CN104324361A - 丙型肝炎病毒(hcv)细胞进入抑制肽zte2序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及丙型肝炎病毒(HCV)细胞进入抑制肽ZTE2序列及应用。所述多肽是根据HCV基因型2a参考株JFH-1的包膜蛋白E2的氨基酸序列合成(纯度＞85％)的15肽。本发明中发现多肽E2-78和E2-79，如Seq ID：No.1和Seq ID：No.2所示氨基酸序列，重叠的10个氨基酸命名为ZTE2，序列如Seq ID：No.3。在剂量为10nM时，对HCVcc(Jc1p7NS2Gluc2a)感染的抑制率可以达到80％以上，分析确定这四条肽的半数有效剂量(ED50)为5nM左右。多肽与HCVcc共孵育(0h)或HCVcc感染后(+4h)共孵育的情况下，多肽皆能明显抑制HCV感染，通过截短肽的合成及抑制筛选分析初步确定了抑制肽的核心序列。这一发现具有重要的意义，不仅可以帮助理解该新发病毒感染的过程和机制，也能为阻断HCV感染提供新的设计思路。
Description
技术领域本发明属于病毒分子生物学领域。涉及利用HCV包膜蛋白E2的多肽对HCV感染的防治。
背景技术丙型肝炎病毒(HCV)为黄病毒属，单股正链RNA病毒，全长基因组约有9600个核苷酸组成，形成单一的开放阅读框，编码一个约3000个氨基酸的单一多蛋白，在病毒自身编码的蛋白酶及宿主编码的信号肽酶的切割加工下，形成4个结构蛋白(Core，E1，E2，p7)和6个非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV引发的丙型肝炎，急性感染者中约80％发展为慢性，其中约20％发展为肝纤维化和肝硬化，并可能进一步发展为肝癌。目前全球约有1.7亿感染者，我国约有4000万，HCV感染已经成为全球性的社会公共卫生问题之一。
丙型肝炎病毒的高度变异性，给疫苗的研究造成了极大的困难。目前对HCV感染的治疗从单一的聚乙二醇-干扰素(PEG-IFN)或者与利巴韦林(RBV)的联合用药外，直接靶向病毒的药物(DAAs)及靶向宿主的抗病毒药物(HTAs)陆续出现。美国FDA已经批准两种抑制HCV复制的药物，即直接靶向HCVNS3/4A蛋白酶的抑制剂，分别是Vertex公司的telaprevir及Merck公司的Boceprevir。另外靶向宿主的抗病毒药物也相继进入临床II期试验，包括靶向HCV进入宿主细胞受体SR-BI的抑制剂：ITX-5061等[1]。虽然目前的治疗效果较好，但是副作用大，价格昂贵，因此寻找防治HCV感染的有效靶点仍然需要众多研究者共同努力。
在病毒感染细胞的生物过程中，病毒与宿主细胞膜表面受体的特异性结合是病毒感染的最初环节，型别不同的同种病毒在与细胞结合过程中作用分子一般是固定的，如果能够阻碍两者之间的结合，即可以有效抑制病毒性感染的发生。2003年美国FDA批准抗人免疫缺陷病毒(HIV)的新药T-20(Enfuvirtide)上市，T-20是穿入抑制剂中第一个上市的药物，含有36aa，能够与HIV包膜蛋白gp41结合，阻止病毒与靶细胞的融合，临床试验证明效果较好，受试者副反应较小[2]。
目前已经证明HCV的包膜糖蛋白E1E2是与宿主细胞受体结合的唯一关键分子，其中E2被认为是最重要的分子。1998年Pileri等的研究表明人CD81(hCD81)可能是HCV的受体，随后低密度脂蛋白受体(LDLR)、清道夫受体B族I型(SR-BI)、钙离子依赖型(C型)凝集素DC/L-SIGN、Occludin和细胞连接骨架蛋白Clauding-1等都被证实是HCV的可能受体，目前比较一致的看法为HCV是通过包膜糖蛋白E2与CD81特异性结合，使病毒吸附于靶细胞表面，但由于CD81介导的内吞作用弱，病毒最终进入细胞可能还需要其他分子，如LDLR、SR-BI等来辅助，Clauding-1则在病毒穿入过程的后期起到关键作用[3-8]。
我们通过分析HCV基因型2a的参考株JFH-1(GenBank no.D95A86)包膜糖蛋白E1E2，人工合成覆盖完整E1E2氨基酸序列的多肽126条，其中E1有37条，E2有89条，每条多肽由15aa组成，相邻两条多肽有10aa重叠。运用HCVcc(FLJclp7NS2Gluc2a)对以上合成的多肽进行筛选，研究发现位于包膜糖蛋白E2氨基酸序列692-710aa位置的两条多肽E2-78，E2-79，在10nM的浓度下，对HCV感染的抑制率可以达到抑制80％左右，半数有效抑制浓度约为5nM。在研究多 肽与病毒作用关系的试验中，多肽与病毒共孵育(0h)和感染后孵育(+4h)的情况下，与阴性对照(DMSO)相比，多肽的加入能够明显抑制HCV感染Huh7.5CD81细胞，具体表现为感染细胞中HCV特异性蛋白Core的表达量下降，病毒RNA的拷贝数下降，细胞培养上清中Gluc荧光素酶的活性下降。该实验证明本次筛选获得的两条多肽，是通过阻止病毒进入细胞的生物过程而发挥作用的，具体是否是通过与病毒竞争性的结合靶细胞表面的受体的方式发挥抑制感染的效果，还需要深入研究。
