CN104357379A

CN104357379A - 干细胞培养基

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Publication number: CN104357379A
Application number: CN201410517249.XA
Authority: CN
Inventors: 刘兴宇; 王猛; 韩雪; 竺亚斌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: CN104357379B

Abstract

本发明涉及一种化学成分确定的干细胞培养基，包含以下组分：水溶性非聚电解质高分子、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素或类胰岛素功能替代品如（IGF-1/2）、成纤维生长因子。本发明不含有动物源性添加物，即各类动物制品，不含有滋养层细胞，不含有条件培养基，具有如下优点：提供了一种无动物源性成分、化学成分确定的干细胞培养基，可以避免传统培养基血液制品提纯不绝对导致的细胞分化；提供的全能干细胞培养基，可以有效的体外扩增人全能干细胞（包括hESC和hiPSC），效果显著，可以代替传统动物源性培养基。提供的是一种无动物源性成分、化学成分确定的干细胞培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。

Description

干细胞培养基

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种化学成分确定的干细胞培养基，可用于人类全能干细胞的培养。

背景技术

体外扩增人全能干细胞（包括hESC和hiPSC）的方法主要有两种：滋养层培养和无滋养层培养。一般在培养基中加入胎牛血清，用于支持细胞生长，执行细胞的功能（主要是物质传送，比如脂肪酸，金属离子转运等）。但血清非常昂贵，而且化学成分不确定，批次质量也存在很大的不稳定性，如果将全能干细胞用于人体再生医学中，培养MEFs的培养基中补加的胎牛血清会使hESC和hiPSC暴露于动物源细胞的风险之中，且死亡的MEFs的DNA会进入上层全能干细胞中，造成基因污染。业界一直期望能够有一种无动物源性成分、化学成分确定的干细胞培养基。本发明旨在提供一种化学成分确定的干细胞培养基。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种无动物源性成分、化学成分确定的干细胞培养基。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

干细胞培养基，包含以下组分：水溶性非聚电解质高分子、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素或类胰岛素功能替代品如（IGF-1/2）、成纤维生长因子。

本发明采用人工合成的细胞培养级的水溶性非聚电解质高分子代替原有培养系统中来自于血清的蛋白等动物源成分，执行细胞功能（主要是物质传送，比如脂肪酸，金属离子转运等）。此外，为了维持干细胞特别是全能干细胞的生长，必须添加足够量的各种培养基成分，以维持干细胞粘附、铺展、迁移和长期自我更新，所以培养基需要添加各种无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖以及其他成分。各种无机盐、维生素、氨基酸和生长因子是细胞扩增的必要成分。葡萄糖是为细胞生长、增殖提供足够的能量来源。文献显示，微量元素，如锌、硒、铜、钼，锰等等对细胞在无血清培养基中生长也至关重要。

作为优选，所述细胞培养基中所用的非聚电解质水溶性高分子为以下的一种或多种：聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，水溶性非聚电解质高分子的分子量范围为500-5,000,000，进一步的在1,000-1,000,000，更进一步的在2,000-200,000，所述培养基含有总非聚电解质水溶性高分子的质量浓度为0.001%到10%（w/v）,更进一步浓度为0.01-7%，更进一步在0.1-5%，以溶解于去离子水或pH缓冲或以粉末形式加入。

作为优选，所述干细胞培养基中无机盐的种类及用量如下：氯化钠3-5g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-7 g/L, 硒酸钠 0.0000005-0.0000060 g/L，硫酸镁0.05-0.2 g/L，氯化钾 0.15-0.45 g/L，磷酸钠 0.075-0.2 g/L，硝酸钾 0.00005-0.00009 g/L，氯化钙 0.08-0.25 g/L，焦葡萄酸钠0.05-0.4 g/L，氢氧化钠0.3-0.9 g/L，碳酸钠 1.5-4.5 g/L。

作为优选，所述干细胞培养基中维生素的组成及用量如下：维生素B7 0.000005-0.000025g/L，维生素C 0.002-0.004 g/L，维生素B5 0.002-0.006 g/L，胆碱0.002-0.006 g/L，叶酸0.002-0.006 g/L，肌醇0.005-0.02 g/L，烟酰胺0.002-0.006 g/L，吡哆醛0.002-0.006 g/L，核黄素0.0002-0.0006 g/L，硫胺0.002-0.006 g/L，维生素B12 0.000005-0.000025 g/L。

