CN104593393B - 红林蚁AChE基因、红林蚁AChE及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因、所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）、制备该酶的方法。红林蚁AChE基因及所编码的红林蚁AChE，其碱基序列及氨基酸序列如序列表所示。该酶的制备方法包括以下步骤：（1）构建并PCR扩增红林蚁AChE基因全序列；（2）构建红林蚁AChE全序列构建真核重组表达载体；（3）转化毕赤酵母宿主细胞，培养，诱导表达；（4）纯化。本发明通过通过实验证明，所制备的红林蚁AChE相较于现有的果蝇AChE具有更高的活性和灵敏度，因而在未来的农药检测试剂制备技术领域具有较好的应用前景。

Description

红林蚁AChE基因、红林蚁AChE及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因、所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）、制备该酶的方法。

背景技术

现在全球环境污染尤其是农药污染日益严重，能快速、简便地检测农药残留尤显迫切。多数农药是有机磷及氨基甲酸酯类，已被大量运用于各类农作物的生产。但此类农药已经给环境造成严重污染、毒害人畜，为此开发灵敏快速的农药残留监测具有重要实意义。

目前运用较广的检测农药残留方法是利用乙酰胆碱酯酶（achetylcholinesterase，AChE）与有机磷和氨基甲酸类农药的抑制反应，通过分光光度检测的方法来定量农药残留量的多少。此方法具有成本低、检测快、相对较灵敏的优点，适宜于较大范围的农残检测需求。因此，农残检测试剂盒的核心试剂原料——乙酰胆碱酯酶的制备即成为技术的关键。

运用基因工程手段以毕赤酵母真核表达体系来制备AChE是主流发展趋势。现有技术中，虽有大量有关利用昆虫乙酰胆碱酯酶基因制备的真核表达体系的研究和报道，但由于对农药的灵敏度仍不太理性，因而仍待改进。而到目前为止，尚未见到有关利用红林蚁的乙酰胆碱酯酶基因及利用其制备的真核表达体系的有关研究报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因、所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）、制备该酶的方法，简而言之，本发明目的在于提供一种利用红林蚁乙酰胆碱酯酶基因及利用该基因所构建的毕赤酵母真核表达体系，利用该体系表达获得的红林蚁乙酰胆碱酯酶可以用于制备农药残留检测试剂盒，从而实现在农药残留试剂检测方面的应用。

本发明所采取的技术方案如下。

红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因，碱基序列如序列表序列1所示。

红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE），其氨基酸序列如序列表序列2所示。

所述红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建并PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因全序列，具体包括以下步骤：

1、提取总RNA，反转录获得cDNA；

2、获得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因保守序列；

引物序列设计如下：

U-ACHE-F：GGTTCGAGGGAGAGGAGATGTGGAA，

U-ACHE-R：CCGTGCATCACTCCCATCCATTC；

以红林蚁cDNA 为模板，以所设计的U-ACHE-F和U-ACHE-R为引物，PCR扩增出红林蚁的乙酰胆碱酯酶基因的保守序列；

3、红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因的3’端和5’端扩增；

设计3’端和5’端特殊引物，引物序列设计如下：

3`GSP-Outer:CACGCAGAGGACGAGTACCAACGTA，

3`GSP-Inner:GAATATGTCACAAATCGAGCGAGAAGCC；

5`GSP-Outer:GACGCTTAGTGAAGTATCGCCTGCA，

5`GSP-Inner: GAGATGTTGGTGTTTGGGTTCCACA。

PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶基因的3’端和5’端基因片段；

4、PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因全序列；

根据已知的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）基因全序列设计引物，引物设计目的在于引入限制性内切酶EcoRI和NotI的酶切位点，引物设计序列如下（序列中下划线部分为酶切位点）：

FF：TCAGAATTCATGAGTTTTTGGATGAATTGTCCGTC，

FR：CAAGCGGCCGCCCCTGTGTATGCGAATTGCGAGAA；

以步骤2所得红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）基因保守序列、步骤3所得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因的3’端和5’端为模板进行PCR扩增，获得红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）基因全序列（即红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）编码区开放阅读框）；

（2）利用步骤1所构建的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）全序列构建真核重组表达载体；

所采用的真核表达载体是pPICZαA，该载体是表达6×His标签的高效表达载体，同时该载体具有多酶切位点，易于插入外源基因片段如红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因编码序列；

