CN104582724A

CN104582724A - 重配btv和ahsv疫苗

Info

Publication number: CN104582724A
Application number: CN201380038286.6A
Authority: CN
Inventors: M·帕尔马里尼; P·于代莱; J-C·奥多内; S·F·努涅斯
Original assignee: Glasgow Administration, University of; Merial Ltd
Current assignee: Glasgow Administration, University of; Merial Ltd
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2015-04-29
Also published as: WO2013188673A3; AU2013274191B2; EP2861248A2; MX2014015311A; CN110628822A; TN2014000518A1; MA37749A1; WO2013188673A2; KR102136437B1; HK1209326A1; IL236148A0; ZA201409124B; MX364875B; IL236148B; JP6347257B2; CA2876196A1; AU2013274191A1; NZ703297A; CA2876196C; US20130337010A1

Abstract

本发明包括BTV和ASHV疫苗或产生重组重配BTV和ASHV载体的组合物和方法，以及接种抗BTV和ASHV的疫苗的方法。

Description

重配BTV和AHSV疫苗

相关申请的交叉参考

本申请要求2012年6月13日提交的美国临时申请61/659,198的优先权。

技术领域

本发明涉及用于抵抗动物的蓝舌病病毒(Bluetongue Virus)(BTV)或非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus)(AHSV)感染的组合物。本发明提供了包括重组的BTV或AHSV载体的药物组合物，接种抗BTV或AHSV疫苗的方法以及用于与这样的方法和组合物使用的试剂盒。

背景技术

蓝舌病(BT)是反刍动物的节肢动物传播的感染性病毒疾病。牛和山羊可容易地感染致病性BTV但没有广泛的血管损伤，从而这些物种通常不能显示明显的临床体征。相反地，该疾病在羊中的特征在于口、鼻和前胃的粘膜的卡他性炎症，和蹄的冠状带和蹄叶的炎症。存在上皮的擦伤，和颊粘膜的最终坏死；肿胀发炎的舌和口呈现蓝色，因而疾病据此命名(Spreull1905)。在绵羊中的死亡率被估计在1－30％。

BTV是环状病毒属(Orbivirus genus)(呼肠弧病毒科(Reoviridaefamily))的原型病毒，其由至少24种不同血清型(Wilson和Mecham2000)组成。BTV的不同菌株在世界范围内已被鉴定为遍布整个热带和温带地区。BTV感染的发生在欧洲远至45°N，在亚洲和北美远至50°N，以及向南远至35°。BTV不在反刍动物之间接触传染，因此BTV的分布依赖于库蠓属(Culicoides sp.)的节肢动物媒介种类(vector species)(咬蠓(biting midges))的存在，不同的媒介种类存在于世界的不同地区。最近的数据表明，遗传漂变和沉默效应(founder effect)促成BTV的野生株的单个基因区段的多样化(Bonneau,Mullens等人，2001)。已经显示BTV血清阳性动物对同源BTV血清型的感染具有抗性。

反刍动物的BTV感染是瞬时的，而库蠓属(Culicoides)昆虫载体的感染是持久的。病毒血症的持续时间取决于动物种类和BTV的毒株。据报道，病毒血症在绵羊中可以是非常短暂的，在BTV感染的个体中可持续长达41天，在山羊中长达42天，在牛中长达100天。由于牛的BTV感染通常导致长时间，但不持久的病毒血症，因此牛充当库蠓属媒介可从其摄取病毒，随后传播给其它反刍动物的贮库(Anderson,Stott等人，1985；MacLachlan 1994；MacLachlan和Pearson 2004)。库蠓属媒介的许多种类的生态学知之甚少并且它们的孳生地在很大程度上未被鉴定，它们的扩散率是未知的。黑唇库蠓(Culicoides sonorensis)是BTV在北美的主要载体。雌库蠓昆虫成为被BTV持续感染和并且在长达14天的外潜伏期后能传播病毒(Mullens，Tabachnick等，1995)。BTV在温带地区越冬可通过垂直感染的昆虫媒介实现，但最近的数据表明，在持续BTV感染过程中在昆虫媒介的幼虫阶段外衣壳基因表达减少(White,Wilson等人2005)。

BTV的病毒体具有为～69nm的直径，双壳外套(衣壳)有时被从受感染细胞的细胞膜衍生的脂蛋白“假包膜”包围。BTV基因组包括10个不同的双链RNA片段，其共同地编码7个结构(VP1至VP7)和4个非结构(NS1、NS2、NS3和NS3a)蛋白(Roy 1996)；基因组片段中有9个是单顺反子，而区段10使用第二框内起始密码子编码NS3和NS3A。基因组RNA在二十面体病毒体颗粒中被双层蛋白质衣壳包壳(Verwoerd,Els等人1972)。二十面体核心由2个大蛋白质(VP3和VP7)和3个小的蛋白质(VP1、VP4、VP6)组成并且被外衣壳包围，所述外衣壳由分别由基因组区段2和5编码的VP2和VP5组成(Roy1996)。VP2负责BTV的结合和进入细胞、中和、血清型特异性和血凝集。VP2的多聚体形式(二聚体和三聚体)装饰病毒颗粒外表面上的大部分VP5支架表面(Hassan和Roy 1999)。VP2在24种BTV血清型中变化最大，并且抗VP2抗体的水平与体外和体内病毒中和相关(Huismans和Erasmus 1981)。VP5在BTV的不同血清型和毒株之间变化也很明显(de Mattos,de Mattos等人，1994；DeMaula,Bonneau等人2000)，虽然迄今还未鉴定出VP5特异性中和MAb，但数据表明，这种蛋白质通过其对VP2的构象影响在中和以及血清型测定中具有作用(Huismans和Erasmus 1981；Roy,Urakawa等人1990；DeMaula等人,2000)。将利用BTV抗核心血清免疫吸附以除去痕量VP7的纯化的VP2注射入绵羊。50微克的VP2的初始剂量足以诱导VP2-沉淀抗体以及中和和血凝抑制抗体。这些绵羊针对利用相同BTV血清型的毒株的攻击得到了充分保护。即便在攻击前未检测到中和抗体，较低剂量的VP2仍然提供显著水平的保护(Huismans,vander Walt等人1987)。最近的结果表明，VP2和NS1表达被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位(Andrew,Whiteley等人1995)，然而VP7和VP5不可能具有CTL表位。到目前为止，VP3、VP4、VP6、NS2和NS3没有刺激绵羊的CTL反应(Lobato,Coupar等人1997)。下面的表1(从Wilson和Mecham 2000修改而来)概述了BTV的基因及其蛋白质的功能。

表1 蓝舌病病毒基因和具有蛋白的定位、性质和功能的编码的蛋白

感兴趣的特定BTV抗原多肽包括VP2和VP5。二十面体核心由两种大(VP3和VP7)和三种小的蛋白质(VP1、VP4、VP6)组成，并且被外衣壳包围，所述外衣壳被分别由基因组区段2和5编码的VP2和VP5包围(Roy 1996)。VP2负责BTV的结合和进入细胞、中和、血清型特异性和血凝集。VP2的多聚体形式(二聚体和三聚体)装饰病毒颗粒外表面上的VP5支架的大部分表面(Hassan和Roy 1999)。VP2在24种BTV血清型中变化最大，抗VP2抗体的水平与体外和体内病毒中和相关(Huismans和Erasmus 1981)。VP5在BTV的不同血清型和毒株之间变化也很明显(de Mattos,de Mattos等人，1994；DeMaula,Bonneau等人2000)，虽然迄今还未鉴定出VP5特异性中和MAb，但数据表明，这种蛋白通过其对VP2的构象影响在中和以及血清型测定中具有作用(Huismans和Erasmus 1981；Roy,Urakawa等人1990；DeMaula等人,2000)。将利用BTV抗核心血清免疫吸附以除去痕量VP7的纯化的VP2注射入绵羊。50微克的VP2的初始剂量足以诱导VP2-沉淀抗体以及中和和血凝抑制抗体。这些绵羊针对利用相同BTV血清型的毒株的攻击得到了充分保护。即便在攻击前未检测到中和抗体，较低剂量的VP2仍然提供显著水平的保护(Huismans,van der Walt等人1987)。最近的结果表明，VP2和NS1表达被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位(Andrew,Whiteley等人1995)，然而VP7和VP5不可能具有CTL表位。到目前为止，VP3、VP4、VP6、NS2和NS3没有刺激绵羊的CTL反应(Lobato,Coupar等人1997)。参见表1。

非洲马瘟(AHS)是马和骡的严重的、往往是致命的节肢动物传播的病毒病(African Horse Sickness,The Merck Veterinary Manual)。在该疾病的一些形式中死亡率可高达95％。无症状或轻度感染可以在马以及斑马和驴，特别是在先前感染了不同血清型的病毒的马中发生。受感染的动物或媒介可携带病毒至无AHS的地区。有些学者推测，气候变化可能会增加节肢动物传播的疾病，如非洲马瘟蔓延的风险，因为最近已出现相关蓝舌病病毒(Wilson A等人,Parasitol.Res.2008；103:69–77)。残肢库蠓(Culicoides imicola)，该疾病的主要媒介，已侵入北非和南欧。潜在的节肢动物媒介事实上也遍及全球几乎所有地区，包括美国的许多地区和美洲其余地区。

非洲马瘟起因于感染非洲马瘟病毒(呼肠病毒科的环状病毒的成员)。迄今为止，非洲马瘟病毒的9个血清型是已知的。非洲马瘟病毒血清型9遍布流行地区，然而血清型1至8主要见于有限的地理区域。血清型9一直是造成大部分非洲以外的非洲马瘟暴发的致病原因。血清型4于1987年与1990年之间在西班牙和葡萄牙造成暴发(Lubroth J.,Equine Pract.1988；10:26–33)。

关于非洲马瘟病毒的初步研究导致十九世纪三十年代针对非洲马瘟病毒的小鼠脑减毒修饰的活病毒疫苗的开发。这些疫苗被精制，并导致十九世纪六十年代组织培养减毒修饰的活病毒(MLV)疫苗的开发。

尽管该疫苗具有功效，但其具有一些固有的限制，包括个别动物的疫苗反应(包括死亡)，个体动物的变化多样的免疫反应，在通过被动母体免疫来免疫幼小动物中的困难，疫苗病毒的毒力的恢复的可能性，以及接种后疫苗株的重组和可能的毒力恢复(du Plessis M.等人，1998,Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65:321-329)。还存在关于使用MLV疫苗的社会经济影响。南非有允许其出口马至欧盟和许多其它国家的流程。该流程也使得来自其它国家的马进入南非以在各活动中竞赛或临时作为种畜的可能。流程基于确保马对抗非洲马瘟病毒充分疫苗接种。兽医局知道使用MLV疫苗的可能的危险。这些问题的大部分将通过开发替代性非洲马瘟病毒疫苗大大降低。

非洲马瘟病毒基因组由编码至少10种病毒蛋白的10个双链RNA区段(Oellermann,R.A.等人，1970；Bremer,C.W.等人，1976)组成。该基因组区段按它们在PAGE中迁移的顺序编号为1-10。病毒蛋白中有7种是结构性的并且形成双壳病毒颗粒。外衣壳是由两种大病毒蛋白VP2和VP5组成，所述病毒蛋白决定非洲马瘟病毒的抗原变异性，而内衣壳由两种大的(VP3和VP7)和三种小的(VP1、VP4和VP6)病毒蛋白组成(Lewis SA和Grubman MJ,1991；Martinez-TorrecuadradaJL等人,1994)；Bremer,CW等人，1990；Grubman,M.J.&Lewis,S.A.,1992)。VP3和VP7在9种血清型中是高度保守的(Oellermann等人，1970；Bremer等人，1990)。至少三个非结构蛋白NS1、NS2和NS3已被鉴定(Huismans,H.&Els,H.J.,1979；van Staden,V.&Huismans,H.,1991；Mizukoshi,N.等人,1992)。

来源于减毒病毒的重组金丝雀痘病毒已被开发为用于异源病毒基因表达的载体。其中一些金丝雀痘构建至今已在许多国家包括南非、欧盟和美利坚合众国被授权作为在马(Minke JM，等人，2004a和b；Minke JM，等人，2007；Siger L，等人，2006)和其它物种(Poulet H，等人，2003)中使用的疫苗。

这些疫苗仅含有目标生物的基因的事实使得它们固有地安全(Minke JM，等人，2004b)。此外，即使在单次剂量的疫苗施用后，可检测的中和抗体的出现仍然是快速的(Minke JM等人，2004b)。这样的疫苗的固有安全性和中和抗体的产生的性质使得这样的疫苗在动物流行病中的使用特别具有吸引力(Minke JM等人，2004a)。

先前的研究已经表明，当用外源表达的VP2和适当的佐剂接种马时，它们产生针对AHS的中和抗体(Scanlen M，等人，2002年)。绵羊中的研究显示，针对蓝舌病病毒的中和抗体反应通过用其中共表达VP2和VP5的病毒样颗粒接种绵羊得到增强(Pearson LD,Roy P,1993)。最近已显示，共表达为编码蓝舌病病毒的VP2和VP5外衣壳蛋白的基因的重组金丝雀痘病毒疫苗在绵羊中诱导高水平的保护作用(Boone JD等人，2007)。

