CN104587460A - 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104587460A CN104587460A CN201410822442.4A CN201410822442A CN104587460A CN 104587460 A CN104587460 A CN 104587460A CN 201410822442 A CN201410822442 A CN 201410822442A CN 104587460 A CN104587460 A CN 104587460A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- cell
- canine distemper
- mink
- viral enteritis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 208000002648 Mink Viral Enteritis Diseases 0.000 title claims abstract description 81
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 63
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 title claims abstract description 45
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 title claims abstract description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 95
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 claims abstract description 59
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 42
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 17
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 229940062042 oxygen 50 % Drugs 0.000 claims description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 12
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 7
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 7
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 239000002435 venom Substances 0.000 claims description 6
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims description 6
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 238000012834 spinner culture method Methods 0.000 claims description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 3
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 39
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 13
- 241001508687 Mustela erminea Species 0.000 description 8
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 3
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 230000001373 regressive effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000025906 Aleutian Mink Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- -1 mono-O Chemical class 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用，本发明的一种二联活疫苗，其有效成分包括水貂病毒性肠炎病毒抗原以及犬瘟热病毒抗原，其中所述的水貂病毒性肠炎病毒抗原为水貂病毒性肠炎病毒JLM株，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9904；所述的犬瘟热病毒抗原为犬瘟热病毒JTM株，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9905。本发明从体液免疫、免疫攻毒保护水平及病理学变化等几方面，均证实MEV JLM株与CDV JTM株间无免疫干扰，并在此基础上，进一步研究了该二联活疫苗的安全和效力，结果表明本发明的一种二联活疫苗使用安全，二联苗的效力均不低于各单苗的效力标准。
Description
技术领域
本发明涉及一种二联活疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用。本发明属于兽用生物制品技术领域，
背景技术
水貂作为一种珍贵的皮毛动物，在世界范围内有着广泛的养殖。丹麦、中国、美国、加拿大、荷兰、俄罗斯、芬兰等都是水貂养殖大国，我国水貂养殖量位居世界第一。水貂养殖具有市场稳定、经营风险小和经济效益好等特点，具有良好的养殖前景。由于我国水貂养殖业多以小规模的家庭式分散养殖为主，饲养条件差，免疫防控不统一、不及时，加之疾病的流行造成整体生产效率低下。目前危害我国水貂养殖业的病毒性传染病主要有水貂病毒性肠炎、水貂犬瘟热和水貂阿留申病等。
水貂病毒性肠炎是由水貂病毒性肠炎病毒(MEV)引起的一种高度接触性传染病，广泛流行于世界各养貂国，是公认的危害水貂养殖业的疾病之一。该病具有较高的发病率和死亡率，3到6月龄的幼貂最易感染，死亡率高达60％。我国于1974年首次发生该病，之后在我国多地爆发性流行，发病率达83.4％，死亡率达15.1％，严重的危害了我国水貂养殖业。
水貂犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种急性、高传染性、高死亡率的疾病，广泛分布于世界各国。该病一年四季均可发病，以夏秋为多发季节，不同年龄、不同品种的水貂均易感，断乳后至3月龄的幼貂最易感染，具有较高的发病率和死亡率。我国1973年首次报道了水貂犬瘟热，以后蔓延至全国，给我国水貂养殖业造成了巨大的经济损失。2002年8月，富锦市某貂场爆发犬瘟热，发病率41.2％，死亡率97.1％；2002年9月，临沂市某貂场爆发犬瘟热，发病率67.9％，死亡率44％；2004年4月，山东潍坊某貂场爆发犬瘟热，发病率50％，死亡率20％。
目前，预防水貂病毒性肠炎和水貂犬瘟热多采用疫苗接种。国内水貂病毒性肠炎疫苗均为灭活苗，犬瘟热为活疫苗，没有联苗。因此国内急需研制水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，以达到一针防两病，提高免疫效果，节省劳动力的目的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种免疫力高、无免疫干扰的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，达到同时预防水貂病毒性肠炎以及水貂犬瘟热的目的。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，其特征在于有效成分包括水貂病毒性肠炎病毒抗原以及犬瘟热病毒抗原，其中所述的水貂病毒性肠炎病毒抗原为水貂病毒性肠炎病毒JLM株，分类命名为水貂病毒性肠炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9904，保藏时间为2014年10月30日；所述的犬瘟热病毒抗原为犬瘟热病毒JTM株，分类命名为犬瘟热病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9905，保藏时间为2014年10月30日。
