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CN104394853B - 多孔性纳米结构在递送中的用途 - Google Patents

多孔性纳米结构在递送中的用途 Download PDF

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CN104394853B CN201380020044.4A CN201380020044A CN104394853B CN 104394853 B CN104394853 B CN 104394853B CN 201380020044 A CN201380020044 A CN 201380020044A CN 104394853 B CN104394853 B CN 104394853B
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Abstract

本发明涉及将至少一种试剂递送至或进入生物样品或生物主体的方法。所述方法包括将所述生物样品或主体与携带有效载荷的纳米结构接触的步骤。所述纳米结构可以是多孔性低密度纳米结构。

Description

多孔性纳米结构在递送中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月19日申请的申请号为61/600,696的美国临时专利的优先权，其通过引用整体并入本申请。
背景
纳米粒子广泛应用于分子成像、早期诊断和靶向疗法等领域。设计和制备能够包含或携带大量有效载荷并且递送进入生物样品的纳米粒子具有挑战但却也是迫切需要的。因此，需要继续开发这种纳米粒子。
发明概述
本申请的一个方面涉及一种组合物，所述组合物包含携带有效载荷的纳米结构和生物样品。在某些实施方式中，所述纳米结构包含嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子，其能够携带或者结合在纳米结构中或表面的至少一个有效载荷。
在某些实施方式中，所述核纳米粒子包括纳米粒子或纳米粒子簇。单一核纳米粒子可以包括多个微型纳米粒子或微型纳米粒子簇。在簇中的纳米粒子可以由相同组分或不同组分制备。
在某些实施方式中，所述核纳米粒子包括例如超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒子或非-SPIO纳米粒子。所述非-SPIO纳米粒子包括例如金属纳米粒子(例如金或银纳米粒子)、金属氧化物纳米粒子、半导体纳米粒子(例如具有单个或多个组分如CdSe/ZnS的量子点、掺杂的无重金属的量子点或其他半导体量子点)；聚合物纳米粒子(例如由PLGA(聚(乳酸共乙醇酸)、PCL(聚己内酯)、PEG(聚乙二醇)或其他聚合物中的一种或组合制备的粒子)；硅纳米粒子；和非-SPIO磁性纳米粒子(例如MnFe2O4、SAF和其他类型的磁性纳米粒子)。所述核纳米粒子的直径范围为约1nm至约900nm(优选尺寸为1-50nm、2-40nm、5-20nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm)。
在某些实施方式中，所述核纳米粒子具有球形、棒状、四脚锥体、角锥体、多臂的、纳米管、纳米线、纳米纤维或纳米板的形状。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构指密度至少比现有介孔材料(例如孔径范围为2nm至50nm的介孔材料)低10多倍(例如10多倍、20多倍、30多倍、50多倍、70多倍、100多倍、1000多倍、10,000倍)的结构。在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构具有<1.0g/cc(例如由0.01mg/cc至1000mg/cc)的密度。在某些实施方式中，所述密度由所述3-D结构的干重除以这种3-D结构在水溶液中的总体积确定。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构域具有较高的多孔性。这种低密度结构进一步指在结构上具有至少40％至至少99.9％(优选50％至99.9％)的空白空间或空隙率的结构。在某些实施方式中，至少80％的孔在孔隙半径上具有的尺寸为1nm至500nm。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构是在透射电子显微镜下不能明显地观察到或基本上不可见的结构，例如即使当所述低密度结构的特征性尺寸在10多或100多纳米范围内时。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构由含有硅的分子制备(例如硅烷、有机硅烷、烷氧基硅烷、硅酸盐及其衍生物)。例如，所述含有硅的分子可以是氨基-丙基三甲氧基硅烷、巯基-丙基-三甲氧基硅烷、羧基-丙基-三甲氧基硅烷、氨基-丙基-三乙氧基硅烷、巯基-丙基-三乙氧基硅烷、羧基-丙基-三乙氧基硅烷、双-[3-(三乙氧基硅基)丙基]-四硫化物、双-[3-(三乙氧基硅基)丙基]-二硫化物、氨基丙基三乙氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基-三(2-甲氧基乙氧基)硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基)-乙基三甲氧基硅烷、3-环氧丙基-丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸基丙基三乙氧基硅烷、3-氰酸基丙基三乙氧基硅烷和硅酸钠。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构与所述核纳米粒子通过分子内相互作用(例如共价键、金属键和/或离子键)或分子间相互作用(例如氢键和/或非共价键)结合。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构是稳定的交联涂层，其厚度范围为1nm至1000nm(例如1nm至500nm)。在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构的厚度是可控的，其能够携带的有效载荷的数量也是可控的。其结果是，所述纳米结构当作为注射剂系统给药进入活体主体的血液时，其能够累积在疾病部位如肿瘤或炎症病灶。在某些实施方式中，所述纳米结构能够携带或结合一个或多个有效载荷。在某些实施方式中，所述纳米结构携带或结合的有效载荷包括但不限于可检测剂(例如荧光分子、化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素、MRI造影剂、CT造影剂、酶底物标记和/或染色剂)、靶向部分(例如抗体、抗原、配体、适体、肽、核酸、多核苷酸、多糖、糖、脂肪酸、类固醇、嘧啶和/或半抗原)、结合伴侣(例如抗原、抗体、受体、配体、DNA、RNA、肽、适体、生物素、亲和素、链霉亲和素、凝集素、碳水化合物、蛋白A、抗体Fc、脱硫生物素和/或亚氨基生物素)、生物活性剂(例如治疗剂、蛋白、抗体、肽、核酸、酶、热响应分子、光响应分子、电子响应分子、磁响应分子、pH响应分子、酶响应分子和/或化合物)、药物、治疗剂、放射剂、化疗剂、小分子药物、生物药物(例如肽、蛋白、抗体、抗原、核酸、适体等)及其组合，其能够用于成像、检测、研究、监测、评估、筛选疾病、病情和/或相关的生物事件。在某些实施方式中，所述纳米结构包括第一有效载荷和第二有效载荷。
本发明的另一个方面涉及递送至少一个试剂至生物样品或进入生物样品的方法，所述方法包括将生物样品与本申请提供的携带有效载荷的纳米结构接触的步骤。
在某些实施方式中，所述纳米结构具有磁性性质以便于通过磁性相互作用增强所述递送。
在某些实施方式中，所述携带有效载荷的纳米结构包括第一有效载荷。在某些实施方式中，所述携带有效载荷的纳米结构还包括第二有效载荷。在某些实施方式中，所述第一有效载荷和所述第二有效载荷随机或定向分布在所述纳米结构中。
在某些实施方式中，所述纳米结构的表面被促进所述递送功能的分子实体所调制，其中所述实体改善特异性的靶向功能、降低非特异性结合或调节在表面上有效载荷的密度。
在某些实施方式中，所述纳米结构的尺寸被定制为1nm至1000nm以优化其递送功能。在某些实施方式中，调整所述纳米结构的电荷以优化其递送功能。
在某些实施方式中，所述纳米结构是生物相容性的并且能够由生理上可接受的组成物料形成。所述纳米结构可以是生物可降解的。
在某些实施方式中，所述有效载荷通过静电原理、生物学或酶促相互作用、或者通过光、pH、热或电敏感性键释放进入生物样品。
本发明的另一个方面涉及将至少一种试剂递送至生物屏障上或通过生物屏障的方法，所述方法包括将生物屏障与携带有效载荷的纳米结构接触的步骤。
本发明的另一个方面涉及一种组合物，所述组合物包含携带有效载荷的纳米结构和生物样品，其中所述纳米结构具有有效载荷。
附图说明
图1对包含多个有效载荷(点)的低密度纳米结构(LDNS)与致密纳米结构(黑色网状物，右图)的示意性比较。
图2金核尺寸为约20nm和流体力学尺寸为约60nm的硅烷化的金纳米粒子的示例性透射电子显微镜(TEM)图像。从TEM图中未见含硅的涂层。
图3纳米粒子核尺寸为约6nm和流体力学尺寸为约200nm的硅烷化的量子点的示例性TEM图像。TEM中无明显可见的含硅涂层。
图4本领域公知的涂覆纳米粒子的示例性TEM图像，其中在TEM中明显可见所述涂层。
图5LDNS的示例性TEM图像，其中显示了大核纳米粒子的直径。
图6使用纳米粒子将Alexa 488荧光标记的DNA递送进入Hela细胞。图6(a)显示了展示所述细胞的亮视野图像，图6(b)显示了展示细胞中的DNA的荧光图像。
图7外加磁力增加递送进入Hela细胞的纳米粒子的数量。在放置或不放置磁铁的条件下将包含DNA和荧光物质的磁性纳米结构与Hela细胞孵育。图7(a)显示了无磁铁时孵育的所述细胞的图像，并且没有多少纳米粒子进入细胞。图7(b)显示了有磁铁时孵育的所述细胞的图像，并且因为磁性改善了纳米粒子的递送，所以相应地观察到更多纳米粒子进入所述细胞。图7(c)显示了在存在或不存在磁铁的条件下所述细胞的数量和递送进入所述细胞的纳米粒子的数量。“总细胞”指计数的细胞总数。“总NP”指计数的纳米结构的总数，“平均”指每个细胞中纳米结构的平均数量。
发明详述
在对本申请进行更加详细的描述之前，应理解本申请不限于所描述的特定实施方式，并且其当然是可以改变的。还应理解本申请中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制，因为本申请的范围仅由所附的权利要求限定。
在提供数值范围时，除非上下文另有明示，应理解在该范围的上限和下限之间的精确到下限单位的十分之一的每个居间值，和在所述范围内的任何其他提及的数值或居间值，都被包括在本申请的范围内。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围中，并且也被包括在本申请的范围内，除非所述范围中任何特定排除的极限值。在所述的范围包括一个或两个极限值时，排除一个或两个极限值的范围也被包括在本申请的范围内。
