CN104313102B

CN104313102B - 一种制备胶原蛋白的方法

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Publication number: CN104313102B
Application number: CN201410620515.1A
Authority: CN
Inventors: 吉世宇; 伍曾利
Original assignee: Individual
Current assignee: Hainan Yun Hao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: CN104313102A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种以鱼皮鱼鳞为原料制备胶原蛋白的方法。本发明所述制备胶原蛋白的方法为鱼皮鱼鳞清洗后加入0.01mol/L～0.1mol/L的柠檬酸溶液，超声波处理4～8小时，加碱液调节pH值至6.0～7.5，滤干；取滤干的鱼皮鱼鳞加水，用胶体磨磨成鱼皮鱼鳞浆液，加碱液调节pH值至8.0‑8.5，加入碱性蛋白酶酶解60min‑180min，灭活蛋白酶即得胶原蛋白溶液。本发明采用柠檬酸处理和超声波相结合工艺对鱼皮鱼鳞进行脱脂脱灰，同时采用胶体磨处理与碱性蛋白酶酶解工艺相结合，酶解迅速，蛋白质大分子彻底水解成小分子，提高胶原蛋白的提取率，使制备得到的胶原蛋白产品更加安全天然。

Description

一种制备胶原蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备胶原蛋白的方法，尤其是涉及一种以鱼皮鱼鳞为原料制备胶原蛋白的方法。

背景技术

胶原蛋白，也称胶原，是细胞外基质的一种结构蛋白质，英文名“collagen”，由希腊文演化而来，多糖蛋白，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质(ECM)的主要成分，约占胶原纤维固体物的85％。胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占哺乳动物体内蛋白质的25％～30％，相当于体重的6％。在许多海洋生物，如鱼类的皮，占其蛋白质含量甚至高达80％以上。对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递，以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。除了生物力学方面的以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。此外胶原蛋白也是生物科技产业最具关键性的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业等均有着广泛应用。其中平均分子量小于3000道尔顿的小分子胶原蛋白具有补水保湿、滋润美白、延缓衰老、锁定钙质、淡化黑斑等功效，是保健食品及化妆品的理想原料，具有重要的商业价值。

畜禽源动物组织一直是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径，但由于疯牛病(BSE)、口蹄疫(FMD)、禽流感等疾病的发生，使人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的安全性产生了质疑，另外来源于牲畜的胶原蛋白在信仰伊斯兰教等地区的应用受到了限制。正在逐步转向海洋生物中开发胶原蛋白。此外由于氨基酸组成和交联度等方面的差异，使得水产动物尤其是其加工废弃物-皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点，如一定的凝胶性、高度的分散性、低粘度性、吸水性、持水性以及乳化性等，另外人们发现来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低抗原性、低过敏性、变性温度低、可溶性高、易被蛋白酶水解等特性。因此水产胶原蛋白可能逐步替代陆生动物胶原蛋白。

目前，从鱼皮鱼鳞中提取胶原蛋白的研究非常多，制备工艺一般都是包括鱼皮鱼鳞的前处理(包括脱脂、脱灰等)、酶解、灭酶、脱色、过滤、浓缩、除菌和喷雾干燥等步骤。其中，在鱼皮鱼鳞的脱脂脱灰方面，目前主要采用强酸强碱进行处理，如专利号为ZL200310114500.X、ZL2005 10023165.1和ZL200510044916.8等中国专利。虽然强酸强碱脱脂脱灰效果非常好，但是强酸强碱不仅造成环境污染，而且还造成胶原蛋白产品的重金属残留，严重制约了胶原蛋白的发展。在鱼皮鱼鳞的酶解过程中，目前主要采用长时间加热加压煮胶与长时间酶解的方法来解决鱼皮鱼鳞酶解的问题，如专利号为ZL201110072987.4和ZL200510044916.8的中国专利均采用的加压加热方法酶解。但是长时间加热加压煮胶与长时间酶解并不能完全解决鱼皮鱼鳞酶解不完全的问题，造成了原料浪费、能耗高、提取率低等问题，影响胶原蛋白的发展。

