CN104277083B - 一种木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法及用途 - Google Patents
一种木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种木犀草素‑7‑o‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷制备方法及用途，属于中药有效成分提取和应用领域。包括提取、水沉、纯化步骤，本发明的方法简单、方便，制备的木犀草素‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷纯度高，对于治疗脑中风后遗症有较好的疗效。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及从苦碟子中提取黄酮苷类的方法及用途。
背景技术
苦碟子味辛、苦，微寒，具有清热解毒，消痈排脓，祛瘀止痛的功效。苦碟子主要成分为黄酮类、酚酸类、倍半萜内酯类、三萜类物质，药理作用较为广泛：(1) 心、脑血管保护作用；具有增加冠脉流量，降低氧代谢，提高耐缺氧能力，对实验性心肌梗死的治疗作用，增加脑血流量，改善微循环，收缩血管作用。(2) 对血液系统的作用；具有抗血小板聚集，增强纤维蛋白酶活性，降血脂、活血化瘀、抗动脉粥样硬化作用。(3) 镇痛、镇静作用；(4) 抗氧化和清除自由基作用；(5) 抗肿瘤作用；(6) 抗呼吸道病毒作用；(7) 肝脏保护作用；(8)其他作用。
为了分析苦碟子中各成分的药理作用，需要对苦碟子进行提取，进一步研究各成分单独的药理作用，以便在临床上更精准的应用，目前，还没有发现木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷的提取方法以及在治疗脑中风后遗症方面的文献。
发明内容
本发明目的是提供一种简单、方便、纯度高的制备木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷的方法以及木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷的用途。
本发明所采用的技术方案是：
木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤：
A、提取：称取苦碟子，向苦碟子中加10-15倍量40-70%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在40-60℃条件下减压浓缩得到生药浓度为0.8-1.2g/ml的浓缩液Ⅰ；
B、水沉：向浓缩液Ⅰ中加入3-6倍量去离子水，4-10℃冷藏，过滤，滤液备用；
C、纯化：将B步骤中所得滤液依次经过大孔吸附树脂Ⅰ纯化得到浓缩液Ⅱ、聚酰胺纯化得到浓缩液Ⅲ、大孔吸附树脂Ⅱ纯化得到浓缩液Ⅳ、高压制备色谱或中压制备色谱纯化两次，然后按照色谱峰收集目标化合物，然后减压浓缩、冷冻干燥即得。
所述大孔吸附树脂Ⅰ为HZ820大孔吸附树脂；大孔吸附树脂Ⅱ为XAD7HP大孔吸附树脂。
作为优选方式所述大孔吸附树脂Ⅰ纯化步骤如下：按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和1小时；再用PH3.5-4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4-6BV/h，洗脱用量为4-6BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6-8BV/h，洗脱用量为6-8BV，收集洗脱液，在40-60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.2-0.5g/ml浓缩液Ⅱ。
作为优选方式：所述聚酰胺纯化中，聚酰胺为30-60目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和1h，先用14-16BV水以流速4-6BV/h洗脱，再用10-12BV 20%乙醇以流速4-6BV/h洗脱，除去杂质，然后再用14-16BV的70%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.9-1.1g/ml浓缩液Ⅲ。
作为优选方式所述大孔吸附树脂Ⅱ纯化步骤如下：按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ调PH8.5-9.0上样，上样流速为1-2BV/h，上样后饱和30分钟，再用4-5BV的10%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60℃条件下减压浓缩得到浓度为12-15g/ml浓缩液Ⅳ。
作为优选方式：所述高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:3，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。
作为优选方式：所述中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:6，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。
木犀草素-7- o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤：
A、提取：称取苦碟子，向苦碟子中加10倍量40%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在60℃条件下减压浓缩得到生药浓度为1.2g/ml的浓缩液Ⅰ；
B、水沉：向浓缩液Ⅰ中加入6倍量去离子水，4℃冷藏，过滤，滤液备用；
C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和1小时；再用PH3.5的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4BV/h，洗脱用量为6BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6BV/h，洗脱用量为8BV，收集洗脱液，在60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.2g/ml浓缩液Ⅱ。
