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CN104507322A - 乳酪类及其制造方法 - Google Patents

乳酪类及其制造方法 Download PDF

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CN104507322A CN201280074985.1A CN201280074985A CN104507322A CN 104507322 A CN104507322 A CN 104507322A CN 201280074985 A CN201280074985 A CN 201280074985A CN 104507322 A CN104507322 A CN 104507322A
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Abstract

本发明的目的是提供一种安全和新型的乳酪类，所述安全和新型的乳酪类用于通过日常摄取来预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎。所述乳酪类包含6.5～160mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和以抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.02～1.6的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。通过摄取乳酪类可强化骨，并预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎。

Description

乳酪类及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种新的乳酪类及其制造方法。所述乳酪类包含特定的乳成分，可用于预防和治疗各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎。
背景技术
近年来，各种骨疾病如骨质疏松症、骨折和腰痛在世界范围内随着社会老龄化等增多，已成为严重的社会问题。这些疾病由钙摄入不足、钙吸收能力下降、闭经后激素失衡等引起。据认为，从生命早期通过活化成骨细胞和骨形成尽可能地增加体内骨量，并且增加最大骨量和骨强度(骨密度+骨质)在预防各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰痛方面是有效的。注意术语“骨质”涉及骨显微结构、代谢更新(metabolic turnover)、微小骨折和钙化。据称各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰痛可通过抑制破骨细胞的骨吸收来预防。骨始终以平衡的方式反复吸收和形成(重塑)。然而，当由于闭经期后激素平衡变化等引起骨吸收超过骨形成时，可发生各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折和腰痛。因此，通过抑制破骨细胞的骨吸收和维持骨强度在恒定水平可使骨得到强化。
考虑到上述情形，为了强化骨，已摄取单独添加钙盐例如碳酸钙、磷酸钙或乳酸钙的钙盐或者天然钙制品例如乳清钙、牛骨粉或鸡蛋壳的药物、饮食品或饲料等。包含此类钙制品以及具有钙吸收促进效果的物质，例如酪蛋白磷肽或寡聚多糖的药物、饮食品或饲料等也已经用于强化骨。然而，当摄取包含钙盐或天然钙制品的饮食品时钙吸收率为50％以下，并且摄取的大部分钙可能排出体外而没有被吸收。另外，即使钙被吸收入体内，由于对骨的亲和性可根据其形式或同时摄取的营养成分的类型而不同，也未必显示骨代谢改善效果或骨强化效果。已知雌激素制品、活性维生素D3制品、维生素K2制品、双膦酸盐(bisphosphonate)制品和降钙素制品等作为用于治疗骨质疏松或强化骨的药物，并且还开发了新型药物例如抗RANKL抗体。然而，这些药物可具有副作用例如耳鸣、头痛或食欲不振。另外，从安全和成本等观点，目前上述物质处于不能添加到饮食品的状况。因此，已需要根据各种骨疾病例如骨质疏松、骨折和腰痛的性质来开发可长期经口摄取，通过促进骨形成和抑制骨吸收增加骨强度，并且可期望具有预防或治疗各种骨疾病的效果的此类饮食品。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]JP-A-H08-151331
[专利文献2]JP-A-H10-7585
[专利文献3]JP-A-2000-281587
发明内容
发明要解决的问题
本发明目的是提供一种乳酪类，其可用于各种骨疾病如骨质疏松症、骨折、风湿症和关节炎的预防和治疗。
用于解决问题的方案
本发明人已发现通过摄取包含血管生成素和/或血管生成素的分解物，并相对于血管生成素和/或血管生成素的分解物以特定的质量比包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(cystatin)和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的分解物的乳酪类可有效地增加骨密度。该发现导致发明的完成。
