗PCSK9抗体液体制剂处方

表10含有不同浓度表面活性剂的抗PCSK9抗体液体制剂稳定性实验结果

如表10所示，样品F22、F23和F24在室温、300rpm振摇1天和3天后，抗体的稳定性均保持良好，且各样品在外观、蛋白质含量、pH值、SEC-HPLC主峰纯度、非还原性Caliper纯度、CEX-HPLC电荷主峰纯度方面均无明显差异。由此可见，本发明抗体液体制剂中含有0.01％-0.04％(w/w)的聚山梨酯80可有效维持抗体的稳定性。

此外，聚山梨酯20同样也可以降低本发明抗体在振摇过程中发生聚集，防止述抗体吸附到容器表面，满足本发明的液体制剂皮下注射给药的要求。

实施例4含有抗PCSK9抗体的液体制剂稳定性验证研究

按照实施例2样品F13中的配方(即140mg/mL抗PCSK9抗体蛋白，20Mm组氨酸/盐酸组氨酸缓冲体系，pH6.0，250mM脯氨酸，0.01％聚山梨酯80)制备半成品，并灌装到具有配套胶塞的1mL细长型预灌封注射器(带注射针)中，分别放置于5±3℃、25±2℃和40±2℃条件下分别进行3个月储存稳定性、3个月加速稳定性以及1个月高温稳定性研究，具体研究内容如表11所示，其中，还原CE-SDS 电泳法主要检测抗体重链、非糖基化重链和轻链的含量之和，非还原CE-SDS电泳法主要检测主峰含量。稳定性实验结果如表12-14所示。

表11抗体液体制剂稳定性验证研究方案

(X表示检测项为外观、pH值、蛋白质含量、SEC-HPLC、CEX-HPLC、还原性CE-SDS、非还原性CE-SDS； Y表示检测项为渗透压、黏度；Z表示检测项为不溶性微粒(MFI)、胶塞滑动性能测试；W表示检测项为活性；“[]”表示根据后一时间点检测结果决定是否进行检测)。

表12抗PCSK9抗体的液体制剂5±3℃的3个月储存稳定性实验结果

表13抗PCSK9抗体的液体制剂25±2℃的3个月加速稳定性实验结果

表14抗PCSK9抗体的液体制剂40±2℃的1个月高温稳定性实验结果

如表12所示，本发明抗体液体制剂在5±3℃、避光储存3个月后，所有检测项的稳定性良好，证明了本发明的抗体液体制剂符合药品质量稳定性的要求。从表13的实验结果可以看出，本发明抗体液体制剂在25±2℃室温条件下储存3个月，样品蛋白质含量、外观、pH值、不溶性微粒、生物学活性测试结果均呈现了良好的稳定性，抗体单体含量(SEC-HPLC)、还原性CE-SDS纯度和非还原性CE-SDS纯度呈现轻微的下降，分别为0.6％、0.5％和1.2％，但下降程度均小于5％，表明本发明的液体制剂在室温储存保持稳定至少是3个月。从表14的实验结果可以看出，本发明抗体液体制剂在40±2℃高温条件下储存1个月，样品的蛋白质含量、外观、pH值、不溶性微粒、生物学活性测试结果都具有良好的稳定性，抗体单体含量(SEC-HPLC)、还原性CE-SDS纯度和非还原性CE-SDS纯度均出现了下降的趋势，分别为1.7％、1％和1.4％，表明本发明抗体液体制剂在高温条件下能够短时间稳定储存。

实施例5含有抗PCSK9抗体的液体制剂长期稳定性研究

基于实施例4稳定性验证实验，本发明进一步研究了三个批次的抗体液体制剂在5±3℃条件下的长期稳定性，研究结果如表15-17所示。

表15抗PCSK9抗体液体制剂(批号：抗体A-001)5±3℃长期稳定性研究结果

表16抗PCSK9抗体液体制剂(批号：抗体A-002)5±3℃长期稳定性研究结果

表17抗PCSK9抗体液体制剂(批号：抗体A-003)5±3℃长期稳定性研究结果

从表15-17中可看出，本发明三个批次的抗体液体制剂在5±3℃储存3个月、6个月、12个月、18 个月、24个月和36个月后，其外观、pH值、蛋白质含量、SEC-HPLC、非还原性CE-SDS和生物学活性均未出现明显变化；可见异物、不容性微粒和无菌均符合药典的规定；CEX-HPLC检测(样品经CPB 酶切处理)的抗体电荷异质性存在轻微变化，其变化主要由脱酰胺及重链N端环化引起，这些变化是抗体一般修饰和构象变化，且这些变化未对其生物学活性产生影响。由此可见，本发明的抗体液体制剂可以在5±3℃低温下储存长达36个月，保证了药品在低温储存的长期稳定性，且制剂批间差异小，抗体生物活性高，符合患者长期用药的质量安全性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 信立泰（成都）生物技术有限公司

<120> 含有抗PCSK9抗体的稳定制剂及其制备方法和用途

<150> 2020110922078

<151> 2020-10-13

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Lys Gly Leu Asp

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Val

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Lys Gly Leu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