除非另有定义，本申请中使用的所有科技术语具有的含义与本发明所属领域一般技术人员通常理解的含义相同。虽然与本申请中所述的方法和材料类似或等价的任何方法和材料也可用于本申请的实践或试验，但是以下描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本申请，相当于每篇出版物或专利都特别地和单独地被指出通过引用并入，并且其通过引用并入本申请以披露和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。所引用的任何出版物均在本申请提交日之前公开，但所述引用不应理解为由于所述出版物是在先公开而承认本申请的发明不早于这些公开。而且，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，其可能需要单独确认。
本领域技术人员在阅读本申请后将理解，本申请中所描述和解释的各个实施方式均具有独立的组成和特性，在不脱离本申请范围或主旨的前提下，可以容易地将其分离或者与任意其他若干实施方式的特性组合。任何所述的方法均可以所叙述的事件顺序或者逻辑上可能的任何顺序进行。
除非另有明示，本申请的实施方式将采用化学、固态化学、无机化学、有机化学、物理化学、分析化学、材料化学、生物化学、生物学、分子生物学、重组DNA技术、药理学、成像等技术，其均在本领域技术的范围内。在文献中对这些技术进行了充分阐述。
在对本申请的实施方式进行详细描述前，除非另有明示，应理解本申请不仅限于特定材料、试剂、反应原料、生产工艺等，其是可以改变的。还应理解在本申请中使用的术语仅用于说明特定实施方式的目的，并不旨在限制。可以以逻辑上可能的不同顺序执行本申请中的步骤也是可能的。
给出下述实施方式以便向本领域的普通技术人员完整地披露和描述本申请所公开和要求保护的方法是如何进行的以及探针是如何使用的。已经付出努力以确保数字的准确度(例如量、温度等)，但是应考虑会有一些误差和偏差。
需要指出的是，除非上下文另有明示，用于本说明书和所附权利要求中的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数对象。因此，例如“化合物”包括多个化合物。在本说明书和所附的权利要求中将会引用多个术语，除非具有明显相反的表示，所述术语具有下述所定义的含义。
本申请的一个方面涉及如美国临时申请61/589,777中所披露的多孔性纳米结构，将其并入本申请，并且涉及将其用于递送有效载荷至生物样品上或生物样品中的用途。
多孔性纳米结构
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构包含被嵌入或涂覆低密度、多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子。
本申请使用的核纳米粒子包括但不限于超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒子和非-SPIO纳米粒子。
SPIO纳米粒子是氧化铁纳米粒子，其为磁赤铁矿(γ-Fe2O3)或磁铁矿(Fe3O4)，或由这两相组成的纳米粒子。SPIO可以使用适宜的方法合成并且以胶状溶液的形式分散在有机溶剂或水中。合成SPIO纳米粒子的方法是本领域公知的(参见例如Morteza Mahmoudi等，Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles:Synthesis,Surface Engineering,Cytotoxicity and Biomedical Applications，Nova Science Pub Inc出版，2011)。在一个实施方式中，可以通过湿化学合成方法制备SPIO纳米粒子，所述方法涉及在存在碱性介质的条件下将Fe2+和Fe3+盐共沉淀。在合成过程中，可以引入氮气以控制氧化，可以加入表面活性剂和适宜的聚合物以抑制团聚或控制粒子尺寸，和/或可以使用乳剂(如油包水微乳)以调节SPIO纳米粒子的物理性质(参见例如Jonathan W.Gunn,The preparation andcharacterization of superparamagnetic nanoparticles for biomedical imagingand therapeutic application，ProQuest出版，2008)。在另一个实施方式中，可以通过单独使用五羰基铁或与过渡态金属羰基化合物联合热解的方法产生SPIO纳米粒子，任选地在存在一种或多种表面活性剂(例如月桂酸和油酸)和/或氧化剂(例如三甲胺-N-氧化物)的条件下以及在适宜溶剂中(例如二辛基醚或十六烷)(参见例如US专利申请20060093555)。在另一个实施方式中，SPIO纳米粒子还可以通过气体沉积法制备，所述方法涉及在含有不同浓度氧气的氦气氛下将铁激光蒸发(参见Miller J.S.等，Magnetism:Nanosizedmagnetic materials，Wiley-VCH出版，2002)。
在某些实施方式中，SPIO纳米粒子是US专利申请US20100008862中所公开的那些。
非-SPIO纳米粒子包括例如金属纳米粒子(例如金或银纳米粒子(参见例如HirokiHiramatsu,F.E.O.,Chemistry of Materials 16,2509-2511(2004)))，半导体纳米粒子(例如具有单个或多个组分如CdSe/ZnS的量子点(参见例如M.Bruchez等，science 281,2013-2016(1998))、掺杂的无重金属的量子点(参见例如Narayan Pradhan等，J.Am.chem.Soc.129,3339-3347(2007))或其他半导体量子点)；聚合物纳米粒子(例如由PLGA(聚(乳酸共乙醇酸)(参见例如Minsoung Rhee等，Adv.Mater.23,H79-H83(2011))、PCL(聚己内酯)(参见例如Marianne Labet等，Chem.Soc.Rev.38,3484-3504(2009))、PEG(聚乙二醇)或其他聚合物中的一种或组合制备的粒子)；硅纳米粒子；和非-SPIO磁性纳米粒子(例如MnFe2O4(参见例如Jae-Hyun Lee等，Nature Medicine 13,95-99(2006))、合成反铁磁性纳米粒子(SAF)(参见例如A.Fu等，Angew.Chem.Int.Ed.48,1620-1624(2009))和其他类型的磁性纳米粒子)。
可以使用本领域公知的适宜方法制备或合成非-SPIO纳米粒子，例如溶胶-凝胶合成法、油包水微乳法、气体沉积法等。例如，金纳米粒子可以通过使用还原剂如柠檬酸盐或丙酮二羧酸由氯金酸盐溶液(HAuCl4)还原制备。又例如，CdS半导体纳米粒子可以在二氧化硅粒子表面上由Cd(ClO4)2和Na2S制备。又例如，II-VI半导体纳米粒子可以在注入热配位溶剂后基于有机金属试剂如二甲基镉和三辛基硒化膦的高温热解合成(参见例如GünterSchmid,Nanoparticles:From Theory to Application，John Wiley&Sons出版，2011)。掺杂的无重金属的量子点例如掺杂Mn的ZnSe量子点可以使用成核掺杂策略制备，其中在高温下形成小尺寸的MnSe纳米簇作为核并且ZnSe层涂覆在核上。又例如，可以通过在双相溶剂系统中乳化聚合物制备聚合纳米粒子，包括通过超声或匀质得到纳米级的聚合物小滴，并蒸发有机溶剂以获得纳米粒子。又例如，硅质纳米粒子可以由溶胶-凝胶合成制备，其中在存在酸或碱催化剂的条件下在水和乙醇的混合物中水解烷氧基硅前体(例如TMOS或TEOS)，通过剧烈搅拌浓缩水解得到的单体，并收集所得到的二氧化硅纳米粒子。又例如，非-SPIO磁性纳米粒子SAF可以在高真空下使用离子束沉积法制备，在无磁性空间层(例如钌金属)的两侧沉积铁磁性层及化学蚀刻铜释放层和保护性钽表面层，并且在除去保护性层和选择性蚀刻铜后能够释放SAF纳米粒子。
核纳米粒子的尺寸范围为尺寸为1nm至100nm(优选尺寸为1-50nm、2-40nm、5-20nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm)。可以通过选择适宜的合成方法和/或系统控制纳米粒子的尺寸。例如，为控制纳米粒子的尺寸，可以在极性溶剂中进行纳米粒子的合成，所述极性溶剂提供了能够吸附在纳米粒子表面上的离子种类，从而提供有助于稳定纳米粒子并且抑制纳米粒子生长的静电作用和粒子间的排斥力。又例如，可以在微异质系统中合成纳米粒子，所述微异质系统使得纳米粒子在被束缚的腔或结构域中划分。这种微异质系统可以包括液晶、单和多层、直接胶束、反向胶束、微乳和囊泡。为获得所需尺寸范围内的纳米粒子，可以适当控制或改变合成条件以提供例如所需的溶液浓度或所需的腔范围(详细的综述可以参见例如Vincenzo Liveri,Controlled synthesis of nanoparticles in microheterogeneoussystems，Springer出版，2006)。
核纳米粒子的形状可以是球形、立方形、棒状(参见例如A.Fu等，Nano Letters,7,179-182(2007))、四脚锥形(参见例如L.Manna等，Nature Materials,2,382-385(2003))、角锥体、多臂的、纳米管、纳米线、纳米纤维或纳米板或任意其他适宜的形状。在制备过程中控制纳米粒子形状的方法是本领域公知的(参见例如Waseda Y.等，Morphology controlof materials and nanoparticles:advanced materials processing andcharacterization，Springer出版，2004)。例如，当由自下而上的工艺(即由分子至纳米粒子)制备纳米粒子时，可以加入强烈吸附于特定晶面上的形状控制物控制所述粒子的生长速率。
单一核纳米粒子可以包括单一纳米粒子或者多个或微纳米粒子簇(A.Fu等，J.Am.chem.Soc.126,10832-10833(2004)，J.Ge等，Angew.Chem.Int.Ed.46,4342-4345(2007)，Zhenda Lu等，Nano Letters 11,3404-3412(2011).)。所述微纳米粒子可以是均质的(例如由相同组分/材料制备或者具有相同尺寸)或异质的(例如由不同组分/材料制备或者具有不同尺寸)。均质微纳米粒子簇指具有基本上相同的特性或特征或者由基本上相同的材料组成的粒子集合。异质微纳米粒子簇指具有不同的特性或特征或者由基本上不同的材料组成的粒子的混合物。例如，异质微纳米粒子可以包括在中心的量子点和附着于量子点上的一些独立的金(Au)纳米晶体。在异质纳米粒子集合中不同的纳米粒子最初彼此间不相结合，但是能够单独地分别与低密度多孔性结构结合。
在某些实施方式中，所公开的纳米结构包括多个嵌入于或包覆于低密度、多空性3-D结构的核纳米粒子。例如，所述纳米结构包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、100多或1000多个核纳米粒子。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构指密度远低于(例如10多倍、20多倍、30多倍、50多倍、70多倍、100多倍)现有介孔纳米粒子(例如具有的孔径范围为2nm至50nm的介孔纳米粒子)的结构。(A.Vincent等，J.Phys.Chem.C,2007,111,8291-8298，J.E.Lee等，J.Am.Chem.Soc.,2010,132,552-557.Y.–S，Lin等，J.Am.Chem.Soc.,2011,133,20444-20457，Z.Lu,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,1862-1866.)