D、将步骤C中所得浓缩液Ⅱ通过聚酰胺纯化，聚酰胺为30目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和1h，先用16BV水以流速4BV/h洗脱，再用12BV 20%乙醇以流速4BV/h洗脱，除去杂质，然后再用16BV的70%乙醇以流速8BV/h洗脱，收集洗脱液，在60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.9g/ml浓缩液Ⅲ。
E、将步骤D中所得浓缩液Ⅲ通过大孔吸附树脂Ⅱ，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ调PH8.5上样，上样流速为1BV/h，上样后饱和30分钟，再用4BV的10%乙醇以流速6BV/h洗脱，收集洗脱液，在60℃条件下减压浓缩得到浓度为15g/ml浓缩液Ⅳ。
F、将步骤E中所得浓缩液Ⅳ通过高压制备色谱纯化，高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:3，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。
或木犀草素-7- o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤：A、提取：称取苦碟子，向苦碟子中加12倍量40-70%乙醇浸泡2小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在50℃条件下减压浓缩得到生药浓度为1.0g/ml的浓缩液Ⅰ；
B、水沉：向浓缩液Ⅰ中加入4倍量去离子水，6℃冷藏，过滤，滤液备用；
C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH4.0条件下，将滤液上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和1小时；再用PH4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为5BV/h，洗脱用量为5BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速7BV/h，洗脱用量为7BV，收集洗脱液，在50℃条件下减压浓缩得到浓度为0.3g/ml浓缩液Ⅱ。
D、将步骤C中所得浓缩液Ⅱ通过聚酰胺纯化，聚酰胺为50目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和1h，先用15BV水以流速5BV/h洗脱，再用11BV 20%乙醇以流速5BV/h洗脱，除去杂质，然后再用15BV的70%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50℃条件下减压浓缩得到浓度为1.0g/ml浓缩液Ⅲ。
E、将步骤D中所得浓缩液Ⅲ通过大孔吸附树脂Ⅱ，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ调PH9.0上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和30分钟，再用5BV的10%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50℃条件下减压浓缩得到浓度为13g/ml浓缩液Ⅳ。
F、将步骤E中所得浓缩液Ⅳ通过中压制备色谱纯化，中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:6，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。
通常将树脂装于圆筒形的树脂柱中，溶液连续地通过，树脂柱内装载树脂的体积称为床容积(bed volume)，简写为BV，这是树脂柱的基本单位，它工作时的各种物料量都以BV为单位。例如溶液通过树脂柱的流量速度为2～4BV/h，即每小时通过溶液的体积为树脂床容积的2～4倍，树脂的处理能力亦常以BV为单位计算。所得的各浓缩液的浓度皆是生药的浓度。
作为优选方式：在制备治疗脑中风后遗症药物中的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明采用的制备方法，操作简单，得到的目标物纯度高在90%以上，用于治疗脑中风后遗症，效果好。在用本发明的方法之前，目标物的纯度不到90%。
为了证明木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷对于脑中风后遗症的作用，做了如下实验：
实验目的
采用三氯化铁制备局灶性脑缺血大鼠模型，尾静脉注射不同剂量的木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，测算大鼠脑梗塞范围，观察其对脑缺血的保护作用。
实验材料
1.1 供试品
1.1.1 名称：木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，供试品号：TN-1210。
1.1.2 理化性质：黄色粉末。
1.1.3 拟临床适应症：拟开发对脑中风后遗症的治疗作用。
1.1.4 拟临床用量：暂无临床推荐用量。
1.1.5 含量及规格：本品为苦碟子提取的单体化合物，纯度为98.07%。
1.1.6 来源和批号：石家庄以岭药业股份有限公司，批号：20121022。
1.1.7 供试品保管：低温冷藏。
阳性药及工具药
尼莫地平注射液，山东方明药业股份有限公司，批号：1202002。
精氨酸，上海协和氨基酸有限公司，批号：09021156。
盐酸，石家庄市华迪化工工贸有限公司，批号：20100123。
三氯化铁，天津市永大化学试剂有限公司，批号：20100131。
水合氯醛，天津市大茂化学试剂厂，批号：20090228。