这一发现具有重要的意义，不仅可以帮助理解该新发病毒感染的过程和机制，也能为阻断HCV感染，尤其是肝移植病人再感染的预防治疗提供新的设计思路，希望能为研发理想的HCV预防/治疗性候选药物提供参考依据。
发明内容：
本发明解决的问题在于提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)的多肽ZTE2，筛选能与HCV包膜糖蛋白E2结合的多肽序列，获得以HCV E2为靶位的多肽，以阻断病毒与细胞的结合，从而抑制病毒侵染细胞。
本发明是通过以下技术方案来实现：
抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。重叠核心多肽ZTE2的序列如SEQ ID NO：3所示。
所述的抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽应用于丙型肝炎病毒侵染细胞的吸附抑制剂或阻断剂。
本发明提供的多肽E2-78，E2-79，能够阻断HCV进入细胞，通过分泌Gluc荧光素酶的HCVcc系统检测多肽E2-78，E2-79对HCV入胞的抑制作用，结果显示E2-78，E2-79对HCVcc感染细胞具有一定的抑制效果，可以作为HCV的吸附抑制剂或阻断剂。
附图说明
图1：HCVcc FLJclp7NS2Gluc2a的结构示意图。
图2：对照病毒VSVpp-Gluc的结构示意图。
图3：多肽的初步筛选结果。
图4：多肽的第二轮筛选结果。
图5：多肽的半数有效抑制浓度的测量结果。
图6：MTT检测多肽对细胞活力的影响。
图7：多肽与病毒作用关系的间接免疫荧光结果。
图8：多肽与病毒作用关系的Western blotting结果。
图9：多肽与病毒作用关系的感染抑制率结果。
图10：多肽与病毒作用关系RNA拷贝数的检测结果。
图11：多肽与其他抗病毒药物的联合应用对HCV感染的抑制效果。
图12：多肽核心序列的确定
图13：多肽序列信息表
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1：多肽的合成信息
试验所用多肽是根据HCV基因型2a JFH-1的包膜蛋白E1E2的氨基酸序列合成的15肽，相邻两条多肽之间有10个氨基酸的重叠。其中包膜蛋白E1的多肽有37条，包膜蛋白E2的多肽有89条，多肽的纯度大于85％。所有的多肽均有上海强耀生物科技有限公司合成。
实施例2：多肽筛选
将多肽溶解于100％的DMSO中，配制成母液浓度为5μM/ml，然后以10μl为单位分装10份，尽量避免反复冻融，一并冻存于零下20℃。根据参考文献中的多肽剂量为10nM(多肽的平均分子量约为2000mol/g)，在此试验条件下，对多肽进行筛选。具体试验方法如下：
1)准备细胞：提前一天准备Huh7.5CD81细胞，按照8000cell/well的比例铺96孔细胞培养板，用DMEM-10进行培养过夜。
2)多肽孵育：按照2μl多肽溶解于100ul细胞培养液(含有HCVcc FLJc1P7NS2Gluc2a，200FFU/m1)的比例将每一条多肽进行稀释。每条多肽做三个复孔进行筛选。将与病毒液稀释好的多肽，37℃，孵育1h后，加入待感染的细胞中，继续37℃，孵育4h，然后除去孵育液，将细胞用PBS洗涤两遍后，每孔加入120μlDMEM-10，37℃，5％C02培养箱培养72小时后，检测细胞上清中分泌型荧光素酶Gluc的活性。同时设置阳性对照IFN-α2b(200IU/ml)，anti-CD81单抗(2μg/ml)，阴性对照DMSO，空白对照。
3)分泌型荧光素酶Gluc活性测定：取细胞上清，按照Gaussia荧光素酶检测试剂盒操作说明书，使用Promega GloMax单管发光检测仪检测Gluc荧光素酶活性，从而指示HCVcc的复制水平。只有HCVcc检测值>104才可以用于后续试验。
实施例3：细胞杀伤试验(MTT)
1)Huh7.5CD81细胞(1.5×105)接种于96孔板内，过夜培养至汇合度达到80％。
2)多肽按照逐级浓度梯度(100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM)依次稀释后加入细胞培养液中，培养两天，终体积为100ul。DMSO设为阴性对照。
3)5mg/ml的MTT溶液10μl加入到细胞培养液中，孵育4小时。
4)弃去培养基，甲臢晶体用100μl的DMSO/乙醇(1∶1)溶液溶解，检测490nm处的光密 度值(OD)。
实施例4：50％抑制浓度的确定
将多肽进行2倍梯度稀释，即100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM与同体积的病毒液同时孵育2h后，加入待感染的细胞中，继续37℃，孵育4h，然后除去孵育液，将细胞用PBS洗涤两遍后，每孔加入100μl DMEM-10，37℃，5％CO2培养箱培养72小时后，检测细胞上清中分泌型荧光素酶Gluc的活性。同时设置阳性对照IFN-α-2b(200IU/ml)，anti-CD81单抗(2μg/ml)，阴性对照DMSO。