作为优选，所述干细胞培养基中氨基酸种类及其用量如下：丙氨酸0.015-0.035 g/L，天冬酰胺酸0.01-0.035 g/L，精氨酸0.06-0.10 g/L，天门冬氨酸0.02-0.04 g/L，半胱氨酸 0.3-0.5 g/L，胱氨酸 0.05-0.2 g/L，谷氨酰胺0.8-1.5 g/L，谷氨酸 0.06-0.09 g/L，甘氨酸 0.02-0.04 g/L，组氨酸 0.03-0.05 g/L，异亮氨酸 0.05-0.25 g/L，亮氨酸 0.05-0.25 g/L，赖氨酸 0.05-0.25 g/L，蛋氨酸 0.02-0.04 g/L，苯丙氨酸 0.055-0.075g/L，脯氨酸 0.03-0.05 g/L，丝氨酸 0.03-0.055 g/L，苏氨酸 0.07-0.15 g/L，色氨酸 0.005-0.025 g/L，酪氨酸 0.05-0.15 g/L，缬氨酸 0.02-0.04 g/L。

作为优选，所述干细胞培养基中葡萄糖用量为1-10 g/L。

作为优选，所述干细胞培养基中转铁蛋白是APO脱转铁蛋白或者柠檬酸铁，用量为1-100mg /L。

作为优选，所述干细胞培养基中胰岛素或类胰岛素功能替代品的用量是1-100mg/L。

作为优选，所述干细胞培养基中成纤维生长因子用量是0.1ng-100ng/ml。

本发明的有益效果是：本发明不含有动物源性添加物，即各类动物制品，不含有滋养层细胞，不含有条件培养基，具有如下优点：

1、提供了一种无动物源性成分、化学成分确定的干细胞培养基，可以避免传统培养基血液制品提纯不绝对导致的细胞分化。

2、提供的全能干细胞培养基，可以有效的体外扩增人全能干细胞（包括hESC和hiPSC），效果显著，可以代替传统动物源性培养基。

3、提供的是一种无动物源性成分、化学成分确定的干细胞培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。

4、本发明提供的化学成分确定的培养基成本较传统动物源性培养基低，有利于规模化应用。

附图说明

图1:实验1中干细胞扩增速度结果图；

图2: 实验2中Matrigel铺板状态下干细胞培养结果图；

图3: 实验2水溶性高分子作为添加剂被加入DMEM/F12/N2 培养基用于hESCs培养，培养72小时后的细胞形态照片；

图4：实验3小鼠胚胎干细胞在含有PVA的培养基与DMEM/F12/FBS15%培养基中细胞增殖数量结果图；

图5：实验3水溶性高分子PVA31K作为添加剂被加入DMEM/F12/N2 培养基用于hESCs培养48h后照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

实施例1：

干细胞培养基，包含了以下组分：聚乙烯醇、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、成纤维生长因子。

作为细胞培养基成分所用的聚乙烯醇成分，是细胞培养级聚乙烯醇，以溶解于去离子水的形式加入，其用量以质量浓度计为0.1-4.6%，所用的聚乙烯醇的分子量为100000；

作为细胞培养基成分所用的无机盐种类和用量如下：氯化钠3 g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5g/L, 硒酸钠 0.0000005g/L，硫酸镁0.2 g/L，氯化钾 0.15g/L，磷酸钠 0. 2 g/L，硝酸钾0.00009 g/L，氯化钙 0.08g/L，焦葡萄酸钠0.05 g/L，氢氧化钠0.9 g/L，碳酸钠4.5 g/L；

作为细胞培养基成分所用的维生素种类及用量如下：维生素B7 0.000005g/L，维生素C 0.002g/L,维生素B5 0.006 g/L，胆碱0.006 g/L，叶酸0.006 g/L，肌醇0.02g/L，烟酰胺0.006g/L，吡哆醛0.002g/L，核黄素0.0006 g/L，硫胺（维生素B1）0.006 g/L，维生素B12用量0.000025 g/L；

作为细胞培养基成分所用的氨基酸种类及其用量如下：丙氨酸0.035 g/L，天冬酰胺酸0.01g/L，精氨酸0.10 g/L，天门冬氨酸0.04 g/L，半胱氨酸0.5 g/L，胱氨酸 0.05 g/L，谷氨酰胺0.8g/L，谷氨酸0.09 g/L，甘氨酸0.04 g/L，组氨酸0.05 g/L，异亮氨酸 0.25 g/L，亮氨酸 0.25 g/L，赖氨酸 0.05 g/L，蛋氨酸 0.02 g/L，苯丙氨酸 0.055g/L，脯氨酸 0.03 g/L，丝氨酸 0.03 g/L，苏氨酸 0.07 g/L，色氨酸 0.005 g/L，酪氨酸 0.05 g/L，缬氨酸 0.02 g/L；