发明内容

本发明针对目前胶原蛋白生产工艺的缺点，本发明提供一种以鱼皮鱼鳞为原料制备胶原蛋白的方法，解决目前胶原蛋白制备工艺存在环境污染严重、重金属残留、工艺复杂、提取率低等问题。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种制备胶原蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)鱼皮鱼鳞清洗后加入0.01mol/L～0.1mol/L的柠檬酸溶液，超声波处理4～8小时，加碱液调节pH值至6.0～7.5，滤干备用；

(2)取步骤(1)滤干的鱼皮鱼鳞加水，用胶体磨磨成鱼皮鱼鳞浆液，加碱液调节pH值至8.0～8.5，加入碱性蛋白酶酶解60min～180min，灭活蛋白酶即得胶原蛋白溶液。

优选的，所述鱼皮鱼鳞与所述柠檬酸溶液的重量比为1:4～1:12。

优选的，所述碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG和/或Neutrase 0.8L。

优选的，所述碱性蛋白酶的加入量为鱼皮鱼鳞浆液的0.1wt％～0.4wt％。

优选的，所述酶解温度为50℃～55℃。

优选的，所述灭活蛋白酶为酶解结束后加温至90℃以上，维持10min。

优选的，还包括对胶原蛋白液进行后处理的步骤。

优选的，所述后处理为取制得的胶原蛋白溶液活性碳脱色，过滤，滤液用柠檬酸溶液调PH值至5.5～7.0，浓缩、除菌、干燥即得胶原蛋白粉。

优选的，所述活性碳脱色为加入0.5wt％～2.0wt％活性碳，50℃～60℃维持20min～60min。

优选的，所述浓缩、除菌为调pH值至5.5～7.0滤液浓缩至30％～50％，滤膜过滤，收集滤液。

本发明所述制备胶原蛋白的方法采用柠檬酸处理和超声波相结合工艺对鱼皮鱼鳞进行脱脂脱灰，强酸强碱脱脂脱灰造成的环境污染及重金属残留问题，使制备得到的胶原蛋白产品更加安全天然。同时采用胶体磨处理与碱性蛋白酶酶解工艺相结合，使原料与蛋白酶接触的面积更大，酶解更加迅速、更完全，使蛋白质大分子彻底水解成小分子，提高胶原蛋白的提取率。实验表明本发明所述方法制备的胶原蛋白，平均分子量小于3000道尔顿，胶原蛋白提取率达到了95％以上，胶原蛋白含量达到98％以上，胶原蛋白中羟脯氨酸含量达到5.5％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例4高效凝胶排阻色谱法检测的空白溶剂的色谱图；

图2示实施例4高效凝胶排阻色谱法检测的对照品溶液的色谱图；

图3示实施例4高效凝胶排阻色谱法检测的供试品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种制备胶原蛋白的方法，包括以下步骤：

本发明所述制备胶原蛋白的方法步骤(1)采用柠檬酸处理和超声波相结合工艺对鱼皮鱼鳞进行脱脂脱灰，解决强酸强碱脱脂脱灰造成的环境污染及重金属残留问题，使制备得到的胶原蛋白产品更加安全天然。

其中，本发明所述制备胶原蛋白的方法中，步骤(1)所述鱼皮鱼鳞与所述柠檬酸溶液的重量比为1:4～1:12。

在一些实施方案中，步骤(1)所述柠檬酸溶液浓度为0.01mol/L～0.1mol/L。优选的，所述柠檬酸溶液浓度为0.05mol/L。

在一些实施方案中，步骤(1)所述超声波功率为500W-5000W。

在一些优选实施方案中，所述步骤(1)还包括对滤干后的鱼皮鱼鳞进行水洗，滤干的步骤。

在一些实施方案中，所述鱼皮鱼鳞清洗的具体操作为取水产加工下脚料鱼皮鱼鳞，用自来水洗净，加入鱼皮鱼鳞重量4～12倍的水，加热至90℃以上，维持30min～90min，滤干鱼皮鱼鳞备用。