具体地，本发明包括以下方面：
(1)一种乳酪类，所述乳酪类包含6.5mg～160mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和以与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.02～1.6的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
(2)一种预防骨疾病的方法，其包括以20g/天以上的量摄取根据(1)所述的乳酪类。
(3)根据(1)所述的乳酪类的制造方法，其包括将血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与原料乳酪和/或乳酪凝乳混合。
(4)根据权利(1)所述的乳酪类的制造方法，其包括将原料乳酪与血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物混合以获得混合物，并乳化和冷却混合物。
发明的效果
本发明的乳酪类显示骨强化效果，并且可用于预防和治疗各种骨疾病例如骨质疏松、骨折、风湿症和关节炎。
具体实施方式
本发明的乳酪类的特征在于乳酪类以特定量包含血管生成素和/或血管生成素的分解物，并且相对于血管生成素和/或血管生成素的分解物以特定质量比进一步包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的分解物。
乳酪类通常包含约1.1～6.3mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和包含约2.1～9.3mg/100g的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
相反，本发明的乳酪类添加有血管生成素和/或血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物，并且所述乳酪类包含6.5～160mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以0.02～1.6的质量比的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
作为本发明的乳酪类中包含的血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物，可使用由哺乳动物，例如人、奶牛(cow)、水牛(buffalo)、山羊或绵羊的乳制备的包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分；由哺乳动物，例如人、奶牛、水牛、山羊或绵羊制备的包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分；由基因工程生产的包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物的级分；从血液或器官纯化的血管生成素和/或血管生成素的水解产物；从血液或器官纯化的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物等。还可使用商购可得的纯化的血管生成素或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白试剂。
本发明的乳酪类可包含通过使用一种或多种蛋白酶消化包含血管生成素的级分、血管生成素试剂，或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的级分、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白试剂等获得的血管生成素的水解产物或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
本发明的乳酪类可包含通过直接从乳或来源于乳的材料，例如脱脂乳或乳清提取包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的级分制备的蛋白材料。例如，该蛋白材料可如下制备。具体地，使乳或来源于乳的材料与阳离子交换树脂接触，并以0.1至2.0M的盐浓度洗脱吸附到树脂的乳来源的蛋白，使用反渗透膜、电渗析膜、超滤膜或微滤膜等脱盐和浓缩，并任选地使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、激肽释放酶、组织蛋白酶、嗜热菌蛋白酶或V8蛋白酶进行蛋白水解至分子量为8000以下。当使用蛋白酶进行蛋白水解时，分子量的下限优选为500以上。由此获得的蛋白材料可通过冷冻干燥或喷雾干燥等干燥，并且干燥产物可并入乳酪类中。
本发明的乳酪类通过将上述血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物、或包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的蛋白材料等与原料和/或乳酪凝乳、乳酪原料等混合，以使乳酪类包含6.5mg～160mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和相对于血管生成素和/或血管生成素的水解产物以0.02～1.6的质量比的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
