CN104383530B - 水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水貂犬瘟热‑细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途。本发明的二联活疫苗中，有效成分包括水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB‑F61以及水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3‑CL，其中所述的人工致弱的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB‑F61保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.9560。安全性试验表明，使用本发明的二联活疫苗接种水貂无任何不良反应发生；效力试验表明，单剂量接种疫苗后，可使水貂免于犬瘟热病毒、细小病毒检验用强毒的攻击，获得保护。本发明的二联活疫苗可用于同时预防水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎两种疾病，实现“一针防两病”，具有广阔的应用前景。

Description

水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种二联活疫苗及其制备方法和用途，特别涉及一种水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途，本发明属于兽医生物制品技术领域。

背景技术

犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病，其主要特征是以侵害黏膜系统为主，出现双相体温升高，伴有卡他性肺炎、胃肠炎，偶有神经症状，容易继发其他细菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高达80％。带毒动物是最危险的传染源，通过眼及鼻分泌物、唾液、尿、粪便排出病毒，主要经消化道、呼吸道传染，是水貂养殖业三大疫病之一，俗称“貂瘟”。

水貂细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属水貂细小病毒引起的急性、高度接触性传染病，是水貂养殖业三大疫病之一。不同年龄和品种的水貂均有易感性，但50～60日龄的仔貂和幼貂最为易感，幼貂的发病率为70％以上，其死亡率可达90％；成年貂的发病率为30％左右，死亡率在30％以下。患病水貂和耐过貂是该病的主要传染源，通过粪、尿、唾液排毒，经消化道和呼吸道传染给易感染的健康貂。该病全年都可发生，常呈地方性流行，一旦传入貂场，如兽医防疫卫生措施不完善，常常导致该病长期存在和周期性发生。

我国毛皮动物养殖业从上世纪50年代起步，90年代获得蓬勃发展，现金已成为畜牧业养殖的重要组成部分。目前，我国水貂存栏数可达5000万只，主要集中在山东、河北、吉林、辽宁、黑龙江等省份地区，并形成了较大的产业链。在某些地区水貂等毛皮动物养殖业甚至成为区域经济的支柱性产业。可见毛皮动物养殖业对推动“三农”经济发展，促进农村产业结构调整，增加农民就业和收入起到了重要的作用。水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎是危害水貂养殖业的两种最重要传染病，由于缺乏特效的治疗方法，目前仍以疫苗接种作为两种疫病的主要防控手段。

目前国内市场上流行的水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎疫苗多为未冻干的单疫苗，往往需要对水貂进行两次或两次以上的免疫，既提高了养殖成本，加大养殖户的工作量，又对兽群造成严重的应激反应，甚至导致各别水貂的猝死。同时湿苗还具有保存期短，不易运输和储存等缺点。因此，研制出安全、有效、保存期长、容易储存运输的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗是控制水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎的有效方法，实现“一针防两病”，是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法，本发明的二联活疫苗可用于同时预防水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎两种疾病。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗，其特征在于有效成分包括水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61以及水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3-CL，其中所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.9560。

其中，所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61为本发明发明人自行经过在猫肾细胞CRFK上多次传代后获得的弱毒疫苗株，命名为MEVB-F61，分类命名为水貂细小病毒(Mink Enteritis Virus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.9560，保藏时间为：2014年8月13日。

所述的水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3-CL为市售且已进行新兽药注册的弱毒疫苗株，该疫苗株由本单位(中国农业科学院特产研究所)分离、克隆纯化并鉴定。

在本发明中，优选的，所述的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗成品中犬瘟热病毒滴度(TCID₅₀)≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度(TCID₅₀)≥10^5.5/头份。

本发明还提供了一种制备以上所述的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将所述的水貂细小病毒弱毒株MEVB-F61接种在猫肾细胞F81或CRFK上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒滴度(TCID₅₀≥10^6.5)、纯净性检验，将检验合格的病毒液保存于-20℃；

(2)水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3-CL接种于非洲绿猴肾细胞Vero上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒滴度(TCID₅₀≥10^5.0)、纯粹性检验，将检验合格的病毒液保存于-20℃；

(3)将步骤(1)和(2)收获的病毒液混合均匀，加入冻干保护剂混合，定量分装于无菌的安瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥，即得。

在本发明所述的方法中，优选的，疫苗成品中犬瘟热病毒滴度≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度≥10^5.5/头份。

进一步的，本发明还提出了所述的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗在制备预防水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎药物中的应用。

本发明的二联苗经安全性试验结果表明，经过单剂量(犬瘟热病毒滴度≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度≥10^5.5/头份)、单剂量重复和10倍剂量接种水貂，体温、食欲、精神状态等生理指标均表现正常，无任何临床症状，剖检观察水貂主要脏器均无病变，证明水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗对水貂安全；

效力试验表明，单剂量接种疫苗后，可保护水貂免于犬瘟热病毒、细小病毒检验用强毒的攻击，有效预防水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎的发生。一次免疫接种3周、3个月后，水貂对犬瘟热病毒、细小病毒的保护率均为100％；一次免疫接种6个月后，水貂对犬瘟热病毒、细小病毒的保护率均为95％；一次免疫接种9个月后，水貂对犬瘟热病毒、细小病毒的保护率分别为85％和90％。疫苗的免疫期定为6个月。-8～-10℃的保存期定为12个月，-15～-20℃疫苗的保存期为15个月。