本发明所述制备胶原蛋白的方法步骤(2)在对鱼皮鱼鳞酶解过程当中，采用胶体磨处理与碱性蛋白酶酶解工艺相结合，使原料与蛋白酶接触的面积更大，酶解更加迅速、更完全，使蛋白质大分子彻底水解成小分子，提高胶原蛋白的提取率。

其中，步骤(2)中加水的量优选为鱼皮鱼鳞重量的3-8倍。即鱼皮鱼鳞与水的重量比为1:3～1:8。

胶体磨是由电动机通过皮带传动带动转齿(或称为转子)与相配的定齿(或称为定子)作相对的高速旋转，其中一个高速旋转，另一个静止，被加工物料通过本身的重量或外部压力(可由泵产生)加压产生向下的螺旋冲击力，透过定、转齿之间的间隙(间隙可调)时受到强大的剪切力、摩擦力、高频振动、高速旋涡等物理作用，使物料被有效地乳化、分散、均质和粉碎，达到物料超细粉碎及乳化的效果。本发明所述制备胶原蛋白的方法步骤(2)采用胶体磨对鱼皮鱼鳞进行粉碎，使后续酶解过程中鱼皮鱼鳞与酶制剂接触的面积增大。

本发明所述制备胶原蛋白的方法步骤(2)加碱液调节鱼皮鱼鳞浆液pH值至碱性环境，采用碱性蛋白酶酶解处理经胶体磨粉碎的鱼皮鱼鳞。

其中，优选的，步骤(2)中所述碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG和/或Neutrase0.8L。

进一步的，所述酶解温度为50℃～55℃。

本发明所述制备胶原蛋白的方法步骤(2)在酶解后需要对碱性蛋白酶进行灭活以终止酶解反应。其中，所述灭活蛋白酶为酶解结束后加温至90℃以上，维持10min。

本发明所述制备方法步骤(1)和步骤(2)分别采用碱液调节溶液pH值至适宜环境。本领域技术人员可以理解所述碱可以为任意一种提供碱性环境的有机碱或无机碱。其中，在一些实施方案中，所述碱为NaOH或Na₂CO₃。

在一些实施例中，步骤(1)和步骤(2)中所述碱液调节溶液pH值中所述碱液浓度为10.0mol/L。

在一些实施方案中，本发明所述制备胶原蛋白的方法还包括对胶原蛋白溶液进行后处理的步骤。

在一些优选实施方案中，所述后处理具体为取制得的胶原蛋白溶液活性碳脱色，过滤，滤液用柠檬酸溶液调pH值至5.5～7.0，浓缩、除菌、干燥即得胶原蛋白粉。

其中，在一些实施方案中，所述活性碳脱色为加入0.5wt％～2.0wt％活性碳，50℃～60℃维持20min～60min。

在一些实施例中，所述调pH值的柠檬酸溶液的浓度为10.0mol/L。

在一些实施方案中，所述浓缩、除菌为调pH值至5.5～7.0的滤液浓缩至30％-50％，滤膜过滤，收集滤液。其中，所述浓缩至30％～50％为含有30％-50％的固形物。所述固形物是液体或流体中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等。

进一步的，在一些优选实施方案中，所述滤膜为0.22微米。

由于灭活蛋白酶通常采用高温处理，因此在一些实施方案中，在灭活蛋白酶后、活性炭脱色前包括对制得的胶原蛋白溶液降温的步骤。具体优选为制得的胶原蛋白溶液降温至60℃。

本发明所述制备方法浓缩除菌后干燥获得胶原蛋白粉。本领域技术人员可以理解所述干燥可以采用本领域技术人员公知的任意一种干燥方法进行。其中，在一些实施方案中，所述干燥为喷雾干燥。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。其中实施例中所述Alcalase 2.4L FG和Neutrase 0.8L购自诺维信(中国)公司。所述水无特殊说明均为纯化水。

实施例1：

1、取水产加工下脚料鱼皮鱼鳞，用水洗净，加入鱼皮鱼鳞重量6倍的水，搅拌加热至90℃以上，维持90℃以上30min，滤干，鱼皮鱼鳞备用；

2、取处理过的鱼皮鱼鳞，加入鱼皮鱼鳞重量4倍的0.05mol/L的柠檬酸溶液，超声波处理4小时，用10.0mol/L的NaOH调节pH值至6.0-7.5，滤干，用水洗一遍，滤干，备用；