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构指密度<1.0g/cc(例如<100mg/cc、<10mg/cc、<5mg/cc、<1mg/cc、<0.5mg/cc、<0.4mg/cc、<0.3mg/cc、<0.2mg/cc或<0.1mg/cc)(例如，由0.01mg/cc至10mg/cc、由0.01mg/cc至8mg/cc、由0.01mg/cc至5mg/cc、由0.01mg/cc至3mg/cc、由0.01mg/cc至1mg/cc、由0.01mg/cc至1mg/cc、由0.01mg/cc至0.8mg/cc、由0.01mg/cc至0.5mg/cc、由0.01mg/cc至0.3mg/cc、由0.01mg/cc至1000mg/cc、由0.01mg/cc至915mg/cc、由0.01mg/cc至900mg/cc、由0.01mg/cc至800mg/cc、由0.01mg/cc至700mg/cc、由0.01mg/cc至600mg/cc、由0.01mg/cc至500mg/cc、由0.1mg/cc至800mg/cc、由0.1mg/cc至700mg/cc、由0.1mg/cc至1000mg/cc、由1mg/cc至1000mg/cc、由5mg/cc至1000mg/cc、由10mg/cc至1000mg/cc、由20mg/cc至1000mg/cc、由30mg/cc至1000mg/cc、由30mg/cc至1000mg/cc、由30mg/cc至900mg/cc、由30mg/cc至800mg/cc或由30mg/cc至700mg/cc)的结构。
可以使用本领域公知的多种方法确定3-D结构的密度(参见例如Lowell,S.等，Characterization of porous solids and powders:surface area,pore size anddensity,Springer出版,2004)。示例性的方法包括Brunauer Emmett Teller(BET)法和氦比重瓶法(参见例如Varadan V.K.等，Nanoscience and Nanotechnology inEngineering，World Scientific出版，2010)。简言之，在BET法中，将待测3-D结构的干粉置于通入氦气和氮气的检测室中，记录温度变化情况并对结果进行分析和外推以计算检测样品的密度。在氦比重瓶法中，在待测3-D结构的干粉中充入氮气，研究通过改变体积产生的氦气压以提供密度。基于干粉样品测定的密度不能反映3-D结构的真实密度，因为所述3-D结构的密度极低，在干燥过程中其架构容易崩塌，因此其与当3-D结构完全伸展时例如就像当3-D结构在缓冲溶液中完全伸展时相比在孔隙度检测中提供了小得很多的数值。
在某些实施方式中，所述3-D结构的密度可以使用3-D结构的干质量除以这种3-D结构在水溶液中的总体积确定。例如，可以分别确定具有或不具有3-D结构的核粒子的干质量，这两者之间的差值将是所述3-D结构的总质量。类似地，可以分别确定在水溶液中具有和不具有3-D结构的核粒子的体积，这两者之间的差值将是在水溶液中核粒子上所述3-D结构的体积。
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构在水溶液中能够以多个包覆于3-D结构的大纳米粒子的形式分散，在这种情况下，所述3-D结构的总体积可以根据各个大纳米粒子3-D结构的平均体积乘以大纳米粒子的数量计算。
对于各个大纳米粒子而言，可以使用动态光散射(DLS)技术测定具有3-D结构的粒子的尺寸(例如半径)，不具有3-D结构的粒子核的尺寸(例如半径)可以在透射电子显微镜(TEM)下测定，因为3-D结构在TEM下基本上不可见。因此，可以通过从具有3-D结构的粒子的体积中减去不具有3-D结构的粒子的体积获得各个较大纳米粒子中3-D结构的体积。
可以使用任意适宜的方法计算针对给定核质量的大纳米粒子的数量。例如，各个大纳米粒子可以由在TEM下是可见的多个小纳米粒子组成。在这种情况下，可以根据在TEM下的检测结果确定小纳米粒子的平均尺寸和体积，小纳米粒子的平均质量可以通过已知的核材料的密度乘以小粒子的体积确定。通过使用核质量除以小纳米粒子的平均质量可以估算小纳米粒子的总数。对于各个大纳米粒子而言，可以在TEM下确定其中小纳米粒子的平均数量。因此，针对给定核质量的大纳米粒子的数量能够通过使用小纳米粒子的总数除以在各个大纳米粒子中小纳米粒子的平均数量估算。
或者，所述低密度、多孔性3-D结构指在结构中具有40％-99.9％(优选50％至99.9％)的空白空间或空孔隙的结构，其中80％的孔具有尺寸为1nm至500nm的半径。
3-D结构的孔隙度可以通过气体/蒸汽吸附法确定。在这项技术中，通常氮气在其沸点被吸附于固体样品上。可以使用在特定分压下吸附的气体的量通过Brunauer、Emmit和Teller(BET)氮气吸附/解吸附公式计算所述材料的特定表面积。通过Kelvin公式或改良的Kelvin公式，BJH公式计算孔径(参见例如D.Niu等，J.Am.chem.Soc.132,15144-15147(2010))。
还可以通过压汞法表征3-D结构的孔隙度(参见例如Varadan V.K.等，如上所述)。简言之，从3-D结构中抽出气体，然后将所述结构浸入汞中。由于汞在室温下不润湿，因此施加外部压力逐渐将汞压入样品中。通过监测所应用的各个压力下逐渐增加的进入汞的体积，可以根据Washburn公式计算孔径。
或者，所述低密度、多孔性3-D结构指具有下述材料性质的结构，即所述多孔性结构(除了核纳米粒子以外)在透射电子显微镜下不能明显地观察到或基本通透，例如即使当所述3-D结构的特征尺寸在10多或100多纳米范围内。本申请中使用的术语“明显地观察到”或“基本通透”指基于TEM下的3-D结构图像所述3-D结构的厚度能够容易地评估或确定。可以采用本领域公知的方法观察或测定纳米结构(例如涂覆或嵌入于低密度多空性3-D结构中的纳米粒子)。例如，可以使用DLS法测定具有3-D结构的纳米结构的尺寸(例如半径)，可以在TEM下测定不具有3-D结构的核粒子的尺寸(例如半径)。在某些实施方式中，利用DLS测定以10多、100多纳米范围计的3-D结构的厚度，但其不能在TEM下容易地测定。例如，当在透射电子显微镜(TEM)下观察本申请中提供的纳米结构时，能够识别纳米粒子，但是不能明显地观察到所述低密度多孔性3-D结构或者不能基本通透(例如参见图2和3)。这能够将本申请中提供的纳米结构与现有技术中报道的那些(参见图4)相区分，所述纳米结构包括涂覆有交联的和尺寸可调的3-D结构的纳米粒子，所述3-D结构包括介孔二氧化硅纳米粒子或涂层(参见例如J.Kim等，J.Am.Chem..Soc.,2006,128,688-689；J.Kim等，Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,8438-8441)。这种特征还表明本申请提供的低密度多孔性3-D结构与本领域公知的其他经涂覆的纳米粒子相比具有低得更多的密度和/或较高的多孔性。
可以通过负载不同分子的容量进一步评估3-D结构的孔隙度(参见例如Wang L.等，Nano Research 1,99-115(2008))。因为本申请所提供的3-D结构具有较低的密度，因而按照设想与其他经涂覆的纳米粒子相比更多的有效载荷能够与该3-D结构结合(参见例如图1)。例如，当3-D结构负载有机荧光团如罗丹明时，一个纳米粒子的3-D结构能够负载超过105个罗丹明分子。
在某些实施方式中，所述低密度结构指能够吸收或携带荧光有效载荷的结构，所述荧光有效载荷的荧光强度是游离荧光分子的至少100倍(例如至少150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍或600倍)。可以在与荧光分子相同的激发和发射波长下对负载纳米粒子的荧光强度进行定量。负载低密度结构的荧光强度显示了所述荧光分子的有效载荷，还间接地反映了所述低密度结构的孔隙度。
在某些实施方式中，所述低密度、多孔性3-D结构由含有硅烷的或硅烷样分子(例如硅烷、有机硅烷、烷氧基硅烷、硅酸盐及其衍生物)制备。
在某些实施方式中，含有硅烷的分子包括有机硅烷，也将其称为硅烷偶联剂。有机硅烷的通式为RxSiY(4-x)，其中R基团是烷基、芳基或有机官能团。Y基团是甲氧基、乙氧基或乙酰氧基。X是1、2或3。R基团能够具有特定功能如使有机硅烷分子与核纳米粒子或其他有效载荷的表面通过共价或非共价相互作用结合。Y基团是可水解的并且能够形成与另一个有机硅烷分子交联的硅氧烷键。示例性的R基团包括但不限于二硫化物烷基、氨基烷基、巯基烷基、乙烯基烷基、环氧烷基和甲基丙烯基烷基、羧基烷基基团。在R基团中的烷基可以是甲烯基、乙烯基、丙烯基等。示例性的Y基团包括但不限于烷氧基如OCH3、OC2H5和OC2H4OCH3。例如，有机硅烷可以是氨基-丙基-三甲氧基硅烷、巯基-丙基-三甲氧基硅烷、羧基-丙基-三甲氧基硅烷、氨基-丙基-三乙氧基硅烷、巯基-丙基-三乙氧基硅烷、羧基-丙基-三乙氧基硅烷、双-[3-(三乙氧基硅烷基)丙基]-四硫化物、双-[3-(三乙氧基硅烷基)丙基]-二硫化物、氨基丙基三乙氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基-三(2-甲氧基乙氧基)硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧基环己基)-乙基三甲氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基-丙基三乙氧基硅烷、3-异氰基丙基三乙氧基硅烷和3-氰基丙基三乙氧基硅烷。
所述3-D结构与核纳米粒子的相互作用通过1)分子内相互作用如共价键(例如Sigma键、Pi键、Delta键、双键、三键、四键、五键、六键、3c–2e、3c–4e、4c–2e、抓氢键、弯曲键、偶极键、Pi反向键、共轭、超共轭、芳香性、哈普托数和反键)、金属键(例如在核纳米粒子中与金属原子的螯合相互作用)或离子键(阳离子π-键和盐键)，以及2)分子间相互作用如氢键(例如二氢键、二氢复合物、低屏障氢键、对称氢键)和非共价键(例如疏水性、亲水性、电荷-电荷或π-堆积相互作用，范德华力，伦敦分散力，机械键，卤键，亲金作用，插层，堆积，熵力和化学极性)。
制备方法
本申请的另一个方面涉及形成纳米结构的方法，所述纳米结构包括具有低密度、多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子。例如，所述纳米结构通过使用低密度、多孔性3-D结构涂覆或包裹一个或多个纳米粒子以使得所述粒子位于或嵌入3-D结构中形成。
所述低密度、多孔性3-D结构通过含硅烷或硅烷样分子的组装或交联使其沉积或覆盖核纳米粒子表面形成。可以通过在核纳米粒子表面的硅烷化过程制备低密度多孔性3-D结构。硅烷化过程包括例如在酸性或碱性条件下交联含硅烷或硅烷样分子(例如烷氧基硅烷如氨基-丙基-三甲氧基硅烷、巯基-丙基-三甲氧基硅烷或硅酸钠)的步骤。
在某些实施方式中，在交联中使用酸性或碱性催化剂。示例性的酸性催化剂包括但不限于质子酸催化剂(例如硝酸、乙酸和磺酸)和Lewis酸催化剂(例如三氟化硼、三氟化硼单乙胺复合物、三氟化硼甲醇复合物FeCl3、AlCl3、ZnCl2和ZnBr2)。示例性的碱性催化剂包括胺或季胺化合物如四甲基氢氧化铵和氢氧化铵。
硅烷化过程可以包括一个或多个阶段，例如：引发阶段，在此阶段所述3-D结构开始形成；生长阶段，在此阶段硅质结构层易于在核纳米粒子上形成并且形成更多；和/或结束阶段，在此阶段所述3-D结构即将完成(例如所述3-D结构的外表面即将形成)。在硅烷化过程中，可以在该过程的不同阶段加入一种或多种含硅烷的分子。例如，在引发阶段，可以加入有机硅烷如氨基丙基三甲氧基硅烷或巯基丙基三甲氧基硅烷以便在核纳米粒子表面起始硅烷化。对于另一个例子，可以在硅烷化的生长阶段将具有更少烷氧基(例如仅2个烷氧基)的硅烷分子加入反应中。对于另一个例子，在硅烷化的结束阶段，可以加入具有一种或多种不同官能团的有机硅烷分子。这些官能团可以是氨基、羧基、巯基或膦酸盐基团，其可以进一步与其他分子偶联，例如亲水性剂、生物活性剂、可检测标记、光响应基团、电子响应基团、磁响应基团、酶促响应基团或pH响应基团，或者结合伴侣，以使得所述3-D结构在稳定性、溶解度、生物相容性、进一步偶联或衍生的能力或与有效载荷亲和性方面得到进一步修饰。或者，所述官能团还可以是易于与其他分子偶联的基团(例如与生物活性剂、热响应分子、光响应分子、电子响应分子、磁响应分子、pH响应分子、酶促响应分子、可检测标记或结合伴侣如生物素或亲和素偶联的基团)。