还未证明的是，当用含有AHSV VP2和VP5并共表达其的载体接种时，马产生针对非洲马瘟病毒的中和抗体。因此，可以理解的是，本发明通过提供重组痘病毒，包括来源于其的组合物和产品，特别是基于ALVAC的重组体和来源于其的组合物和产品，尤其是这样的表达AHSV VP 2和5的重组体或其任意组合和来源于其的组合物和产品，满足了本领域内的需要。

关于BTV或AHSV的遗传修饰的研究已经由Piet A van Rijn等人(Virology Journal,2010,7:261)、Polly Roy等人(Journal of Viology,2011,85,19；10213-10221)、Polly Roy等人(Journal of Viology,2008,p8339-8348)、Massimo Palmarini等人(PloS pathogens,2011,7(12):e1002477)以及在WO2009/068870中进行了描述。

因此，有利地提供抗BTV和AHSV的具有改善的免疫原性的疫苗组合物，以及制备和使用这样的组合物(包括提供鉴别诊断法、测定和试剂盒的这样的组合物)的方法。

考虑到动物(包括人)对BTV或AHSV的易感性，预防BTV或AHSV感染和保护动物的方法是必要的。因此，存在对抗BTV或AHSV的有效疫苗的需要。

发明内容

提供了包含一种或多种重组重配(reassortant)BTV或AHSV载体的组合物，所述载体包含编码BTV或AHSV的至少一种抗原的一个或多个异源多核苷酸。

本发明的方法包括用于制备该重组重配BTV或AHSV组合物或载体的方法。方法还包括使用方法，所述使用方法包括给动物施用有效量的组合物或载体，以产生保护性免疫原性反应。

附图说明

可最好结合附图理解以举例的方式给出，但并非意在仅将本发明限制于所描述的具体实施方案中的下列详细描述，其中：

图1描述了重配BTV-1及BTV-8的示意图和产生重组重配BTV载体的流程图。

图2描述了BTV重配株(reassortant)的平均噬菌斑(plaue)直径。

图3描述了重组病毒的生长曲线分析。大多数重配株与野生型亲代病毒类似地生长。

图4描述了BTV中和结果。

图5描述了BTV重配株的产生。

图6描述了使用反向遗传学(reverse genetics)产生BTV重配株的示意图。

图7显示了包含SEQ ID NO分配以及DNA和蛋白质序列的表。

图8描述了攻击后平均直肠温度的评估。

图9描述了最大过热的分散。

图10描述了平均日临床评分的评估。

图11描述了整体临床评分的分散。

图12描述了平均病毒血症滴度的演变。

图13描述了AUC的分散。

图14描述了均值BTV-8中和抗体滴度的演变。

图15描述了包含每个血清型的VP2和VP5蛋白的sBTV的噬菌斑形态学。

图16描述了BHK-21中的sBTV病毒的病毒滴度。

图17描述了BTV1+BTV8VP2(RAS10)的感染滴度、ELISA、斑点印迹Vp2。

图18描述了BTV1+BTV8VP2/VP5(RAS32)的感染滴度、ELISA，斑点印迹Vp2。

发明详述

提供包含一种或多种重组BTV或AHSV载体的组合物，所述载体包含编码BTV或AHSV的至少一种抗原的一个或多个异源多核苷酸，所述抗原引发动物的免疫原性反应。在一个实施方案中，多肽抗原是BTV VP2或VP5多肽或其活性片段或变体。

应当认识到，本发明的抗原性多肽可以是全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“活性变体”是指片段或变体保留了多肽的抗原性质。因此，本发明包括引发动物的免疫原性反应的任何BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原。所述BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于，引发、诱导或刺激动物例如绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或马类动物的反应的蛋白质、肽或其片段或变体。

本发明涉及牛类动物、绵羊类动物、山羊类动物或马类动物疫苗或组合物，其可包含有效量的重组BTV或AHSV载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。

在一些实施方案中，所述疫苗还包含佐剂，例如美国专利7,371,395中描述的水包油(O/W)乳剂。

在其它实施方案中，佐剂包括EMULSIGEN、氢氧化铝和皂苷和CpG，或其组合。

在一些实施方案中，动物的反应是保护性免疫反应。

关于“动物”，其意指哺乳动物、鸟类等。动物或宿主包括哺乳动物和人类。动物可选自马科动物(equine)(例如，马)、犬科动物(cannine)(例如，狗、狼、狐狸、丛林狼、豺)、猫科动物(feline)(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫科动物和其它猫科动物，包括猎豹和山猫)、绵羊类动物(ovine)(例如绵羊)、牛类动物(bovine)(例如，牛)、猪类动物(porcine)(例如，猪)、山羊类动物(caprine)(例如，山羊)、禽类动物(avian)(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(primate)(例如，狐猴、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)和鱼。术语“动物”还包括所有发育阶段，包括胚胎期和胎儿期中的个体动物。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属的技术领域的普通技术人员通常中理解的含义相同的含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述/其(the)”包括复数对象。类似地，除非上下文清楚地表明并非如此，否则单词“或”旨在包括“和”。

应当指出，在本公开和特别在权利要求和/或段落中，术语例如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等可具有美国专利法中规定的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且术语例如“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有美国专利法中规定的含义，例如，它们允许未明确引述的元素，但不包括在现有技术中被发现的要素或影响本发明的基本或新颖特征的元素。

术语“重组BTV或AHSV载体”、“重组重配BTV或AHSV载体”、“重配BTV或AHSV”、“BTV或AHSV重配株”在本文可互换使用，是指BTV或AHSV病毒的任何修饰、改变或工程。BTV或AHSV病毒的修饰、改变或工程可包括但不限于一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失，整个基因的缺失，基因的密码子优化，氨基酸的保守置换，一个或多个异源多核苷酸的插入，不同血清型或物种的基因、转录物、RNA区段，DNA区段至新组合的混合。

本发明的抗原性多肽能够防止BTV和AHSV的侵害。也就是说，它们能够刺激动物的免疫反应。“抗原”或“免疫原”是指诱导宿主动物特异性免疫反应的物质。抗原可以包括整个生物体(杀死的、减毒的或活的)；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性性质的插入的重组载体；在呈递给宿主动物后能够诱导免疫反应的DNA的碎片或片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

如本文所用，术语“免疫原性蛋白、多肽或肽”包括这样的多肽，所述多肽在一旦给宿主施用后，其就能够激起针对所述蛋白的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上是有免疫活性的。优选地蛋白片段是这样的片段，其具有与完整蛋白大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白片段包含至少一个表位或抗原决定簇，或基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白或多肽，包括蛋白的全长序列，其类似物，或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包含一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白的片段。这样的片段可使用任何数目的本领域中公知的表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,编辑,1996)。例如，线性表位可以通过例如如下过程来确定：在固体载体上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的各个部分，随后将肽与抗体反应，同时肽仍然附连于载体。这样的技术在本领域是已知的并且描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986中。类似地，构象表位可以容易地通过确定氨基酸的空间构象(例如通过例如X射线结晶学和二维核磁共振)来鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols，同上。

如所讨论，本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性蛋白、多肽或肽”还考虑针对序列的缺失、添加和置换，只要所述多肽起着产生本文中定义的免疫反应的功能即可。术语“保守变异”意指氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基置换，或核酸序列中使得所编码的氨基酸残基不发生变化或为另一种生物学上相似的残基的核苷酸的置换。在这方面，特别优选的置换在性质上通常是保守性的，即，在氨基酸的家族内发生的那些置换。例如，氨基酸一般被分成4个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电荷的极性-甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括一个疏水残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残基的置换，或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换，谷氨酸对天冬氨酸的置换，或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或对生物活性无重大影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似保守置换。因此，具有与参考分子大体上相同的氨基酸序列但具有少量大体上不影响该蛋白的免疫原性的氨基酸置换的蛋白质，在参考多肽的定义内。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用置换的氨基酸替代未置换的亲代氨基酸，只要针对置换的多肽产生的抗体也与未置换的多肽免疫反应。

术语“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞对其作出反应的抗原或半抗原上的位点。也可将该术语与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”交换使用。可在简单的免疫测定中鉴定识别相同表位的抗体，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力。

针对组合物或疫苗的“免疫反应”是细胞和/或抗体介导的针对目标组合物或疫苗的免疫反应在宿主中的发展。通常地，“免疫反应”包括但不限于下列效应的一个或多个：特异性针对目标组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，以便对新感染的抗性将得到增强和/或疾病的临床严重度减轻。这样的保护作用将通过通常由受感染的宿主显示的症状的减轻或不存在、更快的恢复时间和/或受感染的宿主中更低的病毒滴度来证明。

合成抗原也包括在定义内，例如，多表位、侧翼表位(flankingepitopes)和其它重组或合成衍生的抗原。参见，例如，Bergmann等人，1993；Bergmann等人,1996；Suhrbier,1997；Gardner等人,1998。为了本发明的目的，通常免疫原性片段会包含分子的至少约3个氨基酸，至少约5个氨基酸，至少约10-15个氨基酸，或约15-25个氨基酸或更多个氨基酸。对于片段的长度没有严格的上限，所述片段可包括几乎全长蛋白质序列，或甚至融合蛋白包含所述蛋白的至少一个表位。

因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是，其包含编码BTV或AHSV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由所述核苷酸组成或由所述核苷酸组成。编码BTV或AHSV多肽的片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最少15个核苷酸、约30-45个核苷酸、约45-75或至少57、87或150个连续或邻接的核苷酸，或基本上由所述核苷酸组成或由所述核苷酸组成。表位测定法，例如产生重叠肽文库(Hemmer等人,1998)、肽扫描(Geysen等人,1984；Geysen等人,1985；Van der Zee R.等人,1989；Geysen,1990；Multipin.RTM.PeptideSynthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人,1999；PCT/US2004/022605)可在本发明的实践中使用。

术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性或分支的、单或双链的RNA或DNA，或其杂合体。术语还包括RNA/DNA杂合体。以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其它糖和连接基团例如氟代核酸和硫醇盐，以及核苷酸分支。可聚合后用标记组分进一步修饰核苷酸的序列，例如通过缀合。包括在此定义中的其它类型的修饰是帽、用类似物对1个或更多个天然存在的核苷酸的置换，和装置(means)的引入(用以将多核苷酸连接于蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体载体)。多核苷酸可以通过化学合成获得或来源于微生物。

术语“基因”在广义上用于指与生物学功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包括内含子和外显子(如在基因组序列中)，或仅编码序列(如在cDNA中)和/或它们的表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质的核酸片段，其包括调控序列。

术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，其可以包含修饰氨基酸或氨基酸类似物，并且其可被除氨基酸外的化学部分中断。术语还包括氨基酸聚合物，所述聚合物已被天然地修饰或通过干预修饰；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记或生物活性组分的缀合。

“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指这样的组分，所述组分已大体上与所述组分天然存在于其中的生物的细胞中的其它生物组分例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器分离，或从所述其它组分纯化出来。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。术语还涵盖通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。

如本文所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反地，它意欲作为相对术语。因此，例如，纯化的多肽制剂是其中多肽比所述多肽在其天然环境中更加富集的制剂。即将多肽与细胞组分分离。所谓“大体上纯化的”，其意指使得多肽代表几个至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少98％或更多的细胞组分或材料已被除去的实施方案。同样地，该多肽可以是部分纯化的。“部分纯化的”意欲指少于60％的细胞组或材料被去除。这同样适用于多核苷酸。本文所公开的多肽可以通过本领域公知的任何方法进行纯化。

如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是BTV或AHSV抗原性多肽。公开的多核苷酸和由其编码的多肽的片段和变体也包括在本发明中。“片段”意欲是多核苷酸的一部分或由其编码的抗原性氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段可以编码蛋白片段，所述片段保留天然蛋白的生物活性，从而具有如本文中其它地方指出的免疫原性活性。多肽序列的片段保留诱导动物的保护性免疫反应的能力。

“变体”意指大体上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含缺失和/或添加一个或多个核苷酸在天然多核苷酸内的一个或多个位点上的缺失和/或添加，和/或一个或多个核苷酸在天然多核苷酸内的一个或多个位点上的置换。如本文使用的，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸(即，参照多核苷酸)的变体还可通过由变体多核苷酸编码的多肽与由参照多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比的比较来评价。“变体”蛋白意指通过天然蛋白质内一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的缺失或添加或天然蛋白质内一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的置换，从天然蛋白质衍生的蛋白质。由本发明包括的变体蛋白具有生物学活性，即它们引发免疫反应的能力。

在一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种重组BTV或AHSV载体的组合物或疫苗，所述载体包含编码BTV或AHSV的至少一种多肽的一个或多个异源多核苷酸。所述多肽可以是选自VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP5、VP7、NS1、NS2、NS3/3A的任何BTV或AHSV多肽。在一方面，重组BTV或AHSV载体包含来源于BTV或AHSV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26的基因组的载体主链。在另一个方面，异源多核苷酸编码来自BTV或AHSV的血清型的抗原，所述BTV或AHSV血清型与用作载体主链的BTV或AHSV的血清型不同。

