CN104491927A - 一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 - Google Patents
一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104491927A CN104491927A CN201410664973.5A CN201410664973A CN104491927A CN 104491927 A CN104491927 A CN 104491927A CN 201410664973 A CN201410664973 A CN 201410664973A CN 104491927 A CN104491927 A CN 104491927A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tongue
- tissue
- matrix material
- decellularized
- sterile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract 1
- 208000010798 Tongue disease Diseases 0.000 abstract 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 abstract 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 83
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 82
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 72
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 72
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 16
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 14
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 13
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 11
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 7
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 6
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 206010009269 Cleft palate Diseases 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 238000012424 Freeze-thaw process Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- -1 aminoglycan Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000021252 tongue development Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种脱细胞舌基质材料及其制备方法，其特点是选取健康的动物的舌组织进行物理、化学和酶综合法处理，通过低渗液、高渗液、Triton X-100和核酸酶低温处理制备,获得具有良好的生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞舌基质材料。该材料可用于舌部再生修复以及舌部疾患的研究模型。其材料来源广泛、易得，价格低廉，制作容易。
Description
技术领域
本发属于及生物医用材料的加工领域，具体涉及一种脱细胞舌基质材料及其制备方法。
背景技术
细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质。ECM通过高度组织有序的细胞外微环境，构成复杂的网架连接组织结构，对细胞的生存、分化等细胞生理活动具有关键的调节作用。因此，可模拟ECM的支架基底和支架材料是组织工程研究和组织修复的理想载体。细胞与ECM的接触是动态的，ECM的变化将会导致邻近细胞形态和功能的改变。用于组织工程的理想支架材料需要为种植的细胞提供与体内ECM相同或者相似的微环境(包括ECM的组成、结构和生物力学特征等)。但是，天然的ECM是由多种蛋白质组成(主要分为胶原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、弹性蛋白4大类)，并且具有复杂的结构，不易在体外重构与体内ECM组成相同和结构一致的ECM材料。通过不同化学、物理或酶学去细胞方法从组织和器官获得天然的ECM，为解决这一难题提供了新的有效解决途径。去细胞化基质具有组织或者细胞特异性的ECM蛋白质和微结构，同时具有良好的力学特性、细胞相容性以及生物降解性，有利于细胞粘附、生长、增殖及分化。
制备脱细胞基质材料的方法有很多，主要是通过物理、化学和生物酶综合处理的方法。中国专利申请号为201110134511.9的发明专利涉及制备一种脱细胞真皮基质材料的方法，虽然可以比较彻底地去除细胞而且处理时间短，但是制备过程中采用了十二烷基硫酸钠(SDS)的处理。由于SDS的强洗脱效果，很大程度上破坏了细胞基质的结构完整性和生物活性，此外使用SDS制备的细 胞外基质具有潜在的生物毒性，不利于该基质材料对组织的三维结构重建。中国专利申请号为201210237911.7的发明专利涉及制备一种细胞外基质支架材料的脱细胞方法。虽然采用了吡喃葡萄糖苷降低了去污剂在清洗过程中可能对再植细胞造成的潜在生物毒性，但主要应用于含较多胶原纤维和弹力纤维的组织和器官，应用到肌纤维丰富且发达的舌组织中并不完全适用。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上技术的不足，采用健康的动物舌组织为原料，应用复合酶处理剂和碱等化学物质，提供一种具有良好生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞舌基质材料。
本发明是由以下技术方案实现的：
(1)选取健康的动物舌组织，切成1厘米见方的小块，用PBS缓冲液洗去血渍备用；
(2)将舌组织反复冻融3次，破碎细胞；
(3)把舌组织块置于75％酒精中消毒；