如下述试验例中所示，当如上所述乳酪类包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物时，与单独摄取血管生成素和/或血管生成素的水解产物或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的情况相比可更加有效地获得骨强化效果。
本发明的乳酪类可以常规方式来生产，只要乳酪类以各自特定的量包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物即可。此处所用的术语“乳酪类”包括各种类型的乳酪，如天然乳酪，或使用通过Codex Standard规定的再制乳酪(processed cheese)、涂抹型再制乳酪(spreadable processed cheese)、再制乳酪制品(processed cheese food)、乳等作为主原料得到的食品的所谓的乳酪样的食品(processed cheese preparation)等。例如，天然乳酪如生(未熟化)乳酪如奶油乳酪、马苏里拉(mozzarella)、里科塔(ricotta)、马斯卡邦尼(mascarpone)、白乳酪(fromage blanc)，白霉乳酪如卡门贝特(Camembert)和布里(Brie)，青霉乳酪(blue mold cheese)如古冈左拉(Gorgonzola)、斯蒂尔顿(Stilton)、酪克福(Roquefort)，洗浸乳酪如利瓦若(Livarot)，半硬质乳酪如菠罗伏洛(Provolone)和高达(Gouda)，硬质乳酪如哥瑞纳(Grana)、埃曼塔尔(Emmentaler)、切达(Cheddar)，使用天然乳酪制造的再制乳酪类，使用油脂或多糖类等制造的乳酪样食品。
对于高达乳酪的情况，例如，将脂肪含量调整至2.8％的乳作为原料，并且向其添加特定量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和进一步添加与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比在特定范围内的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。将混合物在77℃下灭菌15秒，并且冷却。向其添加发酵剂或凝乳酶等，并且搅拌。然后使混合物静置约30分钟，并且去除乳清以制备乳酪凝乳。在乳酪凝乳任选添加盐之后，可通过成型乳酪凝乳来生产高达乳酪。
对于乡村乳酪(cottage cheese)的情况，将奶油等用作原料，向其添加特定量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和进一步添加与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比在特定范围内的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。将混合物均匀添加到乳酪凝乳以能够制造乡村乳酪。用于制造本发明的乳酪类的原料的实例包括哺乳动物如奶牛、水牛、山羊或绵羊的乳，其中脂肪含量已调整的它们的乳或由此类哺乳动物乳制备的奶油等。
本发明的乳酪类可如下制造。当制造再制乳酪作为本发明的乳酪时，例如，将柠檬酸钠、单磷酸钠或多磷酸钠等作为乳化盐以约2％的量添加到原料乳酪中。添加约10％的量的水后，将血管生成素和/或血管生成素的水解产物以特定的量添加到混合物中，并且进一步添加与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比在特定范围内的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。将混合物以通常的方式在85℃下乳化，并将乳液置于硬纸盒中，并在5℃下冷却以能够制造再制乳酪。
作为特定量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物和特定质量比的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与再制乳酪的混合方法，可以使用前述通过添加血管生成素和/或血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物而制备的乳酪混合物作为原料乳酪，或者可以将血管生成素和/或血管生成素的水解产物和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与再制乳酪的原料适量混合。
本发明的乳酪类，除了血管生成素和/或血管生成素的水解产物、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物以外，可以添加饮食品中通常使用的原料等，如除上述乳酪类原料以外的糖类、脂质、蛋白质、维生素、矿物质或香料，还可添加其他骨强化成分，如钙、维生素D、维生素K或异黄酮。