在另一个实施方案中，重组BTV或AHSV载体包含编码多肽VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、VP6和NS3/3A的异源多核苷酸，其中所述多肽可以是来自BTV或AHSV的不同血清型，例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26。来自BTV或AHSV的不同血清型的多肽的不同组合可在下列表中进行举例说明。用于本发明的重组重配BTV(或AHSV)载体的命名法被定义为：名称的大写部分是指病毒的主链，随后是包括置换的蛋白质的下标，在此之前是区段的血清型来源，例如BTV-1_8VP1是指具有包含BTV-8的VP1基因的BTV-1主链的病毒。

表1 包含来自一个BTV血清型的1或2种多肽和来自另一个BTV血清型的9或8种多肽的重配BTV的一些实例

	VP1	VP2	VP3	VP4	VP5	VP6	VP7	NS1	NS2	NS3/3A
											BTV-1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
BTV-1_8VP1VP2	8	1	1	1	1	1	1	1	1	1
											BTV-1_8VP2	1	8	1	1	1	1	1	1	1	1
BTV-1_8VP3	1	1	8	1	1	1	1	1	1	1
											BTV-1_8VP4	1	1	1	8	1	1	1	1	1	1
BTV-1_8VP5	1	1	1	1	8	1	1	1	1	1
											BTV-1_8VP6	1	1	1	1	1	8	1	1	1	1
BTV-1_8VP7	1	1	1	1	1	1	8	1	1	1
											BTV-1_8NS1	1	1	1	1	1	1	1	8	1	1
BTV-1_8NS2	1	1	1	1	1	1	1	1	8	1
											BTV-1_8NS3/3A	1	1	1	1	1	1	1	1	1	8
BTV-8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8
											BTV-8_1VP1	1	8	8	8	8	8	8	8	8	8
BTV-8_1VP2	8	1	8	8	8	8	8	8	8	8
											BTV-8_1VP3	8	8	1	8	8	8	8	8	8	8
BTV-8_1VP4	8	8	8	1	8	8	8	8	8	8
											BTV-8_1VP5	8	8	8	8	1	8	8	8	8	8
BTV-8_1VP6	8	8	8	8	8	1	8	8	8	8

BTV-8_1VP7	8	8	8	8	8	8	1	8	8	8
											BTV-8_1NS1	8	8	8	8	8	8	8	1	8	8
BTV-8_1NS2	8	8	8	8	8	8	8	8	1	8
											BTV-8_1NS3/3A	8	8	8	8	8	8	8	8	8	1
BTV-1_8VP1,VP2	8	8	1	1	1	1	1	1	1	1
											BTV-1_8VP2,VP3	1	8	8	1	1	1	1	1	1	1
BTV-1_8VP2,VP5	1	8	1	1	8	1	1	1	1	1
											BTV-8_1VP1,VP2	1	1	8	8	8	8	8	8	8	8
BTV-8_1VP2,VP3	8	1	1	8	8	8	8	8	8	8
											BTV-8_1VP2,VP5	8	1	8	8	1	8	8	8	8	8

本发明包括包含重配BTV的重组BTV载体，所述重配BTV具有式BTV-A_BVPa、BTV-A_BVPc,VPd、BTV-A_BNSe、BTV-A_BVPc,NSe，其中A和B＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26(对于BTV或AHSV血清型)；c和d＝1、2、3、4、5、6和7(对于VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6或VP7)；e＝1、2和3/3A(对于NS1、NS2或NS3/3A)。

在另一个方面，本发明提供了具有示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190的序列的BTV多肽及其变体或片段。

此外，来自绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或马类动物的BTV或AHSV多肽的同源物旨在本发明的范围之内。如本文所用，术语“同源物”包括直向同源物(orthologs)、类似物和种内同源物(paralogs)。术语“类似物”是指具有相同或类似功能，但已经在不相关的生物分别进化的两种多核苷酸或多肽。术语“直向同源物”是指来自不同物种，但已通过物种形成从一个共同祖先基因演化而来的两个多核苷酸或多肽。通常地，直向同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“种内同源物”是通过基因组内的复制而相关的两种多核苷酸或多肽。种内同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以相关。野生型BTV或AHSV多肽的类似物、直向同源物和种内同源物可与野生型BTV多肽相异在于翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者。具体地，本发明的同源物将通常显示与野生型BTV或AHSV或多核苷酸序列的全部或部分至少80-85％，85-90％、90-95％、或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且将显示相似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指包含导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒种或变种)中的多态性的多核苷酸或多肽。这样的天然等位基因变异通常可导致1-5％的多核苷酸或多肽的变异。等位基因变体可以通过对许多不同物种中的目标核酸序列进行测序来鉴定，所述测序可通过使用杂交探针来鉴定这些物种的相同基因的基因座来容易地进进。作为天然等位基因变异的结果并且不改变目标基因的功能活性的任何和所有这样的核酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意在本发明的范围之内。

如本文中所用，术语“衍生物”或“变体”是指这样的多肽或编码多肽的核酸，其具有一个或多个保守氨基酸变异或其它小的修饰，以便(1)当与野生型多肽比较时，相应多肽具有基本上等同功能，或(2)针对所述多肽的抗体与野生型多肽发生免疫反应。这些变体或衍生物包括具有BTV或AHSV一级氨基酸序列的少量修饰的多肽，所述修饰可导致相较于未修饰对应多肽具有大体上相当的活性的肽。这样的修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是自发的。术语“变体”还涉及对序列的缺失、添加和置换，只要多肽发挥产生如本文中所定义的免疫反应的功能。

术语“保守变异”是另一种生物学上相似的残基对氨基酸残基的取代，或核酸序列的核苷酸的取代，所述取代使得编码的氨基酸残基不发生变化或为另一种生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的置换通常是性质上保守性的，如上文中所述的。

本公开内容的多核苷酸包括作为遗传密码(例如用于特定宿主的最优化的密码子选择)的结果而为简并的序列。如本文中所用，“最优化的”是指经基因工程改造以增加其在给定的物种中的表达的多核苷酸。为了提供最优化的编码BTV或AHSV多肽的多核苷酸，可修饰BTV或AHSV蛋白基因的DNA序列以1)包含由特定物种中的高度表达的基因优先选择的密码子；2)在核苷酸碱基组成上包含A+T或G+C的含量至与在所述物种中发现的含量大体上相同的含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除造成RNA的不稳定、不适当的多腺苷酸化、降解和终止，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。BTV或AHSV蛋白在所述物种中的增加的表达可通过利用密码子选择在真核生物和原核生物或在特定物种中的分布频率来实现。术语“优先密码子选择的频率”是指由特定宿主细胞在使用核苷酸密码子指定给定的氨基酸上显示的偏好。存在20种天然氨基酸，其大部分由一个以上的密码子指定。因此，所有简并核苷酸序列包括在公开内容中，只要核苷酸序列编码的BTV或AHSV多肽的氨基酸序列在功能上不变。

可利用NCBI(美国国家生物技术信息中心)成对blast以及blosum62矩阵，使用标准参数来建立两个氨基酸序列之间的序列同一性(参见，例如，可在“国家生物技术中心信息”(NCBI，Bethesda,Md.,USA)服务器上，以及在Altschul等人中获得的BLAST或BLASTX算法；并且从而，该文献利用术语“blasts”提及使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。

关于序列的“同一性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两个序列的更短序列中的核苷酸或氨基酸的数目，其中两个序列的比对可以根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)，例如，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和为4的缺口罚分(gap penalty)来测定，包括比对的序列数据的计算机辅助分析和解释可使用商购可得的程序(例如，Intelligenetics^TM Suite,IntelligeneticsInc.CA)来方便地进行。当RNA序列被认为是相似，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可通过将DNA序列中的胸苷(T)认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)来从DNA序列衍生。

两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来测定。

下列文献提供了用于比较序列的相对同一性或同源性的算法，并且相对前述内容另外地或可选择地，这些参考文献中的教导可用于测定百分比同一性或同源性：Needleman SB和Wunsch CD；Smith TF和Waterman MS；Smith TF,Waterman MS和Sadler JR；Feng DF和Dolittle RF；Higgins DG和Sharp PM；Thompson JD,Higgins DG和Gibson TJ；以及Devereux J,Haeberlie P和Smithies O。而且，无需过多实验，本领域普通技术人员可咨询用于测定百分比同源性的许多其它程序或参考文献。

可在不同“严格度”的条件下进行杂交反应。提高杂交反应的严格度的条件是公知的。参见例如，“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”,第2版(Sambrook等人,1989)。

本发明还包括包含在载体分子或表达载体中以及可操作地连接于启动子元件和任选连接于增强子的BTV多核苷酸。

“载体”指重组DNA或RNA质粒或病毒，其包含待被体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可以包含用于预防或治疗目的的目标序列，并且可任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体无须能够在最终的靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“重组体”意指半合成或合成来源的多核苷酸，其不存在于自然界中或以在自然界中未发现的排列方式连接于另一个多核苷酸。

“异源”意指来源于在遗传上与其所被比较的实体(entity)的其余部分不同的实体。例如，多核苷酸可通过基因工程技术被置于来源于不同来源的质粒或载体中，并且为异源多核苷酸。从其天然编码序列取出并可操作地连接于除天然序列外的编码序列的启动子是异源启动子。

本发明涉及绵羊类动物，牛类动物，山羊类动物和猪类动物的疫苗或药物或免疫组合物，其可包括有效量的重组BTV抗原和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。

本文中描述的主题部分地针对与在植物或藻类表达系统中制备的BTV抗原相关的组合物和方法，所述BTV抗原具有高度免疫原性，并且保护动物免受来自同源和异源BTV菌株的攻击。

本发明涉及包含一种或多种重组BTV或AHSV载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物的组合物或疫苗，所述载体包含编码BTV或AHSV的至少一种多肽的一个或多个异源多核苷酸。

在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是油包水乳剂。在又一个实施方案中，油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三重乳剂。

本发明还包括包含在载体分子或表达载体中和任选地可操作地连接于启动子元件和任选地连接于增强子的BTV多核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了与本发明的抗原性多肽，特别地与具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。

在另一个方面，本发明提供了上文中鉴定的BTV多肽(SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190)的片段和变体，其可由本领域普通技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。

变体是与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的同源多肽。

在另一个方面，本发明提供了编码BTV多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了编码多肽或其保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段(包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸)或这些多肽的组合的多核苷酸，所述多肽与具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中所示的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一个方面，本发明提供了具有与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131或132中所示的序列的多核苷酸之一至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸或其变体。

本发明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在相同转录单位内的另外的编码序列，控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5'UTR、3'UTR、转录终止子、多腺苷酸化位点、在相同或不同的启动子控制之下的另外的转录单位、允许克隆、表达、同源重组以及宿主细胞的转化的序列，并且可期望任何这样的构建体提供本发明的实施方案。

用于BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原表达的元件有利地存在于本发明的载体中。它以最低限度的方式包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子以及任选地还有聚腺苷酸化序列(对某些载体如质粒和某些病毒载体，例如除痘病毒外的病毒载体)，或基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸编码多蛋白质片段，例如BTV肽时，有利地在载体中将ATG置于阅读框的5'并将终止密码子置于3'。用于控制表达的其它元件可存在，例如增强子序列、稳定序列，例如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。

本发明还涉及包含载体，例如表达载体的制剂，例如治疗性组合物。制剂可包含一种或更多种载体，例如表达载体，例如体内表达载体，其包含和表达一种或多种BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原。在一个实施方案中，载体包含和表达多核苷酸，所述多核苷酸包含编码(且有利地表达)BTV或AHSV抗原、表位或免疫原的多核苷酸(在药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物中)，基本上由其组成，或由其组成。因此，根据本发明的实施方案，制剂中的其它一种或多种载体包含(并且在适当的情况下所述载体表达)编码BTV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种其它蛋白质或其片段的多核苷酸，基本上由所述多核苷酸组成或由所述多核苷酸组成。

根据另一个实施方案，制剂中的一种或多种载体包含编码BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白质或其片段的多核苷酸，基本上由所述多核苷酸组成，或由所述多核苷酸组成，所述一种或多种载体表达所述多核苷酸。在另一个实施方案中，制剂包含一种、两种或更多种载体，所述载体包含编码和表达(有利地在体内)BTV或AHSV多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。本发明还涉及载体的混合物，所述载体包含编码并表达不同BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原，例如，来自不同动物物种(例如但不限于绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物)的BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸。

根据另一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体的非限制性实例中，pVR1020或1012质粒((VICAL Inc.；Luke等人，1997；Hartikka等人，1996，参见例如，美国专利No.5,846,946和6,451,769)可以用作用于多核苷酸序列的插入的载体。pVR1020质粒来源于pVR1012并且包含人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号在Genbank中于登录号HUMTPA14下包含氨基酸M(1)至氨基酸S(23)。在另一个具体的非限制性实例中，用作用于多核苷酸序列的插入的载体的质粒可在Genbank中于登录号U28070下包含马类动物IGF1的从氨基酸M(24)至氨基酸A(48)的信号肽序列。可被咨询或用于实践的关于DNA质粒的另外信息可见于例如美国专利No.6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中。