（3）将步骤2所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母宿主细胞，培养，诱导表达红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）；

将所构建的真核重组质粒表达载体电击转化进入毕赤酵母X33感受态菌株，筛选阳性菌株，扩增培养，甲醇诱导红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）表达；

（4）红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的纯化；

由于所采用的真核表达载体pPICZαA特异性表达6×His标签，因而进一步通过Ni-NTA His-Bind Resins 柱即可获得纯化的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）。

所述红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）在农药残留中的应用，所述农药为有机磷或氨基甲酸酯类农药。

红林蚁（Formica cinae），属于蚁亚科(Formicinae)蚁属(Fomicia)，以捕食昆虫为食，广泛分布在我国北方地区。本发明通过将红林蚁乙酰胆碱酯酶基因克隆、重组后转化到毕赤酵母内，加甲醇诱导，获取目的蛋白乙酰胆碱酯酶，用于农产品中农药的残留检测。通过实验证明，本发明所制备的红林蚁乙酰胆碱酯酶相较于现有的果蝇乙酰胆碱酯酶具有更高的活性和灵敏度，因而在未来的农药检测试剂制备技术领域具有较好的应用前景。

附图说明

图1为重组质粒的酶切与PCR鉴定图，在图1中，M：DNA Maker(DL 5000)；1、2：重组质粒EcoRI和NotI双酶切结果；3、4：重组质粒PCR鉴定结果。

图2是真核重组质粒表达载体转化至毕赤酵母X33后不同阶段电泳图；图中M：低分子量蛋白Maker；1：甲醇诱导表达后纯化的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE），2：毕赤酵母X33发酵液中上清蛋白，3：未诱导表达的发酵液中上清蛋白，4：甲醇诱导后未纯化的上清蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

介绍具体实施例前，首先对本发明中所用到的主要仪器设备和试剂简要介绍如下。

主要设备：台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1650-W）；

电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-7C型），PCR仪(TAKARA BIO INC,D-8707)；

紫外仪（北京六一仪器厂，DWD-9403C型）；

恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司，ZWY-2012C)；

Bio-Rad MicroPulser（北京友华照钦医疗器械有限公司，Micro Pulser）；

CL-B八通道残留农药测定仪（上海博纳新技术研究所，CL-B八通道)。

主要试剂：Mollusc RNA Kit(OMEGA,R6875-00)；

Prime Script^TM 1st strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa,6210A)；

3`-Full RACE CoreSet(TaKaRa,D314)；

5`-Full RACE CoreSet (TaKaRa,D315)；

TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa,9760)；

T4 DNA 连接酶（纽英伦生物技术（北京）有限公司，M0202)；

酵母粉（天津科密欧化学试剂有限公司）；

蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；

甲醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）；

S-乙酰基硫代乙酰胆碱，96%（Alfa Aesar,A Johnson Mathey Company，A16802）；

DTNB(生工生物，D8350)；

乙酰胆碱酯酶（家蝇）(北京中生瑞泰科技有限公司，9000-81-1)；

马拉硫磷、杀扑磷、辛硫磷、乙酰甲胺磷均为农药检测标准品（上海

农药研究所，SPL-BA-017、SPL-BA-022、SPL-BA-009、SPL-BA-011）。

菌株和载体：

大肠杆菌感受态 E.coli JM109（TaKaRa，9052）；

PMD^TM19-T Vector Cloning Kit（TaKaRa，6013）；

毕赤酵母 Pichia pastoris X33 (Invitrogen, K1740-01)；

酵母表达载体 pPICZαA (Invitrogen, K1740-01)。

实验材料：

红林蚁，2013年9月份取材于河南省焦作市云台山中。

实施例

红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因，碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE），其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

制备红林蚁乙酰胆碱酯酶的技术原理是：利用重组DNA技术将红林蚁乙酰胆碱酯酶基因克隆至真核表达载体，并使其在毕赤酵母中大量表达，进一步纯化即可得到其表达产物乙酰胆碱酯酶。