红四氮唑（TTC），国药集团化学试剂有限公司，批号：20120210。
甲醛，天津市大茂化学试剂厂，批号：20101109。
生理盐水，石家庄四药有限公司，批号：120421405。
实验系统
1.3.1 动物种系：SD大鼠。
1.3.2 动物级别：SPF级。
1.3.3 动物性别和数量：75只，雄性。
1.3.4 动物年龄：约4-6周龄。
1.3.5 动物体重：180-200g。
1.3.6 动物来源：购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所。
1.3.7 动物合格证号及发证单位、接收日期：合格证编号0295390，许可证号SCXK（京）2009-0017，发证单位是中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，接收日期2012年11月23日。
1.3.8 饲养条件：大鼠笼养，饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心，光照12小时/天，温度20-25℃，相对湿度40-70%。
1.3.9 检疫过程：新到的动物检疫期5天，在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况，以及是否存在疾病和死亡征兆。
1.3.10 饲料：实验动物全价颗粒饲料，由军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证：SCXK（军）2007-005。
1.3.11 饮水：瓶装普通饮用水，动物自由饮用。每日冲洗水瓶并换水一次。
1.3.12 垫料：购自河北省实验动物中心，隔日更换。
1.3.13 标识：动物识别采用5%苦味酸标记。
实验方法
2.1 实验设计依据
2.1.1 采用标准：国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》，附件1-中药、天然药物注册分类及申报资料要求。
2.1.2 实验系统选择说明：实验性脑缺血的动物模型有多种，主要分两大类，即局灶性脑缺血和全脑缺血。但临床上局灶性脑缺血的发生率远高于全脑缺血，单支动脉阻断，尤其是大脑中动脉阻断造成的脑梗塞与人类缺血性卒中最为类似。因此引起局灶性脑梗塞的方法，以大脑中动脉阻断尤为常见。FeCl3局部浸润动脉可使血管内膜剥脱，内膜下组织暴露，通过Fe3+促发羟自由基的产生，引发脂质过氧化，损伤血管内皮，促使血小板粘附聚集并发生释放反应，激发凝血过程，导致血管内血栓形成，阻塞血管，引起脑组织缺血、缺氧，形成局灶性缺血性梗塞灶。本模型成功率高，栓塞位置固定，梗死范围稳定，重复性好，适合药物的药效学评价。
2.1.3委托单位提供资料：木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，黄色粉末，为苦碟子提取的单体化合物，纯度为98.07%，低温冷藏，由石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号：20121022。
剂量与分组
木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷剂量设置参考其对心肌缺血的改善作用（2、10、50mg/kg），本次实验木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷设置低、中、高三个剂量，分别为2.5、5、10 mg/kg，尼莫地平剂量为0.5mg/kg，另设模型对照组，根据以上剂量设置情况，将75只大鼠按体重随机分为下列5组，每组15只，具体分组和剂量见附表1。
给药方法
经尾静脉注射给药。
供试品配制和保存
根据尾静脉注射体积为1ml/100g，木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷纯度为98.07%，计算高、中、低剂量组的配制浓度，分别是1.02、0.51、0.225mg/ml，临用前生理盐水稀释至所需浓度，0.22μm滤膜过滤除菌，每日现用现配。
尼莫地平注射液于尾静脉注射前用生理盐水稀释至0.05mg/ml,每日现用现配。
供试品的给予
用一次性注射器抽取药液进行尾静脉注射，体积为1ml/100g体重，模型组尾静脉给予同体积的生理盐水，均于大脑中动脉栓塞后10min开始给药，连续给药3天。
模型制备
实验动物检疫期结束后开始模型制备，以10%水合氯醛腹腔麻醉，侧卧固定，在眼眦和外耳道中线处剪一小口，暴露颞肌，用止血钳将颞肌夹开，向两侧分开，注意不要损伤面神经。暴露鳞状骨大部分，然后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm钻孔，在手术显微下，用小号直纹钳开约2mm直径小颅窗，显露大脑中动脉。将吸有50%三氯化铁溶液（1mol/L盐酸溶液配制，浓盐酸百分浓度36-38%，物质的量浓度为12mol/L，取8.3-8.5ml盐酸，加水稀释到100ml，即为1mol/L）10μl滴在小片滤纸上，敷在该段大脑中动脉处，放置30分钟后中动脉变黑去掉滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合后回笼饲养，室温控制在25℃左右。
观测的指标、时间和内容
末次给药后3h，麻醉动物，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干后，在冰箱中速冻15min，取出后行冠状切4刀分为5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与叶尾极之间。迅速将脑片置于TTC染液中（5ml染液中含4%TTC 1.5ml，1M K2HPO4 0.1ml，其余加蒸馏水至刻度），37℃避光温孵20min，取出后置于4%甲醛液中避光保存24h。正常组织经染色后呈玫瑰红色，梗塞组织呈白色。将每个脑平面投射到密度均一的铝铂上，小心挖下白色组织并称重，以梗塞组织重量占全脑重量及手术侧半脑重量的百分比作为梗塞范围（%），并以手术侧半脑梗塞范围计算各药物治疗组的抑制率（%）抑制率计算公式如下：
抑制率（%）= ×100%
2.8 相关工作人员通知