(4)将舌组织块悬于入无菌三级水中，4℃中速搅拌处理12小时；
(5)将舌组块织悬于1M NaCl无菌溶液中，4℃中速搅拌处理24小时；
(6)将舌组织块悬于2％TritonX-100的无菌缓冲溶中，4℃中速搅拌处理48小时；
(7)将舌组织块悬于5mM CaCl2和5mM MgCl2无菌溶液中，4℃中速搅拌处理24小时；
(8)将舌组织块转移到含有DNase I的无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37℃处理24小时；
(9)将舌组织块悬于无菌PBS缓冲溶液中，4℃中速搅拌处理24小时，获得 所述脱细胞舌基质材料。
进一步地，所述步骤(1)中选取组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物舌头。
进一步地，所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入-80℃冰冻30分钟后取出，在37℃水浴解冻，如此反复冻融3次。
进一步地，所述步骤(6)中，无菌缓冲液可选用PBS缓冲液或者pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液。
进一步地，所述脱细胞舌基质材料可放置于含有90μg/ml氨苄的PBS中，4℃保存2个月以上。
本发明还包括根据上述任意一项的方法制备获得的脱细胞舌基质材料。
本发明脱细胞舌基质材料的制备方法中所有操作均在无菌超净工作台中进行。
采用本方法所制备的脱细胞舌基质材料，能够满足以下医学应用和医学研究的要求：
1、作为舌的替代品，用于手术后舌部损伤和缺失的修复。
2、用于舌部溃疡的修复，尤其适用于因不良修复体和咬伤引起的舌部溃疡的医治。
3、可以用于口腔科整形术，如腭裂的修复等。
4、可作为细胞培养和组织工程体外模型材料，如用于舌再生和舌发育研究、舌癌发生和浸润的研究等。
本发明具有以下优点：
1、在维持动物舌头三维组织构造不变的前提下，彻底清除了动物舌中的细胞成分，得到具有完整的三维组织构造的舌部基质。
2、具有良好的力学性能、可赋形性、良好的细胞分化增殖环境以及良好的粘附性能；
3、方法简便、易行，经济、合理、安全、可靠。
4、整个工艺过程属于清洁化制备，对环境无污染。
附图说明
图1a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的HE染色显微镜照片，图1b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的HE染色显微镜照片。
图2a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的扫描电子显微镜照片，图2b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的扫描电子显微镜照片。
图3为新鲜小鼠舌组织DNA含量和脱细胞处理后小鼠舌组织ECM中的DNA含量柱状图。
图4a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Collagen Ⅰ免疫组化结果，图4b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Collagen Ⅰ免疫组化结果。
图5a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的CollagenⅣ免疫组化结果，图5b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的CollagenⅣ免疫组化结果。
图6a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Fibronectin免疫组化结果，图6b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Fibronectin免疫组化结果。
图7a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Laminin免疫组化结果，图7b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Laminin免疫组化结果。
图8a为含有细胞的新鲜猪舌组织的HE染色显微镜照片(×100)，图8b为经脱细胞处理后的猪舌细胞外基质材料的HE染色显微镜照片(×100)。
图9为经脱细胞处理后的猪舌细胞外基质的扫描电子显微镜照片。
图10为新鲜猪舌组织DNA含量和脱细胞处理后猪舌组织ECM中的DNA 含量柱状图。
图11a为含有细胞的新鲜大鼠舌组织的HE染色显微镜照片,图11b为经脱细胞处理后的大鼠舌细胞外基质的HE染色显微镜照片(×100)。
图12为经脱细胞处理后的大鼠舌细胞外基质材料的扫描电子显微镜照片。
图13为新鲜大鼠舌组织DNA含量和脱细胞处理后大鼠舌组织ECM中的DNA含量柱状图。
图14a和图14b为小鼠舌ECM材料在注射舌癌细胞系Cal27培养20天后的HE染色显微镜照片。其中图14b(400×)为图14a(100×)的局部放大图。
图15a和图15b为利用I型胶原制作的皮肤模型在接种舌癌细胞系Cal27培养14天后的HE染色显微镜照片。其中图15b(400×)为图15a(100×)的局部放大图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述。
实施例1小鼠舌ECM的制作
(1)取材：选取健康的小鼠的舌组织，用PBS清洗两边去除血渍。至于EP管中-80℃冰箱备用。
(2)破碎细胞：将组织块从-80℃冰箱取出在37℃水浴锅解冻后再放回-80℃冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
(3)消毒和准备：把组织块至于75％的酒精中，用缝合线将舌组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
(4)预清洗和破碎：加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4℃处理12小时。
(5)清洗细胞残片：将舌组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌 循环器中。4℃处理24小时。
(6)破碎并清洗：将舌组织换到装有250ml 2％TritonX-100的无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理48小时。