在本发明中，优选的，每头份所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗中，水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50。
本发明的目的之二是提供所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗在在制备预防或治疗水貂病毒性肠炎以及水貂犬瘟热中的应用。
本发明的目的之三是提供一种制备水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的方法。
在本发明中，分别提供了三种制备水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的方法，分别是转瓶培养方法、悬浮培养方法以及微载体悬浮培养方法。
其中，一种制备所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的转瓶培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液制备
取生长良好的CRFK细胞按MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒JLM株病毒，置37℃下培养，培养4～5日后收获病毒液，-15℃冻融1次后保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(2)制苗用犬瘟热病毒病毒液制备
取生长良好的Vero或MDCK单层细胞按MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒JTM株病毒，置37℃下培养，培养4～5日后收获病毒液，-15℃冻融1次后保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(3)配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将水貂病毒性肠炎病毒与犬瘟热病毒病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
其中，一种制备所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液的制备：取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(2)制苗用犬瘟热病毒病毒液的制备：取生长良好的Vero或MDCK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(3)配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将MEV与CDV病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
其中，一种制备所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的微载体悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液的制备：取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(2)制苗用犬瘟热病毒病毒液的制备：取生长良好的Vero或MDCK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时。当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(3)配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将MEV与CDV病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
在水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的研发过程中，我们发现水貂病毒性肠炎病毒JLM株与水貂犬瘟热病毒JTM株均具有优良的安全性和免疫原性，两者同时免疫水貂无免疫干扰现象。因此选定水貂病毒性肠炎病毒JLM株和犬瘟热病毒JTM株作为毒种研制出了水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗(JLM株+JTM株)(简称二联苗)。为进一步确定两个毒种间无免疫干扰作用，研究中进行了多项试验，从体液免疫、免疫攻毒保护水平及病理学变化等几方面，证实MEV JLM株与CDV JTM株间无免疫干扰。在此基础上，进一步研究了二联苗的安全和效力，结果表明疫苗使用安全，二联苗的效力均不低于各单苗的效力标准。
附图说明
图1为水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗效力试验2008121批制品免疫组水貂攻毒后肠道(正常)；
图2为水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗效力试验2008121批制品MEV对照组No.0464号水貂攻毒后肠道(出血)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1制苗用毒种的来源与特性
①水貂病毒性肠炎病毒JLM株
制造本品用毒种系从吉林省某貂场采集的水貂粪拭子中分离所得，经CRFK细胞传代，特异性中和试验、免疫荧光试验、PCR和基因序列分析等鉴定，证实该毒株为水貂病毒性肠炎病毒(MEV)。动物回归试验表明该毒株仅具有较弱的致病力。随即我们将该毒株在CRFK细胞上进行传代致弱，病毒滴度可达到105.6TCID50/ml以上。对MEV JLM株病毒进行安全性、免疫原性、特异性、纯净性等全面鉴定，表明MEV JLM株病毒具有优良的安全性、免疫原性良好，无菌、无支原体、无外源病毒污染。
所述的水貂病毒性肠炎病毒，命名为JLM株，分类命名为水貂病毒性肠炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9904，保藏时间为2014年10月30日
②水貂犬瘟热病毒JTM株
制造本品用毒株系从吉林省九台市某貂场采集的发病貂肺脏分离所得，经Vero细胞传代，特异性中和试验、免疫荧光试验、RT-PCR、基因序列分析和动物回归试验等鉴定，证实该病毒为水貂犬瘟热病毒(CDV)。动物回归试验，发病水貂组织脏器制备的脏器毒接种水貂后，2/4的水貂出现体温升高，眼鼻分泌物增多、稀便等症状。随即我们将分离毒在Vero细胞上进行传代致弱，病毒滴度达到105.2TCID50/ml以上。对CDV JTM株病毒进行安全性、免疫原性、特异性、纯净性等全面鉴定，表明CDV JTM株病毒安全性、免疫原性良好，无菌、无支原体、无外源病毒污染。
所述的犬瘟热病毒，命名为JTM株，分类命名为犬瘟热病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9905，保藏时间为2014年10月30日。
实施例2二联苗的制备方法
1、制苗用病毒液制备
1.1制苗用MEV病毒液制备
1.1.1用转瓶方法制备
取生长良好的CRFK细胞，同步按MOI为0.005-0.5接种MEV JLM病毒(CGMCC No.9904)，置37℃下培养。培养4～5日后收获病毒液，-15℃冻融1次后保存，分别测定各批次病毒含量并进行无菌检验备用。
1.1.2用悬浮培养方法制备