如下述动物试验中所示，当以每kg体重20g以上的量经口摄取时，本发明的乳酪类可强化骨。由于实验动物的摄入相当于根据血中药物浓度的成人摄入(参见Mitsuyoshi Nakajima(1993)，“Yakkou Hyoka Vol.8”，Hirokawa-Shoten Ltd.，第2-18页)，所以期望可强化骨，并且特别地通过以通常每个成人20g/天以上的量摄取本发明的乳酪类可预防或治疗各种骨疾病，例如骨质疏松、骨折、风湿症和关节炎。
以下通过参考例、实施例和试验例进一步更详细地描述本发明。注意以下实施例仅用于说明性目的，不应解释为限制本发明。
参考例1
血管生成素级分的制备(1)
用去离子水彻底洗涤填充有30kg阳离子交换树脂(磺化Chitopearl；由FujiSpinning Co.,Ltd.制造)的柱，然后将1000升未灭菌的脱脂乳(pH 6.7)施加到柱。在用去离子水彻底洗涤柱之后，用0.1至2.0M线性梯度的氯化钠洗脱吸附的蛋白。使用S-Sepharose阳离子交换色谱(由Amersham Bioscientific制造)分级包含血管生成素的洗脱级分，并在90℃下热处理所得包含血管生成素的级分10分钟，并离心除去沉淀物。将包含血管生成素的级分进一步进行凝胶过滤色谱(柱：Superose 12)。使用反渗透膜使获得的洗脱物脱盐，并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得16.5g血管生成素级分，其血管生成素纯度为90％。重复这些连续操作30次。
参考例2
血管生成素级分的制备(2)
用去离子水彻底洗涤填充有10kg肝素Sepharose(由GE Healthcare制造)的柱，然后将500升未灭菌的脱脂乳(pH 6.7)施加到柱。在用0.5M氯化钠溶液彻底洗涤柱之后，用1.5M氯化钠溶液洗脱柱。使用反渗透膜使洗脱物脱盐，并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得18g血管生成素级分，其血管生成素纯度为5％。重复上述连续操作50次。
参考例3
抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分的制备
在90℃下热处理100,000升5％乳清蛋白溶液，并通过离心除去沉淀物。用通过将羧甲基化的木瓜蛋白酶结合至Tresyl-Toyopearl(由Tosoh Corporation制造)制备的载体填充柱。用0.5M氯化钠溶液平衡化后，将上述乳清蛋白溶液施加到柱。然后用0.5M氯化钠溶液和包含吐温20(0.1％)的0.5M氯化钠溶液连续洗涤柱。之后，用20mM乙酸-0.5M氯化钠溶液洗脱包含抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的级分。用1M氢氧化钠溶液立即中和洗脱物。然后使用反渗透膜使获得的洗脱物脱盐，并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得9.6g抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分，其抑半胱氨酸蛋白酶蛋白纯度为90％。重复上述连续操作20次。
包含于乳酪类中的血管生成素和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的测量
根据修正的JP-A-2008-164511中所述的方法测量乳酪类中的血管生成素、血管生成素的水解产物、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物的含量。具体地，将190mg乳酪类添加到65ml超纯水，并将1/1000当量的甲酸添加到混合物以制备样品溶液。干燥十微升(10μl)样品溶液，并溶解于20μl含8M脲和1mM三(羧乙基)膦(TCEP)的0.1M碳酸氢铵中。在56℃下加热溶液30分钟。在溶液回到室温后，将5μl 100mM碘乙酰胺溶液添加到溶液，并在暗处使混合物反应30分钟。在添加54μl超纯水后，将10μl的0.1μg/ml胰蛋白酶和10μl的0.1μg/ml赖氨酰基肽链内切酶添加到混合物。在37℃下使混合物反应16小时。然后通过添加3μl甲酸终止反应，并用作测量用的样品肽溶液。用包含0.1％甲酸、0.02％三氟乙酸(TFA)和2％乙腈的10fmol/μl内标肽溶液稀释样品溶液6倍，并将2.5μl稀释的溶液进行LC/MS/MS分析。
通过使用HPLC系统梯度洗脱分离肽。更具体地，使用在MAGIC2002HPLC系统上的配备有5μl肽trap的柱(MAGIC C18,0.2mm(ID)×50mm)以2μl/分钟的流速分离肽。使用溶液A(2％乙腈-0.05％甲酸)和溶液B(90％乙腈-0.05％甲酸)作为HPLC洗脱液。在2至65％使用溶液B的洗脱条件下经20分钟实施梯度洗脱。
作为测量抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的对象离子，母体离子(parent ion)为NH2-QVVSGMNYFLDVELGR-COOH(m/z 914.4)，和MS/MS靶离子为NH2-FLDVELGR-COOH(m/z 948.7)。作为测量血管生成素的对象离子，母体离子为NH2-YIHFLTQHYDAK-COOH(m/z 768.8)，和MS/MS靶离子为NH2-FLTQHYDAK-COOH(m/z 1122.8)。关于内标肽，母体离子为NH2-ETTVFENLPEK-COOH(其中，P标记有13C和15N)(m/z 656.9)，和MS/MS靶离子为NH2-FENLPEK-COOH(其中，P标记有13C和15N)(m/z 882.4)。