术语质粒涵盖任何DNA转录单位，所述转录单位包含根据本发明的多核苷酸和其在期望的宿主或靶细胞中体内表达所必需的元件；且在这方面，应指出的是超螺旋或非超螺旋的环状质粒以及线性形式旨在本发明的范围内。

每一个质粒还包含或含有编码BTV或AHSV抗原、表位或免疫原的多核苷酸，其任选地与异源肽序列、变体、类似物或片段融合，可操作地连接于启动子或处于启动子的控制之下或依赖于启动子，或基本上由所述多核苷酸组成。一般而言，有利地使用在真核细胞中具有功能的强启动子。强启动子可以是但不限于人或鼠来源或任选具有另一个来源例如大鼠或豚鼠的即时早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，超级启动子(Ni,M.等人，Plant J.7,661-676,1995.)。CMV-IE启动子可包含实际启动子部分，其可以与或可以不与增强剂部分相关联。可参考EP-A-260148，EP-A-323597，美国专利No.5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及参考PCT申请No WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart等人，1985)或鼠CMV-IE。

在更一般的术语中，启动子具有病毒、植物或细胞来源。除可成功地用于本发明的实践的CMV-IE外的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于本发明的实施的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa等人，2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人，1989)。

可使用组成型、可调控型或刺激依赖性启动子的任一种启动子。例如，组成型启动子可包括来自根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露碱合酶启动子。或者，可有利地使用热休克基因启动子、干旱诱导型基因启动子、病原体诱导型基因启动子、伤口诱导型基因启动子和光/暗诱导型基因启动子。可有用地使用受植物生长调节剂例如脱落酸、生长素、细胞分裂素和赤霉酸控制的启动子。还可选择提供组织特异性表达的启动子(例如，根、叶和花特异性启动子)。

质粒可包括其它表达控制元件。特别有利的是掺入稳定序列例如内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶的内含子(Callis等人，Genes&Dev.1(10):1183-1200,Dec.1987)、hCMV-IE的第一内含子(PCT申请No.WO1989/01036)、兔β珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，1979)。在另一个实施方案中，质粒可含3'UTR。3'UTR可以是但不限于农杆菌胭脂碱合酶(agrobacterium nopaline synthase)(Nos)3'UTR(胭脂氨酸合酶：转录物作图和DNA序列。Depicker，A.等人J.Mol.Appl.Genet.,1982；Bevan,NAR,1984,12(22):8711-8721)。

关于除痘病毒外的质粒和病毒载体的聚腺苷酸化信号(polyA)，更多地使用牛生长激素(bGH)基因(参见U.S.5,122,458)的poly(A)信号，或兔β珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。

“宿主细胞”或“细胞”是指已被遗传改变，或能够通过外源多核苷酸例如重组质粒或载体或ssRNA或dsRNA的施用遗传改变的原核或真核细胞。当指遗传上改变的细胞时，该术语是指最初改变的细胞及其后代。

在一个实施方案中，本文中公开的主题涉及产生重组BTV或AHSV载体的方法，其包括用a)编码BTV或AHSV的血清型的一种或多种多肽的RNA；和b)包含不同血清型的BTV或AHSV的完整基因组的转录物和包含编码a)中的抗原的转录物的缺失的RNA转染细胞。

在另一个实施方案中，本文中公开的主题涉及接种绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物的方法，包括给绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物施用有效量的疫苗，所述疫苗可包含有效量的重组BTV载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

在实施方案中，本文中公开的主题涉及引发免疫反应的方法，包括给绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物施用包含绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物，或猪类动物的重组BTV或AHSV载体的疫苗，其中免疫反应被引发。

施用可以是皮下或肌肉内施用。施用可以是无针的(例如Pigjet或Bioject)。

在本发明的一个实施方案中，可使用初免-加强(prime-boost)方案，该方案由使用至少一种共同的多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初次施用和至少一次加强施用组成。通常情况下，初次施用中使用的免疫组合物或疫苗在性质上与用作增压的那些免疫组合物或疫苗不同。然而，应指出的是，同样的组合物可用作初次施用和加强施用。该施用方案称为“初免-加强”。

根据本发明的初免-加强可包括用于表达编码抗原性多肽或其片段或变体的BTV编码序列或其片段的重组病毒载体。具体地，病毒载体可表达编码抗原性多肽的BTV或AHSV基因或其片段。本文中涉及的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如，痘苗病毒或减毒痘苗病毒、禽痘病毒或减毒禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘、dovepox、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC、TROVAC；参见例如，US 5,505,941、US 5,494,8070)、浣熊痘病毒、猪痘病毒等]、腺病毒(例如，人腺病毒、犬腺病毒)、疱疹病毒(例如，犬疱疹病毒、火鸡的疱疹病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、猫疱疹病毒、喉气管炎病毒(ILTV)、牛疱疹病毒、猪疱疹病毒)、杆状病毒、逆转录病毒等。在另一个实施方案中，禽痘表达载体可以是金丝雀痘载体例如ALVAC。在另一个实施方案中，禽痘表达载体可以是鸡痘载体例如TROVAC。待表达的本发明的BTV或AHSV抗原被插入在特定痘病毒启动子的控制下，所述启动子是除了其它以外，例如桑灯蛾昆虫痘病毒(Amsacta moorei)42K启动子(Barcena,Lorenzo等人，2000)、牛痘启动子7.5kDa的(Cochran等人，1985)、牛痘启动I3L(Riviere等人，1992)、牛痘启动子HA(Shida，1986)、牛痘启动子ATI(Funahashi等人，1988)、牛痘启动子H6(Taylor等人，1988b；Guo等人，1989；Perkus等人，1989)。

在另一个实施方案中，禽痘表达载体可以是金丝雀痘载体，如，ALVAC。BTV或AHSV多肽、抗原、表位或免疫原可以是BTV或AHSV VP2或BTV VP5。病毒载体可以是vCP2289，其编码BTV密码子最优化的合成VP2和VP5(参见US 2007/0280960)。

在本发明的初免-加强方案的另一个方面，施用包含本发明的重组BTV载体的组合物，随后施用包含BTV或AHSV抗原的疫苗或组合物、或灭活的病毒疫苗或包含或表达BTV或AHSV抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样地，初免-加强方案可包括施用包含灭活的病毒疫苗的疫苗或组合物，或包含BTV或AHSV抗原的组合物，或包含或表达BTV或AHSV抗原的DNA质粒疫苗或组合物，随后施用包含本发明的重组BTV或AHSV载体的组合物。还应进一步指出，初次和第二施用可包括包含本发明的BTV抗原的组合物。

初免-加强方案包括使用共同的多肽和/或其变体或片段的至少一次初次施用和至少一次加强施用。在初次-施用中使用的疫苗可在性质上与用作随后的加强疫苗的那些疫苗不同。初次施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。

用于为哺乳动物的目标物种的组合物的剂量体积，例如基于病毒载体的绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物的组合物，例如基于非痘病毒-病毒-载体的组合物的剂量体积通常为约0.1至约5.0ml、约0.1至约3.0ml和约0.5ml至约2.5ml。

可在最后一次免疫后约2至4周，通过用BTV的毒株例如BTV-1/2/3/4/8/9/16或17株攻击动物例如绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物来测试疫苗的效力。例如，BTV株可以是血清型17，其最初是从来自Tulare County,CA的绵羊的血液分离而来的(参见Bonneau,DeMaula等人2002；DeMaula,Leutenegger等人2002)。BTV株也可以是血清型8，目前可从Merial Limited获得的灭活的疫苗。

其它菌株可以包括BTV1(澳大利亚分离株)、BTV1(南非分离株)、BTV2(美国分离株)、BTV3(南非分离株)、BTV4-9、BTV10(美国分离株)、BTV11(美国分离株)、BTV12、BTV13(美国分离株)、BTV14-17、BTV17(美国分离株)、BTV18、BTV19、BTV20(澳大利亚分离株)、BTV21-24或科西嘉岛BTV。

将同源和异源菌株用于攻击以测试疫苗的效力。动物可经真皮内、皮下、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或经口攻击。

对于BTV，评估牛类动物和山羊类动物的广泛的血管损伤。同样地对于BTV，评价绵羊类动物的口、鼻和前胃的粘膜的卡他性炎症、蹄的冠状带和蹄叶的炎症、上皮的擦伤、颊粘膜的坏死以及肿胀/发炎的/蓝舌头和嘴。可在攻击后从所有动物收集拭子以用进行病毒分离。存在或不存在，病毒抗原在上述组织中的存在或不存在可通过定量实时逆转录聚合酶链反应(qRRT-PCR)进行评价。可在攻击前和攻击后收集血液样品，可就抗BTV特异性抗体的存在分析所述样品。

初免-加强施用可有利地间隔2-6周进行，例如，间隔约3周。根据一个实施方案，还设想半年加强或一年加强(有利地使用基于病毒载体的疫苗)。在第一次施用时，动物是有利地为至少6至8周龄。

将包含用于初免-加强方案的本发明的重组抗原性多肽的组合物包含于药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂中。本发明的方案保护来自绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物的动物免受BTV或AHSV的侵害和/或防止疾病在受感染的动物中进展。

各种施用优选间隔1-6周，更具体地间隔约3周进行。根据优选的模式，还设想优选使用疫苗的基于病毒载体的免疫组合物的每年加强。动物在第一次施用时优选为至少1日龄。

本领域普通技术人员应当理解，本文中的公开内容以举例说明的方式提供，并且本发明不限于此。根据本文中的公开内容和本领域的知识，本领域普通技术人员可确定施用次数、施用途径和用于每一个注射方案的剂量而无需任何过度实验。

本发明设想至少一次对动物施用有效量的根据本发明制造的治疗组合物。动物可以是雄性、雌性、怀孕雌性和新生儿。该施用可以通过各种途径，包括但不限于肌内(IM)、真皮内(ID)或皮下(SC)注射或通过鼻内或口服施用进行。根据本发明的治疗组合物还可通过无针装置(例如，例如利用Pigjet、Dermojet、Biojector、Avijet(Merial,GA,USA)、Vetjet或Vitajet装置(Bioject,Oregon,USA))施用。施用质粒组合物的另一种方法是使用电穿孔(参见，例如，Tollefsen等人,2002；Tollefsen等人，2003；Babiuk等人，2002；PCT申请No.WO99/01158)。在另一个实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗组合物递送给动物。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的制剂的施用，所述制剂用于将BTV或AHSV抗原或表位递送至靶细胞并在所述靶细胞中表达。治疗有效量的确定对于本领域普通技术人员来说是常规实验。在一个实施方案中，制剂包含表达载体和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂，所述表达载体包含表达BTV或AHSV抗原或表位的多核苷酸。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂促进多核苷酸至宿主动物的转染或其它方式的转移和/或改善载体或蛋白质在宿主中的保存。

在一个实施方案中，本文中公开的主题提供了用于区分受感染的动物与接种的动物(DIVA)的检测方法。

目前，存在几种可用的BTV疫苗。Merial和Intervet都提供灭活的BTV8疫苗。最近已描述了区分BTV接种动物与BTV感染的动物的方法(Sílvia C.Barros等人,Veterinary-Microbiology,2009).