取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时。控制转速为8～12转/小时。当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入15L生物反应器中培养48～72小时。当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至150L生物反应器中培养48～72小时。当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种MEV生产毒种JLM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用。
1.1.3用微载体悬浮培养方法制备
取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
1.2制苗用CDV病毒液制备
1.2.1用转瓶方法制备
取生长良好的Vero单层细胞按MOI为0.005-0.5接种CDV JTM病毒(CGMCCNo.9905)，置37℃下培养。培养4～5日后收获病毒液，-15℃冻融1次后保存，分别测定各批次病毒含量并进行无菌检验备用。
1.2.2用悬浮方法制备
取生长良好的Vero细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时。控制转速为8～12转/小时。当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入15L生物反应器中培养48～72小时。当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至150L生物反应器中培养48～72小时。当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种CDV生产毒种JTM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用。
1.1.3用微载体悬浮培养方法制备
取生长良好的Vero细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时。当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
2、病毒含量测定
2.1MEV病毒含量测定
将毒种或疫苗(疫苗先用稀释液稀释成1头份/ml)用含2％新生牛血清的DMEM培养基将稀释好的疫苗作10倍系列稀释。取10-2、10-3、10-4、10-54个稀释度，接种培养1～4小时CRFK细胞的96孔培养板，每个稀释度接种8孔，0.1ml/孔，同时设正常细胞对照孔。置37℃、含5％CO2培养箱培养。观察7日，-15℃冻融一次，微量血凝试验检测每孔血凝性，若出现红细胞凝集，则判为阳性，用Spearman-Karber公式计算TCID50。
2.2CDV病毒含量测定
将毒种或疫苗(疫苗先用稀释液稀释成1头份/ml)用含2％新生牛血清的DMEM分别作10倍系列稀释。取10-2、10-3、10-4、10-54个稀释度，接种长满单层Vero细胞的96孔培养板，每个稀释度接种8个孔，0.1ml/孔，同时设正常细胞对照孔。置37℃、含5％CO2培养箱培养4～5日，观察细胞病变(CPE)，用Spearman-Karber法计算TCID50。
3、无菌检验
按《中国兽药典》(二O一O年版)(三部)附录进行无菌检验。
4、配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液。将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗含MEV不低于102.5TCID50，CDV不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂。将MEV与CDV病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
按照上述方法分别制备了三批水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，批号分别为2008121、2008122和2008123。
实施例3水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗超剂量接种安全性试验
为评价水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗接种水貂后的安全性，使用7～8周龄水貂病毒性肠炎、犬瘟热抗原、抗体均阴性健康水貂20只，分为4组，每组5只。第1组至第3组为疫苗接种组，分别接种该疫苗3批制品(批号为：2008121、2008122、2008123)，10头份/只(正常剂量为1头份/只)，第4组为对照组，每只接种1ml PBS溶液，疫苗接种后连续21日对试验动物进行测温及临床观察，试验结束所有动物剖检。结果表明，疫苗接种后各组水貂体温正常，精神状态及食欲良好，注射部位及全身未见不良反应。试验结束所有动物剖检观察，水貂各组织脏器均未见异常。结果表明，水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗(JLM株+JTM株)10倍剂量接种对水貂安全。
实施例4、水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的效力试验
本实施例进行该疫苗3批制品(批次：2008121、2008122、2008123)的效力学试验。试验选用7～10周龄水貂病毒性肠炎、犬瘟热抗原、抗体均阴性健康易感水貂40只，试验分4组，每组10只。第1组至第3组分别接种3批该疫苗制品，注射剂量为1头份/ml/只。第4组为PBS对照组。免疫后28日，从各免疫组和对照组各随机取5只水貂，每只水貂注射MEV ZJ株强毒1ml。攻毒后，每日采集水貂粪拭子进行血凝检测，观察水貂精神、食欲状态，粪便形态，有无腹泻等其他症状，试验于攻毒后14天结束。剩余各免疫组和对照组水貂，每只水貂注射CDV DL株攻击用强毒2ml。攻毒后，每日观察水貂精神、食欲状态，粪便形态，有无腹泻、眼鼻黏性或脓性分泌物、脚垫增厚等症状，试验于攻毒后21天结束。攻毒试验结束后，统计每组动物保护情况。结果显示：疫苗接种后28日，二联苗组攻击MEV ZJ株强毒后3批疫苗制品的保护率分别为5/5、4/5、5/5；MEV阴性对照组攻击MEVZJ株强毒后发病率为4/5；二联苗组攻击CDV DL株脏器毒后3批疫苗制品的保护率分别为4/5、5/5、5/5；CDV阴性对照组攻击CDV DL株脏器毒后发病率为4/5。结果表明，实验室制品对MEV和CDV强毒攻击均可提供良好保护，可有效预防水貂病毒性肠炎和犬瘟热。
图1为水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗效力试验2008121批制品免疫组水貂攻毒后肠道照片，显示正常；图2为水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗效力试验2008121批制品MEV对照组No.0464号水貂攻毒后肠道照片，显示有明显出血现象。
Claims (6)
1.一种水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，其特征在于有效成分包括水貂病毒性肠炎病毒抗原以及犬瘟热病毒抗原，其中所述的水貂病毒性肠炎病毒抗原为水貂病毒性肠炎病毒JLM株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9904；所述的犬瘟热病毒抗原为犬瘟热病毒JTM株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9905。
2.如权利要求1或2所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗，其特征在于每头份疫苗中，水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50。
3.权利要求1或2所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗在制备预防或治疗水貂病毒性肠炎以及犬瘟热药物中的应用。
4.一种制备权利要求1或2所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的转瓶培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液制备