3、鱼皮鱼鳞加入3倍量的水，用胶体磨磨成鱼皮鱼鳞浆液，用10.0mol/L的NaOH调节pH值至8.0-8.5，维持PH值在8.0-8.5范围内，加入鱼皮鱼鳞重量0.1％的Alcalase 2.4LFG，50℃-55℃酶解100min，酶解结束后加温至90℃以上10min，进行酶灭活，降温至60℃，备用；

4、加入0.5％活性碳脱色，维持温度50℃-60℃搅拌20min，过滤，用10.0mol/L的柠檬酸溶液调PH值至5.5-7.0，备用；

5、浓缩至50％，过0.22微米的膜除菌，喷雾干燥，即得胶原蛋白粉。

实施例2：

1、取水产加工下脚料鱼皮鱼鳞，用自来水洗净，加入鱼皮鱼鳞重量12倍的水，搅拌加热至90℃以上，维持90℃以上90min，滤干，鱼皮鱼鳞备用；

2、取处理过的鱼皮鱼鳞，加入鱼皮鱼鳞重量12倍的0.05mol/L的柠檬酸溶液超声波处理8小时，用10.0mol/L的Na₂CO₃调节pH值至6.0-7.5，滤干，用自来水洗一遍，滤干，备用；

3、鱼皮鱼鳞加入8倍量的纯化水，用胶体磨磨成鱼皮鱼鳞浆液，用10.0mol/L的Na₂CO₃调节pH值至8.0-8.5，维持PH值在8.0-8.5范围内，加入鱼皮鱼鳞重量0.4％的Neutrase 0.8L，50℃-55℃酶解60min，酶解结束后加温至90℃以上10min，进行酶灭活，降温至60℃，备用；

4、加入2.0％活性碳脱色，维持温度50℃-60℃搅拌60min，过滤，用10.0mol/L的柠檬酸溶液调PH值至5.5-7.0，备用；

5、浓缩至固形物为30％，过0.22微米的膜除菌，喷雾干燥，即得胶原蛋白粉。

实施例3：

1、取水产加工下脚料鱼皮鱼鳞，用水洗净，加入鱼皮鱼鳞重量8倍的、水，搅拌加热至90℃以上，维持90℃以上60min，滤干，鱼皮鱼鳞备用；

2、取处理过的鱼皮鱼鳞，加入鱼皮鱼鳞重量8的0.05mol/L的柠檬酸溶液超声波处理6小时，用10.0mol/L的NaOH调节pH值至6.0-7.5，滤干，用水洗一遍，滤干，备用；

3、鱼皮鱼鳞加入6倍量的纯化水，用胶体磨磨成鱼皮鱼鳞浆液，用10.0mol/L的NaOH调节pH值至8.0-8.5，维持PH值在8.0-8.5范围内，加入鱼皮鱼鳞重量0.2％的Alcalase2.4L FG，50℃-55℃180min，酶解结束后加温至90℃以上10min，进行酶灭活，降温至60℃，备用；

4、加入1.0％活性碳脱色，维持温度50℃-60℃，搅拌40min，过滤，用10.0mol/L的柠檬酸溶液调PH值至5.5-7.0，备用；

5、浓缩至固形物为40％，过0.22微米的膜除菌，喷雾干燥，即得胶原蛋白粉。

实施例4：

采用高效凝胶排阻色谱法对实施例1制得的胶原蛋白进行检测。

1.检测方法

(1)色谱条件

色谱柱：TSK-GEL G2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)3根串联，柱温：25℃；

流动相：乙腈-0.1％三氟乙酸溶液(15∶85)；

流速：0.6ml/min；进样量：20μL。检测波长：220nm。

理论板数以成骨生长肽计为40000，对照品各峰分离度均>1.2。

(2)对照溶液的制备

分别精密称取成骨生长肽(1523Da)、胸腺5肽(680Da)、L-甲硫氨基酸(149Da)及氨基酸序列Lys-Leu-Pro-Ser-Thr-Glu-Val-Lys-Glu-Asp-Ser-Ala-Tyr-Gl y-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Gln-Arg-Arg的寡肽(2495Da)、Val-Ser-Lle的寡肽(317D a)对照品各约2mg于2ml量瓶中，用水稀释至刻度摇匀，配成浓度各为1mg/ml混合对照品溶液。

