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CN104473974A - 一种调节胃肠道菌群的组合物及其应用、食品 - Google Patents

一种调节胃肠道菌群的组合物及其应用、食品 Download PDF

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CN104473974A
CN104473974A CN201410660511.6A CN201410660511A CN104473974A CN 104473974 A CN104473974 A CN 104473974A CN 201410660511 A CN201410660511 A CN 201410660511A CN 104473974 A CN104473974 A CN 104473974A
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黄远英
殷光玲
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BY Health Co Ltd
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Abstract

本发明涉及保健食品领域，特别涉及益生菌组合物及其应用、食品。该益生菌组合物包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido。本发明提供的益生菌组合物与益生元按一定比例配伍具有显著的协同增效作用，可有效调节肠道菌群平衡，具有增强免疫力功能。

Description

一种调节胃肠道菌群的组合物及其应用、食品
技术领域
本发明涉及保健食品领域，特别涉及益生菌组合物及其应用、食品。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制，是机体抵抗外来侵袭、维护体内环境稳定性的能力，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。当人体免疫功能失调，或者免疫系统不健全时，身体易于被感染，如感冒、扁桃体炎、哮喘、支气管炎、肺炎、腹泻等反复发作，还易还易诱发重大疾病，如癌症。现代医学科学发现，免疫是一个与衰老有密切关系的因素。据有关报道，机体免疫功能在30岁左右就开始减迟，又加之现代人生活节奏加快、生活不规律、工作学习环境的压力以及缺乏锻炼等因素，免疫力低下人群的数量呈逐年增加的趋势。因此，如何提高免疫力低下人群的免疫力成为现代医学研究的热点。
人体的免疫力大多取决于遗传基因，但是环境的影响也很大，如饮食、睡眠、运动、压力等。其中饮食具有决定性的影响力，因为有些食物的成分能够协助刺激免疫系统，增强免疫能力。如果缺乏这些重要营养成分，会严重影响身体的免疫系统机能。能够增强免疫力的营养成分包括维生素、胶原蛋白、含铁锌硒食物、乳免疫蛋白等等。研究显示，身体抵抗外来侵害的干扰素及各类免疫细胞的数量与活力都和维生素有关。胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，免疫细胞可与胶原蛋白结合，发生一连串免疫应答反应，提升免疫机能，从而使得人体抵抗力增加。锌可维持胸腺和外周淋巴细胞正常功能，缺锌会导致胸腺及外周淋巴结萎缩，使淋巴细胞功能减弱，免疫细胞发育受到障碍，从而降低人体免疫功能和白细胞杀菌作用；锌参与核酸、蛋白质和能量的代谢及氧化还原过程，有利于免疫细胞的分裂繁殖，保持体内均衡，适量的锌可增强机体免疫功能。
然而，肠道功能紊乱者由于摄取营养物质不足等因素，常表现免疫力低下，单纯的食物摄取不能完全满足这部分人群的需求。因此，提供一种能够调节胃肠道功能、增强人体免疫力的食品具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了益生菌组合物及其应用、食品。该益生菌组合物与益生元按一定比例配伍具有显著的协同增效作用，可有效调节肠道菌群平衡，具有增强免疫力功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种益生菌组合物，包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido。
嗜酸乳杆菌NCFM属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，对致病微生物具有拮抗作用。其明显的特征是具有高度耐酸性。最适pH值为5.5～6.2，在pH5.0以下仍然可以生长。专性代谢糖类化合物生成50％以上的乳酸。多分布于乳制品、发酵植物产品如泡菜、酸菜以及青贮饲料和人的肠道，尤其是乳儿肠道中。它们是许多恒温动物，包括人类口腔、胃肠和阴道的正常菌群，很少致病。嗜酸乳杆菌NCFM可调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖。
人体肠道内的双歧杆菌对人体健康有着重要作用，双歧杆菌是人体的健康标志，是对人体有诸多好处的有益菌群。有研究表明，通过饮食(单一营养物质或者多种维他命剂及矿物质)可以有效提高T淋巴细胞循环的比例，还可以加强NK细胞功能。对于3-5岁的孩子，连续六个月服用乳双歧杆菌Bi-07可以有效减少发烧、流鼻涕、咳嗽发病率和持续时间。乳双歧杆菌HOWARU Bifido可有效缓解便秘。
在本发明中，研究表明嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07、乳双歧杆菌HOWARU Bifido与益生元按一定比例配伍具有显著的协同增效作用，能对抗地芬诺酯引起的肠推进抑制作用，缩短便秘模型小鼠的首次排便时间，增加排便粒数和排便重量；可显著提高小鼠迟发型变态反应能力、抗体生成能力、半数溶血值(HC50)和NK细胞活性。结果表明，本发明提供的益生菌组合物具有协同增效作用，可有效调节肠道菌群平衡，具有增强免疫力功能。
在本发明提供的一些实施例中，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为(10～60)：(10～60)：(10～60)。
作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARUBifido的质量比为30：60：10。
作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARUBifido的质量比为60：10：30。
作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARUBifido的质量比为10：30：60。
本发明还提供了本发明提供的益生菌组合物在制备调节肠道菌群平衡或增强免疫力的食品或药物中的应用；该益生菌组合物包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido；在本发明提供的一些实施例中，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARUBifido的质量比为(10～60)：(10～60)：(10～60)；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为30：60：10；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为60：10：30；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为10：30：60。