本文中公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许检测动物的BTV或AHSV感染。本文中公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许通过区分受感染的动物与接种的动物(DIVA)来检测动物的感染。本文中公开了使用基于BTV-NS3的免疫原性检测法，例如，NS3特异性ELISA诊断动物的BTV感染的方法。

制品

在实施方案中，本文中公开的主题涉及用于执行诱发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可以包括任一种重组的BTV或AHSV免疫组合物或疫苗，或灭活的BTV或AHSV免疫组合物或疫苗，重组的BTV或AHSV病毒组合物或疫苗，和用于执行该方法的说明书。

本发明的另一个实施方案是用于进行诱导动物的针对BTV或AHSV的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包括包含本发明的BTV抗原的组合物或疫苗和重组BTV或AHSV病毒免疫组合物或疫苗，以及用于进行以引发动物的免疫反应的有效量进行递送的方法的说明书。

本发明的另一个实施方案是用于进行诱导动物的针对BTV或AHSV的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包括包含本发明的BTV或AHSV抗原的组合物或疫苗和灭活的BTV免疫组合物或疫苗，以及用于进行以引发动物的免疫反应的有效量进行递送的方法的说明书。

如上文中描述的，本发明的另一个方面涉及用于进行根据本发明的初免-加强接种的试剂盒。试剂盒可包含至少两个小瓶：包含用于根据本发明的初次接种的疫苗或组合物的第一小瓶，和包含用于根据本发明的加强接种的疫苗或组合物的第二小瓶。试剂盒可有利地包含用于另外的初次接种或另外的加强接种的另外的第一或第二小瓶。

本发明包括下列实施方案。在实施方案中，公开了包含重组BTV或AHSV载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物的组合物。在实施方案中，公开了其中药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物是油包水乳剂或水包油乳剂的上述组合物。在另一个实施方案中，公开了接种对绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物BTV或AHSV易感的动物的方法，所述方法包括给动物施用上述组合物。在实施方案中，公开了接种对绵羊类动物、牛类动物、山羊类动物或猪类动物BTV或AHSV易感的动物的方法，其包括初免-加强方案。在一个实施方案中，公开了诊断动物的流感感染的方法。在另一个实施方案中，公开了用于初免-加强接种的试剂盒，其包括至少两个小瓶，其中第一小瓶包含本发明的组合物，第二小瓶包含用于加强-接种的组合物，所述组合物包括包含重组病毒载体的组合物，或包含灭活的病毒组合物的组合物，或包含或表达BTV或AHSV抗原的DNA质粒组合物。

药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或佐剂或赋形剂对于本领域普通技术人员是公知的。例如，药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％的NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括但不限于，聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是促进载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)的施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，载体、媒介物或赋形剂可促进转染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中于一般性描述中进行了讨论，并且还可由本领域普通技术人员根据与本领域的知识结合阅读的本公开内容来测定，而无需任何过度实验。

有利地但非唯一地适合于质粒的包含季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下列通式的脂质：

其中R1为具有12至18个碳原子的饱和或不饱和的直链脂烃基，R2为含有2或3个碳原子的另一个脂烃基，并且X是胺基或羟基，如DMRIE。在另一个实施方案中，还可将阳离子脂质与中性脂质例如DOPE结合。

在这些阳离子脂质中，优选考虑DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质，有利地DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr，1994)结合以形成DMRIE-DOPE。

有利地，临时和有利地与制剂施用的同时或在制剂施用前不久形成质粒与佐剂的混合物；例如，在施用前不久或即将施用时，有利地形成质粒-佐剂混合物，以便在施用前得到足够的时间以便所述混合物形成复合物，例如在施用前约10至约60分钟，例如施用前约30分钟。

当DOPE存在时，DMRIE:DOPE的摩尔比有利地为约95:约5至约5:约95，更有利地约1:约1，例如1:1。

DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂:质粒的重量比可以为约50:约1至约1:约10，例如约10:约1至约1:约5，约1:1至约1:约2，例如，1:1至1:2。

在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂可以是油包水乳剂。适合的油包水乳剂的实例包括油基油包水乳剂疫苗，其在4℃是稳定的并且具有流动性，其包含：6至50v/v％，优选12至25v/v％的含抗原水相，50至94v/v％的全部或部分包含下述油的油相：不可代谢的油(例如，矿物油例如石蜡油)和/或可代谢的油(例如，植物油，或脂肪酸、多元醇或醇酯)、0.2至20p/v％，优选3至8p/v％的表面活性剂，后者是全部或部分的，或存在于混合物(聚甘油酯，所述聚甘油酯优选是聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或其他氢化聚氧乙烯蓖麻油)。可用于油包水乳剂的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨醇酯(例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN )，可获自AppliChem，Inc.,Cheshire,CT)和脱水山梨醇酯(例如，脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN)，可购自Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。此外，关于油包水乳剂，也参见美国专利No.6,919,084，例如，其实施例8，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，含有抗原的水相包含含有一种或多种缓冲剂的盐水溶液。适合的缓冲液的实例是磷酸盐缓冲盐水。在有利的实施方案中，油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三重乳剂(美国专利No.6358500)。其它适合的乳剂的实例描述于美国专利No.7,371,395。

根据本发明的免疫组合物和疫苗可包含一种或多种药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂或基本上由其组成。用于本发明的实施的适合的载体或佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit andAdjuvant Approach”的第147页上描述的SPT乳剂和相同著作的第183页上描述的乳剂MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在通过引用并入本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或(9)其任意组合或混合物。

特别适合于病毒载体的水包油乳剂(3)可以基于：轻液体石蜡油(欧洲药典类型)，类异戊二烯油例如角鲨烷，角鲨烯，因烯烃例如异丁烯或癸烯的低聚化而产生的油，具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支链脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。

将油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如：一方面脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如无水油酸甘露醇酯)、甘油、聚甘油或丙二醇的酯与另一方面油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选地被乙氧基化，或为聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic，例如L121。

在类型(1)佐剂聚合物中，优选考虑交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别地通过糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物在卡波姆的名义下是已知的(Pharmeuropa,第8卷,no.2,1996年6月)。本领域普通技术人员还可以参考美国专利No.2,909,462，其提供通过多羟基化合物交联的这样的丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个这样的基团，至少三个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基替换。优选基团是那些包含2至4个碳原子的基，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团。所述不饱和基团还可含有其它取代基，例如甲基。在卡波姆名义出售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)是特别适合的。它们通过烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，提及卡波普974P、934P和971P。

关于马来酸酐-烯基衍生共聚物，优选考虑EMA(Monsanto)，其是直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物，并且它们例如通过二乙烯基醚交联。也可参考J.Fields等人,1960。

关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下列通式的基本单元形成：

其中：

-R1和R2可以相同或不同地代表H或CH3

-x＝0或1，优选地x＝1

-y＝1或2，x+y＝2。

对于EMA，x＝0并且y＝2，以及对于卡波姆x＝y＝1。

这些聚合物可溶于水或生理盐水溶液(20g/l NaCl)，可以例如利用苏打(NaOH)将pH值调整至7.3至7.4，以提供其中可掺入表达载体的佐剂溶液。最终免疫或疫苗组合物中的聚合物浓度可在约0.01至约1.5％w/v、约0.05至约1％w/v和约0.1至约0.4％w/v的范围内。

细胞因子(5)可以以蛋白质形式存在于免疫或疫苗组合物中，或可与其免疫原或表位一起在宿主中共表达。优先考虑通过与表达其免疫原或表位的载体相同的载体或通过其单独的载体进行的一种或多种细胞因子的共表达。

本发明包括制备这样的组合组合物；例如通过，有利地与佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂一起，混合活性成分。

可用于本发明的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ、(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)和转化生长因子β(TGFβ)。应理解，可将细胞因子与本发明的免疫或疫苗组合物共同施用和/或依次施用。因此，例如，本发明的疫苗还可包含外源核酸分子，所述外源核酸分子在体内表达合适的细胞因子，例如与待接种的或将在其中引发免疫反应的该宿主匹配的细胞因子(例如，用于待给牛类动物施用的制剂的牛细胞因子)。

有利地，根据本发明的免疫组合物和/或疫苗包含引发治疗反应的有效量的一种或多种本文中论述的多肽，或基本上由所述有效量的所述多肽组成或由所述有效量的所述多肽组成；并且有效量可根据本公开内容，包括并入本文的文献以及本领域的知识来确定，而无需过度实验。

在基于所述表达的多肽的免疫组合物和/或疫苗的情况下，剂量可包括约1μg至约2000μg，有利地约50μg至约1000μg，和更有利地约100μg至约500μg的BTV或FMDV抗原、表位或免疫原。剂量体积可以为约0.1至约10ml，有利地约0.2与约5ml。

本发明现在将通过以下非限制性实施例来进一步描述。

具体实施方式

实施例

使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)描述的标准生物学技术进行DNA插入物(insert)、质粒和重组病毒或植物载体的构建。

实施例1 重配BTV的产生

细胞和病毒

BSR细胞是BHK-21细胞的克隆，并被维持在补充有5％胎牛血清(FBS)和25μg/ml青霉素/链霉素(p/s,Gibco)的Dulbecco改良伊格尔培养基(DMEM,Gibco)中。将Vero细胞维持在补充有5％FBS和p/s的DMEM培养基中。CPT-Tert细胞是绵羊脉络丛细胞的永生化品系(59)，并且被维持在补充有10％FBS和p/s的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM,Gibco)中。将所有哺乳动物细胞在具有5％CO₂的润湿培养箱中于37℃进行温育。

BTV-1是南非血清型1参考菌株，并已用作第一BTV反向遗传学系统的基础。欧洲BTV-8株(BTV-8NET2008/06(IAH环状病毒集合))是在荷兰从临床上受影响的牛分离的，并且具有仅在KC细胞中传代一次，随后在BHK-21细胞中再进行一次传代的传代史。

质粒

先前已描述了用于BTV-1和BTV-8的拯救的质粒(Ratinier等人，2011)。每个质粒包含单个BTV cDNA拷贝的侧翼连接5'T7启动子和3'限制位点的基因组区段。这样排列T7启动子和限制性位点，以便用适当的限制性内切酶线性化的质粒允许体外转录具有真实的BTV末端的加帽RNA转录物。商业(GenScript)合成在与其它拯救质粒相同的背景中包含BTV-2、BTV-4和BTV-9(13)的野外强毒分离株(virulentfield isolates)的Seg-2的另外质粒。

反向遗传学

用合适的限制性酶线性化包含BTV-1或BTV-8或所得的突变体的基因组区段的质粒，随后用苯酚-氯仿提取进行纯化。按照制造商的说明书，使用mMESSAGE mMACHINE T7Ultra试剂盒(Ambion)将消化的质粒用作用于体外转录的模板。按照制造商的方案，通过苯酚/氯仿提取和通过illustra Microspin G25柱(GE Healthcare LifeSciences)依次纯化ssRNA。

按照期望的重配株装配单个RNA的组合(参见表1和图1)。

在转染前24h，将2×10⁵个BSR细胞涂板在无抗生素的生长培养基中的12孔板中。使用Lipofectamine2000，利用RNA转染细胞2次。对于第一转染，将1×10¹¹个拷贝的体外转录的编码VP1、3、4、6、NS1和NS2的BTV样加帽的RNA与含有RNAsin Plus(0.5U/μl,Promega)的OptiMEM(Gibco)以10μl的终体积混合。将2μlLiptofectamine2000与10μl的OptiMEM(含有RNAsin Plus)混合，在与RNA组合之前温育5分钟。在将转染复合物逐滴添加至细胞之前，使转染复合物形成20分钟。第一转染后约18小时，替换培养基，并按照第一转染第二次转染细胞，但用全部10个区段和3μl脂质体。第二次转染后4小时，将培养基替换为琼脂覆盖。

在整个本报告中采用标准命名法：名称的大写部分是指病毒的主链，随后是包括取代的蛋白质的下标，下标之前是区段的血清型来源，例如BTV-1_8VP1是指具有BTV-1主链，包含BTV-8的VP1基因的病毒。

描述重配BTV的产生的示意图示于图6中。

生长曲线

关于病毒生长的体外分析，在感染前一天，将2×10⁵个CPT-Tert细胞/孔或3×10⁶个KC细胞/孔涂板在1ml生长培养基中的12孔板中。将细胞在含有相关病毒的培养基中在37℃温育2小时。随后弃去培养基，用DMEM洗涤细胞一次，随后用1ml的适当的新鲜生长培养基进行温育。在感染后(p.i.)0、8、24、48和72小时取出100μl的上清液样品，并用100μl的新鲜生长培养基替换。通过在500×g离心5分钟澄清100μl样品，然后于4℃贮存。随后通过在BSR细胞中进行有限稀释测定法(60)滴定样品，病毒滴度表示为TCID₅₀/ml。

噬菌斑测定

在用BTV感染之前24h，将CPT-Tert细胞以4×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中。细胞在37℃感染2小时。之后，将含病毒培养基弃去，用DMEM洗涤细胞，在3ml的半固体覆盖层(1.2％的补充有4％的FBS和p/s的DMEM中的Avicel)中温育72h。随后弃去覆盖层，用PBS洗涤洗涤细胞，随后用甲醛中的结晶紫染色持续>1h。

中和测定

使用50μl的在含有3％FBS的DMEM中稀释的各测试血清在96孔板中一式四份地制备BTV-1或BTV-8特异性抗血清的三倍连续稀释液。随后将100TCID₅₀的BTV-1、BTV-8和选择的重配株添加至相应的孔和平板中，并在37℃温育1h。最后，2.5×10⁴个Vero细胞添加至各孔中，将板在具有5％CO的湿润的培养箱中于37℃温育5天，随后目视评估病毒CPE。随后使用Reed-Muench法(60)来测定定义为血清稀释抑制50％的Vero细胞培养物的BTV感染的血清稀释度的每一个血清样品的保护剂量50(PD₅₀)。将悬浮BHK-21细胞按比例放大用于重配BTV的大规模生产。将收获的重配BTV灭活。将适合的佐剂加至重配BTV以用于疫苗配制。

结果

反向遗传学被用来确定是否有可能将BTV-1或BTV-8的任何个别区段重配成替代主链。在BTV-1的主链中具有BTV-8的单个区段的病毒的所有组合被成功拯救，反之亦然(图1)。通过来自每一个区段的片段的RT-PCR扩增和测序检查每个重配病毒的基因型(图1)。结果表明，任何BTV区段可在BTV-1与BTV-8之间重配。