实施例5：多肽与病毒相互作用的确定试验
1)准备细胞：提前一天准备Huh7.5CD81细胞，按照8000cell/well的比例铺96孔细胞培养板，用DMEM-10进行培养过夜。
2)病毒与多肽的孵育：次日按照HCVcc1000FFU/well感染细胞，多肽的终浓度确定为10nM，依据多肽加入的时间先后，进行以下三个感染程序：i)预孵育：多肽加入细胞，37℃，孵育4h后，用PBS清洗2次后加入HCVcc继续培养2h，清洗后加入DMEM-10继续培养然后。ii)共孵育：多肽和病毒在37℃共同孵育2h后，加入细胞中37℃，孵育4h，清洗后加入DMEM-10继续培养。iii)感染后孵育：将病毒加入待感染细胞中，37℃，孵育4h，然后除去病毒，加入含有多肽的培养基DMEM-10继续培养。检测细胞上清中分泌型荧光素酶Gluc的活性。同时设置阳性对照IFN-α2b(200IU/ml)，anti-CD81单抗(2μg/ml)，空白对照。3)结果测定：通过间接免疫荧光、Westem blotting、荧光定量RT-PCR的方法测定试验结果，其中间接免疫荧光、Western blotting的具体操作参照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件进行，所用抗体为抗HCV核心蛋白的小鼠单抗C7-50，二抗为Invitrogen公司生产的羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor568，及Li-COR公司产品羊抗小鼠IgG IRDye800cw。荧光定量RT-PCR的具体操作参照QIAGEN公司的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的使用说明书进行。
实施例6：与其他抗HCV药物的联合应用。
1)准备细胞：提前一天准备Huh7.5CD81细胞，按照8000cell/well的比例铺96孔细胞培养板，用DMEM-10进行培养过夜。
2)病毒与抗病毒药物共孵育：次日按照HCVcc1000FFU/well感染细胞，多肽的用量确定为10nM。将多肽、IFN-α2b(100IU/ml)、anti-CD81单抗(1μg/ml)、阴性对照DMSO分别和病毒在37℃共同孵育2h后，加入细胞中37℃，孵育4h，清洗后加入DMEM-10继续培养。
3)结果测定：通过检测细胞上清中Gluc荧光素酶的活性来评价单肽及单肽与抗病毒药 物IFN-α2b及anti-CD81单抗联合应用的情况下对HCV感染的作用效果。
实施例7：多肽核心序列的确定
多肽E2-78和E2-79的合并序列(GLLHLHQNIVDVQYMYGLS)的N端及C端依次截短两个氨基酸，获得多肽24条，纯度大于95％，所有的多肽均有上海强耀生物科技有限公司合成。
1)准备细胞：提前一天准备Huh7.5CD81细胞，按照8000cell/well的比例铺96孔细胞培养板，用DMEM-10进行培养过夜。
2)HCVcc与多肽共同孵育：次日按照感染病毒的量为5×105ffu/ml。终浓度依次确定为多肽(纯度大于95％，10nM)，试验分四组：多肽组、阳性对照anti-CD81单抗组、阴性对照组(HCVcc)、空白对照组(DMSO)。每组做三个复孔。与HCVcc混合均匀后，置于37℃中孵育2小时后，加入准备好的细胞中，置于37℃中孵育4小时，除去混合液，用PBS清洗细胞两遍，以除去残余的混合液，加入100tl DMEM-10继续培养72小时，检测细胞培养上清中Gluc荧光素酶的活性，以评判对HCVcc感染抑制效果较好的多肽序列。
参考文献：
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Claims (3)
1.抑制丙型肝炎病毒(HCV)的多肽药物ZTE2其特征在于，位于丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2区。
2.权利要求1所述的ZTE2它具有SEQ.ID.NO.3所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求2所述的序列的基础上延长、截短或某些氨基酸的缺失、插入和突变后的氨基酸序列。
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| 吕欣: "利用噬菌体肽库筛选以HCV包膜糖蛋白E2为靶位的抗病毒多肽", 《第三届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛》 * |
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