作为细胞培养基成分所用的葡萄糖用量是10g/L。

作为细胞培养基成分所用的转铁蛋白是：APO脱铁转铁蛋白，用量10 mg/L。

作为细胞培养基成分所用的胰岛素用量是2 mg/L。

作为细胞培养基成分所用的成纤维生长因子用量是10ng/ml。

实施例2

干细胞培养基，包含了以下组分：聚乙烯吡咯烷酮、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、成纤维生长因子。

作为细胞培养基成分所用的聚乙烯吡咯烷酮成分，是细胞培养级，以溶解于pH缓冲液形式加入，其用量以质量浓度计为2%，所用的聚乙烯醇的分子量为50000。

作为细胞培养基成分所用的无机盐种类和用量是：氯化钠5g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸7 g/L, 硒酸钠 0.000006g/L，硫酸镁0.05 g/L，氯化钾 0.45 g/L，磷酸钠 0.075 g/L，硝酸钾0.00005 g/L，氯化钙 0.25 g/L，焦葡萄酸钠0.4 g/L，氢氧化钠0.3 g/L，碳酸钠 1.5 g/L。

作为细胞培养基成分所用的维生素种类及用量如下：维生素B7 0.000025g/L，维生素C 0.004 g/L，维生素B5 0.002 g/L，胆碱0.002 g/L，叶酸0.002g/L，肌醇0.005g/L，烟酰胺0.002g/L，吡哆醛0.006g/L，核黄素0.0002g/L，硫胺（维生素B1）0.006 g/L，维生素B12用量0.000005 g/L。

作为细胞培养基成分所用的氨基酸种类及其用量是：丙氨酸0.035 g/L，天冬酰胺酸0.01g/L，精氨酸0.10 g/L，天门冬氨酸0.02 g/L，半胱氨酸 0.3g/L，胱氨酸0.2 g/L，谷氨酰胺1.5 g/L，谷氨酸 0.06 g/L，甘氨酸 0.02 g/L，组氨酸 0.03 g/L，异亮氨酸 0.05 g/L，亮氨酸 0.05 g/L，赖氨酸 0.25 g/L，蛋氨酸 0.04g/L，苯丙氨酸 0.075g/L，脯氨酸0.05 g/L，丝氨酸 0.055 g/L，苏氨酸 0.15 g/L，色氨酸 0.025 g/L，酪氨酸 0.15 g/L，缬氨酸 0.04 g/L；

作为细胞培养基成分所用的葡萄糖用量是3.5g/L；

作为细胞培养基成分所用的转铁蛋白是：柠檬酸铁，用量1 mg/L。

作为细胞培养基成分所用的胰岛素用量是50 mg/L。

作为细胞培养基成分所用的成纤维生长因子用量是2ng/ml。

实施例3

干细胞培养基，包含了以下组分：聚乙二醇、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、成纤维生长因子。

作为细胞培养基成分所用的聚乙二醇成分，是细胞培养级，以去离子水溶液液体形式加入。其用量以重量浓度计为10%，分子量为500。

作为细胞培养基成分所用的无机盐种类和用量是：氯化钠4.5 g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.5 g/L, 硒酸钠 0.000020 g/L，硫酸镁0.1 g/L，氯化钾 0.25 g/L，磷酸钠 0.2 g/L，硝酸钾 0.00006 g/L，氯化钙 0.11 g/L，焦葡萄酸钠0.35 g/L，氢氧化钠0.6 g/L，碳酸钠 1.9g/L。

作为细胞培养基成分所用的维生素种类及用量如下：维生素B7 0.000015g/L，维生素C用量0.003 g/L,维生素B5用量0.0025g/L，胆碱0.0025 g/L，叶酸0.0025 g/L，肌醇0.008g/L，烟酰胺0.0025 g/L，吡哆醛0.0025 g/L，核黄素0.00025 g/L，硫胺（维生素B1）0.0025 g/L，维生素B12用量0.000015g/L。