为控制低密度硅质结构的形成，所述制备进一步包括降低密度的操作如在反应或形成过程中引入空气气泡、增加反应温度、微波、超声、涡旋、摇动/旋转和/或调节反应的化学组成以调节硅烷分子的交联度。不被理论所束缚，据信这些操作能够有助于使得反应介质均匀、分散良好并且促进空腔或孔隙度增加的低密度多孔性3-D结构的形成。
在某些实施方式中，降低密度的操作包括超声处理反应或形成混合物。可以对在硅烷化过程中超声处理的条件(例如持续时间)进行适当的选择以便在所得到的低密度多孔性3-D结构中产生所需的孔隙度。例如，可以在硅烷化过程的某一阶段应用超声处理。超声在硅烷化阶段中的持续时间可以持续例如至少1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时。在某些实施方式中，在硅烷化过程中的各阶段均应用超声处理。
在某些实施方式中，降低密度的操作包括向反应中引入至少一种醇。在某些实施方式中，所述醇具有至少3个(例如至少4个、至少5个或至少6个)碳原子。例如，所述醇可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多的碳原子。在某些实施方式中，所述醇可以是一元醇或多元醇。一元醇说明性的例子包括丙醇、丁醇、戊醇、己醇等。多元醇说明性的例子包括丙二醇、丙三醇、苏糖醇、木糖醇等。在某些实施方式中，所述醇可以具有饱和的碳链或不饱和的碳链。具有饱和碳链的醇可以以化学式CnH(2n+2)O表示。在某些实施方式中，n不低于3，或者不低于4，或者不低于5(例如n＝3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。具有不饱和碳链的醇在两个碳原子之间具有双键或三键。在某些实施方式中，所述醇可以是环醇，例如环己醇、肌醇或薄荷醇。
在某些实施方式中，所述醇具有直链碳链(例如n-丙醇、n-丁醇、n-戊醇、n-己醇等)或支链碳链(例如异丙醇、异丁醇、叔丁醇等)。在某些实施方式中，所述醇的体积分数为约30％至约70％(例如30％至约70％、约30％至约60％、约30％至约55％、约40％至约70％、约45％至约70％、约40％至约60％)。在某些实施方式中，所述醇的体积分数为50％左右(例如45％左右、46％左右、47％左右、48％左右、49％左右、50％左右、51％左右、52％左右、53％左右、54％左右、55％左右、56％左右、57％左右、58％左右、59％左右或60％左右)。
在某些实施方式中，降低密度的操作包括向反应中引入空气气泡。在某些实施方式中，所述空气气泡可以在反应过程中不断的存在。可以通过任何适宜的方法将空气气泡引入反应中，例如通过向反应中通入气泡或者通过向反应混合物中引入气体产生剂。
还可以对其他实验条件进行优化以提供形成所需的低密度多孔性3-D结构的条件。这种实验条件包括例如核纳米粒子的浓度、催化剂的浓度、催化剂与核纳米粒子的浓度比、低密度硅质结构形成的温度或有机硅烷的分子结构。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括在多孔性结构之中或其表面上引入一个或多个官能团。所述官能团可以在交联过程中形成多孔性结构时引入，例如通过在交联过程中特别是在交联过程的结束阶段中通过加入含有这种官能团的含硅化合物引入。所述官能团还可以在交联产物形成后引入，例如通过化学修饰将官能团引入交联产物的表面。在某些实施方式中，所述官能团是多孔性结构中固有的。
所述官能团作为多孔性结构和有效载荷之间的连接。所述官能团的例子包括但不限于氨基，巯基，羰基，膦酸盐，生物素，链霉亲和素，亲和素，羟基，烷基或其他疏水性分子，聚乙二醇或其他亲水性分子以及光裂解、热裂解或pH响应连接基团。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括纯化所得到的纳米结构产物。所述纯化可以包括使用透析、切向流过滤、超滤或其组合。
低密度多孔性3-D结构的厚度，其直接与纳米结构的尺寸相关，能够通过例如修改含硅烷分子(例如三烷氧基硅烷或硅酸钠)的数量、反应时间以及反应步骤和这类反应参数之间的时间间隔被控制(例如从1nm至1000nm)。
所述3-D结构的厚度可以是约1至5nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至10nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至20nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至30nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至40nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至50nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至60nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至100nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至500nm厚。在某些实施方式中，所述厚度可以是约1至1000nm厚。
所述低密度、多孔性3-D结构在核纳米粒子表面上形成后，所述核纳米粒子被嵌入于3-D结构中。所得到的纳米结构能够具有的厚度(例如纳米结构的最长尺寸或者如果所述结构是球形则为直径)为约1至1000nm、1至100nm或者1至10nm。在另一个实施方式中，所述纳米结构能够具有的直径为约1至30nm。在另一个实施方式中，所述纳米结构能够具有的直径为约500nm。在另一个实施方式中，所述纳米结构能够具有的直径为约100nm。在另一个实施方式中，所述纳米结构能够具有的直径为约50nm。在另一个实施方式中，所述纳米结构能够具有的直径为约30nm。在另一个实施方式中，所述纳米结构能够具有的直径为约10nm。
载荷
在某些实施方式中，本申请提供的纳米结构携带或与有效载荷结合。所述有效载荷被纳米结构携带或结合，其包括但不限于可检测剂、靶向部分、结合伴侣、生物活性剂、药物、治疗剂、放射剂、化学剂、小分子药物、生物药(例如肽、蛋白、抗体、抗原、核酸、适体等)及其任意组合，其能够用于成像、检测、研究、监测、评估、筛选和/或疾病、状况或相关生物学事件。有效载荷可以是物理吸入多孔性结构中或通过本申请所公开的官能团与多孔性结构连接。
可检测剂可以是荧光分子、化学发光分子、生物发光分子、放射性同位素、MRI造影剂、CT造影剂、酶底物标记和/或着色剂等。荧光分子的例子包括但不限于荧光化合物(荧光团)，其可以包括但不限于：1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘基荧光素；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-HAT(羟基色胺)；5-羟基色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄(acridine yellow)；吖啶黄(Acriflavin)；富尔根氏吖啶黄(Acriflavin Feulgen)SITSA；水母素(发光蛋白)；AFPs—自体荧光蛋白—(量子生物科技(Quantum Biotechnologies))；Fluor 350；Fluor 405；Fluor 500；Alexa Fluor 430TM；Alexa Fluor 488TM；Alexa Fluor532TM；Alexa Fluor 546TM；Alexa Fluor 568TM；Alexa Fluor 594TM；Alexa Fluor 633TM；Alexa Fluor 647TM；Alexa Fluor 660TM；Alexa Fluor 680TM；茜素络合指示剂；茜素红；别藻蓝素(APC)；AMC，AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA)；苯胺蓝；Anthrocyl stearate；APC(别藻蓝素)；APC-Cy7；APTRA-BTC；APTS；阿斯屈拉松(Astrazon)亮红4G；阿斯屈拉松(Astrazon)橙R；阿斯屈拉松(Astrazon)红6B；阿斯屈拉松(Astrazon)黄7GLL；阿的平；ATTO-TAGTMCBQCA；ATTO-TAGTMFQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基恶二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸黄连素；β内酰胺酶；Bimane；双苯甲酰胺；双苯甲酰胺(赫司特公司(Hoechst))；双-BTC；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBOTM-1；BOBOTM-3；氟硼荧492/515；氟硼荧493/503；氟硼荧500/510；氟硼荧505/515；氟硼荧530/550；氟硼荧542/563；氟硼荧558/568；氟硼荧564/570；氟硼荧576/589；氟硼荧581/591；氟硼荧630/650-X；氟硼荧650/665-X；氟硼荧665/676；氟硼荧Fl；氟硼荧FL ATP；氟硼荧Fl-神经酰胺；氟硼荧R6G SE；氟硼荧TMR；氟硼荧TMR-X偶联物；氟硼荧TMR-X，SE；氟硼荧TR；氟硼荧TR ATP；氟硼荧TR-XSE；BO-PROTM-1；BO-PROTM-3；磺基亮黄素(Brilliant Sulphoflavin)FF；BTC；BTC-5N；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；深红钙TM；绿钙；绿钙-1Ca 2+染料；绿钙-2Ca 2+；绿钙-5N Ca 2+；绿钙-C18Ca 2+；橙钙；卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor White)；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；瀑布蓝(Cascade BlueTM)；瀑布黄(Cascade Yellow)；儿茶酚胺；CCF2(GeneBlazer商标)；CFDA；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CL-NERF；羧基荧光素双醋酸盐(CMFDA)；香豆素鬼笔环肽；C-藻青素；CPM甲基香豆素；CTC；CTC甲臜；Cy2TM；Cy3.18；Cy3.5TM；Cy3TM；Cy5.18；Cy5.5TM；Cy5TM；Cy7TM；环AMP氟传感器(FiCRhR)；Dabcyl；单磺酰；单磺酰胺；单磺酰尸胺；单磺酰氯；单磺酰DHPE；单磺酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3′DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(未按照比例)；DiA(4-二-16-ASP)；二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)；DiD-亲脂性示踪剂；DiD(DiIC18(5))；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；DiI(DiIC18(3))；二硝基酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；DM-NERF(高pH)；DNP；多巴胺；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；ELF 