红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，具体包括以下步骤：

1、构建并PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因全序列

（1）提取总RNA，反转录获得cDNA

A．提取总RNA，以捕获的太行山脉红林蚁作为实验材料，按照Moluse RNA kit实验步骤提取总RNA；提取步骤具体如下：

a．取红林蚁头部约50 mg，液氮研磨，转至1.5 mL EP管(RNase-free)中，加入1 mLRNA-Solv 试剂用力涡旋至红林蚁头部研磨物团块全部溶解，室温孵育3 min；

b．加入0.2 mL 氯仿，用力混匀15 s，室温放置3 min；4℃，12000×g离心15 min，RNA完全溶于低酚氯仿相的上层水相中；

c．将不超过80 %的水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10 min；4℃，12000×g离心3 min，弃上清（倒置排尽残液）；

d．100 μL无菌DEPC水（预热至65℃）重悬；加入350 μL Buffer RB（2-巯基乙醇）和250 μL 无水乙醇混匀，混合液转移至HiBind RNA Column；室温10000×g离心30 s，弃上清；加入500 μL RNA Wash Buffer Ӏ，10000×g离心30 s，弃上清；

e．将离心吸附柱置于一个新的收集管（2 mL）上，加入400 μL RNA WashBuffer ，10000×g离心30 s，弃上清，并重复一次，空管全速（20000 ×g）离心2 min，甩干残留液体；

f．将离心吸附柱移至新的1.5 mL EP 管（RNase-free）上，用40 μL无菌DEPC 水洗脱，全速离心1 min；得红林蚁总RNA 40 μL，-80℃保存备用。

．RNA反转录成cDNA，利用Prime Script^TM 1st strand cDNA Synthesis kit将步骤A所提取的红林蚁RNA反转录成cDNA。具体包括以下步骤：

a．在EP管中加入以下反应液：

Oligo dT Primer(50 μM )，1 μL；

dNTP Mixture (10mM each)，1 μL；

红林蚁 RNA，4 µg；

RNase free dH₂O 至10 μL。

65℃保温5min，然后冰上迅速冷却。

b．再向EP管内加入以下反应液：

5×PrimerScript Buffer，4μL；

RNase Inhibitor (20U)，0.5 μL(40 U/μL)；

PrimerScript RTase (200U)，1μL (200 U/μL)；

步骤a中变性后反应液，10μL；

RNase free dH₂O加至20 μL。

c．缓慢混匀，按以下条件反转录：42℃、60min，70℃、15min；反应后冰上冷却，得到20μL 1st cDNA，-20℃保存待用。

（2）红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因保守序列的获得

设计引物，PCR扩增：参照GenBank中其他昆虫乙酰胆碱酯酶基因，设计红林蚁AchE基因保守序列的PCR通用引物，引物序列设计如下：

U-ACHE-F：GGTTCGAGGGAGAGGAGATGTGGAA，

U-ACHE-R：CCGTGCATCACTCCCATCCATTC。

引物由金唯智（北京）生物科技有限公司合成提供。

以步骤B中所得红林蚁cDNA 为模板，以所设计的U-ACHE-F和U-ACHE-R为引物，PCR扩增出红林蚁的乙酰胆碱酯酶基因的保守序列。

PCR扩增程序为：95℃预变性 5 min；95℃变性 0.5 min，60℃退火0.5 min，72℃延伸 1.5 min，共 32个循环；72℃延伸 7min。

PCR 产物通过1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

构建重组质粒：将步骤（2）中PCR扩增的红林蚁乙酰胆碱酯酶AchE基因保守序列与pMD-19T载体连接，构建重组质粒，具体步骤如下：

A．将步骤（2）中切胶回收后的PCR扩增的红林蚁乙酰胆碱酯酶AchE基因序列与pMD-19T载体连接，连接体系如下：

pMD 19-T Vector，1 μL；

Insert DNA（即步骤（2）切胶回收产物），2 μL；

ddH₂O加至5 μL混匀；

然后加入Solution，5 μL。

连接体系总体积10 μL。16℃反应过夜。

B．热激法将连接产物转化到 E. coli JM109，涂布LB平板，37℃培养10~12 h。

C．挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定及EcoRI 和 Hind 双酶切鉴定（鉴定结果见图1），鉴定正确菌株提取质粒进一步测序鉴定，测序由金唯智（北京）生物科技有限公司完成。