(7)清洗并增强酶活：将舌组织换到装有250ml 5mM CaCl2和5mM MgCl2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
(8)去残留核酸：将舌组织转移到含有300单位的DNase I(sigma)的1ml无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37℃处理24小时。
(9)清洗：将舌组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中，4℃处理24小时。
结果评价
1、ECM结构观察：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，苏木素-伊红(HE)染色，观察ECM结构，其HE染色显微镜照片见图1b，同时制作新鲜小鼠舌组织的HE染色，其显微镜照片见图1a。可见用本发明方法制备的小鼠ECM结构，证实无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
2、ECM超微结构观察：将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片见图2b，同时拍摄新鲜小鼠舌组织电子微镜照片见图2a。对比两图可见用本发明方法制备的小鼠ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
3、ECM中DNA含量检测：将ECM组织磨碎后，用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-drop(Thermo)测定DNA含量，并与新鲜小鼠舌组织DNA含量进行对比，结果见图3。可见用本发明方法制得的小鼠ECM中，DNA含量减少了90.98％，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
4、ECM中CollagenⅠ蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育CollagenI抗体(稀释比例1:500)(abcam)4℃过夜，孵育二抗室温1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图4b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的CollagenⅠ免疫组化显微镜照片4a作为对照。
5、ECM中CollagenⅣ蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育CollagenⅣ抗体(稀释比例1:300)(abcam)4℃过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察拍摄显微镜照片如图5b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的CollagenⅣ免疫组化显微镜照片5a作为对照。
6、ECM中laminin蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育laminin抗体(稀释比例1:200)(abcam)4℃过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图6b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的Laminin免疫组化显微镜照片6a作为对照。
7、ECM中fibronectin蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育fibronectin抗体(稀释比例1:250)(abcam)4℃过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图7b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的fibronectin免疫组化显微镜照片7a作为对照。
实施例2,猪舌ECM的制作
(1)取材：选取健康的猪的舌组织，分解为一厘米见方的小块，用PBS清洗两边去除血渍。至于EP管中-80℃冰箱备用。
(2)破碎细胞：将组织块从-80℃冰箱取出在37℃水浴锅解冻后再放回-80℃冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
(3)消毒和准备：把组织块至于75％的酒精中，用缝合线将舌组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
(4)预清洗和破碎：加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4℃处理12小时。
(5)清洗细胞残片：将舌组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
(6)破碎并清洗：将舌组织换到装有250ml 2％TritonX-100的无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理48小时。
(7)清洗并增强酶活：将舌组织换到装有250ml 5mM CaCl2和5mM MgCl2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
(8)去残留核酸：将舌组织转移到含有300单位的DNase I(sigma)的1ml无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37℃处理24小时。
(9)清洗：将舌组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理48小时。
结果评价
1、ECM结构观察：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，HE染色，其HE染色显微镜照片见图8b，同时制作新鲜猪舌组织的HE染色，其显微镜照片见图8a。可见用本发明方法制备的猪ECM结构中无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
2、ECM超微结构观察：将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片见图9。可见用本发明方法制备的猪ECM 结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