购买动物时通知动物室，在动物出现异常情况时通知病理室进行处理。
仪器系统
307-6型台式牙科钻，上海医疗器械股份有限公司齿科医疗厂。
SZ-PT体视显微镜，奥林巴斯，日本。
DT2000电子天平，常熟双杰测试仪器厂。
YP-3000电子天平，上海越平科学仪器有限公司。
AL204电子天平，METTLER POLEDO。
HZQ-F160振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
统计方法
数据用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS统计软件包，首先进行正态性检验，符合正态分布的数据，均数比较用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用最小显著差法，若方差不齐则采用Dunnett’sT3检验行两两比较；如不符合正态分布，则用非参数检验进行统计分析。
结果
梗塞范围结果见附表1：模型组手术侧及全脑梗塞范围分别为6.37%、3.28%。
与模型组比较：木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷低、中、高三个剂量组的术侧及全脑梗塞范围均显著减少（P<0.01），抑制率分别为23.70、37.68、33.12%。尼莫地平对照组术侧及全脑梗塞范围亦显著减少（P<0.01），抑制率为32.03%。
表1
注：各给药组与模型组比较：**P<0.01。
结论
本实验以三氯化铁损伤大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血模型，以TTC为染色剂，观察木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷静脉给药后脑梗塞范围的改变，以此评价其对脑缺血的保护作用。实验结果表明：木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷各剂量组均能显著降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围，具有良好的拮抗脑缺血损伤作用，对于脑中风后遗症有较好的疗效。
讨论
本次实验是设置低（2.5mg/kg）、中（5mg/kg）、高（10mg/kg）三个剂量的木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，采用尾静脉注射给药，观察对脑缺血的保护作用。结果显示木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷对脑缺血有较好的保护作用，与尼莫地平（0.5mg/kg）作用相当。
此外，本次实验第一天给药时，尼莫地平组54号大鼠尾静脉注射失败，将其移入模型组，故模型组动物数为16只。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明：
实施例1
木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤：
提取：称取苦碟子药材10kg，向苦碟子药材中加10倍量的40%乙醇浸泡1小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在60℃减压浓缩得到浓度为1.2g/ml浓缩液Ⅰ；
水沉：向浓缩液Ⅰ中加入6倍量去离子水，将浓缩液Ⅰ的浓度稀释为0.2g/ml 4℃冷藏24h，过滤，滤液备用；
纯化：首先采用大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂6.67kg，湿树脂装柱，将滤液用盐酸调在PH3.5条件下，将滤液上样，上样浓度为0.2g/ml，上样流速为2BV/h，上样后饱和1小时；再用PH3.5的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4BV/h，洗脱体积为6BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6BV/h，洗脱体积8BV，收集洗脱液，在60℃减压浓缩得到浓度为0.2g/ml的浓缩液Ⅱ。
然后进行聚酰胺纯化，称取30目聚酰胺，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样浓度为0.2g/ml，上样流速为2BV/h，上样后饱和1h，先用16BV的水以流速4BV/h洗脱，再用12BV的20%乙醇以流速4BV/h洗脱，除去杂质，然后再用16BV的70%乙醇以流速8BV/h洗脱，收集洗脱液，在60℃减压浓缩得到浓度为0.9g/ml浓缩液Ⅲ。
再用大孔吸附树脂Ⅱ纯化，称取XAD7HP吸附树脂，树脂与生药质量比为2.03:1，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ用饱和Na2CO3调在PH8.5条件下，将浓缩液Ⅲ上样，上样浓度为0.9g/ml，上样流速为1BV/h，上样后饱和30分钟，再用4BV的10%乙醇以流速6BV/h洗脱，收集洗脱液，在60℃减压浓缩得到浓度为15g/ml浓缩液Ⅳ。
最后用高压制备色谱，C18填料与生药质量比为1:3，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，纯度在90%以上。
实施例2
木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤：
提取：称取苦碟子药材20kg，向苦碟子药材中加15倍量的70%乙醇浸泡3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在40℃减压浓缩得到浓度为0.8g/ml的浓缩液Ⅰ；
水沉：向浓缩液Ⅰ中加入3倍量去离子水，将浓缩液Ⅰ的浓度稀释为0.2g/ml 10℃冷藏20h，过滤，滤液备用；