双酶切鉴定体系如下：

EcoRI，0.5 μL；

Hind，0.5 μL；

10×NEB Buffer 4，5 μL；

100×BSA，0.2 μL；

筛选后含有阳性重组质粒液体，4 μL；，

ddH₂O加至20μL。

37℃反应3.5h。

（3）红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因的3’端和5’端扩增

设计引物，PCR扩增：根据步骤（2）中红林蚁AchE保守序列片段测序结果，设计3’端和5’端特殊引物，引物序列设计如下：

3`GSP-Outer:CACGCAGAGGACGAGTACCAACGTA，

3`GSP-Inner:GAATATGTCACAAATCGAGCGAGAAGCC；

5`GSP-Outer:GACGCTTAGTGAAGTATCGCCTGCA，

5`GSP-Inner: GAGATGTTGGTGTTTGGGTTCCACA。

引物由金唯智（北京）生物科技有限公司合成提供。

按照3`-Full RACE CoreSet(TaKaRa)和5`-Full RACE CoreSet(TaKaRa)试剂盒说明书扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶基因的3’端和5’端基因片段。

PCR扩增程序为：94℃预变性 3 min；94℃变性 0.5 min，60℃退火0.5 min，72℃延伸 0.75 min，共 30个循环；72℃延伸 10 min。

1%琼脂糖凝胶检测Race扩增PCR产物，胶回收，

构建重组质粒：将所回收的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因3’端和5’端序列与pMD-19T载体连接（连接体系及反应条件同步骤（2）），热激法将连接产物转化到 E. coliJM109，涂布LB平板筛选阳性重组质粒。

挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定及EcoRI和Hind双酶切鉴定（鉴定体系及反应条件同步骤（2）），鉴定正确菌株提取质粒进一步测序鉴定，测序由金唯智（北京）生物科技有限公司完成。

（4）PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因全序列

设计引物，PCR扩增：根据已知的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）基因全序列设计引物，引物设计目的在于引入限制性内切酶EcoRI和NotI的酶切位点，引物设计序列如下（序列中下划线部分为酶切位点）：

FF：TCAGAATTCATGAGTTTTTGGATGAATTGTCCGTC，

FR：CAAGCGGCCGCCCCTGTGTATGCGAATTGCGAGAA。

引物由金唯智（北京）生物科技有限公司合成提供。

以步骤（2）所得红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）基因保守序列、步骤（3）所得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因的3’端和5’端为模板进行PCR扩增，以获得红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）基因全序列（即红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）编码区开放阅读框）。

PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性0.5 min，60℃退火0.5 min，72℃延伸2.5min，共32个循环；72℃延伸7 min。

切胶回收PCR产物。

构建重组质粒：将所回收的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因全序列与pMD-19T载体连接（连接体系及反应条件同步骤（2）），热激法将连接产物转化到 E. coli JM109感受态细胞，涂布LB平板筛选阳性重组质粒。

挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定及EcoRI和NotI双酶切鉴定（酶切鉴定体系如下），鉴定正确菌株提取质粒进一步测序鉴定，测序由金唯智（北京）生物科技有限公司完成。

测序结果表明所得为红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因编码区全长序列，进一步经Blast对比后与拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina)的AchE序列相似度为91%。

EcoRI和NotI双酶切鉴定体系如下：

EcoRI，0.5 μL；

NotI，0.5 μL；

0.1%BSA，0.2 μL；

10×H Buffer，2 μL；

阳性重组质粒，5 μL

ddH₂O加至20 μL。

37℃酶切3.5 h。

、利用步骤1所构建的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）全序列构建真核重组表达载体

本发明所采用的真核表达载体是pPICZαA，该载体是表达6×His标签的高效表达载体，同时该载体具有多酶切位点，易于插入外源基因片段如红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因编码序列。简要介绍过程如下：

酶切，连接：将步骤1回收获得的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE）全序列进行EcoRI和NotI双酶切（酶切体系同步骤1中酶切鉴定体系），同时将pPICZαA载体进行EcoRI和NotI双酶切（酶切体系同步骤1中酶切鉴定体系），酶切后产物进行连接，连接体系如下：

T4 DNA连接酶，1 μL；

T4 DNA连酶缓冲液，5 μL；

酶切后PCR产物，2 μL；

酶切pPICZαA产物，2 μL。

16℃连接过夜。

转化、筛选：将上述过夜后连接体系热激法转化至100 μL大肠杆菌JM109感受态细胞中，加入890μL LB^-液体培养基，37℃、200 rpm摇床培养孵育1h，然后均匀涂布于含有Zeocin（100 μg/mL）LB平板上筛选阳性重组质粒表达载体。

菌落PCR及双酶切鉴定：挑取LB平板上单一阳性菌落扩大培养，菌落PCR鉴定，同时提取质粒EcoRI、NotI双酶切鉴定（酶切鉴定体系同步骤1），为增加结果的可靠性，可增加选取5`端编码区引物FF扩增检测（引物同步骤1中（3））。