3、ECM中DNA含量检测：将ECM组织磨碎后，用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop(Thermo)测定DNA含量，并与新鲜小鼠舌组织DNA含量进行对比，结果见图10。可见用本发明方法制备的猪ECM中，DNA含量减少97.17％，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
实施例3,大鼠舌ECM的制作
(1)取材：选取健康的大鼠的舌组织，分解为一厘米见方的小块，用PBS清洗两边去除血渍。至于EP管中-80℃冰箱备用。
(2)破碎细胞：将组织块从-80℃冰箱取出在37℃水浴锅解冻后再放回-80℃冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
(3)消毒和准备：把组织块至于70％的酒精中，用缝合线将舌组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
(4)预清洗和破碎：加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4℃处理12小时。
(5)清洗细胞残片：将舌组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
(6)破碎并清洗：将舌组织换到装有250ml 2％TritonX-100的无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
(7)清洗并增强酶活：将舌组织换到装有250ml 5mM CaCl2和5mM MgCl2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
(8)去残留核酸：将舌组织转移到含有300单位的DNase I(sigma)的1ml无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37℃处理24小时。
(9)清洗：将舌组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理24小时。
结果评价
1、ECM结构观察：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，HE染色，观察ECM结构其HE染色显微镜照片见图11b，同时制作新鲜大鼠舌组织的HE染色，其显微镜照片见图11a。可见用本发明方法制备的大鼠ECM结构中无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
2、ECM超微结构观察：将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，见图12。可见用本发明方法制备的大鼠ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
3、ECM中DNA含量检测：将ECM组织磨碎后，用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop(Thermo)测定DNA含量，并与新鲜大鼠舌组织DNA含量进行对比，结果见图13。可见用本发明方法制得的大鼠ECM中，DNA含量减少98.93％，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
实施例4,小鼠舌ECM在舌癌细胞增殖和浸润研究的应用
(1)注射细胞：准备106的Cal27口腔癌细胞。在超净工作台中用无菌的大头针将实施例1制得的舌ECM组织固定在新制蜡板上。用酒精灯将巴氏管拉取口径大约为100μm左右的玻璃针，吸取Cal27口腔癌细胞注入ECM组织中。
(2)培养：将注入Cal27口腔癌细胞的舌ECM组织放至于加有3mlDF+10％FBS培养液的3.5cm的细胞培养皿中，将培养皿放于37℃的CO2培养箱，定期换液，培养20天。
(3)组织固定：将培养后的舌ECM组织至于10％中性福尔马林中，固定48 小时。
(4)制片：将固定的ECM组织用PBS缓冲液洗5分钟，经自动脱水机脱水、石蜡包埋、石蜡切片、切成5μm的薄片，烘片过夜，4℃保存。
(5)HE染色：将组织切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后用苏木素染色5分钟，伊红染色1分钟，酒精梯度脱水，二甲苯透化，中性树脂封片观察。图14a和图14b为小鼠舌ECM材料在注射舌癌细胞Cal27培养20天后的HE染色显微镜照片。从图中可以看出Cal27细胞在本发明的小鼠舌ECM材料中的具有很高的增殖能力和组织浸润性。
在此补充利用皮肤模型培养舌癌细胞系的方法，用于与舌ECM材料对照。
(1)皮肤模型的建立：将含有1×105癌巢成纤维细胞(Cancer associated fibroblast,CAF)的10％FBS的RD培养液与酸性胶原(collagen I)在冰上迅速混合均匀后，取2ml加入到24孔板的一个孔中。连续培养1周，让CAF细胞收缩皮肤模型。
(2)培养：将牛津杯垂直放置于皮肤模型上方，在其中加入1×106个Cal27细胞。将24孔板放于37℃的CO2培养箱，用DF+10％FBS培养液培养，定期换液，培养14天。
(3)组织固定：将培养后的皮肤模型至于10％中性福尔马林中，固定48小时。
(4)制片：将固定的皮肤模型用PBS缓冲液洗5分钟，经自动脱水机脱水、石蜡包埋、石蜡切片、切成5μm的薄片，烘片过夜，4℃保存。
(5)HE染色：将组织切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后用苏木素染色5分钟，伊红染色1分钟，酒精梯度脱水，二甲苯透化，中性树脂封片观察。图15a和图15b为皮肤模型在接种舌癌细胞Cal27培养14天后的HE染色显微镜照片。从图中可以看出Cal27细胞主要分布于皮肤模型的表面，细胞呈单层生长，没有 表现出明显的增殖和浸润现象。
以上实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。
Claims (6)
1.一种脱细胞舌基质材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取健康的动物舌组织，切成1厘米见方的小块，用PBS缓冲液洗去血渍备用；
(2)将舌组织块反复冻融3次，破碎细胞；
(3)把舌组织块置于75％酒精中消毒；
(4)将舌组织块悬于入无菌三级水中，4℃中速搅拌处理12小时；
(5)将舌组块织悬于1M NaCl无菌溶液中，4℃中速搅拌处理24小时；
(6)将舌组织块悬于2％TritonX-100的无菌缓冲溶中，4℃中速搅拌处理48小时；
(7)将舌组织块悬于5mM CaCl2和5mM MgCl2无菌溶液中，4℃中速搅拌处理24小时；