将系统“LCQ Advantage”用于MS。各蛋白的峰面积由所得色谱计算，并且由相对于内标肽的比计算浓度。
实施例1
将八点八克(8.8g)高达乳酪与8.8g切达乳酪混合。接下来，向其添加0.4g的柠檬酸钠作为乳化盐，并进一步向混合物添加2g水、35mg参考例1中得到的血管生成素级分和0.25mg参考例3中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分。将混合物以通常的方式在85℃下乳化。乳化完成后，将乳液置于硬纸盒中，并在5℃下冷却两天两夜以获得乳酪类(实施例制品1)。所得乳酪类包含160mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.02。
实施例2
将八点八克(8.8g)高达乳酪与8.8g切达乳酪混合。接下来，向其添加0.4g的柠檬酸钠作为乳化盐，并进一步将2g水、20mg参考例2中得到的血管生成素级分和1.4mg参考例3中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与混合物混合。将混合物以通常的方式在85℃下乳化。乳化完成后，将乳液置于硬纸盒中，并在5℃下冷却两天两夜以获得乳酪类(实施例制品2)。所得乳酪类包含6.5mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为1.6。
实施例3
将八点八克(8.8g)高达乳酪与8.8g切达乳酪混合。接下来，向其添加0.4g的柠檬酸钠作为乳化盐，并进一步将2g水、20mg参考例1中得到的血管生成素级分和1.4mg参考例3中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与混合物混合。将混合物以通常的方式在85℃下乳化。乳化完成后，将乳液置于硬纸盒中，并在5℃下冷却两天两夜以获得乳酪类(实施例制品3)。所得乳酪类包含90mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.11。
比较例1
将八点八克(8.8g)高达乳酪与8.8g切达乳酪混合。接下来，向其添加0.4g的柠檬酸钠作为乳化盐，并进一步将2g水、18mg参考例2中得到的血管生成素级分和3.4mg参考例3中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与混合物混合。将混合物以通常的方式在85℃下乳化。乳化完成后，将乳液置于硬纸盒中，并在5℃下冷却两天两夜以获得乳酪类(比较例制品1)。所得乳酪类包含5.8mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为3.3。
比较例2
将八点八克(8.8g)高达乳酪与8.8g切达乳酪混合。接下来，向其添加0.4g的柠檬酸钠作为乳化盐，并进一步将2g水、35.2mg参考例1中得到的血管生成素级分和0.05mg参考例3中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与混合物混合。将混合物以通常的方式在85℃下乳化。乳化完成后，将乳液置于硬纸盒中，并在5℃下冷却两天两夜以获得乳酪类(比较例制品2)。所得乳酪类包含161mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.14。
试验例1
通过动物试验测定实施例制品1至3以及比较例制品1和2的骨强化效果。将C3H/HeJ小鼠(5周龄，雄性)用于动物试验。将实施例制品1至3以及比较例制品1和2的每一种乳酪类添加到热水(60℃)以使乳酪类的含量为20％，并且均匀地搅拌混合物。1周驯化后，将小鼠分为六组(10只小鼠/组)。使用管以每1kg小鼠重量20g(为乳酪类)/天的量、一天两次分剂量向小鼠经口投与实施例制品1至3以及比较例制品1和2的各制品。对照组不投与任何实施例制品1至3以及比较例制品1和2。投与完成后(第二周)，使用micro-CT(由RigakuCorporation制造)测量各小鼠右胫骨的骨密度。结果示于表1中。如表1所示，经口投与实施例制品1至3的组与对照组和经口投与比较例制品1或2的比较例组相比显示骨密度显著增加。
表1
骨密度(mg/cm3)
对照组 1236±9
实施例制品1 1268±13
实施例制品2 1271±11
实施例制品3 1269±10
比较例制品1 1242±7
比较例制品2 1243±5
参考例4
用去离子水彻底洗涤填充有400g阳离子交换树脂(磺化Chitopearl；由FujiSpinning Co.,Ltd.制造)的柱(直径：4cm，高度：30cm)，并以25ml/分钟的流速将40升未灭菌的脱脂乳(pH6.7)施加到柱。用去离子水彻底洗涤柱后，使用包含0.78M氯化钠的0.02M碳酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱吸附到树脂上的蛋白。使用反向渗透膜脱盐洗脱物，并冷冻干燥脱盐的洗脱物以获得18g粉状蛋白材料(参考例制品4)。