将初步鉴定正确的阳性单克隆菌株送金唯智（北京）生物科技有限公司进行进一步测序鉴定。

重组质粒DNA测序结果表明，重组质粒中插入片段的序列与红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）mRNA一致，由此证明成功地将红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的编码序列插入了真核表达载体，且插入方向正确。即经PCR扩增出的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因全序列，成功地插入了真核表达载体pPICZαA中，成功地构建了真核重组质粒表达载体。

、将步骤2所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母宿主细胞，培养，诱导表达红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）

电击法将步骤2所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母X33感受态菌株，筛选阳性菌株，扩增培养，甲醇诱导红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）表达，具体步骤如下：

（1）毕赤酵母X33感受态菌株的制备：

将毕赤酵母X33菌种划YPD平板29℃培养3天直至菌体长至合适大小，挑单菌落至3mL YPD液体培养震荡培养（29℃、220 rpm）至OD₆₀₀=0.6。

1%体积量转接至20.0 mL YPD继续扩大培养（29℃、220 rpm）至OD₆₀₀=0.6。

4℃、1500×g离心5min，弃上清。室温下用8.0 mL X液（100 mM LiAC，10 mM DTT，0.6 M山梨醇和10mM Tris-Hcl，PH=7.5)重悬菌体，常温作用30 min。

4℃、1500×g离心5 min，弃上清。用1 mL冰上预冷的山梨醇（1 M）重悬；转至1.5mL EP管中，4℃，1500×g离心5 min，弃上清，重复三次进行洗涤。

最后用80 μL冰上预冷的山梨醇（1 M）重悬菌体，即为毕赤酵母X33感受态菌体，置冰上待用。

（2）酶切、浓缩真核重组质粒表达载体：

限制性内切酶SacI酶切线性化步骤2所得真核重组质粒表达载体，酶切体系如下：

步骤2的真核重组质粒表达载体，30 μL；

10×CutSmart Buffer，10 μL；

SacI，5 μL；

ddH₂O 加至100μL。

37℃反应4 h。

跑胶鉴定正确后，浓缩酶切产物，具体步骤如下：

将SacI酶切后体系80℃保持10 min，然后依次加入1/10体积的NaAc(1M)，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃反应2.5 h。

12000 rpm离心7 min，弃上清。

加500 μL的75%乙醇轻洗，4℃、12000 rpm离心7 min，弃上清，重复一次。

将EP管开口置于37℃培养箱中直至无乙醇气味后，加入12 μL ddH₂O重溶酶切产物（重溶后取其中2μL用于跑胶检测浓缩效果，剩余10μL -20℃保存备用）。

（3）电击法转化毕赤酵母X33感受态菌株

将步骤（2）浓缩的酶切后的真核重组质粒表达载体10 μL加入到步骤（1）制备的80μL的毕赤酵母X33感受态菌液中，轻轻混匀后转入电转杯内（电转杯提前冰上预冷30 min），冰上放置5 min。

电击转化（2 KV，25 μF，186 Ω），作用5 ms。电击后迅速加入1 mL冰上预冷的山梨醇（1 M），轻轻混匀后转至新的1.5 mL EP管内，30℃孵育1 h。

然后将电转液均匀涂布于Zeocin（100 μg/mL）抗性的YPD平板上，29℃倒置培养三天，直至菌体长至合适大小。

（4）扩增培养，甲醇诱导红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）表达

挑取步骤（3）中阳性单一菌落至液体YPD（Zeocin，100 μg/mL）培养基，振荡培养12h。然后转接到BMMY培养基培养24 h，4℃、1500×g离心5 min，弃上清。

BMGY培养基重悬菌体并继续培养，同时按1%的体积量添加甲醇进行红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的诱导表达。

每隔24h取出培养液上清检测酶活，酶活达到最高峰时停止培养。

停止培养后菌液4℃、10000 r/min离心10 min，取上清，即可获得重组后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的粗酶液。

4、红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的纯化

由于本发明所采用的真核表达载体pPICZαA特异性表达6×His标签，因而步骤3所得的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的粗酶液中的重组后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的C-端带有组氨酸标签，进一步通过Ni-NTA His-Bind Resins 柱（TAKARA公司）即可获得纯化的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE），纯化过程简要介绍如下：