(8)将舌组织块转移到含有DNase I的无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37℃处理24小时；
(9)将舌组织块悬于无菌PBS缓冲溶液中，4℃中速搅拌处理24小时，获得所述脱细胞舌基质材料。
2.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中选取舌组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物舌头。
3.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入-80℃冰冻30分钟后取出，在37℃水浴解冻，如此反复冻融3次。
4.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，无菌缓冲液可选用PBS缓冲液或者pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于：所述脱 细胞舌基质材料可放置于含有90μg/ml氨苄的PBS中，4℃保存2个月以上。
6.按照权利要求1～5任意一项的方法制备得到的脱细胞舌基质材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410664973.5A CN104491927B (zh) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | 一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410664973.5A CN104491927B (zh) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | 一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104491927A true CN104491927A (zh) | 2015-04-08 |
| CN104491927B CN104491927B (zh) | 2016-10-05 |
Family
ID=52933437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410664973.5A Active CN104491927B (zh) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | 一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104491927B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108514657A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-09-11 | 浙江大学 | 缓释igf-1生长因子的肌肉脱细胞材料的制备方法 |
| CN108992709A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-12-14 | 山东省眼科研究所 | 一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用 |
| WO2021223674A1 (en) * | 2020-05-05 | 2021-11-11 | International Business Machines Corporation | Bioprinted living tissue with therapy capability |
| CN117563048A (zh) * | 2023-11-13 | 2024-02-20 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002067867A2 (en) * | 2001-02-23 | 2002-09-06 | The University Of Pittsburgh | Rapid preparation of stem cell matrices for use in tissue and organ treatment and repair |
| CN1562388A (zh) * | 2004-04-15 | 2005-01-12 | 深圳市清华源兴生物医药科技有限公司 | 一种口腔组织补片及其制作方法与应用 |
| JP2005193049A (ja) * | 2003-12-29 | 2005-07-21 | Depuy Products Inc | 植込み可能な組織修復器具及びその製造方法 |
| CN103908700A (zh) * | 2013-01-06 | 2014-07-09 | 陕西佰傲再生医学有限公司 | 一种脱细胞角膜的制备方法 |
| CN103990179A (zh) * | 2014-05-24 | 2014-08-20 | 河北爱能生物科技有限公司 | 一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品 |
-
2014
- 2014-11-19 CN CN201410664973.5A patent/CN104491927B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002067867A2 (en) * | 2001-02-23 | 2002-09-06 | The University Of Pittsburgh | Rapid preparation of stem cell matrices for use in tissue and organ treatment and repair |
| JP2005193049A (ja) * | 2003-12-29 | 2005-07-21 | Depuy Products Inc | 植込み可能な組織修復器具及びその製造方法 |
| CN1562388A (zh) * | 2004-04-15 | 2005-01-12 | 深圳市清华源兴生物医药科技有限公司 | 一种口腔组织补片及其制作方法与应用 |
| CN103908700A (zh) * | 2013-01-06 | 2014-07-09 | 陕西佰傲再生医学有限公司 | 一种脱细胞角膜的制备方法 |