97；曙红；赤藓红；赤藓红ITC；溴化乙锭；乙啶均二聚体-1(EthD-1)；Euchrysin；EukoLight；氯化铕(III)；EYFP；快蓝；FDA；富尔根(副品红)：FIF(甲醛诱导的荧光)；FITC；Flazo Orange；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；荧光素二乙酸酯；Fluoro-Emerald；荧光金(羟芪巴脒)；Fluor-Ruby；Fluor X；FM 1-43TM；FM 4-46；Fura RedTM(高pH)；Fura RedTM/Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl Brilliant Red B；Genacryl Brilliant Yellow 10GF；Genacryl Pink3G；Genacryl Yellow 5GF；GeneBlazer(CCF2)；Gloxalic Acid；粒状蓝；血卟啉；Hoechst33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟色胺；Indo-1，高钙；Indo-1，低钙；吲哚二碳菁(DiD)；吲哚三碳菁(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/乙锭均二聚体；LOLO-1；LO-PRO-1；荧光黄；Lyso示踪蓝；Lyso示踪蓝-白；Lyso示踪绿；Lyso示踪红；Lyso示踪黄；Lyso传感器蓝；Lyso传感器绿；Lyso传感器黄/绿；Mag绿；萘红(根皮红B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；镁绿；镁橙；孔雀石绿；海蓝；Maxilon BrilliantFlavin 10GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8GFF；血蓝蛋白；甲氧基香豆素；线粒体示踪绿FM；线粒体示踪橙；线粒体示踪红；光辉霉素；Monobromobimane；Monobromobimane(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基氯派若宁二苯乙烯)；NBD；NBD胺；尼罗红；Nitrobenzoxadidole；去甲肾上腺素；核快红；核黄；Nylosan Brilliant lavin E8G；俄勒冈绿；俄勒冈绿488-X；俄勒冈绿TM；俄勒冈绿TM488；俄勒冈绿TM500；俄勒冈绿TM514；太平洋蓝；副蔷薇胺(福尔根)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德克萨斯红[Red613]；根皮红B(麦哥达拉红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；磷化氢3R；光刻胶；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome Blue Black；POPO-1；POPO-3；PO—PRO-1；PO-PRO-3；樱草黄；普施安黄；碘化丙啶(PI)；PYMPO；芘；派若宁；派若宁B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；喹吖因氮芥；红613[PE-德克萨斯红]；试卤灵；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；罗丹明B额外的；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻青蛋白；R-藻红蛋白(PE)；S65A；S65C；S65L；S65T；SBFI；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红4G；Sevron亮红B；Sevron橙；Sevron黄L；SITS；SITS(樱草黄)；SITS(二苯乙烯异硫代磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿；光谱浅绿；光谱绿；光谱橙；光谱红；SPQ(6-甲氧基-N-(3-硫代丙基)喹啉)；二苯乙烯；硫代罗丹明B和C；硫代罗丹明额外；SYTO11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；德克萨斯红TM；德克萨斯红-XTM偶联物；硫代二羰基菁(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫代黄素5；硫代黄素S；硫代黄素TCN；Thiolyte；硫代噻唑橙；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基罗丹明异硫氰酸酯；真蓝；真红；Ultralite；荧光素钠B；Uvitex SFC；WW 781；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；YOYO-3；Sybr绿、噻唑橙(内部螯合染料)、荧光半导体纳米粒子、镧系元素或其组合。
放射性同位素的例子包括123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、18F、201Tl、67Ga、137Cs和其他放射性同位素。
酶底物标记的例子包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
靶向部分对目标靶点(例如细胞、细胞组分、组织、蛋白、抗体、抗原、DNA、RNA等)具有亲和性。靶向部分的例子包括抗体(例如肿瘤表面抗原的抗体、细胞特异性抗原的抗体或受体的抗体)、受体的配体(例如生长因子、激素、细胞因子或神经递质)、适体、肽、抗原、核酸、多核苷酸、多糖、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、半抗原或其组合。
结合伴侣的例子包括抗体、抗原、受体、配体、DNA、RNA、肽、适体、生物素、亲和素、链霉亲和素、凝集素、碳水化合物、蛋白A、抗体Fc、脱硫生物素和亚氨基生物素。
生物活性剂的例子包括治疗剂、蛋白、抗体、肽、核酸、酶、热应答性分子、光应答性分子、电子应答性分子、磁应答性分子、pH应答性分子、酶促应答性分子和/或化合物。示例性的治疗剂包括但不限于局部麻醉剂、抗癫痫药和抗惊厥剂、抗阿兹海默氏病药、镇痛药、抗痛风、抗高血压药、抗心律失常药、利尿药、用于治疗肝脏疾病的药物、用于治疗胰腺疾病的药物、抗组胺药、抗变态反应药、糖皮质激素药、性激素药和避孕药、降血糖药、抗骨质疏松药、抗生素、磺胺类、喹诺酮类和其他合成抗菌药、抗结核药、抗病毒药、抗肿瘤药和免疫调节剂。
至于抗原或其抗体，目标蛋白可以是任意一种或多种下述抗原包括但不限于：1)白细胞标记物如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a,b,c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27及其配体、CD28及其配体B7.1，B7.2，B7.3、CD29及其配体、CD30及其配体、CD40及其配体gp39、CD44、CD45及其亚型、CDw52(Campath抗原)、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR；2)组织相容性抗原如MHC I或II类、Lewis Y抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb；3)整合素如VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6和LFA-1；4)粘附分子如Mac-1和p150,95；5)选择素如L-选择素、P-选择素和E-选择素及其反受体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2和LFA-3；6)白介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15；7)白介素受体如IL-1R、IL-2R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R和IL-15R；8)趋化因子如PF4、RANTES、MIP1.α、MCP1、NAP-2、Grou、Grog和IL-8；9)生长因子如TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、PTHrP、EGF家族、FGF、PDGF家族、内皮素和胃泌素释放肽(GRP)；10)生长因子受体如TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、FGFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R、GCSF-R及其他造血受体；11)干扰素受体如IFN.α.R、IFN.β.R和IFN.γ.R；12)Ig及其受体如IgE、FceRI和FCeRII；13)肿瘤抗原如her2-neu、粘蛋白、CEA和内皮唾液酸蛋白；14)过敏原如屋尘螨抗原、lol p1(草)抗原和漆酚；15)病毒蛋白如CMV糖蛋白B，H和gCIII、HIV-1包膜糖蛋白、RSV包膜糖蛋白、HSV包膜糖蛋白、EBV包膜糖蛋白、VZV包膜糖蛋白、HPV包膜糖蛋白、肝炎家族表面抗原；16)毒素如假单胞菌内毒素和骨桥蛋白/尿桥蛋白、蛇毒和蜂毒；17)血液因子如补体C3b、补体C5a、补体C5b-9、Rh因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘相关生长抑制剂；18)酶如胆固醇酯转移蛋白、膜结合基质金属蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)和19)杂项抗原包括神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、LMP1、LMP2、嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、PANCA、Amadori蛋白、IV型胶原、糖化脂质、γ-干扰素、A7、P-糖蛋白和Fas(AFO-1)以及氧化型-LDL。
在某些实施方式中，目标蛋白可以是与抗原结合的抗体或其片段(抗原的非限制性例子如上文所示)。抗体或其片段可以是多克隆的、单克隆的动物源(例如鼠源、家兔、骆驼)、人源(例如全人源)、嵌合的、人源化、可变区、CDR、ScFv、双特异性的、双价抗体或具有抗原结合能力的其他形式的抗体。
可以在纳米结构形成过程中或之后引入有效载荷。例如，当通过硅烷化过程形成纳米结构时，可以将有效载荷(例如荧光化合物)引入硅烷化系统中，以使得在硅烷化过程中将所述有效载荷引入纳米结构中。对于另一个例子，可以在例如溶液、分散液、混悬液、乳剂等中将有效载荷与易于形成的纳米结构混合以便将所述有效载荷掺入纳米结构的多孔性部分中或者使得所述有效载荷与纳米结构上的官能团偶联。
在某些实施方式中，至少一个有效载荷可以与所述多孔性结构结合。例如，仅一组有效载荷与所述多孔性结构结合。对于另一个例子，第一个有效载荷和第二个有效载荷与所述多孔性结构结合。尽管有效载荷均选自下组可检测剂、靶向部分、结合伴侣、生物活性剂、药物、治疗剂、放射剂、化学剂、小分子药物、生物药(例如肽、蛋白、抗体、抗原、核酸、适体等)；但是第一有效载荷与第二有效载荷不同。例如，所述第一有效载荷是靶向剂，其使得所述纳米结构特异性结合至或与靶点(例如癌细胞)结合，以及所述第二有效载荷是可检测剂(用于诊断)或治疗剂(用于治疗)。