使用噬菌斑测定并通过进行病毒的生长曲线来评估每一个重组病毒的体外生长特性。从两个独立轮次的噬菌斑测定来测定平均噬菌斑的直径。在大多数情况下，噬菌斑直径基本上不受影响，并与替代的个别区段被插入其中的亲代主链几乎无差异(图2A-B)。然而，一些病毒始终显示相对于亲代主链的较小或较大的噬菌斑表型。BTV-8Seg-8(编码NS2)至BTV-1主链的替代(BTV-1_8NS2)导致比野生型BTV-1小约33％的噬菌斑(图2A)。相对的重配株即BTV-8_1NS2的噬菌斑，也减少，尽管程度更低(图2B)。始终产生具有相较于亲代病毒更小的直径的噬菌斑的其他单重配株是具有编码VP1、VP4和NS1的重配区段的重配株。

进行生长曲线分析以评估每个重配株的生长动力学。多数重配株表现与相应野生型病毒(图3)相似的生长动力学(图3)。

若干研究表明，VP2与BTV血清型有着千丝万缕的联系。然而，也有人认为VP5有助于界定特定菌株的血清型。为了调查VP2和VP5对血清型确定的相对贡献，使用重配株BTV-1、BTV-8和具有BTV-1或BTV-8和单独的异源VP2或VP2和VP5的主链的重配株(BTV-1_8VP2、BTV-1_8VP2,VP5、BTV-8_1VP2和BTV-8_1VP2,VP5)进行血清中和测定。BTV-1和BTV-8中和抗血清来自于接种抗BTV-1或BTV-8疫苗并用同源株攻击的动物。

结果显示，BTV-8抗血清完全中和野生型BTV-8，同时显示了对BTV-1无中和能力(图4A)。类似地，通过BTV-1抗血清但非BTV-8抗血清中和BTV-1(图4A)。

利用包含异源病毒的单独的VP2或VP2和VP5的重配株的实验显示当血清匹配VP2蛋白时，病毒才被中和，从而确认研究使血清型唯一地与VP2相关联。

表明单独的VP2可决定血清型的结果促使我们产生并入来自血清型的选择的Seg-2的另外的BTV-1重配株。分别导致BTV-1_2VP2、BTV-1_4VP2和BTV-1_9VP2的包含BTV-2、BTV-4和BTV-9的VP2的BTV-1重配株病毒被成功地拯救。在所有情况下，与野生型病毒等同地生长的病毒被拯救(图5)。

实施例2 接种的动物的临床和血清学研究

将使用BTV-1主链和用(VP2BTV8)或(VP2BTV8+VP5BTV8)替换(VP2BTV1)或(VP2BTV1+VP5BTV1)的两个构建体分别用于攻击研究。被产生来配制测试疫苗的抗原的特性概述于下表2中。

表2 抗原的特征

抗原	主链	蛋白质替代(和血清型)
			VP2	BTV-1	VP2(BTV-8)
VP2+VP5	BTV-1	VP2(BTV-8)+VP5(BTV-8)

生长重配病毒，将其灭活和处理，以产生两个抗原批次。通过将这些抗原与作为佐剂的铝凝胶(2.7mg氢氧化铝)和皂苷(30HU皂苷/1mL疫苗剂量)混合来将这些抗原配制成疫苗。测试的疫苗列于表3。

表3 疫苗的特征

*:通过在AI(Active Ingredient)上进行定量斑点印迹测量的VP2_BTV8含量

**:相同mL的非浓缩AI

将疫苗在1或2次注射中施用至常规BTV血清阴性绵羊。保护是通过在接种完成后21天进行强毒BTV-8攻击并且随后的临床和病毒学监测来评估保护作用。按照下表4进行绵羊的攻击研究。

表4

在接种期之前，监测所有动物的健康状况和直肠温度。在D0和/或D21，来自组G1至G6的每一个动物接受1个剂量的1mL适当的疫苗，如表4中描述的。在注射部位局部消毒后，在胸的左(D0)或右(D21)侧面、肘部旁边通过皮下途径进行注射。来自组G7的动物保持不处理并用作对照。

对于所有动物，在D42(挑战前)记录直肠温度，随后从D47至D56每天记录直肠温度。从D47至D56，记录所有动物的一般行为和身体状况。对于一般条件：良好被赋予0分；冷淡被赋予1分；抑郁被赋予2分；屈服被赋予3分。对于身体状况：正常被赋予0分；瘦被赋予1分；恶病质被赋予2分。

从D47至D56，记录在蓝舌病感染期间观察到的临床体征，包括：

-充血和/或水肿，尤其是头部：眼、鼻孔、耳、嘴唇、倒角(chamfer)、下颌间空间

-多涎

-鼻涕/痂皮

-哀怨咩咩

-瘀点

-运动烦恼(跛行)

-呼吸困难(咳嗽/呼吸困难)

-消化麻烦(腹泻)

-红斑

当存在时记录其他临床体征。在其中未进行个体临床监测的日子，每日检查群体的一般健康状况，作为每日护理和维持的部分。

在D0(接种前)、D21(接种疫苗前)、D42(攻击前)和D56，利用光管通过颈内穿刺从所有绵羊采样血液样品。处理所有样品以收集血清。在将它们转移至临床分析实验室之前，将血清等分和热灭活(56℃，30分钟)。通过血清中和测试在所有采样日期测定个体血清的BTV-8特异性抗体滴度。

血清中和试验，按照目前临床分析实验室使用技术(N°002488)进行血清中和测度。简言之，在微量滴定板中以始于1/3的3倍稀释度(0.48Log10)测试血清。将100微升的稀释血清与50微升的给定的BTV血清型(血清型8)的病毒悬浮液一起在37℃温育1小时。随后将50微升的每ml含500000个细胞的VERO细胞悬浮液添加至混合物中，将板在37℃进行温育。在7天的温育后，板的读取基于致细胞病变效应。以Log10(PD50％)表示的血清滴度在角度变换后通过回归来计算。

在D42(攻击前)、D47、D49、D51、D54和D56，利用EDTA管通过颈内穿刺对所有绵羊采集血液样品。

为了检测和定量血液中的蓝舌病病毒RNA，通过qRT-PCR测试对这些样品进行分析。按照当前由临床分析实验室使用的技术No.200336(自动化方法)进行这些测定。

简言之，在使用商业试剂盒(Nucleospin multi 96)提取后，首先通过热处理使RNA变性。随后使用来自Invitrogen Super Script IIIPlatinium One step试剂盒的MGB探针、特异性引物和试剂温育一个等分部分，以允许在热循环仪上进行扩增。以一式两份进行该步骤。荧光信号与合成的DNA的量成正比。扩增涉及24种BTV血清型的任何一种。将样品中的BTV核酸的量与标准化RNA样品相比较。RNA的量表示为Log₁₀RNA拷贝数/mL血液，考虑到在每一个一式两份中获得结果(当二者都是阳性时)，和当发现一式两份之一是阴性的，仅有一个阳性)。技术的阳性截断点95％(定义为可在95％的测试运行被检测的每体积样品的目标序列的最少数量)或阳性响应阈值95％(PRT95)经测定为3.68log10 RNA拷贝/mL。低于3.68log10 RNA拷贝/mL的样品滴定的结果表示为<PRT95，并且被认为是阴性的。同样地，给出≥P RT95的样品滴定的结果，该结果被认为是阳性的。

为了进行结果描述(平均值、标准差和曲线下面积的计算)和分析，将3.68log10 RNA拷贝/mL的滴度归因于阴性样品。

过热结果

攻击后平均温度的演化示于图8中。极大过热的分散示于图9。

始于D48(即攻击后6天)在对照组中清楚地观察到直肠温度的增加，并且在D49达到峰值(平均41.3℃)，然后逐渐降低直至D56。

在所有接种疫苗的组中，平均温度在整个监测期间相当稳定。当与对照组(G7)相比较时，在接种组G1、G3和G4中，最大过热在统计学上显著(p≤0.01)降低。对于G2和G6差异在统计学上不显著。

临床体征和临床评分

平均每日临床评分的演化示于图10中。每组GCS的分散描绘于图11中。

攻击后，最常观察到的临床体征是头部的充血和水肿。其中，还偶尔观察到红斑、冷漠、瘦、鼻涕及痂皮、呼吸和运动困难。

这些体征的观察的频率和持续时间在对照组中明显高于接种组。

在对照组(G7)中，平均每日临床评分在D50(即攻击后8天)达到峰值8.8，并且恒定地高于任何接种。G7的平均GCS为50。在接种组中，平均每日临床评分在整个监测期间极低。当与对照组(G7)相比较时，在除G2外的所有接种组中GCS在统计学上地显著(p≤0.01)降低。对于G2，差异接近统计显著性。

病毒血症结果

平均病毒血症滴度的演化概述于图12中。PCR阳性样品的频率和AUC示于表5中。图13示出的AUC的分散。

所有绵羊在攻击前被确认为RT-PCR阴性。在对照组中，所有绵羊在D47(即攻击后5天)为阳性，并且它们以相当高的滴度一直保持阳性，直至监测期结束。

在接种组G3和G4中，在接种后立即取样的日期，一只羊被检测具有低阳性。随后发现两组绵羊总是阴性。这些短暂的低阳性结果很可能归因于攻击接种物的残留物的检测，并且显然不归因于病毒繁殖。

当与对照组(G7)比较时，除G2外，在所有接种组中曲线下面积在统计学上显著地(p≤0.01)减少。对于G2，差异接近统计显著性。病毒血症的完全预防被认为在G1，G3，G4和G5得以实现。

表5 PCR阳性样品的频率和AUC

*:商业疫苗BR8:商业BTV-8疫苗(Merial)

**:在D53死亡一只绵羊。

血清学结果

平均BTV-8中和抗体滴度的演化概述于图14中。

所有绵羊在接种前被确认为血清阴性，对照在攻击前保持血清阴性。

在2次注射接种组(G1和G4)中，在D21观察到一些血清转变(sero-conversion)。在D42，所有绵羊在两个组中具有血清转变，并且平均滴度几乎相同。

在一次注射接种组(G2、G3、G5和G6)中，在接种后21天(即D42)观察到一些血清转变。然而在一次与两次注射接种组(G1对G2和G4对G5)之间观察到血清学滴度的明显差异(D42)，根据抗原的有效负载(G2对G3)的血清学滴度的差异不太明显。

所有绵羊在攻击后(D56)发生强烈的血清转变，并且在所有接种组中存在明确的加强效应。

结论

结果表明，构建体提供过热的显著减少，临床体征的显著减少以及病毒血症的完全和显著预防。

实施例3 多个血清型的合成BTV的产生

通过使用如实施例1中所述的反向遗传系统，可产生覆盖26种不同的血清型中24种的“合成”BTV重配株(sBTV)，其中每一个VP2与BTV-1主链(VP1、VP3、VP4、NS1、VP7、NS2、VP6和NS3蛋白)中的同源VP5蛋白偶联，如下面表6中显示的。术语“合成的”被用来描述该平台，其原因在于，可从已知序列体外合成基因组区段，而非通过扩增病毒株的基因组来合成基因组区段。

有趣地和令人惊讶地，尽管BTV-25(吐根堡环状病毒属(Toggenburg Orbivirus))在细胞培养不生长，但通过将BTV-1的非翻译区引入VP2和VP5蛋白的编码序列，我们就能够拯救BTV-25血清型的sBTV。因此，疫苗平台对于不能在组织培养容易分离的那些病毒株是极为有用的。

表6 通过反向遗传学系统分析的可得sBTV病毒

#侧翼连接有BTV-1的非翻译区的蛋白质编码区

sBTV的表征和体外复制

生长每个_SBTV病毒的病毒原液，且在BSR细胞中进行滴定。在感染后72小时，通过噬菌斑测定在绵羊细胞中评价噬菌斑表型(图15)。如先前所述，所有拯救的血清型具有同源VP2/VP5组合。

在BHK-21细胞(具有0.001的MOI感染)中测定sBTV复制。在感染后72小时收集细胞上清液(图16)。随后通过BHK-21细胞的TCID₅₀滴定一式三份样品(使用Reed-Muench法)，且作为Log₁₀TCID₅₀/ml绘图。

实施例4 灭活的重配病毒的产生

在BHK21细胞中，扩增两个构建菌株为重配BTV，一个对应于来自BTV-1主链中的BTV8的VP2，第二个具有来自BTV-1主链中的BTV8的VP2/VP5。

细胞的产生

用5升含有7％的小牛血清和2×10⁹个细胞(6BHK2M12-第47代)的GMEM培养基接种7L生物反应器(第48代)。使用pH值：7.1±0.1，温度：37.0±1.5℃，DO2：40±10％和搅拌：300rpm±10％作为参数调节培养物。在2天的培养后，进行计数。将整个体积的悬浮液转移至预先灭菌并装有35升GMEM培养基+7％CS的B4生物反应器中。使用pH值：7.1±0.1，温度：37.0±1.5℃，DO2：40±10％和搅拌：150rpm±10％作为参数调节培养物。培养3天后，停止生物反应器的搅拌以在+5℃下约24小时的过程中倾倒细胞。倾倒后，除去培养基，(剩余体积＝5升)。添加VMM培养基(30升)。混合后，进行细胞计数，添加接种物：接种物BTV1+BTV8VP2(RAS10)(针对第一活性成分)，和接种物BTV1+BTV8VP2/VP5(RAS32)(针对第二活性成分)。生物反应器的终体积为35升，计算接种物的体积，以获得等于5×10^-4CCID₅₀/细胞的MOI。培养的参数是：pH值：7.4±0.1，温度：37.0±1.5℃，DO2：40±10％，搅拌：100rpm±10％和压力：0.1巴±10％。在约46小时后通过在搅拌下冷却终止培养。