本发明还提供了一种食品，包括益生元、食品学上可接受的辅料和本发明提供的益生菌组合物；该益生菌组合物包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido；在本发明提供的一些实施例中，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为(10～60)：(10～60)：(10～60)；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为30：60：10；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为60：10：30；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为10：30：60。
作为优选，食品中益生菌组合物的添加量为1×1010～5×1010CFU/g。
优选地，食品中益生菌组合物的添加量为1.9×1010～5×1010CFU/g。
在本发明提供的一些实施例中，益生元为低聚果糖。但本发明并不局限于此，本领域技术人员认为可行的益生元均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，食品学上可接受的辅料为填充剂、崩解剂或润滑剂中的一种或两者以上的混合物。但本发明并不局限于此，本领域技术人员认为可行的食品学上可接受的辅料均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，填充剂为麦芽糊精、硅酸钙、微晶纤维素、异麦芽酮糖醇或预胶化淀粉中的一种或两者以上的混合物。但本发明并不局限于此，本领域技术人员认为可行的填充剂均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，崩解剂为交联羧甲基纤维素钠。但本发明并不局限于此，本领域技术人员认为可行的崩解剂均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，润滑剂为二氧化硅或硬脂酸镁中的一种或两者的混合物。但本发明并不局限于此，本领域技术人员认为可行的润滑剂均在本发明的保护范围之内。
在本发明提供的一些实施例中，食品的剂型为粉剂、片剂或胶囊剂。
本发明还提供了一种药物，包括益生元、药学上可接受的辅料和本发明提供的益生菌组合物；该益生菌组合物包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido；在本发明提供的一些实施例中，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为(10～60)：(10～60)：(10～60)；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为30：60：10；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为60：10：30；作为优选，嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07与乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为10：30：60。
本发明提供了益生菌组合物及其应用、食品。该益生菌组合物包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido。功效试验表明本发明提供的益生菌组合物与益生元按一定比例配伍具有显著的协同增效作用，可有效调节肠道菌群平衡，具有增强免疫力功能。
具体实施方式
本发明公开了益生菌组合物及其应用、食品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的益生菌组合物及其应用、食品中所用原料药或辅料均可由市场购得。本发明所用益生菌均购自杜邦(北京)食品配料有限公司，活菌培养计数为：嗜酸乳杆菌NCFM：2×1011CFU/g；乳双歧杆菌Bi-07：3×1011CFU/g；乳双歧杆菌HOWARU Bifido：3×1011CFU/g。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 调节肠道菌群的效果试验
(一)对抗地芬诺酯抑制肠推进作用试验
试验动物：NIH小鼠，6-8周龄、体重18-22克，雄性，由广东省医用动物场提供。
试验条件：清洁级，合格书粤检证号2001C047和医动字26-040。室温25±2℃；湿度60％-80％。
试验仪器和试剂：手术剪，眼科镊，直尺，活性碳粉，复方地芬诺酯(国营武进制药厂，批号20000125)。
给药方案如表1所示：
表1 给药方案
试验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将90只小鼠分成9组，每组10只，即空白对照组、模型组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。末天禁食12小时后，便秘模型组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，灌胃给予地芬诺酯(止泻药，用于构建药物性便秘模型)25mg/kg，10分钟后用含受试样品的碳末悬液按0.2mL/10g.b.w灌胃，20分钟后，处死小鼠开腹，取小肠剪取上端自幽门，下端至回盲部的肠管，将小肠悬吊垂直成直线，测定肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汗前沿为“墨汁推进长度”，计算墨汁推进率。墨汁推进率的计算公式如下：
墨汁推进率＝墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100％
各组对小鼠肠推进作用的影响见表2。
表2 各组对肠推进作用的影响
注：与便秘模型对照组比较*P＜0.05**P＜0.01；
与空白对照组比较△△P＜0.01。
(二)对抗药物性便秘试验
试验动物：NIH小鼠，6-8周龄、体重18-22克，雄性，由广东省医用动物场提供。
试验条件：清洁级，合格书粤检证号2001C047和医动字26-040。室温25±2℃；湿度60％-80％。
试验仪器和试剂：眼科镊，天平，活性碳粉，阿拉伯树胶，复方地芬诺酯(国营武进制药厂，批号20000125)。
给药方案见表1。
试验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将90只小鼠分成9组，每组10只，即空白对照组、模型组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)，便秘模型组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，灌胃给予地芬诺酯25mg/kg，给地芬诺酯后1小时，空白对照组给予碳末悬液，其余组别给予含给药成分的碳末悬液按0.2mL/10g，每只小鼠均单独喂养，观察记录每只小鼠首次排便时间，6h排便粒数和排便重量。