纯化：首先采用大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5，称取HZ820大孔吸附树脂13.4kg，湿树脂装柱，将滤液用盐酸调在PH4.0条件下，将滤液上样，上样浓度为0.2g/ml，上样流速为4BV/h，上样后饱和1小时；再用PH4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为6BV/h，洗脱体积为4BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速8BV/h，洗脱体积6BV，收集洗脱液，在40℃减压浓缩得到浓度为0.5g/ml的浓缩液Ⅱ。
然后进行聚酰胺纯化，称取60目聚酰胺，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样浓度为0.5g/ml，上样流速为4BV/h，上样后饱和1h，先用14BV的水以流速6BV/h洗脱，再用10BV的20%乙醇以流速6BV/h洗脱，除去杂质，然后再用14BV的70%乙醇以流速6BV/h洗脱，收集洗脱液，在40℃减压浓缩得到浓度为1.1g/ml浓缩液Ⅲ。
再用大孔吸附树脂Ⅱ纯化，称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，树脂与生药质量比为2.03:1，将浓缩液Ⅲ用饱和Na2CO3调在PH9.0条件下，将浓缩液Ⅲ上样，上样浓度为1.1g/ml，上样流速为2BV/h，上样后饱和30分钟，再用5BV的10%乙醇以流速8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40℃减压浓缩得到浓度为12g/ml浓缩液Ⅳ。
最后用高压制备色谱或中压制备色谱纯化两次，如果是用高压制备色谱纯化，C18填料与生药质量比为1:3，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。如果是中压制备色谱纯化，C18填料与生药质量比为1:6，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，纯度在90%以上。
实施例3
木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤：
提取：称取苦碟子药材20kg，向苦碟子药材中加12倍量的50%乙醇浸泡2小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在50℃减压浓缩得到浓度为1.0g/ml的浓缩液Ⅰ；
水沉：向浓缩液Ⅰ中加入4倍量去离子水，将浓缩液Ⅰ的浓度稀释为0.25g/ml，6℃冷藏15h，过滤，滤液备用；
纯化：首先采用大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5，称取HZ820大孔吸附树脂13.4kg，湿树脂装柱，将滤液用盐酸调在PH4.0条件下，将滤液上样，上样浓度为0.25g/ml，上样流速为3BV/h，上样后饱和1小时；再用PH4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为5BV/h，洗脱体积为5BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速7BV/h，洗脱体积7BV，收集洗脱液，在50℃减压浓缩得到浓度为0.3g/ml的浓缩液Ⅱ。
然后进行聚酰胺纯化，称取50目聚酰胺，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样浓度为0.3g/ml，上样流速为3BV/h，上样后饱和1h，先用15BV的水以流速5BV/h洗脱，再用11BV的20%乙醇以流速5BV/h洗脱，除去杂质，然后再用15BV的70%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50℃减压浓缩得到浓度为1.0g/ml浓缩液Ⅲ。
再用大孔吸附树脂Ⅱ纯化，称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，树脂与生药质量比为2.03:1，将浓缩液Ⅲ用饱和Na2CO3调在PH9.0条件下，将浓缩液Ⅲ上样，上样浓度为1.0g/ml，上样流速为2BV/h，上样后饱和30分钟，再用5BV的10%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50℃减压浓缩得到浓度为13g/ml浓缩液Ⅳ。
最后用中压制备色谱纯化两次，C18填料与生药质量比为1:6，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷，纯度在90%以上。
Claims (3)
1.一种木犀草素-7- o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取：称取苦碟子，向苦碟子中加10-15倍量40-70%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在40-60℃条件下减压浓缩得到生药浓度为0.8-1.2g/ml的浓缩液Ⅰ；
B、水沉：向浓缩液Ⅰ中加入3-6倍量去离子水，4-10℃冷藏，过滤，滤液备用；
C、纯化：将B步骤中所得滤液依次经过HZ820大孔吸附树脂纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和1小时；再用PH3.5-4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4-6BV/h，洗脱用量为4-6BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6-8BV/h，洗脱用量为6-8BV，收集洗脱液，在40-60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.2-0.5g/ml浓缩液Ⅱ； 聚酰胺纯化，聚酰胺为30-60目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和1h，先用14-16BV水以流速4-6BV/h洗脱，再用10-12BV 