在某些实施方式中，第一有效载荷与多孔性结构在所述结构的一个区域结合并且第二有效载荷与多孔性结构在所述结构的另一个区域结合，以使得所述纳米结构可以是相对于纳米结构中有效载荷的分布是具有方向的或定向的。这种位点选择性修饰可以通过将所述多孔性结构沉积于基材上，然后使用保护性聚合物层(如聚(3-己基-噻吩)(P3HT)和聚(甲基丙烯酸甲酯))部分涂覆所述基材来实现，在位点选择性修饰完成后可以使用某些溶剂如氯仿或吡啶将所述护性聚合物层溶解。(Liu H.等，nano letters,2004,vol 4.,2397-2401)。第二修饰可以在保护层被去除并且经过修饰的纳米结构被暴露后使用不同的有效载荷进行进一步的修饰来实现。而且，可以将所述纳米结构沉积于与可裂解分子键合的基材上，例如光可裂解分子如光可裂解生物素胺响应标记试剂(www.ambergen.com)，然后在位点选择性修饰后可以释放所述纳米结构。此外，在与可裂解接头分子结合的基材上，所述纳米结构能够在第一位点选择性修饰(SSM1)后被释放。SSM1可以包括在下一位点选择性修饰步骤中用于将SSM1修饰的区域与基材连接的官能团和用于信号产生、药物或其他功能性目的的有效载荷。在SSM2中可以重复该过程。通过控制保护性聚合物层的厚度，可以实现第3个、第4个或更多的位点选择性修饰步骤以使得所述纳米结构具有多个不同的有效载荷区域。
由所述流程制备的产品
本申请的另一个方面涉及由本申请提供的任意方法制备的纳米结构。使用本申请所描述的方法和/或本领域公知的常规方法，本申请制备的所述纳米结构可以被任选地分离、纯化、干燥或与一种或多种有效载荷结合。本申请制备的纳米结构可以进一步针对3-D结构进行表征，如所述3-D结构的密度、孔隙度、表面积、厚度等。任选地，有效载荷也可以以如有效载荷的量或有效载荷的可检测信号表征。
使用方法
在某些实施方式中，本申请提供的纳米结构可以用于制备治疗或诊断组合物。
在某些实施方式中，所述纳米结构可以用于递送一种或多种治疗剂。例如，所述纳米结构可以用于提供治疗剂所需的递送(例如靶向递送)和/或所需的释放(例如缓释和/或控释)。所述纳米结构可以通过适宜的途径(例如静脉、腹腔、肌内、皮内、皮下、透皮、皮下、颅内、鼻内、粘膜、肛内、阴道、口服、舌下、口腔或鼻)递送至主体。适于治疗用途的纳米结构可以包括一种或多种治疗剂，其作为结合的有效载荷或作为偶联的分子(例如前药)。任选地，针对靶向递送，所述纳米结构可以进一步包括靶向部分。
所述纳米结构还可以用于诊断用途的样品(例如体内或离体)。例如，可以在适宜条件下将所述纳米结构用于或与样品接触，所述条件允许与在样品中疑似存在的其靶分子(例如针对某病情的生物标记物、标记物抗原、病原体和/或病毒基因序列)发生预期的反应(例如杂交、扩增、亲和结合、染色等)。可以检测或测定所述反应的存在情况和/或程度，以提供存在或不存在所述靶分子和/或这种靶分子的量(例如浓度)的信息。在这种诊断用途中使用的所述纳米结构可以包括能够与目标靶分子反应的试剂。这种试剂可以是结合伴侣如抗体、抗原、适体、核酸、探针、化学或其他适宜的试剂。这种试剂可以作为有效载荷与所述纳米结构结合和/或与所述纳米结构偶联。任选地，所述纳米结构可以进一步包括可检测标记，其使得可以对反应进行检测。
在某些实施方式中，本申请提供的纳米结构可以用于制备用于在定性或定量检测中使用的试剂。例如，可以将所述纳米结构用于与待分析物接触并且对待分析物进行鉴定和/或定量。所述待分析物可以是能够被检测的任意物质如化学制品、爆炸物(例如TNT)、药物(例如可卡因、海洛因、大麻等)、有害物质、金属离子(例如重金属离子)、污染物、有机化合物、乙醇、合成代谢类固醇、质子、一氧化氮、血糖和代谢产物等。所述待分析物可以是任意适宜的样品形式例如生物样本(例如尿、汗液、呼吸、头发、唾液和血液)、环境样本(例如河水、土壤和空气)或实验室样本(例如溶于实验室的缓冲液中)。适于这种分析用途的所述纳米结构可以包含可检测剂(例如作为有效载荷或作为偶联分子)，其使得所述待分析物被鉴定和/或定量，并且这种可检测剂可以由本领域技术人员根据针对所述待分析物公知的检测方法适当的选择。
在某些实施方式中，本申请提供的纳米结构可以用于制备用于在分子成像中使用的试剂。例如，本申请提供的纳米结构可以在体内或体外通过适宜的途径(例如静脉、动脉、口服、皮肤应用、皮下、肌内、腹腔)给予主体(例如哺乳动物、人或其他动物)，待所述主体产生图像后使用适宜的装置检测如X-射线装置、MRI装置、CT装置，或者用于光学成像、光学相干断层扫描、计算机断层扫描或正电子发射断层扫描的装置。可以对所产生的图像进行进一步分析以提供所给予的纳米结构在主体中或者在所述主体的目标组织、器官或腔室中的分布情况。用于分子成像的纳米结构可以携带有效载荷或与其结合，所述有效载荷包括荧光分子、生物发光分子、放射性同位素和/或其他适于成像的试剂或造影剂(关于分子成像的综述可以参见Weissleder,R等，Radiology,219:316-333(2001))。
在某些实施方式中，本申请提供的纳米结构可以用于制备用于分离、纯化或富集的试剂。例如，所述纳米结构可以用于与混合物接触，所述混合物含有需要分离/纯化/富集的组分。所述目标组分可以是例如细胞(例如肿瘤细胞、表达特异性标记物抗原的细胞)、蛋白(例如抗体、抗体片段、抗原等)、核酸和化学化合物等。所述混合物可以是或来源于例如生物样本(例如血液、血清、血浆、尿液、组织、细胞提取物、细胞裂解物)、合成的化学产品、草药或植物提取物等。所述纳米结构包括与目标组分具有亲和性的一种或多种捕获剂。例如，所述纳米结构可以携带或与例如抗原、抗体、互补的核酸分子、适体以及任意其他适宜的结合伴侣偶联。可以使用任意适宜的分离方法将具有捕获于其上的目标组分的纳米结构与混合物的其余部分分离，例如通过过滤、离心、色谱(例如体积排阻色谱)、应用磁场(例如针对包括磁性纳米粒子的纳米结构)或应用电场。任选地，由所述纳米结构捕获目标组分是可逆的，以使得在分离/纯化/富集后所述组分可以从纳米结构释放。
在某些实施方式中，本申请提供的纳米结构可以用于制备半导体。这种半导体可以用于光发射装置、光电器件、荧光标记、电极、光伏电池、光学传感器和生物传感器等。这些应用中的一些在Schmid,G等在2011由John Wiley&Sons出版的Nanoparticles:FromTheory to Application中进行了详细描述。
递送进入生物样品
本发明的另一个方面涉及本申请所述的多孔性纳米结构在递送有效载荷至生物样品上或进入生物样品中的用途。
在某些实施方式中，本申请提供了递送至少一种有效载荷至或进入生物样品的方法，所述方法包括将生物样品与本申请提供的携带有效载荷的多孔性纳米结构接触。
在本申请中的生物样品包括来自生物有机体的细胞、细胞簇、组织、器官、生物体。所述生物样品可以是正常的、健康的样品或异常的、有病的样品(例如癌症或肿瘤)。
生物有机体包括例如微生物(如细菌)、真菌、植物和动物(例如人)。
来自动物生物有机体(例如人)的器官包括例如循环系统的器官(例如心脏、血液和血管)，消化器官(例如唾液腺、食道、胃、肝、胆、胰、小肠、直肠和肛门)，内分泌器官(例如内分泌腺如下丘脑、垂体或垂体腺、松果体或松果腺、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺、即肾上腺(adrenal gland))，外皮器官(例如皮肤、毛发和指甲)，淋巴器官(例如淋巴结和血管、扁桃体、腺样体、胸腺和脾脏)，肌肉器官(例如肌肉)，神经器官(例如脑、脊髓、周围神经和神经)，生殖器官(例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺和阴茎)，呼吸器官(例如咽、喉、气管、支气管、肺和膈肌)，骨骼器官(例如骨骼、软骨、韧带和肌腱)，泌尿系统(例如肾，输尿管，膀胱和尿道)。器官可以是正常的或健康的，以及或者，异常的或不健康的(例如癌症)。
来自植物生物有机体的器官包括例如根、茎、叶、花、种子和果实。
来自生物样品(例如动物)的组织包括结缔组织、肌肉组织、神经组织和上皮组织。组织可以是正常的或健康的，以及或者，异常的或不健康的(例如癌变的)。来自生物样品(例如植物)的组织包括表皮、脉管组织和基本组织。
细胞可以是原核的或真核的。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如哺乳动物细胞或人源细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞(例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如网织红细胞)、肥大细胞、血小板和巨核细胞以及树突状细胞)；来自内分泌系统或器官的细胞(例如甲状腺细胞(例如甲状腺上皮细胞、副滤泡细胞)、甲状旁腺细胞(例如甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺细胞(例如嗜铬细胞)和松果体细胞(例如松果腺细胞))；来自神经系统或器官的细胞(例如成神经胶质细胞(例如星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、贝彻细胞和垂体细胞(例如促性腺激素细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺素细胞、促生长激素细胞和促乳激素细胞))；来自于呼吸系统或器官的细胞(例如肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、肺泡巨噬细胞)；来自循环系统或器官的细胞(例如心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞(例如胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏细胞(例如肝细胞和枯否细胞))；来自外皮系统或器官的细胞(例如骨细胞(例如成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、牙齿细胞(例如成牙骨质细胞和成釉质细胞)、软骨细胞(例如成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如毛发细胞、角质形成细胞和黑素细胞(痣细胞))、肌肉细胞(例如肌细胞)、脂肪细胞、成纤维细胞和肌腱细胞)；来自泌尿系统或器官的细胞(例如足状突细胞、肾小球旁细胞、球内系膜细胞、球外系膜细胞、肾近曲小管刷状缘细胞和致密斑细胞)以及来自生殖系统或器官的细胞(例如精子、睾丸支持细胞、间质细胞、卵子、卵母细胞)。细胞可以是正常的、健康的细胞；或者病变的或不健康的细胞(例如癌细胞)。
细胞还包括哺乳动物干细胞，所述干细胞包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期同时维持未分化的状态并分化成特定细胞型的细胞。干细胞可以是万能干细胞、多能干细胞、全能干细胞、寡能干细胞和单能干细胞(参见Hans R.(2007)."The Potential of Stem Cells:An Inventory"inNikolaus Knoepffler,Dagmar Schipanski,and Stefan LorenzSorgner.Humanbiotechnology as Social Challenge.Ashgate Publishing,Ltd.pp.28)，其中的任意一个均可以由体细胞诱导获得。干细胞还可以包括癌干细胞。
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构能够用于在体外递送一个或多个有效载荷至生物样品(如细胞培养物或组织培养物)。例如，能够将与有效载荷结合的所述多孔性纳米结构在体外引入生物样品，并且能够在允许将所述有效载荷递送至所述生物样品的条件下培养所述样品。
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构能够用于在体内递送一个或多个有效载荷至生物样品(如在生物体中的细胞、组织、器官)。例如，可以通过适宜的途径如胃肠外(例如皮下、腹腔内、静脉内包括静脉输注、肌内或皮内注射)或非胃肠外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径将与有效载荷结合的所述多孔性纳米结构给予生物体。可以将所述多孔性纳米结构制成适宜的剂型以允许通过给药途径递送，例如用于胃肠外途径递送的注射剂，用于口服递送的固体剂型、溶液、乳剂和用于局部递送的洗剂或乳膏剂。所述多孔性纳米结构可以在体内全身或局部给予生物样品。