灭活前处理

停止氧的调节，添加氯仿以获得0.05％的终浓度。在搅拌下将混合物在约8℃放置1小时，将pH值调整至7.4±0.1。停止pH调整，在不搅拌的情况下将产物在约8℃贮存，直至处理。利用turrAX T50处理约24升培养物：在实验室温度以1000瓦处理8个3000ml的样品，进行3分钟。处理后混合样品。

随后通过离心(在20℃以3500rpm进行20分钟)澄清产物。过滤上清液，并在灭活前于+5℃贮存。

灭活

将上清液滤液在37℃进行加热，将pH调整至7.4±0.1。添加甲醛溶液以获得0.5mg/ml的终浓度。20分钟后，添加一个剂量的EI以获得1.5mM的终浓度。18小时后，加入第二剂量的EI(同一浓度)。在37℃进行灭活步骤24小时(T0＝EI的第一次添加的时间)。在该灭活步骤过程程中，利用L-半胱氨酸的溶液进行和处理样品。

过滤和浓缩

过滤(CUNO 30S)灭活产物。测量新体积。在实验室温度浓缩滤液，计算浓缩倍数(factor of concentration)。

纯化和甲醛处理

使用具有S6FF的柱子XK 25/100纯化浓缩物。进行2个运行。纯化的条件为：样品的体积：15％的柱子(约60ml)；用于洗脱的缓冲液：磷酸盐缓冲液pH7.4；速度洗脱：2.5ml/分。分别收集排阻峰(exclusion peak)(活性成分)、安全级分和蛋白质峰。将甲醛溶液添加至活性成分以获得在+5℃贮存的1mg/ml的终浓度。

BTV1+BTV8VP2(RAS10)和BTV1+BTV8VP2/VP5(RAS32)的感染性滴度、ELISA、斑点印迹Vp2的结果示于图17和18中。成功地进行了两个纯化灭活的BTV重配株的产生。将这两个重配株用来配制疫苗。

***********************

尽管已在本发明的详细的优选实施例进行了描述，但是应当理解，由上述段落限定的本发明不应被限于上面的描述中所示的特定细节，因为许多其显而易见的变化是可能的，并且不背离发本发明的精神或范围。

本申请引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文中引用或参考的所有文献(“本文中引用的文献”)，和本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，与本文中或通过引用并入本文中的任何文献中提及的任何制造商的说明书、描述、产品规格以及任何产品说明书在此通过引用并入本文，并且可用于本发明的实施。

参考文献

Anderson，G.A.，J.L.Stott，et al.(1985).″Subclinical and clinical bluetongue disease incattle：clinical，pathological and pathogenic considerations.″Prog Clin Biol Res 178：103-7.Andreansky，S.S.，B.He，et al.(1996).″The application of genetically engineered herpessimplex viruses to the treatment of experimental brain tumors.″Proc Natl Acad Sci U S A93(21)：11313-8.

Andrew，M.，P.Whiteley，et al.(1995).″Antigen specificity of the ovine cytotoxic Tlymphocyte response to bluetongue virus.″Vet Immunol Immunopathol 47(3-4)：311-22.

Antoine，G.，F.Scheiflinger，et al.(1998).″The complete genomic sequence of the modifiedvaccinia Ankara strain：comparison with other orthopoxviruses.″Virology 244(2)：365-96.

Ballay，A.，M.Levrero，et al.(1985).″In vitro and in vivo synthesis of the hepatitis B virussurface antigen and of the receptor for polymerized human serum albumin from recombinanthuman adenoviruses.″Embo J 4(13B)：3861-5.

Barcena，J.，M.M.Lorenzo，et al.(2000).″Sequence and analysis of a swinepox virushomologue of the vaccinia virus major envelope protein P37(F13L).″J Gen Virol 81(Pt 4)：1073-85.

Bernard，K.A.，B.A.Israel，et al.(1997).″Sequence and cognitive analyses of two virulence-associated markers ofbluetongue virus serotype17.″Intervirology 40(4)：226-31.

Bonneau，K.R.，C.D.DeMaula，et al.(2002).″Duration of viremia infectious to Culicoidessonorensis in bluetongue virus-infected cattle and sheep.″Vet Microbiol 88(2)：115-25.

Bonneau，K.R.，B.A.Mullens，et al.(2001).″Occurrence of genetic drift and founder effectduring quasispecies evolution of the VP2 and NS3/NS3A genes of bluetongue virus uponpassage between sheep，cattle，and Culicoides sonorensis.″J Virol 75(17)：8298-305.

Bonneau，K.R.，N.Zhang，et al.(1999).″Sequence comparison of the L2 and S10 genes ofbluetongue viruses from the United States and the People′s Republic of China.″Virus Res61(2)：153-60.

Boshart，M.，F.Weber，et al.(1985).″A very strong enhancer is located upstream of animmediate early gene of human cytomegalovirus.″Cell 41(2)：521-30.

Bradel-Tretheway，B.G.，Z，Zhen，et al.(2003).″Effects of codon-optimization on proteinexpression by the human herpesvirus 6 and 7 U51 open reading frame.″J Virol Methods111(2)：145-56.

Carroll，M.W.，W.W.Overwijk，et al.(1997).″Highly attenuated modified vaccinia virusAnkara(MVA)as an effective recombinant vector：a murine tumor model.″Vaccine 15(4)：387-94.

Cochran，M.A.，C.Puckett，et al.(1985).″In vitro mutagenesis of the promoter region for avaccinia virus gene：evidence for tandem early and late regulatory signals.″J Virol 54(1)：30-7.

Cowley，J.A.and B.M.Gorman(1989).″Cross-neutralization of genetic reassortants ofbluetongue virus serotypes 20 and 21.″Vet Microbiol 19(1)：37-51.

De Groot，A.S.and F.G.Rothman(1999).″In silico predictions；in vivo veritas.″Nat Biotechnol 17(6)：533-4.

de Mattos，C.A.，C.C.de Mattos，et al.(1994).″Heterogeneity of the L2 gene of fieldisolates of bluetongue virus serotype 17 from the San Joaquin Valley of California.″Virus Res31(1)：67-87.

DeMaula，C.D.，K.R.Bonneau，et al.(2000).″Changes in the outer capsid proteins ofbluetongue virus serotype ten that abrogate neutralization by monoclonal antibodies.″Virus Res 67(1)：59-66.

DeManla，C.D.，H.W.Heidner，et al.(1993).″Neutralization determinants of United Statesbluetongue virus serotype ten.″Virology 195(1)：292-6.

DeMaula，C.D.，C.M.Leutenegger，et al.(2002).″The role of endothelial cell-derivedinflammatory and vasoactive mediators in the pathogenesis of bluetongue.″Virology 296(2)：330-7.

Disbrow，G.L.，I.Sunitha，et al.(2003).″Codon optimization of the HPV-16 E5 geneenhances protein expression.″Virology 311(1)：105-14.

Felgner，J.H.，R.Kumar，et al.(1994).″Enhanced gene delivery and mechanism studies witha novel series of cationic lipid formulations.″J Biol Chem 269(4)：2550-61.

Frolov，I.，T.A.Hoffman，et al.(1996).″Alphavirus-based expression vectors：strategies andapplications.″Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11371-7.

Funahashi，S.，T.Sato，et al.(1988).″Cloning and characterization of the gene encoding themajor protein of the A-type inclusion body of cowpox virus.″J Gen Virol 69(Pt 1)：35-47.

Geysen，H.M.(1990).″Molecular technology：peptide epitope mapping and the pintechnology.″Southeast Asian J Trop Med Public Health 21(4)：523-33.

Geysen，H.M.，S.J.Barteling.et al.(1985).″Small peptides induce antibodies with asequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies raisedagainst the native protein.″Proc Natl Acad Sci U S A 82(1)：178-82.

Geysen，H.M.，R.H.Meloen，et al.(1984).″Use of peptide synthesis to probe viral antigensfor epitopes to a resolution ofa single amino acid.″Proc Natl Acad Sci U S A 81(13)：3998-4002.

Ghiasi，H.，A.Fukusho，et al.(1987).″Identification and characterization of conserved andvariable regions in the neutralization VP2 gene of bluetongue virus.″Virology 160(1)：100-9.Graham，F.L.(1990).″Adenoviruses as expression vectors and recombinant vaccines.″Trends Biotechnol 8(4)：85-7.

Guo，P.X.，S.Goebel，et al.(1989).″Expression in recombinant vaccinia virus of the equineherpesvirus 1 gene encoding glycoprotein gp13 and protection of immunized animals.″J Virol 63(10)：4189-98.

Hartikka，J.，M.Sawdey，et al.(1996).″An improved plasmid DNA expression vector fordirect injection into skeletal muscle.″Hum Gene Ther 7(10)：1205-17.

Hassan，S.S.and P.Roy(1999).″Expression and functional characterization of bluetonguevirus VP2 protein：role in cell entry.″J Virol 73(12)：9832-42.

Heidner，H.W.，P.V.Rossitto，et al.(1990).″Identification of four distinct neutralizingepitopes on bluetongue vires serotype 10 using neutralizing monoclonal antibodies andneutralization-escape variants.″Virology 176(2)：658-61.

Hemmer，B.，C.Pinilla，et al.(1998).″The use of soluble synthetic peptide combinatoriallibraries to determine antigen recognition of T cells.″J Pept Res 52(5)：338-45.

Huang，I.J.，G.Y.Hwang，et al.(1995).″Sequence analyses and antigenic epitope mappingof the putative RNA-directed RNA polymerase of five U.S.bluetongue viruses.″Virology214(1)：280-8.

Huismans，H.and B.J.Erasmus(1981).″Identification of the serotype-specific and group-specific antigens of bluetongue virus.″Onderstepoort J Vet Res 48(2)：51-8.

Huismans，H.，N.T.van der Walt，et al.(1987).″Isolation of a capsid protein of bluetonguevirus thai induces a protective immune response in sheep.″Virology 157(1)：172-9.

Jewell，J.E.and J.O.Mecham(1994).″Identification of an amino acid on VP2 that affectsneutralization of bluetongue virus serotype 10.″Virus Res 33(2)：139-44.

Ju，Q.，D.Edelstein，et al.(1998).″Transduction of non-dividing adult human pancreatic betacells by an integrating lentiviral vector.″Diabetologia 41(6)：736-9.

Kim，C.H.，Y.Oh，et al.(1997).″Codon optimization for high-level expression of humanerythropoictin(EPO)in mammalian cells.″Gene 199(1-2)：293-301.

Kitson，J.D.，K.L.Burke，et al.(1991).″Chimeric polioviruses that include sequencesderived from two independent antigenic sites of foot-and-mouth disease virus(FMDV)induce neutralizing antibodies against FMDV in guinea pigs.″J Virol 65(6)：3068-75.

Klinman，D.M.，A.K.Yi，et al.(1996).″CpG motifs present in bacteria DNA rapidly inducelymphocytes to secrete interleukin 6，interleukin 12，and interferon gamma.″Proc Natl Acad Sci U S A 93(7)：2879-83.

Kwissa，M.，K.van Kampen，et al.(2000).″Efficient vaccination by intradermal orintramuscular inoculation of plasmid DNA expressing hepatitis B surface antigen underdcsmin promoter/enhancer control.″Vaccine 18(22)：2337-44.

Laval，F.，R.Paillot，et al.(2002).″Quantitative analysis of the antigen-specific IFNgamma+T cell-mediated immune response in conventional outbred pigs：kinetics and duration of theDNA-induced IFNgamma+CD8+T cell response.″Vet Immunol Immunopathol 90(3-4)：191-201.

Lobato，Z.I.，B.E.Coupar，et al.(1997).″Antibody responses and protective immunity torecombinant vaccinia virus-expressed bluetongue virus antigens.″Vet Immunol Immunopathol 59(3-4)：293-309.

Luckow，V.A.and M.D.Summers(1988).″Signals important for high-level expression offoreign genes in Autographa californica nuclear polyhedrosis virus expression vectors.″Virology 167(1)：56-71.

MacLachlan，N.J.(1994).″The pathogenes is and immunology of bluetongue virus infectionof ruminants.″Comp Immunol Microbiol Ihfect Dis 17(3-4)：197-206.

MacLachlan，N.J.and J.E.Pearson(2004).Bluetongue：Prodeedings of the ThirdInternational Symposium.Bluetongue：Prodeedings of the Third Intemational Symposium.N.J.MacLachlan and J.E.Pearson，Vet ltaliana.40：1-730.