在层析柱中装入适量 Ni-NTA His-Bind Resins，用5倍体积的结合缓冲液平衡树脂。

用48%饱和度的硫酸铵沉淀步骤3所得的重组后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的粗酶液，4℃、12000rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀。

适量结合缓冲液溶解沉淀，让溶解后的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）流过层析柱，弃流出液。用5倍体积的结合缓冲液洗涤层析柱，弃流出液。

用3倍体积的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。

将收集到的洗脱液用10倍体积的生理盐水(pH=7.0)反复透析，除去咪唑即可得到纯化的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）。

分别对步骤3中毕赤酵母X33菌体发酵液甲醇诱导前菌液、甲醇诱导培养24h后菌液、甲醇诱导结束后未纯化的菌液、甲醇诱导醇化后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示。

从图2可以看出，甲醇诱导后的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）在约64 KD大小的位置有明显的AchE条带，因而可以证实红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）在毕赤酵母中获得了高水平的表达；纯化后的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶条带单一且大小正确，表明纯化成功。

实施例2

针对实施例1所制得的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE），发明人进一步进行了活性检测和抑制率检测，简要介绍如下。

实施例1纯化后所得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性检测

按照GB/T 5009.199-2003配制检测试剂：

PH=8.0缓冲液：分别取11.9 g无水磷酸氢二钾与3.2 g磷酸二氢钾，用1000 mL蒸馏水溶解；

显色剂：分别取160 mg 二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6 mg 碳酸氢钠，用20mL 上述配制的PH=8.0缓冲液溶解，4℃保存。

底物：取25 mg S-乙酰基硫代乙酰胆碱，加3.0 mL 蒸馏水溶解，4℃保存。

按照Ellman的方法，取实施例1纯化后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）酶液100 μL，添加2.5 mL磷酸钾缓冲液（1M，PH=8.0)，37℃水浴15 min，然后加入100μL显色剂迅速混匀后加入100 μL底物；在412 nm（比色皿，712型分光光度仪）条件下检测3 min的吸光值（A）的变化量，变化量越大就表明蛋白酶活越高。

根据酶活公式计算酶活，公式如下：

，

其中ΔA为3 min吸光度的变化值，V为酶液的体积（μL)，ρ是蛋白的质量浓度(mg/mL)，所得酶比活为U/mg。

测得纯化后酶比活为1865 U/mg。

将所得纯化后红林蚁乙酰胆碱酯酶和家蝇乙酰胆碱酯酶（中生瑞泰科技有限公司）调整到相同质量浓度，同时进行酶活检测，酶活性检测结果如下表所示。

从上表数据可以看出，本发明获得了更优、活性更高的乙酰胆碱酯酶，可用于工业生产农残检测试剂盒应用。

实施例1纯化后所得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）的农药抑制率的检测

参照CL-B八通道残留农药测定仪（上海博纳新技术研究所）使用说明进行，简要介绍如下。

对照测试：于反应瓶中加入2.5 mL磷酸缓冲液（0.1M，PH=8.0），再分别加入100 μLAChE酶液（重组红林蚁AChE酶液或家蝇乙酰胆碱酯酶）和显色剂，混匀，静置反应10 min后加入100 μL底物，摇匀并立即倒入比色杯中，及时放入仪器的测量室第1通道，合上盖。按〈B〉键，显示屏下方延迟10s后，测量时间开始倒计时180 s，计时完毕，显示屏显示吸光度增量及抑制率。在进行对照测试时，2～8通道可同时进行样品测试。

样品测试：于反应瓶中加入2.5 mL样品待测液(2.4 mL磷酸缓冲液（0.1M，PH=8.0）和100μL农药稀释液)，再分别加入实施例1所制得的100 μL重组红林蚁AChE酶液和显色剂，混匀，静置反应10 min后加入100 μL底物，摇匀并立即倒入比色杯中，及时放入仪器的测量室通道，合上盖。按〈M〉键，显示屏下方延迟10 s后，测量时间开始倒计时180 s，计时完毕，显示屏显示吸光度增量及抑制率，数据自动保存。