各组对药物性便秘的影响见表3。
表3各组对药物性便秘的影响(平均值±标准差)
注：1、表示与便秘模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
2、△△与空白对照组比较P＜0.01。
由表2、表3的试验结果可知，对NIH小鼠每日分别按给药方式给药共10天，结果显示嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07、乳双歧杆菌HOWARUBifido与益生元按一定比例配伍具有显著的协同增效作用，能对抗地芬诺酯引起的肠推进抑制作用，缩短便秘模型小鼠的首次排便时间，增加排便粒数和排便重量。结果表明，本发明提供的益生菌组合物具有协同增效作用，可有效调节肠道菌群平衡。
实施例2 免疫功能影响试验
实验动物：清洁级昆明种雄性小鼠，体重为18～22g。
实验条件：环境条件温度23℃～25℃，湿度54％～68％。
主要仪器与试剂：动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴箱、液体闪烁仪、酶标仪、显微镜等；无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板，96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等；绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、Hank’s液(pH7.2～7.4)、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、ConA、1％冰醋酸，1mol/L的HCL溶液，酸性异丙醇(96mL异丙醇1mol/L的HCL溶液4mL)、MTT、PBS缓冲液(pH7.2～7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、其琼脂糖、都氏试剂、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液、1％的NP40、0.1％的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
给药方案见表1(不包括便秘模型组)。
(一)脏器/体重比值测定试验
实验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将80只小鼠分成8组，每组10只，即空白对照组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。给样量根据体重增减调整，实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)。称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平上称重，计算脏器/体重比值。试验结果见表4。
表4 益生菌对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
(二)迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)
实验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将80只小鼠分成8组，每组10只，即空白对照组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)。小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC(0.2mL/每鼠)致敏后4d，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC(20μL/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。计算在左后足跖部注射前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)，来表示迟发型变态反应(DTH)的程度。试验结果见表5。
表5 益生菌对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
(三)ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
实验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将80只小鼠分成8组，每组10只，即空白对照组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)。无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’s液洗3次，每次离心10min(1000rpm)。然后将细胞悬浮于2mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加50μLConA液(相当于5Lg/mL)，另一孔作为对照，置5％二氧化碳，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体用酶标仪测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。试验结果见表6。
表6 样品对小鼠淋巴细胞转化能力实验的影响
注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
(四)抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
实验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将80只小鼠分成8组，每组10只，即空白对照组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，将压积SRBC用生理盐水配2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL将免疫后4d的小鼠处死，取脾，轻轻撕碎，用Hank’s液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在5mLHank’s液中。将表层培养基加热溶解后与等量的pH7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加入用SA液配制的10％SRBC 50μL(v/v)、20μL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA液稀释的补体(1:10)加入到玻片凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空斑数。试验结果见表7。