20%乙醇以流速4-6BV/h洗脱，除去杂质，然后再用14-16BV的70%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.9-1.1g/ml浓缩液Ⅲ；XAD7HP大孔吸附树脂纯化，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ调PH8.5-9.0上样，上样流速为1-2BV/h，上样后饱和30分钟，再用4-5BV的10%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60℃条件下减压浓缩得到浓度为12-15g/ml浓缩液Ⅳ； 高压制备色谱或中压制备色谱纯化两次，然后按照色谱峰收集目标化合物，然后减压浓缩、冷冻干燥即得，其中所述高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:3，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液；所述中压制备色谱纯化步骤如下：中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:6，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取：称取苦碟子，向苦碟子中加10倍量40%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在60℃条件下减压浓缩得到生药浓度为1.2g/ml的浓缩液Ⅰ；
B、水沉：向浓缩液Ⅰ中加入6倍量去离子水，4℃冷藏，过滤，滤液备用；
C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和1小时；再用PH3.5的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4BV/h，洗脱用量为6BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6BV/h，洗脱用量为8BV，收集洗脱液，在60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.2g/ml浓缩液Ⅱ；
D、将步骤C中所得浓缩液Ⅱ通过聚酰胺纯化，聚酰胺为30目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和1h，先用16BV水以流速4BV/h洗脱，再用12BV 20%乙醇以流速4BV/h洗脱，除去杂质，然后再用16BV的70%乙醇以流速8BV/h洗脱，收集洗脱液，在60℃条件下减压浓缩得到浓度为0.9g/ml浓缩液Ⅲ；
E、将步骤D中所得浓缩液Ⅲ通过大孔吸附树脂Ⅱ，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ调PH8.5上样，上样流速为1BV/h，上样后饱和30分钟，再用4BV的10%乙醇以流速6BV/h洗脱，收集洗脱液，在60℃条件下减压浓缩得到浓度为15g/ml浓缩液Ⅳ；
F、将步骤E中所得浓缩液Ⅳ通过高压制备色谱纯化，高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:3，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取：称取苦碟子，向苦碟子中加12倍量40-70%乙醇浸泡2小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在50℃条件下减压浓缩得到生药浓度为1.0g/ml的浓缩液Ⅰ；
B、水沉：向浓缩液Ⅰ中加入4倍量去离子水，6℃冷藏，过滤，滤液备用；
C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂Ⅰ纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH4.0条件下，将滤液上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和1小时；再用PH4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为5BV/h，洗脱用量为5BV；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速7BV/h，洗脱用量为7BV，收集洗脱液，在50℃条件下减压浓缩得到浓度为0.3g/ml浓缩液Ⅱ；
D、将步骤C中所得浓缩液Ⅱ通过聚酰胺纯化，聚酰胺为50目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液Ⅱ上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和1h，先用15BV水以流速5BV/h洗脱，再用11BV 20%乙醇以流速5BV/h洗脱，除去杂质，然后再用15BV的70%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50℃条件下减压浓缩得到浓度为1.0g/ml浓缩液Ⅲ；
E、将步骤D中所得浓缩液Ⅲ通过大孔吸附树脂Ⅱ，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液Ⅲ调PH9.0上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和30分钟，再用5BV的10%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50℃条件下减压浓缩得到浓度为13g/ml浓缩液Ⅳ；
F、将步骤E中所得浓缩液Ⅳ通过中压制备色谱纯化，中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:6，纯化两次，按照色谱峰收集木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得木犀草素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷。
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