以分光光度计测试(412 nm波长)时，按下式计算抑制率：

酶活抑制率（%）=[（∆A₀－∆At）/∆A₀]×100

其中：∆A₀ 为对照溶液反应3min吸光度的变化值；

∆At为样品溶液反应3min吸光度的变化值。

本实施例中，所采用的CL-B八通道残留农药测定仪检测时可对抑制率自动计算。若样品抑制率≥50%，表示样品中农残超标。

用磷酸缓冲液分别稀释农药马拉硫磷、杀扑磷、辛硫磷和乙酰甲胺磷，作为样品待测液。测定对应农药浓度时实施例1所制备的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）及家蝇乙酰胆碱酯酶的抑制率，酶活抑制率（%）测定结果如下表所示。

从表中数据可知，本发明所得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）具有较高的农药抑制率，即3 min的吸光值变化量较大，对应具有更高的酶活，所以对农药更为敏感，更适宜于农药残留的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 红林蚁AChE基因、红林蚁AChE及其制备方法

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> Formica cinae

<400> 1

atgagttttt ggatgaattg tccgtcctcg ttgttgctgt tgctgttagg cctgagcctg 60

catagcgcgt gcatcacgcg agcgaacgtc gccggccagc atggtggcca ggacaatgat 120

cacgatgatc ctctgttggt agagactacg agcggcttga tgcgcggttt ctcccgtaca 180

gtgcttgaac gcgaggtcca cgtattctac ggagtgccgt tcgcgaaacc ccccgtcggt 240

ccgttgcggt ttcgcaagcc gctgccgatc gaaccctggc acggaatcct gaatgctacc 300

acattgccca acagttgcta ccaggagcgt tacgagtatt ttcctggttt cgagggtgag 360

gagatgtgga acccaaacac caacatctct gaggattgtc tctatctaaa catctgggtg 420

ccacagaagc tacgtctacg tcacaaacct gagtcacagg acaatgccgg taataatggc 480

atggcgatat tagtatggat ctacggcggc ggcttcatga gtggtactgc cactttggac 540

gtttatgacg ccgaccttat ggcagcggcc ggcaatgcaa taatcgcatc gatgcagtac 600

cgagtcggtg ctttcggctt tctgcacctc aatcagcact ttaccaacag tgaggaggca 660

ccgggcaata tgggcctttg ggatcaagct ttggctctca ggtggctgcg cgaaaatgcg 720

cgcgctttcg gcggcgatcc cgatttgatt acaattttcg gcgaatccgc aggcggcagt 780

tcggtatctc tacacctgat ctcaccagtt acacagggtc tagtacgccg ggggattctt 840

caaagtggca ctctgaacgc cccatggagt tacatgaccg gcgaaaaggc gaatgaggtg 900

gcccgagtat tggtagacga ttgtggatgt aattcgacga tgctgcaggg aaacccggcg 960

cgagttatgg cctgtatgag gtcggtggat gcaaaaaccc tctccgtgca gcagtggagc 1020

agttattggg gcatcctcgg ctttccgtcg gcgcccacta ttgacggcgt ctttctacct 1080

aaggatccgt tggacttggt cagggaggcg gacttcaaag acaccgagat cctgattgga 1140

aataacgaaa acgaaggaac gtactttatt ctgtacgatt ttattgactt cttcgagaaa 1200

gatcaagcca gttttctcga acgagacaag tttctcaaca tcattaatac cattttcaag 1260

aatatgtcac aaatcgagcg agaagccatc attttccaat ataccgattg ggatcagata 1320

aatgacggct ataagaatca gaaagcggta gcggatgtcg tgggcgatta tctcttcatc 1380

tgcccatcca cgcatttcgc tcagttgttt gcagatcgtg gcatgaaggt ctactattac 1440

ttcttcacgc agaggacgag taccaacgta tggggcgaat ggatgggagt gatgcacggt 1500

gatgaggtag aatatgtctt cgggcatcct ttgaaccaat ctctggtata caacgccaaa 1560

gagcgagatc tggcttccag aataattcgc tatttctcgc aattcgcata cacagggtag 1620

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> Formica cinae

<400> 2

Met Ser Phe Trp Met Asn Cys Pro Ser Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ser Leu His Ser Ala Cys Ile Thr Arg Ala Asn Val Ala Gly

20 25 30

Gln His Gly Gly Gln Asp Asn Asp His Asp Asp Pro Leu Leu Val Glu

35 40 45

Thr Thr Ser Gly Leu Met Arg Gly Phe Ser Arg Thr Val Leu Glu Arg

50 55 60

Glu Val His Val Phe Tyr Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Val Gly