表7 样品对小鼠抗体生成细胞数的影的影响
注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
(五)半数溶血值(HC50)的测定
实验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将80只小鼠分成8组，每组10只，即空白对照组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)。取羊血，用生理盐水洗涤3次每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC0.2mL进行免疫。5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍，取1mL置试管内，依次加入10％(v/v，用SA缓冲液配制)压积SRBC0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1:10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(v/v，用SA缓冲液配制)压积SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算:
半数溶血值(HC50)＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数。
试验结果见表8。
表8 样品对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
(六)NK细胞活性的测定(同位素3H-TdR测定法)
实验方法：动物在实验室条件下检疫一周后，随机将80只小鼠分成8组，每组10只，即空白对照组、益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组，按照表1中的给药方案，取益生元组、第一～三对照组、第一～三试验组的给药成分分别溶于100mL蒸馏水中，配制成溶液。每组按设定要求每日灌胃给受试样品，给药时间为10天，三天称重一次，给样量根据体重增减调整。实验前各组小鼠禁食12小时(其间自由饮水)。取传代后24h生长良好的YAC-1细胞(存活率>95％)按1×106/mL YAC-1细胞悬液加3H-TdR10LCi进行标记，于37℃5％二氧化碳培养箱中培养2h，每30min振荡1次，标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×105个/mL。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗3次，每次1000rpm离心10min，再用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液悬浮，用台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为1×107个/mL。在96孔板中每孔加100μL标记的靶细胞，试验孔加100μL效应细胞，空白对照孔加100μL培养液，最大释放孔加100μL TritonX-100。每个样品设3个复孔，置5％二氧化碳，37℃培养4h。用多头细胞取集器取集于玻璃纤维滤纸上，用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
NK细胞活性＝[1-试验孔cpm/(空白对照孔cpm-最大释放孔cpm)]×100％
试验结果见表9。
表9 样品对小鼠NK细胞活性的影响
注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
由表4～表9的试验结果可知，对NIH小鼠每日分别按给药方式给药共10天，结果显示嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07、乳双歧杆菌HOWARU Bifido与益生元按一定比例配伍具有显著的协同增效作用，可显著提高小鼠迟发型变态反应能力、抗体生成能力、半数溶血值(HC50)和NK细胞活性。结果表明，本发明提供的益生菌组合物具有协同增效作用，具有增强免疫力功能。
实施例3 益生菌组合物食品粉剂的制备
益生菌组合物食品粉剂的配方见表10。
表10 益生菌组合物食品粉剂的配方
称取配方量的嗜酸乳杆菌NCFM(200B/g)、乳双歧杆菌Bi-07(300B/g)、乳双歧杆菌HOWARU Bifido(300B/g)、低聚果糖、麦芽糊精、硅酸钙，将配方量的原辅料投入混合机中混合20～30分钟，即得。
实施例4 益生菌组合物食品片剂的制备
益生菌组合物食品片剂的配方如表11所示。
表11 益生菌组合物食品片剂的配方
称取配方量的嗜酸乳杆菌NCFM(200B/g)、乳双歧杆菌Bi-07(300B/g)、乳双歧杆菌HOWARU Bifido(300B/g)、低聚果糖、微晶纤维素、异麦芽酮糖醇、交联羧甲基纤维素钠、二氧化硅、硬脂酸镁，将配方量的原辅料投入混合机中混合20～30分钟。
用压片机将上述混合料进行压片，1.5g/片。
实施例5 益生菌组合物食品胶囊剂的制备
益生菌组合物食品胶囊剂的配方如表12所示。
表12 益生菌组合物食品胶囊剂的配方
称取配方量的嗜酸乳杆菌NCFM(200B/g)、乳双歧杆菌Bi-07(300B/g)、乳双歧杆菌HOWARU Bifido(300B/g)、低聚果糖、预胶化淀粉淀粉、二氧化硅、硬脂酸镁，将配方量的原辅料投入混合机中混合20～30分钟。
将上述混合料采用全自动胶囊填充机填充入胶囊，装量为0.4g/粒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种益生菌组合物，其特征在于，包括：嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌Bi-07和乳双歧杆菌HOWARU Bifido。
2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌NCFM、所述乳双歧杆菌Bi-07与所述乳双歧杆菌HOWARU Bifido的质量比为(10～60)：(10～60)：(10～60)。
3.如权利要求1或2所述的益生菌组合物在制备调节肠道菌群平衡或增强免疫力的食品或药物中的应用。
4.一种食品，其特征在于，包括益生元、食品学上可接受的辅料和如权利要求1或2所述的益生菌组合物。
5.根据权利要求4所述的食品，其特征在于，所述食品中所述益生菌组合物的添加量为1×1010～5×1010CFU/g。
6.根据权利要求4所述的食品，其特征在于，所述益生元为低聚果糖。
7.根据权利要求4所述的食品，其特征在于，所述食品学上可接受的辅料为填充剂、崩解剂或润滑剂中的一种或两者以上的混合物。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的食品，其特征在于，所述食品的剂型为粉剂、片剂或胶囊剂。
9.一种药物，其特征在于，包括益生元、药学上可接受的辅料和如权利要求1或2所述的益生菌组合物。
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