指定对照品的色谱峰并输入相应的对照品的相对分子质量信息，随机软件自动生成标准曲线。

(3)供试品溶液的制备

取实施例1制得的胶原蛋白50mg于10mL量瓶中，用水稀释至刻度摇匀，配成浓度为5mg/ml的供试品溶液。

5mg/ml的胶原蛋白于9000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤即可。

2.结果

取供试品溶液，进样测定，空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各20μL进样，记录色谱图，结果见图1-3。由图1-3结果可见溶剂对测定无干扰。

把保留时间代入标准曲线，计算各组分蛋白分子量，结果见表1。

表1实施例1制得的胶原蛋白分子量分布表：

编号	保留时间/min	分子量/Da	峰面积	峰面积百分比/％
					1	43.430	>2500	1850336	0.74
2	46.742	1637	20358075	8.08
					3	47.815	1294	14295307	5.67
4	48.489	1092	19729808	7.83
					5	49.900	815	26181492	10.39
6	50.703	684	29970955	11.90
					7	51.487	565	36099842	14.33
8	53.640	357	19154669	7.60
					9	54.542	295	31203153	12.39
10	57.307	157	21416836	8.50
					11	58.000	131	7508417	2.98
12	59.765	<100	3837980	1.52
					13	61.307	<100	6062245	2.41
14	62.175	<100	10673194	4.24
					15	67.812	<100	3574100	1.42

从表1结果可知，分子量大于1500Da只占到9％左右，<150Da约为10％，其中分子量130-1500Da的寡肽(2-12个氨基酸)，占到80％左右，而分子量大于2500Da只占到0.74％左右。表明本发明实施例1制得的胶原蛋白平均分子量小于3000Da，为小分子胶原蛋白。

采用上述方法对实施例2和实施例3制备的胶原蛋白进行检测，结果与实施例1制得的胶原蛋白结果相似，制备的胶原蛋白为小分子胶原蛋白，分子量130-1500Da的寡肽占到80％左右。

实施例5：

采用GB/T 5009.5规定的方法对实施例1-3制得的胶原蛋白的蛋白含量进行测定，采用GB/T 9695.23规定的方法对实施例1-3制得的胶原蛋白的羟脯氨酸含量进行测定，结果见表2。

表2实施例1-3制得的胶原蛋白的蛋白含量及羟脯氨酸含量

	实施例1	实施例2	实施例3
				蛋白质含量	98.6％	98.8％	98.4％
羟脯氨酸含量	5.7％	5.9％	5.6％

Claims

1.一种制备胶原蛋白的方法，由以下步骤制备而成：

2.根据权利要求1所述的方法，所述鱼皮鱼鳞与所述柠檬酸溶液的重量比为1:4～1:12。

3.根据权利要求1所述的方法，所述碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG和/或Neutrase0.8L。

4.根据权利要求1所述的方法，所述碱性蛋白酶的加入量为鱼皮鱼鳞浆液的0.1wt％～0.4wt％。

5.根据权利要求1所述的方法，所述酶解温度为50℃～55℃。

6.根据权利要求1所述的方法，所述灭活蛋白酶为酶解结束后加温至90℃以上，维持10min。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括对胶原蛋白液进行后处理的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，所述后处理为取制得的胶原蛋白溶液活性碳脱色，过滤，滤液用柠檬酸溶液调PH值至5.5～7.0，浓缩、除菌、干燥即得胶原蛋白粉。

9.根据权利要求8所述的方法，所述活性碳脱色为加入0.5wt％～2.0wt％活性碳，50℃～60℃维持20min～60min。

10.根据权利要求8所述的方法，所述浓缩、除菌为调pH值至5.5～7.0的滤液浓缩至30％～50％，滤膜过滤，收集滤液。