参考例5
将参考例制品4的四克(4g)蛋白材料溶解于800ml水。在添加作为蛋白酶的胰蛋白酶(由Sigma制造)后，从而获得0.03重量％的终浓度，在37℃下使混合物进行酶促处理8小时。通过90℃下热处理5分钟失活蛋白酶后，冷冻干燥混合物以获得3.0g粉状蛋白材料(参考例制品5)。
实施例4
将四十毫克(40mg)参考例制品4与3g的30％奶油混合。将混合物均匀添加至17g乡村乳酪凝乳以获得乳酪类(实施例制品4)。获得的乳酪类包含11mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.35。
实施例5
将四十毫克(40mg)参考例制品5与3g的30％奶油混合。将混合物均匀添加至17g乡村乳酪凝乳以获得乳酪类(实施例制品5)。获得的乳酪类包含11mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.36。
实施例6
将四十毫克(40mg)参考例制品4添加到100ml的脂肪含量调整至2.8％的乳中，将混合物在77℃下灭菌15秒。冷却后，向其添加发酵剂或凝乳酶(rennet)等，并且使混合物静置约30分钟。之后，去除乳清以制备乳酪凝乳。将乳酪凝乳盐渍化，并将盐渍化的乳酪凝乳置于模具中以获得乳酪类(实施例制品6)。获得的乳酪类包含16mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.6。
比较例3
将三十毫克(30mg)参考例制品4和10mg参考例3中得到的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白级分与3g的30％奶油混合。将混合物均匀添加至17g乡村乳酪凝乳以获得乳酪类(比较例制品3)。获得的乳酪类包含8.8mg/100g的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为5.6。
试验例2
通过动物试验测定实施例制品4至6以及比较例制品3的骨强化效果。将四十只SD雌性大鼠(51周龄)用于动物试验。将实施例制品4至6以及比较例制品3的每一种添加到热水(60℃)以使乳酪类的含量为20％，并且均匀地混合和搅拌混合物。将大鼠分为六组(8只大鼠/组)。五组进行卵巢切除，剩余一组假手术(sham surgery)。4周恢复期后，使用管以每1kg小鼠重量20g/天、每日六次分剂量向切除卵巢的大鼠经口投与实施例制品4至6和比较例制品3。4周恢复期后，以与对照组相同的方式饲养进行假手术的大鼠16周。投与完成后(第十六周)，使用micro-CT(由Rigaku Corporation制造)测量各大鼠右胫骨的骨密度。
结果示于表2中。如表2所示，经口投与实施例制品4至6的组与对照组和经口投与比较例制品3的比较例组相比显示骨密度显著增加。另外，骨密度接近假手术组的骨密度。
表2
骨密度(mg/cm3)
对照组 550±10
假手术组 600±8
实施例制品4 597±11
实施例制品5 595±12
实施例制品6 598±14
比较例制品3 554±11
实施例7
将五十毫克(50mg)参考例制品4添加到脂肪含量调整至3.6％的100ml乳中，将混合物在77℃下灭菌15秒。将混合物冷却。向其添加发酵剂或凝乳酶等并搅拌，之后使混合物静置40分钟。之后，去除乳清以制备乳酪凝乳。将0.05％的青霉(娄地青霉(P.roqueforti))以相对于凝乳为0.05％添加到乳酪凝乳后，将乳酪凝乳置于乳酪模子(hoop)中，使其在20℃下静置20小时。将乳酪凝乳从模子中取出，用盐浸渍(rubbed)该乳酪的表面3天。盐渍化完成后，在乳酪凝乳的上下面进行穿孔处理。穿孔处理后，用膜包裹该乳酪的表面，然后将该乳酪在8℃下熟化60天。获得的乳酪类以19mg/100g的量包含血管生成素和/或血管生成素的水解产物，并且乳酪类中抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.5。

Claims (4)

1.一种乳酪类，所述乳酪类包含6.5～160mg/100g的量的血管生成素和/或血管生成素的水解产物，和以与血管生成素和/或血管生成素的水解产物的质量比为0.02～1.6的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物。
2.一种预防骨疾病的方法，其包括以20g/天以上的量摄取根据权利要求1所述的乳酪类。
3.根据权利要求1所述的乳酪类的制造方法，其包括将血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物与原料乳酪和/或乳酪凝乳混合。
4.根据权利要求1所述的乳酪类的制造方法，其包括将原料乳酪与血管生成素和/或血管生成素的水解产物以及抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和/或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白的水解产物混合，并乳化和冷却所述混合物。
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