可以通过任意适宜的方法对所述有效载荷的递送进行检测。例如，所述多孔性纳米结构或所述有效载荷可以包括可检测标记(例如荧光分子)，所述可检测标记允许对目标递送的生物样品上或内部的所述多孔性纳米结构或所述有效载荷进行直接观察或检测(例如荧光成像)。再例如，所述有效载荷可以包括药剂(pharmaceutical agent)，可以测定有效载荷在所述生物样品上的生物效应、所述药剂在所述生物样品中的浓度和/或所述药剂的代谢物或产物，从而间接地表征所述有效载荷的递送。
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构具有磁性性质以便于使用磁性相互作用增强所述递送。此类纳米结构可以包括一个SIPO纳米粒子或SIPO纳米粒子簇作为核纳米粒子。当置于强磁场例如来自高场和/或高梯度磁体的磁场时，所述磁性纳米结构能够被吸引至或磁性导向至靶向位点。在递送纳米粒子中使用磁场的方法是本领域熟知的，参见例如McBain,S.C.等，Int,J.Nanomedicine,3(2):169-180(2008)；Polyak,B.等，Proc NatlAcad Sci U.S.A.104(2):698-703(2008)；Urs O.Hafeli等，Nanoparticulates as DrugCarriers，V.P.Torchilin编辑，第18章，Imperial College Press出版,2006；Barnett,B.P.等，Nat.Med.,13,986–991(2007)；Namiki,Y.等，Nat.Nanotechnol.2009,4,598–606。
利用通过磁场导向所述磁性多孔性纳米结构，可以将与所述纳米结构结合的一个或多个有效载荷导向或递送至所述靶向位点，在此处所述有效载荷可以显示出目标生物活性。所述有效载荷的这种靶向递送能够导致在靶向位点的有效载荷增加。在某些实施方式中，在存在磁场的条件下，使用磁性多孔性纳米结构的有效载荷的递送可以比使用非磁性多孔性纳米结构的或在不存在磁场条件下的递送至少高5％(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或者甚至更高)。
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构的尺寸被定制为1nm至1000nm以优化其递送功能。例如，所述多孔性纳米结构的尺寸为1nm至10nm、1nm至50nm、1nm至100nm、1nm至200nm、1nm至300nm、1nm至400nm、1nm至500nm、100nm至600nm、100nm至700nm、100nm至800nm、100nm至900nm或者100nm至1000nm。
在某些实施方式中，对所述多孔性纳米结构的电荷进行调整以优化其递送功能。可以根据所述有效载荷的要求或偏好，将所述多孔性纳米结构调整为带负电的、带正电的或中性的。例如，当递送含有带负电的磷酸基团的DNA时，带正电的多孔性纳米结构可能是理想的。可以通过在多孔性纳米结构上进行表面修饰调整所述多孔性纳米结构上的电荷，例如引入带正电的基团如胺基，带负电的基团如羧基和中性基团如甲基(参见例如Chen L.等，Nanotechnology,22(10):105708(2011))。
在某些实施方式中，所述多孔性纳米结构是生物相容性的。术语“生物相容性的”指对生物样品或生物有机体不具有毒性，例如对所述生物样品是生理学上可接受的并且不产生不希望的毒理学效应。
在某些实施方式中，所述有效载荷通过静电原理、生物学或酶促相互作用、或者通过光、pH、热或电敏感性键释放进入生物样品。
本发明的另一个方面涉及携带有效载荷的多孔性纳米结构在递送有效载荷至或穿过生物样品的生物屏障中的用途。
在本申请中使用的术语“生物屏障”指将环境分隔成不同空间区域或隔室的生物层，该分隔能够调节(例如限定、限制、增强或不发挥作用)物质或材料从一个隔室/区域通过、渗透或转位至另一个。本申请所提及的不同空间区域或隔室可以具有相同或不同的化学或生物环境。本申请所提及的生物层包括但不限于生物膜，细胞层，生物结构，主体、有机体、器官或体腔的内表面，主体、有机体、器官或体腔的外表面，其任意组合或多个上述生物层。
生物膜的示例包括脂质双层结构、真核细胞膜、原核细胞膜、细胞内膜(例如核或细胞器膜，如高尔基体、粗面和光面内质网(ER)、核糖体、液泡、囊泡、脂质体、线粒体、溶酶体、核、叶绿体、质体、过氧化物酶体或微体的膜或包膜)。细胞器包膜可以具有两层以上的膜。
本申请所提及的脂质双层是脂质类分子的双层，所述脂质类分子包括但不限于磷脂和胆固醇。在特定的实施方式中，双层的脂质是由极性头基团和非极性脂肪酸尾组成的两亲性分子。所述双层由两层脂质组成，由于疏水性作用该两层脂质被排列成其烃基尾彼此相对，从而形成油状核，而其带电荷的头部朝向膜两侧的水性溶液。在另一个特定的实施方式中，所述脂质双层可以含有一个或多个嵌入的蛋白和/或糖分子。
细胞层的一层细胞的示例包括真核细胞的衬壁(例如上皮、固有层和平滑肌或粘膜肌层(在胃肠道中))、原核细胞的衬壁(例如表面层或S层，其指由相同的蛋白或糖蛋白组成的二维结构的单分子层。特别地，所述S-层指常见于细菌和古细菌中的细胞包膜的一部分)、生物膜(包封在自形成的聚合物基质中并粘附至活体或惰性表面的结构化的微生物群落)、植物细胞层(例如表皮)。
生物结构的示例包括通过紧密或封闭连接密封的结构，所述结构提供了来自敌对外部的毒素、细菌和病毒进入的屏障，例如血乳屏障和血脑屏障(BBB)。特别地，BBB由不可渗透类型的内皮组成，其提供了通过紧密连接相邻的邻近内皮细胞形成的物理屏障和由外排转运体组成的转运屏障。BBB对例如毒素以及用于神经疾病治疗的药物是一个强大的屏障。
主体、有机体、器官或体腔的内表面的示例包括颊粘膜、食道粘膜、胃粘膜、肠粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、支气管粘膜、子宫粘膜和子宫内膜(子宫的粘膜、花粉粒壁的内层和孢子的内壁层)，或其组合或多个上述内表面。
主体、有机体、器官或体腔的外表面的示例包括毛细血管(例如心脏组织中的毛细血管)、与皮肤连续的粘膜(例如在鼻孔、唇、耳、生殖器区域和肛门的)、器官的外表面(例如肝、肺、胃、脑、肾、心脏、耳、眼、鼻、口、舌、结肠、胰腺、胆囊、十二指肠、直肠)、皮肤、角质层(例如表皮细胞或角化细胞的死层或覆盖动物毛干的重叠细胞的浅层，多种无脊椎动物表皮外的多层结构，植物表皮或者角质层/或胶膜的聚合物)、花粉粒臂的外层或孢子的外壁层，或其组合或多个上述外表面。
本发明的另一个方面涉及携带有效载荷的多孔性纳米结构在递送有效载荷至主体中的靶向位点的用途。在某些实施方式中，将所述携带有效载荷的纳米结构给予主体，并且在存在施加磁场的条件下被吸引至靶向位点。
术语“主体”包括任意活的生物体，例如动物(例如人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、牛、绵羊等)和植物(例如水稻、小麦、大豆、玉米、谷物、水果、烟草、花等)。
可以通过上文所述的适宜途径将所述携带有效载荷的多孔性纳米结构给予主体。所述纳米结构可以全身性给予(例如静脉注射)或局部给予(例如局部应用或皮下注射)。
在某些实施方式中，所述靶向位点是位于距身体表面适宜深度的位置，以使得能够实现磁性靶向。
至少一个有效载荷能够与所述多孔性结构结合。例如，仅有一组均质的有效载荷与所述多孔性结构结合。再例如，所述第一有效载荷和第二有效载荷与所述多孔性结构结合。尽管这两种有效载荷均选自下组：可检测剂、靶向部分、结合伴侣、生物活性剂、药物、治疗剂、放射剂、化疗剂、小分子药物、生物药(例如肽、蛋白、抗体、抗原、核酸、适体等)；但是所述第一有效载荷与所述第二有效载荷不同。例如，所述第一有效载荷是靶向剂，其使得所述纳米结构特异性地结合至或与靶向位点(例如癌细胞)结合，并且所述第二有效载荷是可检测剂(用于诊断)或治疗剂(用于治疗)。
多个有效载荷能够分布或定向在所述纳米结构的不同区域。例如，所述第一有效载荷在所述结构的一个区域中与所述多孔性结构结合，并且所述第二有效载荷在所述结构的另一个区域中与所述多孔性结构结合，以使得所述纳米结构对于在所述纳米结构中有效载荷的分布而言能够是有向的或定向的。
再例如，所述第一有效载荷是针对生物样品或生物屏障的靶向部分或结合伴侣，并且所述第二有效载荷(和第三有效载荷等)是可检测剂、生物活性剂、药物、治疗剂、放射剂、化学剂、小分子药物、生物药(例如肽、蛋白、抗体、抗原、核酸、适体等)及其组合。所得到的纳米结构能够靶向所述第一有效载荷特异性结合的生物样品(或生物屏障)，并将所述第二有效载荷特异性地递送至或进入或通过所述生物屏障。因此，可以检测所述生物样品的存在情况和/或改善所述样品的状态(例如由疾病状态变为健康状态，由未分化变为分化或在生物样品中导致一些生物事件(例如增殖、凋亡、分化和去分化))。
本发明的另一个方面涉及含有携带有效载荷的纳米结构和生物样品的组合物。在某些实施方式中，所述携带有效载荷的纳米结构已被递送进入或至所述生物样品上。在某些实施方式中，所述有效载荷选自下组：靶向部分、结合伴侣、可检测剂、生物活性剂、药物、治疗剂、放射剂、化疗剂、小分子药物、生物药及其组合。在某些实施方式中，所述生物样品是细胞、组织、器官或动物。
实施例
实施例1具有低密度硅质结构的金和半导体量子点纳米粒子的制备
低密度硅质结构是用于制备生物相容性纳米粒子的通用的和灵活的平台。例如，为了将金纳米粒子掺入硅质结构中，可以使用在水溶液或有机溶液中合成的Au纳米粒子。简言之，在13k rpm下离心15min将Au沉淀于样品瓶底部，然后加入硅烷分子如氨基丙基三甲氧基硅烷和四甲基氢氧化胺(TMAOH)。使用更高级的醇如丁醇或丙醇调节反应溶剂。然后在持续通入空气气泡条件下将样品超声几小时，随后加入PEG-硅烷、巯基丙基三甲氧基硅烷和氨基丙基三甲氧基硅烷，将样品再超声2-3小时。随后，加入氯代三甲基硅烷、甲醇和TMAOH或其他仅具有一个与硅原子连接的烷氧基的硅烷分子的混合物与已经生长的硅质结构表面上存在的表面硅氧基反应。经过附加的超声和老化后，通过离心过滤、离心、透析或任意其他溶液交换方法收集具有高多孔性硅质结构的稳定的纳米粒子并将其贮存在生理缓冲溶液中。在TEM下观察所得到的Au纳米结构，示例性的TEM图像见图2。所述纳米粒子的核尺寸为约20nm且流体力学尺寸为约60nm。硅质涂层在TEM下不是明显可见的。
实施例2具有低密度硅质结构的半导体量子点纳米粒子的制备
作为另一个例子，还可以将单个纳米晶或纳米晶簇形式的半导体量子点掺入高多孔性/低密度的硅质结构中。例如，通过加入甲醇然后离心可以将在有机溶剂如氯仿、甲苯或己烷中的CdSe/ZnS纳米粒子沉淀。然后将纳米晶团再分散于氨基丙基三甲氧基硅烷或巯基丙基三甲氧基硅烷中。随后，加入四甲基氢氧化铵。然后使用更高级的醇如丁醇或丙醇调整反应溶剂。在将样品超声1-4小时并通入空气气泡后，随后加入少量的氨基丙基三甲氧基硅烷、巯基丙基三甲氧基硅烷、聚环氧乙烷硅烷和水，然后将样品再超声1至4小时。然后，加入氯代三甲基硅烷、甲醇和TMAOH或其他仅具有一个与硅原子连接的烷氧基的硅烷分子的混合物。然后将该样品再超声1-4小时，随后在缓慢振动或振荡下老化过夜。通过离心过滤、离心、透析或任意其他溶液交换方法将所得到的具有低密度/高多孔性硅质结构的纳米粒子转移至生理缓冲溶液中。在TEM下观察所得到的CdSe/ZnS纳米结构的示例性TEM图像见图3。所述纳米粒子的核尺寸为约10nm且流体力学尺寸为约200nm。硅质涂层在TEM下不是明显可见的。
实施例3低密度磁性粒子的制备和表征
磁性多孔性纳米结构的制备：
制备通过将多个小粒子聚集然后将其涂覆形成的磁性粒子。加入不利于产生分散的纳米粒子的溶剂如丁醇或异丙醇以发生聚集，随后在持续通入空气气泡条件下加入硅烷化试剂以形成多孔性纳米结构。在TEM下观察制备的磁性多孔性纳米结构(图5)。如图5所示，各个大核纳米粒子包括较小的纳米粒子簇，并且涂层在TEM下基本上是不可见的。
涂层密度的表征：
为计算涂层的密度，对涂层的干重和体积进行表征。