具体实施例

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1水貂细小病毒MEVB的传代致弱

1、水貂细小病毒MEVB的传代致弱

(1)将水貂细小病毒疫苗株MEVB以同步接毒的方法接种在猫肾细胞CRFK上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒，标记为MEVB-F1(第1代)。

(2)将第1代病毒MEVB-F1按照上面所述的方法接种、收获病毒，标记为MEVB-F2(第2代)。使用同样的方法，将病毒传代到61代，标记为MEVB-F61。

(3)当水貂细小病毒MEVB连续传代到第10代(MEVB-F10)时，对病毒进行克隆噬斑纯化。其方法为：将待纯化的病毒作10倍比稀释至10^-7，取10^-3～10^-75个稀释度病毒悬液0.1ml，与CRFK细胞同步接种于6孔培养板，并设未接毒细胞对照孔。置培养箱(35℃、5％CO₂)中培养，待细胞完全贴壁后，去掉培养液，用无血清MEM清洗2次，加入预热至37℃的低熔点营养琼脂3mL/孔，室温冷却凝固，置培养箱培养3～5d，每天观察噬斑。选择最高稀释度病毒接种孔，挑取相对独立的单个噬斑，标记为F+1代(即F11代)。挑出的带有病毒的低熔点琼脂噬斑用细胞培养液重悬，与CRFK细胞同步接种于6孔培养板，继续传代，标记为F+2代(即F12代)。从F+3代(即F13代)开始仍用细胞培养瓶进行传代，此后病毒每传10～20代进行一次噬斑克隆纯化。

2、水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61的遗传变异分析

同原始毒株MEVB(GenBank登陆号FJ592174)相比，弱毒株MEVB-F61的主要蛋白氨基酸及其基因序列发生了一定的突变，表现在于结构蛋白VP2第145位氨基酸由I突变为L；第300位氨基酸(主要抗原决定簇位点之一)由V突变为A；第411位氨基酸由A突变为E；第562位氨基酸由V突变为L。

3.水貂细小病毒致弱株MEVB-F61毒力返强试验

(1)第1代毒力返强试验使用第61代病毒MEVB-F61灌胃接种抗体阴性水貂(10ml/只，10⁷TCID₅₀/ml),同时设不接种阴性对照。

(2)将前1代接种动物第4～8天排泄物混合到一起，经PBS重悬、氯仿抽提后，取上清作为下一代毒力返强试验的接种物，灌胃接种量为10ml/只，连续接种5代。

(3)每次接种病毒后连续14天观察水貂的体温、食欲、精神状态等生理指标，并剖检观察接种水貂肠道病变情况。

(4)结果表明，连续5代动物回归试验中接种水貂体温、食欲、精神状态等生理指标均表现正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种水貂肠道无病变，说明疫苗株MEVB-F61未发生毒力返强，可用于疫苗研究。

所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.9560，保藏时间为：2014年8月13日。

实施例2水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的制备

1.优化二联苗中犬瘟热病毒和细小病毒的配比

(1)将制备的弱毒株MEVB-F61稀释为：10^4.5TCID₅₀/ml、10^5.0TCID₅₀/ml、10^5.5TCID₅₀/ml和10^6.0TCID₅₀/ml，后肢肌肉接种阴性水貂，每只1ml，同时设未接种对照组。于免疫后6个月使用细小病毒检验用强毒对各组水貂进行攻击，灌胃接种10ml，含100个LD₅₀(半数致死量)。连续14天观察攻毒水貂体温、食欲、精神状态等生理指标及死亡情况。结果显示，接种不同滴度病毒的保护率分别为：85％、90％、95％和95％。

(2)将制备的弱毒株CDV3-CL稀释为：10^3.5TCID₅₀/ml、10^4.0TCID₅₀/ml和10^4.5TCID₅₀/ml，后肢肌肉接种阴性水貂，每只1ml，同时设未接种对照组。于免疫后6个月使用犬瘟热检验用强毒对各组水貂进行攻击，后肢肌肉接种1ml，含100个LD₅₀。连续14天观察攻毒水貂体温、食欲、精神状态等生理指标及死亡情况。结果显示，接种不同滴度病毒的保护率分别为：80％、90％和90％。

(3)当水貂细小病毒弱毒株MEVB-F61的病毒滴度≥10^5.5/ml，犬瘟热病毒弱毒株CDV3-CL的病毒滴度≥10^4.0/ml时，接种水貂可产生较好的免疫效果，保护接种水貂免于强毒攻击。因此，二联苗中犬瘟热病毒、细小病毒的配比定为：犬瘟热病毒滴度≥10^4.0TCID₅₀/头份，水貂细小病毒滴度≥10^5.5TCID₅₀/头份。

2.水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的制备

(1)将保藏的水貂细小病毒弱毒株MEVB-F61同步接种在猫肾细胞F81或CRFK上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒滴度(TCID₅₀≥10^6.5)、纯净性检验。将检验合格的病毒液保存于-20℃。