Marshall，E.，L.B.Woolford，et al.(1997).″Continuons infusion of macrophageinflammatory protein MIP-lalpha enhances leucocyte recovery and haemopoietic progenitorcell mobilization after cyclophosphamide.″Br J Cancer 75(12)：1715-20.

Martinez-Torrecuadrada，J.L.，J.P.Langeveld，et al.(1999).″Antigenie profile of Africanhorse sickness virus serotype 4 VP5 and identification of a neutralizing epitope shared withbluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus.″Virology 257(2)：449-59.

McClements，W.L.，M.E.Armstrong，et al.(1996).″Immunization with DNA vaccinesencoding glycoprotein D or glycoprotein B，alone or in combination，induces protectiveimmunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease.″Proc Natl Aead Sci U S A93(21)：11414-20.

Mecham，J.O.，V.C.Dean，et al.(1986).″Correlation of serotype specificity and proteinstructure of the five U.S.serotypes of bluetongue virus.″J Gen Virol 67(Pt 12)：2617-24.

Mecham，J.O.and D.J.Johnson(2005).″Persistence of bluetongue virus serotype 2(BTV-2)in the southeast United States.″Virus Res 113(2)：116-22.

Miyazaki，J.，S.Takaki，et al.(1989).″Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5.″Gene 79(2)：269-77.

Moss，B.(1996).″Genetically engineered poxviruses for recombinant genc expression，vaccination，and safety.″Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11341-8.

Mullens，B.A.，W.J.Tabachnick，et al.(1995).″Effects of temperature on virogenesis ofbluetongue virus serotype 11 in Culicoides variipennis sonorensis.″Med Vet Entomol 9(1)：71-6.

Paoletti，E.(1996).″Applications of pox virus vectors to vaccination：an update.″Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11349-53.

Pearson，W.R.and D.J.Lipman(1988).″Imeproved tools for biological sequencecomparison.″Proc Natl Acad Sci U S A 85(8)：2444-8.

Pennock，G.D.，C.Shoemaker，ct al.(1984).″Strong and regulated expression of Eseherichiacoli beta-galactosidase in insect cells with a baculovirus vector.″Mol Cell Biol 4(3)：399-406.

Perkus，M.E.，K.Limbach，et al.(1989).″Cloning and expression of foreign genes invaccinia virus，using a host range selection system.″J Virol 63(9)：3829-36.

Powell，M.F.and M.J.Newman(1995).Vaccine Design，The Subunit and AdjuvantApproach.A Compendium of Vaccine Adjuyants and Excipients.F.Vogel and M.Powell.New York，Plenum Press.6：147，183.

Prevec，L.，M.Schneider，et al.(1989).″Use of human adenovirus-based vectors for antigenexpression in animals.″J Gen Virol 70(Pt 2)：429-34.

Pritchard，L.I.and A.R.Gould(1995).″Phylogenetic comparison of the serotype-specificVP2 protein of bluetongue and related orbiviruses.″Virus Res 39(2-3)：207-20.

Regelson，W.，S.Kuhar，et al.(1960).″Synthetic polyelectrolytes as tumout inhibitors.″Nature 186：778-80.

Riviere，M.，J.Tartaglia，et al.(1992).″Protection of mice and swine from pseudorabies virusconferred by vaccinia virus-based recombinants.″J Virol 66(6)：3424-34.

Robertson，E.S.，T.Ooka，et al.(1996).″Epstein-Barr virus vectors for gene deliver to Blymphocytes.″Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11334-40.

Robinson，H.L.and C.A.Torres(1997).″DNA vaccines.″Semin Immunol 9(5)：271-83.

Roizman，B.(1996).″The function of herpes simplex virus genes：a primer for geneticengineering of novel vectors.″Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11307-12.

Rossitto，P.V.and N.J.MacLachlan(1992).″Neutralizing epitopes of the serotypes ofbluetongue virus present in the United States.″J Gen Virol 73(Pt 8)：1947-52.

Roy，P.(1992).″Bluetongue virus proteins.″J Gen Virol 73(Pt 12)：3051-64.

Roy，P.(1996).″Orbivirus structure and assembly.″Virology 216(1)：1-11.

Roy，P.(1996).Orbiviruses and their replication.Fields Virology.B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley.Philadelphia，PA，Lippincott-Raven：1709-1734.

Roy，P.，T.Urakawa，et al.(1990).″Recombinant virus vaccine for bluetongue disease insheep.″J Virol 64(5)：1998-2003.

Sambrook，J.and D.W.Russell(2001).Molecular Cloning：a laboratory manual/Joseph Sambrook，David W.Russell.Cold Spring Harbor，N.Y.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress.

Schneider，K.，F.Puehler，et al.(2000).″cDNA cloning of biologically active chickeninterleukin-18.″J Interferon Cytokine Res 20(10)：879-83.

Shida，H.(1986).″Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene.″Virology150(2)：451-62.

Smith，G.E.，M.D.Summers，et al.(1983).″Production of human beta interferon in insectcells infected with a baculovirus expression vector.″Mol Cell Biol 3(12)：2156-65.

Snedecor，G.W.&COCHRAN，W.G.(1971)Transformation de proportions en Arcsinus.InMéthodes Statistiques.6th edn.Eds H.Boelle，E.Camhaji.Association de CoordinationTechnique Agricole.pp 366-367

Spreull，J.(1905).″Malarial catarrhal fever(bluetongue)of sheep in South Africa.″J.Comp， Path.，Ther.18：321-337.

Stickl，H.and V.Hochstein-Mintzel(1971).″[Intracutaneous smallpox vaccination with aweak pathogenic vaccinia virus(″MVA virus″)].″Munch Med Wochenschr 113(35)：1149-53.

Stittelaar，K.J.，L.S.Wyatt，et al.(2000).″Protective immunity in macaques vaccinated witha modified vaccinia virus Ankara-based measles virus vaccine in the presenee of passivelyacquired antibodies.″J Virol 74(9)：4236-43.

Sutter，G.and B.Moss(1992).″Nonreplicating vaccinia vector efficiently expressesrecombinant genes.″Proc Natl Acad Sci U S A 89(22)：10847-51.

Sutter，G.，L.S.Wyatt，et al.(1994).″A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunityin mice to BTV or FMDV virus.″Vaccine 12(11)：1032-40.

Tang，D.C.，M.DeVit，et al.(1992).″Genetic immunization is a simple method for elicitingan immune response.″Nature 356(6365)：152-4.

Taylor，J.，R.Weinberg，et al.(1988).″Protective immunity against avia BTV or FMDVinduced by a fowlpox virus recombinant.″Vaccine6(6)：504-8.

Thompson，J.D.，D.G.Higgins，et al.(1994).″CLUSTAL.W：improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gappenalties and weight matrix choice.″Nucleic Acids Res 22(22)：4673-80.

Ulmer，J.B.，J.J.Donnelly，et al.(1993).″Heterologous protection against BTV or FMDVby injection of DNA encoding a viral protein.″Science 259(5102)：1745-9.

Van der Zee，R.，W.Van Eden，et al.(1989).″Efficient mapping and characterization of a Tcell epitope by the simultaneous synthesis of multiple peptides.″Eur J Immunol 19(1)：43-7.van Ooyen，A.，J.van den Berg，et al.(1979).″Comparison of total sequence of a clonedrabbit beta-globin gene and its flanking regions with a homologous mouse sequence.″Science 206(4416)：337-44.

Verwoerd，D.W.，H.J.Els，et al.(1972).″Structure of the bluetongue virus capsid.″J Virol10(4)：783-94.

Vialard，J.，M.Lalumiere，et al.(1990).″Synthesis of the membrane fusion andhemagglutinin proteins of measles virus，using a novel baculovirus vector containing thebeta-galactosidase gene.″J Virol 64(1)：37-50.

Wang，L.F.，D.H.Du Plessis，et al.(1995).″Use of a gene-targeted phage display randomepitope library to map an antigenic determinant on the bluetongue virus outer capsid proteinVP5.″J Immunol Methods 178(1)：1-12.

White，D.M.，W.C.Wilson，et al.(2005).″Studies on overwintering of bluetongue v iruses ininsects.″J Gen Virol 86(Pt 2)：453-62.

Wilson，W.C.and J.O.Mecham(2000).″Molecular Evolution of Orbiviruses.″Proc USAHA 104：169-180.

Xin，K.Q.，K.Hamajima，et al.(1999).″IL-15 expression plasmid enhances cell-mediatedimmunity induced by an HIV-1 DNA vaccine.″Vaccine 17(7-8)：858-66.

Claims

1.包含一种或多种重组BTV或AHSV载体的组合物或疫苗，所述载体包含编码BTV或AHSV的至少一种多肽的一个或多个异源多核苷酸，其中所述重组BTV或AHSV载体包含来源于选自BTV或AHSV的血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26的基因组的载体主链。

2.权利要求1的组合物，其中所述多肽选自BTV或AHSV的VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、VP6和NS3/3A。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述多肽来自BTV-8并且所述载体主链来源于BTV-1基因组。

4.权利要求1或2的组合物，其中所述多肽来自BTV-1并且所述载体主链来源于BTV-8基因组。

5.权利要求3的组合物，其中所述多肽来自BTV-8的VP2并且所述载体主链来源于BTV-1。

6.权利要求3的组合物，其中所述多肽为BTV-8的VP5并且所述载体主链来源于BTV-1。

7.权利要求3的组合物，其中所述多肽为BTV-8的VP2和VP5并且所述载体主链来源于BTV-1。

8.权利要求3的组合物，其中所述多肽为BTV-1的VP2并且所述载体主链来源于BTV-8。

9.权利要求4的组合物，其中所述多肽为BTV-1的VP5并且所述载体主链来源于BTV-8。

10.权利要求4的组合物，其中所述多肽为BTV-1的VP2和VP5并且所述载体主链来源于BTV-8。

11.重组BTV或AHSV载体，所述载体包含编码BTV或AHSV的至少一种多肽的一个或多个异源多核苷酸，其中所述重组BTV或AHSV载体包含载体主链，所述主链包含选自BTV或AHSV的血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26的基因组。

12.权利要求11的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽选自BTV或AHSV的VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、VP6和NS3/3A。

13.权利要求11或12的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽来自BTV-8并且所述载体主链来源于BTV-1基因组。

14.权利要求11或12的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽来自BTV-1并且所述载体主链来源于BTV-8基因组。

15.权利要求13的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽为BTV-8的VP2并且所述载体主链来源于BTV-1。

16.权利要求13的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽为BTV-8的VP5并且所述载体主链来源于BTV-1。

17.权利要求13的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽为BTV-8的VP2和VP5并且所述载体主链来源于BTV-1。

18.权利要求14的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽为BTV-1的VP2并且所述载体主链来源于BTV-8。

19.权利要求14的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽为BTV-1的VP5并且所述载体主链来源于BTV-9。

20.权利要求14的重组BTV或AHSV载体，其中所述多肽为BTV-1的VP2和VP5并且所述载体主链来源于BTV-8。

21.一种产生重组BTV或AHSV载体的方法，其包括用如下RNA转染细胞：

a)编码BTV或AHSV的血清型的一种或多种多肽的RNA；和

b)包含与a)中的BTV或ASHV的血清型不同的BTV或AHSV血清型的完整基因组的转录物的RNA，和包括编码a)中的多肽的转录物缺失的RNA。

22.权利要求21的方法，其中a)中的RNA编码BTV-8的VP2，并且其中b)中的RNA包含(编码)BTV-1的VP1、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、VP6NS4和NS3/3A的转录物。

23.权利要求21的方法，其中a)中的RNA编码BTV-8的VP5，并且其中b)中的RNA包含(编码)BTV-1的VP1、VP2、VP3、VP4、VP7、NS1、NS2、VP6NS4和NS3/3A的转录物。

24.权利要求21的方法，其中a)中的RNA编码BTV-8的VP2和VP5，并且其中b)中的RNA包含(编码)BTV-1的VP1、VP3、VP4、VP7、NS1、NS2、VP6NS4和NS3/3A的转录物。

25.权利要求21的方法，其中a)中的RNA编码BTV-1的VP2，并且其中b)中的RNA包含(编码)BTV-8的VP1、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、VP6NS4和NS3/3A的转录物。

26.权利要求21的方法，其中a)中的RNA编码BTV-1的VP5，并且其中b)中的RNA包含(编码)BTV-8的VP1、VP3、VP4、VP5、VP7、NS1、NS2、VP6NS4和NS3/3A的转录物。

27.权利要求21的方法，其中a)中的RNA编码BTV-1的VP2和VP5，并且其中b)中的RNA包含(编码)BTV-8的VP1、VP3、VP4、VP7、NS1、NS2、VP6NS4和NS3/3A的转录物。

28.一种用于接种动物的方法，其包括至少一次施用权利要求1至20的任一项的组合物或载体。

29.权利要求28的方法，其中所述方法包括初免-加强施用方案。

30.一种用于诱导动物抗一种或多种病原体的免疫原性或保护性应答的方法，其包括至少一次施用权利要求1至20的任一项的组合物或载体。

31.权利要求30的方法，其中所述动物为牛类动物、绵羊类动物、山羊类动物或马类动物。