作为细胞培养基成分所用的氨基酸类及其用量是：丙氨酸0.025 g/L，天冬酰胺酸0.02 g/L，精氨酸0.08 g/L，天门冬氨酸0.03 g/L，半胱氨酸 0.4 g/L，胱氨酸 0.08 g/L，谷氨酰胺0.9 g/L，谷氨酸 0.065g/L，甘氨酸 0.025 g/L，组氨酸 0.033 g/L，异亮氨酸 0.052 g/L，亮氨酸 0.1 g/L，赖氨酸 0.1 g/L，蛋氨酸 0.1 g/L，苯丙氨酸 0.06/L，脯氨酸 0.035g/L，丝氨酸 0.035 g/L，苏氨酸 0.09g/L，色氨酸 0.02g/L，酪氨酸 0.07g/L，缬氨酸 0.025 g/L。

作为细胞培养基成分所用的葡萄糖用量是10 g/L。

作为细胞培养基成分所用的转铁蛋白是：APO脱铁转铁蛋白，用量5 mg/L。

作为细胞培养基成分所用的胰岛素用量是100mg/L。

作为细胞培养基成分所用的成纤维生长因子用量是100ng/ml。

实施例4

干细胞培养基，包含了以下组分：聚乙二醇、聚乙烯醇、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、成纤维生长因子。

作为细胞培养基成分所用的聚乙二醇、聚乙烯醇成分，是细胞培养级，以溶解于去离子水形式加入，聚乙二醇用量的重量百分比为1%，分子量为2500，聚乙烯醇用量的重量百分比是0.001%，分子量为5000000。

作为细胞培养基成分所用的无机盐种类和用量是：氯化钠3.5g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸6 g/L, 硒酸钠 0.0000025 g/L，硫酸镁0.15 g/L，氯化钾 0.25 g/L，磷酸钠 0.085 g/L，硝酸钾 0.00008 g/L，氯化钙 0.12 g/L，焦葡萄酸钠0.25 g/L，氢氧化钠0.35 g/L，碳酸钠 2.5 g/L。

作为细胞培养基成分所用的维生素种类及含量如下：维生素B7 0.0000015g/L，维生素C用量0.0025 g/L，维生素B5用量0.005 g/L，胆碱0.0025 g/L，叶酸0.006 g/L，肌醇0. 02 g/L，烟酰胺0.004 g/L，吡哆醛0.004 g/L，核黄素0.004 g/L，硫胺（维生素B1）0.004 g/L，维生素B12用量0.00001 g/L。

作为细胞培养基成分所用的氨基酸类及其用量是：草酰乙酸0.2 g/L，丙氨酸0.015g/L，天冬酰胺酸0.015 g/L，精氨酸0.06g/L，天门冬氨酸0.025 g/L，半胱氨酸 0.35 g/L，胱氨酸 0.055 g/L，谷氨酰胺0.85 g/L，谷氨酸 0.065 g/L，甘氨酸 0.025 g/L，组氨酸 0.035 g/L，异亮氨酸 0.15 g/L，亮氨酸 0.15 g/L，赖氨酸 0.15 g/L，蛋氨酸 0.025 g/L，苯丙氨酸 0.065g/L，脯氨酸 0.035 g/L，丝氨酸 0.035 g/L，苏氨酸 0.075 g/L，色氨酸 0.02 g/L，酪氨酸 0.055 g/L，缬氨酸 0.025 g/L。

作为细胞培养基成分所用的葡萄糖用量是4.5g/L。

作为细胞培养基成分所用的成纤维生长因子用量是20ng/ml。

作为细胞培养基成分所用的转铁蛋白是柠檬酸铁，用量10 mg/L。

作为细胞培养基成分所用的类胰岛素功能替代品是IGF-1/2，用量是0.1 ng/L。

本发明的干细胞培养基，用于干细胞培养实验，实验如下：

实验一：

以实施例1 中干细胞培养基作为实验对象，此培养基含有FGF2 10ng/ml，培养连续进行了5代（约30天）。

此实验中用于阳性对照组的培养液是（1）含有N2和B27各1x的DMEM-F12培养液，含有FGF2 20ng/ml；（2）含有Knockout serum replacement的hESCs标准培养基，含有FGF2 10ng/ml。所有培养基每天更换一次，每个实验组初始种植细胞密度为1万/每孔（48孔板），干细胞扩增速度结果见图1。

由图1结果证明：有PVA的化学组分确定的培养基，可以用于人类全能干细胞的培养，且培养效果好于B27-N2-DMEM/F12配方和传统的Knockout Serum Replacement配方。