| CN103990179A (zh) * | 2014-05-24 | 2014-08-20 | 河北爱能生物科技有限公司 | 一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108514657A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-09-11 | 浙江大学 | 缓释igf-1生长因子的肌肉脱细胞材料的制备方法 |
| CN108992709A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-12-14 | 山东省眼科研究所 | 一种脱细胞神经基质材料及其制备方法和应用 |
| WO2021223674A1 (en) * | 2020-05-05 | 2021-11-11 | International Business Machines Corporation | Bioprinted living tissue with therapy capability |
| US11559389B2 (en) | 2020-05-05 | 2023-01-24 | International Business Machines Corporation | Bioprinted living tissue with therapy capability |
| GB2611437A (en) * | 2020-05-05 | 2023-04-05 | Ibm | Bioprinted living tissue with therapy capability |
| GB2611437B (en) * | 2020-05-05 | 2024-10-23 | Ibm | Bioprinted living tissue with therapy capability |
| CN117563048A (zh) * | 2023-11-13 | 2024-02-20 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用 |
| CN117563048B (zh) * | 2023-11-13 | 2024-07-19 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104491927B (zh) | 2016-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2022042704A1 (zh) | 脱细胞基质水凝胶及其制备方法和应用 | |
| Parmaksiz et al. | Decellularization of bovine small intestinal submucosa and its use for the healing of a critical‐sized full‐thickness skin defect, alone and in combination with stem cells, in a small rodent model | |
| Zilic et al. | Decellularisation and histological characterisation of porcine peripheral nerves | |
| CN101366976B (zh) | 人源化异种细胞外基质材料及其制备方法 | |
| EP3040088B1 (en) | Method for preparing an animal decellularized tissue matrix material and a decellularized tissue matrix material prepared thereby | |
| CN104436305B (zh) | 以脱细胞生物膜为载体的心肌补片及制备方法与应用 | |
| CN102238970B (zh) | 利用动物组织粉末制造多孔立体支架的方法及其多孔立体支架 | |
| CN105963785B (zh) | 一种基于脂肪干细胞膜片的脱细胞基质材料及其制备方法 | |
| CN103877615B (zh) | 一种软骨组织工程支架及其制备方法 | |
| CN102933705A (zh) | 去细胞化的脂肪组织 | |
| Leonel et al. | Decellularization of placentas: establishing a protocol | |
| CN101985051A (zh) | 一种脱细胞角膜或脱细胞角膜基质及其制备方法和用途 | |
| Lohan et al. | Human hamstring tenocytes survive when seeded into a decellularized porcine Achilles tendon extracellular matrix | |
| CN105288737A (zh) | 一种组织工程软骨复合支架及其制备方法 | |
| CN104491927B (zh) | 一种脱细胞舌基质材料及其制备方法 | |
| CN106581758A (zh) | 一种具诱导血管化能力的抗菌脱细胞真皮敷料及其制备方法 | |
| CN102861360B (zh) | 一种促神经修复材料及其制备方法和用途 | |
| CN1836034A (zh) | 生产神经元的方法 | |
| CN104800890B (zh) | 一种脱细胞颌下腺基质材料及其制备方法 | |
| CN107137769A (zh) | 一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法 | |
| CN108939161B (zh) | 一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法 | |
| JP4876275B2 (ja) | 生物の組織を薄切した切片からなる動物細胞の培養担体と、この担体を用いる動物細胞の培養方法および移植方法 | |
| CN105963795A (zh) | 一种基于胶原制备组织工程表皮的方法 | |
| Kumaresan et al. | Development of Human Umbilical cord based scaffold for tissue engineering application | |
| CN116376818A (zh) | 一种干细胞三维培养生物支架的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| OL01 | Intention to license declared | ||
| OL01 | Intention to license declared |