65 70 75 80

Pro Leu Arg Phe Arg Lys Pro Leu Pro Ile Glu Pro Trp His Gly Ile

85 90 95

Leu Asn Ala Thr Thr Leu Pro Asn Ser Cys Tyr Gln Glu Arg Tyr Glu

100 105 110

Tyr Phe Pro Gly Phe Glu Gly Glu Glu Met Trp Asn Pro Asn Thr Asn

115 120 125

Ile Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Lys Leu

130 135 140

Arg Leu Arg His Lys Pro Glu Ser Gln Asp Asn Ala Gly Asn Asn Gly

145 150 155 160

Met Ala Ile Leu Val Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Met Ser Gly Thr

165 170 175

Ala Thr Leu Asp Val Tyr Asp Ala Asp Leu Met Ala Ala Ala Gly Asn

180 185 190

Ala Ile Ile Ala Ser Met Gln Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu

195 200 205

His Leu Asn Gln His Phe Thr Asn Ser Glu Glu Ala Pro Gly Asn Met

210 215 220

Gly Leu Trp Asp Gln Ala Leu Ala Leu Arg Trp Leu Arg Glu Asn Ala

225 230 235 240

Arg Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asp Leu Ile Thr Ile Phe Gly Glu Ser

245 250 255

Ala Gly Gly Ser Ser Val Ser Leu His Leu Ile Ser Pro Val Thr Gln

260 265 270

Gly Leu Val Arg Arg Gly Ile Leu Gln Ser Gly Thr Leu Asn Ala Pro

275 280 285

Trp Ser Tyr Met Thr Gly Glu Lys Ala Asn Glu Val Ala Arg Val Leu

290 295 300

Val Asp Asp Cys Gly Cys Asn Ser Thr Met Leu Gln Gly Asn Pro Ala

305 310 315 320

Arg Val Met Ala Cys Met Arg Ser Val Asp Ala Lys Thr Leu Ser Val

325 330 335

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Trp Gly Ile Leu Gly Phe Pro Ser Ala Pro

340 345 350

Thr Ile Asp Gly Val Phe Leu Pro Lys Asp Pro Leu Asp Leu Val Arg

355 360 365

Glu Ala Asp Phe Lys Asp Thr Glu Ile Leu Ile Gly Asn Asn Glu Asn

370 375 380

Glu Gly Thr Tyr Phe Ile Leu Tyr Asp Phe Ile Asp Phe Phe Glu Lys

385 390 395 400

Asp Gln Ala Ser Phe Leu Glu Arg Asp Lys Phe Leu Asn Ile Ile Asn

405 410 415

Thr Ile Phe Lys Asn Met Ser Gln Ile Glu Arg Glu Ala Ile Ile Phe

420 425 430

Gln Tyr Thr Asp Trp Asp Gln Ile Asn Asp Gly Tyr Lys Asn Gln Lys

435 440 445

Ala Val Ala Asp Val Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ile Cys Pro Ser Thr

450 455 460

His Phe Ala Gln Leu Phe Ala Asp Arg Gly Met Lys Val Tyr Tyr Tyr

465 470 475 480

Phe Phe Thr Gln Arg Thr Ser Thr Asn Val Trp Gly Glu Trp Met Gly

485 490 495

Val Met His Gly Asp Glu Val Glu Tyr Val Phe Gly His Pro Leu Asn

500 505 510

Gln Ser Leu Val Tyr Asn Ala Lys Glu Arg Asp Leu Ala Ser Arg Ile

515 520 525

Ile Arg Tyr Phe Ser Gln Phe Ala Tyr Thr Gly

530 535

Claims (6)

1.红林蚁乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于，碱基序列如序列表序列1所示。

2.权利要求1所述红林蚁乙酰胆碱酯酶基因所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶，其特征在于，氨基酸序列如序列表序列2所示。

3.权利要求2所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）构建并PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶基因全序列；

（2）利用步骤（1）所构建的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因全序列构建真核重组质粒表达载体；

（3）将步骤（2）所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母宿主细胞，培养，诱导表达红林蚁乙酰胆碱酯酶；

（4）将步骤（3）表达后的红林蚁乙酰胆碱酯酶纯化。

4.如权利要求3所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述真核表达载体为pPICZαA质粒。

5.如权利要求3所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述毕赤酵母采用毕赤酵母X33菌株。

6.如权利要求3所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述纯化采用Ni-NTA His-Bind Resins 柱进行纯化。