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Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 9

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

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35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys

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Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

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Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

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355 360 365

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370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

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<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

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Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

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Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

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Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agctatggca tgcac 15

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttatatggt atgatggaac taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagaaggggc tggac 15

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<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aagtccagcc agagtgtttt atacagctcc accaataaga actacttagt t 51

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgggcatcta cccgggaatc c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagcaatatt atagtactcc gtggacg 27

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<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg atggaactaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagaag 300

gggctggact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342

<210> 20

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca ccaataagaa ctacttagtt 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300

ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339

<210> 21

<211> 692

<212> PRT

<213> 智人(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

Claims (19)

1.一种稳定的制剂，包含：

(1)浓度为50-200mg/mL抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；和

(2)浓度为1-50mmol/L的药学上可接受的缓冲剂；和

(3)浓度为0-1％w/w的药学上可接受的表面活性剂；和

(4)浓度为100-400mmol/L或1-10％w/w的一种以上其他药学上可接受的赋形剂；

其中所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区(HCDRs)和轻链互补决定区(LCDRs)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1,2和3所示的氨基酸序列具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性；LCDR1、LCDR2和LCDR3包含与SEQ ID NO:4，5和6所示的氨基酸序列具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性。

2.如权利要求1所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性；所述的轻链可变区包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性。

3.如权利要求1或2所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，所述的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，优选地，IgG1或IgG4恒定区，更优选的是IgG4恒定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述轻链恒定区选自人κ轻链恒定区或λ轻链恒定区，优选κ轻链恒定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含两条重链和两条轻链或由两条重链和两条轻链组成，所述的重链具有SEQID NO:11所示的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的每个重链互补决定区和/或每个轻链互补决定区根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义的组合、IMGT定义、AbM定义或CDR的接触定义来定义；优选地，每个CDR根据Kabat的CDR定义或Chothia的CDR定义或二者的组合来定义。

6.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的浓度为70-200mg/mL。

7.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的药学上可接受的缓冲剂选自：组氨酸、醋酸盐、琥珀酸盐、或谷氨酸盐，所述的缓冲剂浓度为5-50mmol/L，优选的是10-30mmol/L；优选的缓冲剂是由L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂。

8.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的药学上可接受的表面活性剂为聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，所述的表面活性剂的浓度为0.01-0.05％(w/w)。

9.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的一种其他药学上可接受的赋形剂选自脯氨酸、蔗糖、氯化钠、山梨醇、甘露醇、或盐酸精氨酸中的任意一种或其组合，优选的其他赋形剂是200-300mmol/L脯氨酸或5％-10％(w/w)蔗糖，更优选的是脯氨酸。

10.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述制剂的pH值约为4.5-6.5，优选pH值为5.5-6.5。

11.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的制剂是液体制剂，或冻干制剂，所述冻干制剂为复溶后的液体制剂，所述的液体制剂在25℃下的粘度小于15cp，优选在25℃下的粘度小于10cp，所述的液体制剂在25℃下渗透压为220～370mOsm/Kg，优选渗透压为250-350mOsm/Kg，更优选渗透压为300-330mOsm/Kg。

12.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的液体制剂在约5℃至约40℃条件下可以稳定储存至少2周、至少4周、至少8周、至少12周、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少36个月。

13.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的制剂在2-8℃条件下储存至少3、6、12、24个月或36个月，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的纯度下降不超过10％，和/或酸碱电荷异质体不超过50％，和/或聚集物增加不超过10％，和/或降解物增加不超过10％，优选地，所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的纯度下降不超过5％，和/或聚集物增加不超过5％，和/或降解物增加不超过5％。

14.如权利要求1-5中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，包含：

(1)浓度为70-200mg/mL抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；及

(2)由浓度比为0.2∶1-3∶1的L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐组成的组氨酸缓冲剂；及

(3)浓度为0.01-0.05％w/w聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20；及

(4)浓度为200-300mmol/L脯氨酸；

所述缓冲剂的浓度为1-50mmol/L，制剂的pH值为5.5-6.5，

其中所述的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR2和SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列的LCDR3。

15.一种如权利要求1-14中任一项所述的稳定的制剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

a)提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段；

b)加入缓冲剂和渗透压调节剂；

c)加入表面活性剂；

d)除菌过滤；

e)分装。

16.一种预填充注射器，其特征在于，所述的预填充注射器中装载有如权利要求1-14中任一项的稳定的制剂，所述制剂是液体制剂。

17.如权利要求1-14中任一项所述的稳定的制剂，其特征在于，所述的制剂可以胃肠道外给药，优选皮下或肌肉注射。

18.如权利要求1-14中任一项所述的稳定的制剂在制备用于治疗、预防或改善任何与PCSK9相关的疾病或症状的药物中的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，与PCSK9相关的疾病或病症选自，血脂异常，高脂蛋白血症，高脂血症；血脂异常；高胆固醇血症、心脏病、中风、冠心病、动脉粥样硬化、周围血管病、跛行、II型糖尿病、高血压、心血管疾病或状况、炎症或自身免疫性疾病。