由于磁性粒子具有较高的磁性应答，能够使用磁铁直接将其捕获。这能够产生用于检测物质质量的干粒子。如下所示对涂覆前后粒子的干重进行定量。吸取200ul涂覆粒子的溶液至已事先称重的离心管中。将经涂覆的磁性纳米粒子捕获至管壁的一侧，并除去上清液。使用水洗涤所捕获的粒子。最后，在通风橱内干燥开口的管中吸附至侧壁的粒子。测定包括干燥的经涂覆粒子的管的质量。通过从内部具有干燥的经涂覆粒子的管质量中减去管的质量计算干燥的经涂覆粒子的质量。为测定涂覆前粒子的质量，将与在经涂覆的纳米粒子中相同量的磁性材料对应的未经涂覆的粒子，假定涂覆过程的产率为80％，捕获于管的侧壁，并干燥。通过从内部具有干燥的未经涂覆粒子的管质量中减去管的质量测定涂覆前粒子的干质量。涂层的质量等于干燥的经涂覆粒子的质量减去涂覆前粒子的干质量。
表1
平均核质量(n＝3) 0.67mg
平均涂层质量(n＝3) 0.06mg
使用上述质量下大粒子的数量乘以各个大纳米粒子涂层的体积计算所述涂层的总体积。将粒子混悬于水性溶液中，根据4/3×π(R3 具有涂层-R3 核)计算各个大粒子涂层的体积，其中使用动态光散射(DLS)技术测定各个大纳米粒子的R具有涂层，使用TEM直接成像和测定较大核粒子的R核(参见图5)。
表2
通过使用小纳米粒子的总数除以在各个大纳米粒子中小纳米粒子的数量计算在所述质量中较大粒子的数量。通过使用磁性材料的总质量除以各个小纳米粒子的质量(即使用较小纳米粒子的尺寸和密度计算)估计小纳米粒子的总数。从TEM显微照片中计数各个大粒子中小纳米粒子的数量。因此，可以根据大纳米粒子涂层的体积乘以大纳米粒子的总数计算涂层的总体积。
表3
使用涂层的质量除以涂层的总体积计算涂层的密度，即0.06mg/0.1875×10-6m3＝0.32mg/cm3。
本申请制备的低密度硅质结构的密度仅为0.32mg/cm3，其显著低于一些已报道的二氧化硅涂层的密度，例如Vincent等(Vincent,A等，J.Phys.Chem.C 2007,111,8291-8298)已报道的那些具有的密度为1-2g/cc，其比本申请提供的硅质结构致密104倍。
使用BET法表征孔隙度：
将涂覆后的大磁性纳米粒子捕获至管的侧壁并干燥。制备干质量分别为65mg(样品1)和45mg(样品2)的两份样品用于BET检测。
针对经涂覆的纳米粒子的干物质使用BET法测定表面孔径。结果如下表中所示。
表4：样品1的表征
表5：样品2的表征
使用多孔性纳米结构的干物质测定多孔性纳米结构的表面积和孔体积。如果使用混悬于水溶液中的多孔性纳米结构样品进行检测，则预计孔体积和表面积远大于使用干物质进行的检测，因为已发现涂层的密度比现有技术中已报道的那些低至少104。
基于干粉样品测定的密度不能反映3-D结构的真实密度，因为所述3-D结构的密度极低，在干燥过程中其架构容易崩塌，因此与当3-D结构完全伸展时例如就像当多孔性纳米结构在缓冲溶液中完全伸展时相比在孔隙度检测中提供了小得更多的数值。
实施例4多孔性纳米结构向HeLa细胞的递送
使用非共价方法，将实施例3中制备的磁性多孔性纳米结构与alexa-荧光团488-DNA混合。孵育2小时后，将具有DNA掺入的所述纳米结构磁性纯化，并且在细胞培养基内重新分散。然后，将所述纯化的纳米结构-DNA加入HeLa细胞培养物的培养基中。将细胞培养过夜后，除去细胞培养基(上清液)，然后使用PBS洗涤细胞。随后，将PBS加入细胞培养孔中，使用荧光显微镜获取图像(图6(a)和(b))。
接下来，对在存在和不存在磁场的条件下对DNA的递送进行比较。如上文所述制备和纯化所述纳米结构-DNA。制备两份HeLa细胞培养物，将等量的所述纳米结构-DNA与各HeLa细胞培养物的细胞培养基混合。将一份HeLa细胞培养物放入无磁铁的培养箱中。将另一份HeLa细胞培养物放入培养箱，同时将永磁铁在细胞培养孔的下方放置4小时，然后取出，并将所述细胞培养板继续放置在培养箱内。在第二天，除去这两个样品的细胞培养基上清，洗涤细胞。然后将PBS加入这两个细胞培养孔中，将细胞成像并计数。图7(a)显示了在不存在磁铁的条件下孵育的样品的图像，图7(b)显示了在存在磁铁的条件下孵育的样品的图像。如图7(a)和7(b)所示，与无磁铁孵育的样品相比，有磁铁孵育的样品中荧光信号要强的多。在显微镜下选择各样品的典型视野，并计数视野中的细胞总数，计数所述细胞内的纳米结构总数，并且计算每个细胞中纳米结构的平均数量。结果汇总于图7(c)，其表明磁铁的放置极大地增加了所述磁性纳米结构递送进入所述细胞。
实施例5在小鼠模型中多孔性纳米结构向肿瘤的体内递送
根据实施例1中所述的方法制备多孔性纳米结构。将巯基和氨基基团结合到所述纳米结构的表面上。将NHS(N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺)修饰的荧光团Cy5.5与所述纳米结构表面上的氨基偶联。通过SMCC接头(磺酸基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)将小环[Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys](RGD)肽与所述纳米结构表面上的巯基偶联。所述RGD肽特异性靶向肿瘤血管生成标记物αvβ3，并且导致肿瘤血管的凋亡并促进肿瘤退化。使用TEM进一步表征所得到的纳米结构，并且根据实施例3中所述的方法表征所述密度。
在SCID小鼠的背部植入背皮褶室(参见例如Lehr,H.A.等，Am JPathol.1993October；143(4):1055–1062)，并且将EGFP转染的人肿瘤细胞直接在皮褶顶端孵育。生长10天后，将负载RGD肽的所述多孔性磁性纳米结构在小鼠尾静脉中静脉注射，并且在活体显微镜下检查所述小鼠。获得图像以显示所述纳米结构的Cy5.5荧光和所述转染肿瘤的EGFP荧光，其中所述纳米结构的荧光勾画出了肿瘤中的血管结构。将磁棒(NdFeBN52)置于所述背皮褶室的下方以施加磁力。将Ni微孔筛置于所述小室的顶端以增强顶端的磁场。获得图像，其显示所述纳米结构的Cy5.5荧光被集中在Ni微孔筛下，此处磁场较强。
在具有磁性靶向的治疗组中和不具有磁性靶向的对照组中，测定15天肿瘤的退化情况。每天获取肿瘤区域的图像，并且根据表示肿瘤细胞的EGFP荧光的强度计算肿瘤退化率。结果显示与不存在磁性靶向的相比，存在磁性靶向的条件下肿瘤的退化明显更高。

Claims (27)

1.一种组合物，所述组合物包含可携带有效载荷的纳米结构和生物样品，其中所述可携带有效载荷的纳米结构包含嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子，所述低密度多孔性3-D结构具有<1.0g/cc的密度，且通过有机硅烷的组装或交联使其沉积或覆盖所述核纳米粒子表面形成。
2.可携带有效载荷的纳米结构在制备用于将至少一种试剂递送至或进入生物样品的药物中的用途，其中所述药物与所述生物样品接触，其中所述可携带有效载荷的纳米结构包含嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子，所述低密度多孔性3-D结构具有<1.0g/cc的密度，且通过有机硅烷的组装或交联使其沉积或覆盖所述核纳米粒子表面形成。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述纳米结构具有磁性性质以便于通过磁性相互作用增强所述递送。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述可携带有效载荷的纳米结构包括第一有效载荷。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述第一有效载荷选自下组：靶向部分、结合伴侣、可检测剂、药物、及其任意组合。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物为治疗剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗剂为生物活性剂、放射剂、化疗剂或小分子药物。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述可携带有效载荷的纳米结构还包括第二有效载荷。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述第一有效载荷和所述第二有效载荷随机或定向分布在所述纳米结构中。
10.根据权利要求4所述的用途，其中所述第一有效载荷选自下组：靶向部分和结合伴侣。
11.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述第二有效载荷选自下组：可检测剂、药物、及其任意组合。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述药物为治疗剂。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述治疗剂为生物活性剂、放射剂、化疗剂或小分子药物。
14.根据权利要求2所述的用途，其中所述纳米结构的表面被促进所述递送功能的分子实体所调制，其中所述实体改善特异性的靶向功能、降低非特异性结合或调节在表面上有效载荷的密度。
15.根据权利要求2所述的用途，其中所述纳米结构的尺寸被定制为1nm至1000nm以优化其递送功能。
16.根据权利要求2所述的用途，其中调整所述纳米结构的电荷以优化其递送功能。
17.根据权利要求2所述的用途，其中所述纳米结构是生物相容性的并且能够由生物相容性组成物料形成。
18.根据权利要求2所述的用途，其中所述纳米结构是生物可降解的。
19.根据权利要求2所述的用途，其中所述有效载荷通过静电原理、生物学或酶促相互作用、或者通过光、pH、热或电敏感性键释放进入生物样品。
20.可携带有效载荷的纳米结构用于制备用于将至少一种试剂递送至生物屏障上或通过生物屏障的药物的用途，其中所述药物与所述生物屏障接触，其中所述可携带有效载荷的纳米结构包含嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子，所述低密度多孔性3-D结构具有<1.0g/cc的密度，且通过有机硅烷的组装或交联使其沉积或覆盖所述核纳米粒子表面形成。
21.可携带有效载荷的纳米结构用于制备用于将至少一种试剂递送至主体中的靶向位点的药物的用途，其中所述药物被施用进入主体，并且在存在外加磁场的条件下被吸引至所述靶向位点，其中所述可携带有效载荷的纳米结构包含嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子，所述低密度多孔性3-D结构具有<1.0g/cc的密度，且通过有机硅烷的组装或交联使其沉积或覆盖所述核纳米粒子表面形成。
22.一种组合物，所述组合物包含可携带有效载荷的纳米结构和生物样品，其中所述纳米结构具有有效载荷，并包含嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D结构的至少一个核纳米粒子，所述低密度多孔性3-D结构具有<1.0g/cc的密度，且通过有机硅烷的组装或交联使其沉积或覆盖所述核纳米粒子表面形成。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述可携带有效载荷的纳米结构已被递送进入所述生物样品或递送至所述生物样品上。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述有效载荷选自下组：靶向部分、结合伴侣、可检测剂、药物、及其任意组合。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述药物为治疗剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述治疗剂为生物活性剂、放射剂、化疗剂或小分子药物。
27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述生物样品是细胞、组织、器官或动物。
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