(2)将保藏的水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3-CL接种于非洲绿猴肾细胞Vero上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒滴度(TCID₅₀≥10^5.0)、纯粹性检验。将检验合格的病毒液保存于-20℃。

(3)制备冻干保护剂

将明胶、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照质量百分比计，使明胶的终浓度为2～7％，水解乳蛋白的终浓度为10-25％，蔗糖终浓度为15～30％，于116℃、30min高压灭菌后得到。

(4)将收获的病毒液按照一定比例混合均匀，按照3份病毒混合液与1冻干保护剂混合的比例混合，定量分装于无菌的安瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥。

(5)疫苗成品进行病毒滴度、纯粹性检验，犬瘟热病毒滴度≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度≥10^5.5/头份。

实施例3水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的安全性试验

取检验合格的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗3批(实施例2方法制备)，后肢肌肉接种抗体阴性水貂，设单剂量(犬瘟热病毒滴度≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度≥10^5.5/头份)、单剂量重复和超剂量(10倍)免疫组，同时设不接种疫苗水貂作为对照。疫苗接种后，连续14天观察水貂的体温、食欲、精神状态等生理指标，并剖检观察接种水貂主要脏器病变情况。试验结果表明，水貂经单剂量、单剂量重复和超剂量接种后，各项生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种水貂主要脏器无病变。说明水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗对水貂安全。

实施例4水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的效力试验

1、方法

(1)取检验合格的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎活疫苗3批(实施例2方法制备)，后肢肌肉接种抗体阴性水貂，每只1ml，同时设接种CRFK细胞培养液对照组，免疫后每月采血、分离血清，用于中和抗体和血凝抑制抗体检测。

(2)试验动物接种3周、3个月、6个月和9个月后，按照实施例2所示方法进行攻毒保护试验。每天观察攻毒水貂体温、食欲、精神状态等生理指标。

2、结果

观察发现，一次免疫接种后3周、3个月水貂对犬瘟热、细小病毒的保护率均为100％，接种水貂各项生理指标均正常，无任何临床症状出现；一次免疫接种6个月后，水貂对犬瘟热病毒、细小病毒的保护率均为95％；一次免疫接种9个月后，水貂对犬瘟热病毒、细小病毒的保护率分别为85％和90％。因此，疫苗的免疫期设定为6个月。接种犬瘟热检验用强毒的对照组水貂表现出体温升高达40℃以上，呈双相热，精神沉郁、食欲减退或废绝，两眼眼眵增多、结膜炎，排稀便、粘便，甚至煤焦油样血便。接种细小病毒检验用强毒的对照组水貂表现出体温升高，剧烈腹泻，排出混有肠粘膜的水样稀便或管型便，且经检验血液中白细胞明显减少。

以上结果表明，本发明所提供的二联活疫苗可有效保护水貂免于犬瘟热病毒和细小病毒强毒的攻击，可有效预防水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎的发生。

实施例5水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的保存期测定

取检验合格的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗3批(实施例2方法制备)保存于-8～-10℃和-15～-20℃，分别于保存的第3、6、9、12、15、18和24个月取样，进行性状、真空度、剩余水分、病毒滴度检测。结果表明，3批疫苗在-8～-10℃保存12个月性状仍为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范围内，犬瘟热、细小病毒的病毒滴度(TCID₅₀)分别为：10^4.13/ml和10^5.67/ml、10^4.21/ml和10^5.77/ml、10^4.34/ml和10^5.67/ml；而保存于-15～-20℃15个月后性状为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范围内，犬瘟热、细小病毒的病毒滴度(TCID₅₀)分别为：10^4.12/ml和10^5.76/ml、10^4.19/ml和10^5.65/ml、10^4.29/ml和10^5.86/ml。高于疫苗的免疫要求(犬瘟热病毒滴度≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度≥10^5.5/头份)，因此将该疫苗在-8～-10℃的保存期定为12个月，-15～-20℃的保存期定为15个月。

Claims (5)

1.水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗，其特征在于其有效成分包括水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61以及水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3-CL，其中所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.9560。

2.如权利要求1所述的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗，其特征在于疫苗成品中犬瘟热病毒滴度TCID₅₀≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度TCID₅₀≥10^5.5/头份。

3.一种制备权利要求1所述的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将所述的水貂细小病毒弱毒株MEVB-F61接种在猫肾细胞F81或CRFK上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％时即可通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒滴度、纯净性检验，将检验合格的病毒液保存于-20℃；

(2)水貂犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV3-CL接种于非洲绿猴肾细胞Vero上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒滴度、纯粹性检验，将检验合格的病毒液保存于-20℃；

(3)将步骤(1)和(2)收获的病毒液混合均匀，加入冻干保护剂，定量分装于无菌的安瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥，即得。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于疫苗成品中犬瘟热病毒滴度TCID₅₀≥10^4.0/头份，水貂细小病毒滴度TCID₅₀≥10^5.5/头份。

5.权利要求1或2所述的水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗在制备预防水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎药物中的应用。