取生长良好的CRFK细胞按MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒JLM株病毒，置37℃下培养，培养4～5日后收获病毒液，-15℃冻融1次后保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(2)制苗用犬瘟热病毒病毒液制备
取生长良好的Vero或MDCK单层细胞按MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒JTM株病毒，置37℃下培养，培养4～5日后收获病毒液，-15℃冻融1次后保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(3)配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将水貂病毒性肠炎病毒与犬瘟热病毒病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
5.一种制备权利要求1或2所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液的制备：取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(2)制苗用犬瘟热病毒病毒液的制备：取生长良好的Vero或MDCK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(3)配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将水貂病毒性肠炎病毒与犬瘟热病毒病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
6.一种制备权利要求1或2所述的水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗的微载体悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制苗用水貂病毒性肠炎病毒病毒液的制备：取生长良好的CRFK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种水貂病毒性肠炎病毒生产毒种JLM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(2)制苗用犬瘟热病毒病毒液的制备：取生长良好的Vero或MDCK细胞接种到细胞转瓶中，置37℃培养48～72小时，控制转速为8～12转/小时；当细胞长成致密单层时用0.25％胰酶消化成单个细胞并计数，按0.8×105～1.2×105个/ml细胞密度将细胞接入一级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时。当细胞密度不低于2×106个/ml时，按照同样条件将细胞转移至二级生物反应器中，每升含微载体5g，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/ml时，以MOI为0.005-0.5接种犬瘟热病毒生产毒种JTM株，在37℃、40～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养36～48小时，收获病毒液，置-15℃以下保存，测定病毒含量并进行无菌检验备用；
(3)配苗及分装
检验合格的病毒液作为制苗用病毒液，将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗中水貂病毒性肠炎病毒含量不低于102.5TCID50，犬瘟热病毒含量不低于102.0TCID50，计算两种成分的配苗用量，混合均匀，用稀释液补加所需抗原剂；将水貂病毒性肠炎病毒与犬瘟热病毒病毒混合液与冻干保护剂按4:1体积比例混合均匀，即为疫苗原液，混匀后定量分装并加盖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410822442.4A CN104587460B (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410822442.4A CN104587460B (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104587460A true CN104587460A (zh) | 2015-05-06 |
| CN104587460B CN104587460B (zh) | 2016-09-21 |
Family
ID=53113731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410822442.4A Active CN104587460B (zh) | 2014-12-25 | 2014-12-25 | 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104587460B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105816872A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-08-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗 |
| CN105816869A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-08-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法及用该方法制备的疫苗 |
| CN105838683A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-08-10 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法 |
| CN107794248A (zh) * | 2017-10-24 | 2018-03-13 | 广州齐志生物工程设备有限公司 | 一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法 |
| CN109280648A (zh) * | 2017-12-20 | 2019-01-29 | 吉林特研生物技术有限责任公司 | 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用 |
| CN109652344A (zh) * | 2016-02-17 | 2019-04-19 | 中国农业科学院特产研究所 | 菌株及其应用，以及疫苗及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101422485A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-05-06 | 中国农业科学院特产研究所 | 狐、貉、貂同源抗血清、转移因子的出级产品制备方法 |
| CN101612396A (zh) * | 2009-07-17 | 2009-12-30 | 齐鲁动物保健品有限公司 | 一种犬瘟热活疫苗及其制备方法 |
| CN102000327A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-04-06 | 齐鲁动物保健品有限公司 | 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法 |
-
2014
- 2014-12-25 CN CN201410822442.4A patent/CN104587460B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101422485A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-05-06 | 中国农业科学院特产研究所 | 狐、貉、貂同源抗血清、转移因子的出级产品制备方法 |