实验二

干细胞培养基，用于培养人类全能干细胞，在Matrigel铺板状态下进行。作为细胞培养基成分所用的水溶性高分子为聚乙烯醇或者PEG（聚乙二醇）或者PVP（聚乙烯吡咯烷酮）成分，是细胞培养级，以溶解于去离子水形式加入，高分子具体型号和其他缩写见下表1。

铺板采用Matrigel，在non-TCPS下（1：100稀释），12小时37℃。结果见图2，图2中的12组实验为同时完成，组之间的对比说明了简单添加水溶性高分子即可获得化学组分确定的培养基。相比常用商业培养基，所述培养基能显著提高人类全能干细胞的增殖能力。

水溶性高分子作为添加剂被加入DMEM/F12/N2培养基用于hESCs培养，细胞种植密度为6,000/well(24孔板)。培养72小时以后拍摄细胞形态的照片如图3所示，照片说明了hESCs在有水溶性高分子添加剂的情况下，克隆形态紧密，呈未分化干细胞状态。

表1 高分子具体型号和其它缩写

实验三：

干细胞培养基，用于培养其他干细胞，如小鼠胚胎干细胞。含有PVA的培养基，可以显著的改善培养效果，使其小鼠胚胎干细胞增殖数量和DMEM/F12/FBS15％阳性对照组类似，结果如图4所示。

水溶性高分子PVA31K作为添加剂被加入DMEM/F12/N2 培养基用于hESCs培养，所有培养液加入LIF 20ng/ml，铺板为明胶-TCPS，在细胞铺板后48小时拍摄照片，照片如图5所示。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.干细胞培养基，其特征在于，包含以下组分：水溶性非聚电解质高分子、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素或类胰岛素功能替代品、成纤维生长因子。

2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述细胞培养基中含有以下非聚电解质水溶性高分子的一种或多种：聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，所述非聚电解质水溶性高分子的分子量范围为500-5000000，所述培养基含有总非聚电解质水溶性高分子的质量浓度为0.001%到10%。

3.根据权利要求2所述的干细胞培养基，其特征在于：所述非聚电解质水溶性高分子的分子量范围为2000-200000，所述培养基含有总非聚电解质水溶性高分子的质量浓度为0.01%到7%。

4.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中无机盐的种类及用量如下：氯化钠3-5g/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-7 g/L, 硒酸钠0.0000005-0.0000060 g/L，硫酸镁0.05-0.2 g/L，氯化钾 0.15-0.45 g/L，磷酸钠 0.075-0.2 g/L，硝酸钾 0.00005-0.00009 g/L，氯化钙 0.08-0.25 g/L，焦葡萄酸钠0.05-0.4 g/L，氢氧化钠0.3-0.9 g/L，碳酸钠 1.5-4.5 g/L。

5.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中维生素的组成及用量如下：维生素B7 0.000005-0.000025g/L，维生素C 0.002-0.004 g/L，维生素B5 0.002-0.006 g/L，胆碱0.002-0.006 g/L，叶酸0.002-0.006 g/L，肌醇0.005-0.02 g/L，烟酰胺0.002-0.006 g/L，吡哆醛0.002-0.006 g/L，核黄素0.0002-0.0006 g/L，硫胺0.002-0.006 g/L，维生素B12 0.000005-0.000025 g/L。

6.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中氨基酸种类及其用量如下：丙氨酸0.015-0.035 g/L，天冬酰胺酸0.01-0.035 g/L，精氨酸0.06-0.10 g/L，天门冬氨酸0.02-0.04 g/L，半胱氨酸 0.3-0.5 g/L，胱氨酸 0.05-0.2 g/L，谷氨酰胺0.8-1.5 g/L，谷氨酸 0.06-0.09 g/L，甘氨酸 0.02-0.04 g/L，组氨酸 0.03-0.05 g/L，异亮氨酸 0.05-0.25 g/L，亮氨酸 0.05-0.25 g/L，赖氨酸 0.05-0.25 g/L，蛋氨酸 0.02-0.04 g/L，苯丙氨酸 0.055-0.075g/L，脯氨酸 0.03-0.05 g/L，丝氨酸 0.03-0.055 g/L，苏氨酸 0.07-0.15 g/L，色氨酸 0.005-0.025 g/L，酪氨酸 0.05-0.15 g/L，缬氨酸 0.02-0.04 g/L。

7.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中葡萄糖用量为1-10g /L。

8.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中转铁蛋白用量为1-100mg/L。

9.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中胰岛素或类胰岛素功能替代品的用量是1-100mg/L。

10.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于：所述干细胞培养基中成纤维生长因子用量是0.1ng-100ng/ml。