| CN101612396A (zh) * | 2009-07-17 | 2009-12-30 | 齐鲁动物保健品有限公司 | 一种犬瘟热活疫苗及其制备方法 |
| CN102000327A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-04-06 | 齐鲁动物保健品有限公司 | 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吴英平、李君阁、许树林等: "水貂病毒性肠炎、犬瘟热、伪狂犬病三联弱毒苗的研究——II水貂病毒性肠炎弱毒基础苗的研制", 《中国畜禽传染病》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652344A (zh) * | 2016-02-17 | 2019-04-19 | 中国农业科学院特产研究所 | 菌株及其应用，以及疫苗及其制备方法 |
| CN105816872A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-08-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗 |
| CN105816869A (zh) * | 2016-04-26 | 2016-08-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 水貂犬瘟热病毒活疫苗制备的方法及用该方法制备的疫苗 |
| CN105838683A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-08-10 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法 |
| CN107794248A (zh) * | 2017-10-24 | 2018-03-13 | 广州齐志生物工程设备有限公司 | 一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法 |
| CN109280648A (zh) * | 2017-12-20 | 2019-01-29 | 吉林特研生物技术有限责任公司 | 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104587460B (zh) | 2016-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104587460B (zh) | 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN104162154B (zh) | 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN106497890B (zh) | 一种猪伪狂犬病病毒变异株xf-1株及制备方法和应用 | |
| CN104805060B (zh) | 一种伪狂犬病病毒及其应用 | |
| CN102174476A (zh) | 预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN102258777B (zh) | 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 | |
| CN102260649B (zh) | 传染性法氏囊病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 | |
| CN101948809A (zh) | 预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN103305474A (zh) | 猪伪狂犬病毒毒株及其灭活疫苗和应用 | |
| CN105031639A (zh) | 一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN102220287A (zh) | 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用 | |
| CN103143008B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法 | |
| CN105664150B (zh) | 一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗 | |
| CN109207436A (zh) | 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用 | |
| CN105274064B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用 | |
| CN105535958B (zh) | 一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗 | |
| CN103143007B (zh) | 一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 | |
| CN104087559B (zh) | 一种传染性法氏囊病毒、灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN103923885B (zh) | 鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株及其应用 | |
| CN105727275B (zh) | 一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法 | |
| CN105903011B (zh) | 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法 | |
| CN108421037A (zh) | 一种猪伪狂犬病/猪细小病毒病二联灭活疫苗及其悬浮培养制备方法 | |
| CN103937753A (zh) | H9n2亚型禽流感病毒毒株及其灭活疫苗和应用 | |
| CN104069489B (zh) | 鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN104195114A (zh) | 一种禽肺病毒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160804 Address after: 225300 Jiangsu city of Taizhou Province medical city Kang Road on the south side of West Avenue on the west side Applicant after: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 100085 A306 room, Zhongguancun biological medicine Park, No. 5, Pioneer Road, Beijing, Haidian District Applicant before: Sinovet (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. Applicant before: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 225300 Jiang Gao Avenue, Taizhou, Jiangsu Province, No. 409 Patentee after: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 225300 west side of West Avenue, medical city, Taizhou, Jiangsu. Patentee before: SINOVET (JIANGSU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder |