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CN1042546A - 抗体-药物结合物 - Google Patents

抗体-药物结合物 Download PDF

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CN1042546A
CN1042546A CN89108469A CN89108469A CN1042546A CN 1042546 A CN1042546 A CN 1042546A CN 89108469 A CN89108469 A CN 89108469A CN 89108469 A CN89108469 A CN 89108469A CN 1042546 A CN1042546 A CN 1042546A
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CN
China
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antibody
group
binding substances
medicine
carboxylic acid
Prior art date
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Withdrawn
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CN89108469A
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English (en)
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罗素·拉维恩·巴顿
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

使用由丙二酸酯构成的连接子制备了药物与抗体或其抗原识别片段的结合物，其中抗体或其片段通过羰基连接到丙二酸酯的一个羧基上的酯或酰胺基上，而药物则通过亚甲基连接到丙二酸酯的2位碳原子上。

Description

本发明属于有机化学、药物化学和免疫学领域，本发明提供了抗体与药物的结合物。该结合物可用于药物的定靶施用，即抗体将药物传递至需要此药物的组织或细胞。抗体与药物的结合通过双价连接子完成，该连接子在一个键合点与抗体结合，而在另一点与药物结合。本发明还提供了制备结合物的中间产物。
药物化学提供了日益增多的特异性高效药物以治疗和预防疾病。但直至最近，还没有一种方法可将药物传递至身体中需要它的特定部位。因此，虽然通常能够使用具有所需特异效应的药物来治疗病人，并且对身体没有其他副作用，但仍然必须按全身剂量给药。而另一方面，如果有可能将药物传递至需要治疗的器官、组织甚或细胞，则通常能够施用极少的总剂量，因为药物将浓缩于需要它的地方。这对于病人的安全性和药物的经济使用来说都具有明显的优越性。
近年来，免疫学领域一直在尝试通过使药物与抗体结合而达到定靶治疗的目的，而这种抗体是针对于与药物需要位点相结合的特异抗原的。目前，关于这种抗体药物结合物的专利和科学文献已为数不少了。但直至最近，还没有一种抗体药物结合物获准用于治疗目的。
本发明提供了一种具有下式的生理上可接受的药物结合物
Figure 89108469X_IMG19
其中
Ab是抗体或其识别抗原的片段，它识别与需要传递药物的细胞相结合的抗原;
Q是-NH-，-O-或-S-;
R-Q-是药物残基，它具有可参与反应的氨基、羟基或巯基;
R1是羧酸保护基团;
Y是-O-，-NH-，-NCH3-或-NC2H5-;
n是1至大约8的整数;
m是1至大约10的整数。
本发明还提供了含有本发明结合物及非肠道施用基质的药物组合物，并提供了治疗方法，该方法包括对需要该药物治疗的病人非肠道施用本发明的结合物。
本发明还提供了具有下式的中间产物丙二酸酯
Figure 89108469X_IMG20
其中
R2是羟基、羧酸保护基团或构成羧酸盐的半分子;
R3是羟基、羧酸保护基团、羧酸活化基团或构成羧酸盐的半分子子;
R4是C1-C4烷氧基。
本发明进一步提供了具有下式的修饰抗体或抗体片段
本发明还提供了具有下式的衍生药物
Figure 89108469X_IMG22
本发明进一步提供了制备上述式Ⅰ的药物结合物的方法，包括
（A）使上述式Ⅲ的修饰抗体与式子为R-QH的药物反应，其中Q和R-Q-如上面所定义;或
（B）使上述式Ⅳ的衍生药物与上述式子为Ab的抗体或抗体片段反应。
在本说明书中，所有温度都是指摄氏温度。除非特别指出，所有百分比、浓度等都是重量单位。药物结合物中的所有浓度和剂量都是指结合物中所含药物的浓度或数量。
在上述通式中，术语C1-C4烷氧基是指甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和各种异构体的丁氧基，包括n-丁氧基和t-丁氧基。
在本申请文件中，化合物一般都将称为丙二酸酯。但是，其中Y是氨基的那些化合物应当称为丙酰胺酸酯，在特别提到这种化合物时将使用这一术语。
术语羧酸保护基团是指能用于在其他位点进行反应时保护羧酸的有机基团。这种基团在合成化学中使用得极为广泛，尤其是在肽化学领域，保护基团是有机化学家众所周知的。关于这方面特别方便的教科书是Greene所著的《有机合成中的保护基团》（John        Wiley        and        Sons，New        York，1981）。Greene在第5章中讨论了酸保护基团。本发明中最优选的保护基团是低级烷氧基，尤其是乙氧基。根据Greene的著作，进一步优选的方便的酸保护基团包括例如甲氧基甲氧基、四氢吡喃氧基、四氢呋喃氧基、苄氧甲氧基、苯甲酰甲氧基和取代的苯甲酰甲氧基、2，2，2-三氯乙氧基和其他的卤代乙氧基、三甲基甲硅烷乙氧基、甲硫乙氧基、甲苯磺酰乙氧基、t-丁、氧基、环戊氧基、苄氧基、二苯基和三苯基甲氧基等，以及酰胺形成基团如氨基、乙氨基、二甲氨基、吡咯烷子基、吗啉代、哌啶子基、二乙氨乙氨基、吗啉代乙氨基、苄甲氨基乙氨基等。
术语羧酸活化基团包括合成有机化学中用以提高羧酸反应活性的基团。这种基团合成化学家经常使用，包括例如苯磺酰氧基、甲烷磺酰氧基、甲苯磺酰氧基、苯二甲酰亚氨氧基、琥珀酰亚胺氧基、氯、苯并三唑氧基、溴、迭氮基等。本发明中优选的活化基团是N-琥珀酰亚胺氧基、苯二甲酰亚氨氧基和苯并三唑氧基。
术语构成羧酸盐的半分子是指通常意义上的化学半分子，它通过氧原子连接后构成羧酸的盐类。例如，最好使用这样的盐形成半分子，如碱金属、胺基和季铵基团。更具体说，更为优选的半分子是钠、钾、锂、C1-C4烷基氨基、二烷基氨基和三烷基氨基以及其中的氮原子被四个氢、C1-C4烷基、苯基或苄基取代的季铵基团。作为进一步的例子，可以方便地选来用作半分子的季铵基团有铵、四甲基铵、二乙基二甲基铵、二乙基二丁基铵、苄基三甲基铵、t-丁基三甲基铵、苯基三乙基铵、二乙基二丙基铵、s-丁基三甲基铵、异丁基三乙基铵等。进一步，胺类例如甲胺、丁基胺、三乙基胺、二丙基胺、二乙醇胺等也可方便地用于盐的形成。
本发明的药物结合物由抗体、某些化学类型的药物和连接抗体与药物的有机化学基团组成。本发明还提供了用于制备所述结合物的中间产物丙二酸酯，以及通过抗体或抗体片段与活化形式的丙二酸酯中间产物反应而产生的修饰抗体。下面，将首先分别讨论抗体和药物，然后说明丙二酸酯中间产物及其合成，最后给出合成实例及结合物的生物学性能。
抗体
应当认识到，本发明的药物结合物的功能是由药物的生物学效能和抗体的抗原选择性决定的。所选择的抗体应当识别与将要传递特殊药物的细胞相结合的抗原。例如，如果药物是抗肿瘤的，则所选择的抗体应当识别与肿瘤细胞相结合的抗原。如果药物是抗细菌的，例如一种头孢菌素，则应当选择识别细菌抗原的抗体。根据所用药物的特性，在一给定条件下可优先选择被细胞内化的抗体，或可以优先使用通过识别表面抗原而保留在细胞表面的抗体。
抗体的来源对于本发明并不是重要的。它可以从免疫球蛋白的任何一类或亚类中选择，包括IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。同样，来源的种也不是重要的，只要抗体能定靶于药物可发挥作用的细胞就行。
在现有技术中，药物结合物中使用最多的是单克隆抗体，本发明也优先使用它们。但并不排除多克隆抗体。一种更新的抗体是嵌合抗体，它是由实验室重组技术制备的，该技术能够表达修饰过的DNA分子，这种分子可编码任何所需抗体的抗原结合区，并且还可编码任何其他的所需氨基酸顺序。因此，本发明可以得到并使用这样的嵌合抗体。其中一部分来自一个种，另一部分来自另一个种。
抗体的来源和特性并不是重要的，只要它能定靶于待治疗的细胞并对病人无毒性就行。普通技术人员很容易用候选抗体制备结合物并对其作出评价。为方便起见，下面将讨论评价抗体和结合物的方法。首先，抗体应当由足够稳定的杂交瘤产生，以制备足够数量的抗体。抗体本身应当能经受纯化过程，尤其应当有足够的水溶性，以能够用需要的浓度进行化学操作。
首先评价用候选抗体制备的结合物的抗原结合能力。游离抗体的结合能力可能会有可以接受的适度下降。然后，测定结合物针对抗原阳性细胞的体外效能，例如抗癌药物的细胞毒性。在同样的检测中，有效结合物的效能可能比游离药物的稍低，这是因为它能够将药物高浓度地集中于细胞。然后，根据Johason和Laguzza的方法（Cancer        Res.47∶3118-22，1987），利用裸鼠人肿瘤异体移植模型评价通过了前两种测试的结合物。在裸鼠中测试候选结合物时，应当与游离药物、游离药物与游离抗体的混合物、与非定靶免疫球蛋白的结合物作比较，候选结合物应当比它们有更好的效能或安全性。在异体移植模型中应当进行剂量范围的研究。
再对异体移植模型中有效的结合物进行动物测试，已知所用动物能表达与人体相似形式的抗原。如果结合物在这种测试中与抗原有显著的结合作用，并且如果它在由上述异体移植模型预测有治疗效应的剂量下基本上没有毒性，则此候选结合物可被认为是具有治疗潜力的。
应当理解，正确选择的抗体片段与完整抗体具有相同的效应。因此在实施本发明时，识别与待治疗细胞相结合抗原的抗体片段，尤其是F（ab′）2片段，可与完整抗体一样使用。
式Ⅰ中并未给出连接基团与抗体反应并附着于抗体的严格的机理，因为这一点并不十分清楚。如下所示，该反应也许是酰化作用，抗体分子上有若干可进行酰化作用的位点。通常认为，抗体的酰化作用发生于赖氨酸残基的游离氨基上。然而，酰化作用也能开始于羟基、苯酚基、咪唑环及其他基团。
式Ⅰ指出，有1至大约10个连接子-药物半分子附着于抗体的每个分子。当然，每个抗体分子上的这种半分子数目是平均数，因为，在一批给定的结合物所含的分子中，药物-连接子与抗体的比例必定落在一个范围中。如果使每个抗体分子上附着若干药物分子，则当然能使价格昂贵的抗体得到最大效率的使用。但是，附着过多的药物-连接子半分子，通常会使抗体识别和结合其抗原的能力受到不利影响，因此必须找到一个合适的m值。一般说来，优选的m值为大约4至大约10;另一优选值为大约3至大约8。
有大量的抗体可为免疫学家用于本发明中，在每一期的有关杂志中，都正在公开进一步有用的抗体。不可能也没必要穷举能够用于本发明的抗体。普通的免疫学家和化学家完全能够从下述来源选择抗体，例如美国典型培养物收集中心目录（Rockville，Ma        yland，U.S.A.）和Linscott′s        Directory        of        Immunological        and        Biological        Reagents（Linscott′s        Directory出版，40        Glen        Drive，Mill        Valley，California，U.S.A.94941）。因此，本领域的普通技术人员很容易选择针对几乎任何决定基的抗体，例如肿瘤、细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体，或组织相容性抗原，以及病原体表面抗原、毒素、酶、变应原和与生理重要细胞相关的其他类型的抗原。
本发明最优选的用途是将细胞毒性药物传递给癌细胞，尤其包括鳞状癌细胞、腺癌细胞、小细胞癌细胞、glyoma细胞、黑素瘤细胞、肾细胞癌细胞、移行细胞癌细胞、肉瘤细胞、支持肿瘤维管结构的细胞、淋巴类肿瘤细胞如白血病和淋巴瘤。可以得到定靶于所有这些细胞的合适抗体，在Linscott中可找到其来源。另外，通过常规方法生产这种抗体的必需杂交瘤可得自ATCC和其他的细胞系收集中心。
目前已知的若干抗体尤其适用于本发明的抗肿瘤方面。例如，一个优选的特异抗体是L/1C2，由ATCC杂交瘤HB9682产生。
另一种有用的抗体是KS1/4，它是首先由Varki等人公开的（Cancer        Research        44∶681-86，1984）。含有单克隆抗体KS1/4不同区域编码顺序的若干质粒现在已经保藏，并可从北方地区研究实验室（Northern        Regional        Research        Laboratory        Peoria，IL，USA）得到。普通技术人员能够使用这些质粒通过重组技术生产嵌合抗体，该抗体与以高密度存在于腺癌细胞上的表面抗原结合。1989年4月18日提交的欧洲专利申请89303814.1详细讨论了这种抗体的构建方法。下述质粒涉及KS1/4。
质粒pGKC2310，轻链、与轻链结合的信号肽及5′和3′非转译区的编码顺序，分离自大肠杆菌K12MM294/pGKC2310（NRRLB-18356）。
质粒pG2A52，重链的编码顺序、与重链结合的信号肽及5′和3′非转译区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        MM294/pG2A52（NRRL        B-18357）。
质粒CHKC2-6，轻链可变区的编码顺序、与轻链结合的信号肽的编码顺序、以及人IgG轻链恒定区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        DH5/CHKC2-6（NRRL        B-18358）。
质粒CHKC2-18，衍生的轻链可变区的编码顺序、与轻链结合的信号肽的编码顺序以及人IgG轻链恒定区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        DH5/CHKC2-18（NRRL        B-18359）。
质粒CH2A5，重链可变区的编码顺序、与重链结合的信号肽的编码顺序及人IgGl的重链恒定区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        MM294/CH2A5（NRRL        B-18360）。
质粒CH2A5IG2，重链可变区的编码顺序、与重链结合的信号肽的编码顺序以及人IgG2的重链恒定区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        DH5/CH2A        5IG2（NRRL        B-18361）。
质粒CH2A5IG3，重链可变区的编码顺序、与重链结合的信号肽的编码顺序以及人IgG3的重链恒定区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        DH5/CH2A        5IG3（NRRL        B-18362）。
质粒CH2A5IG4，重链可变区的编码顺序、与重链结合的信号肽的编码顺序以及人IgG4的重链恒定区的编码顺序;分离自大肠杆菌K12        DH5/CH2AIG4（NRRL        B-18363）。
由ATCC杂交瘤HB21产生的抗体5E9Cll识别转铁蛋白受体，后者可由许多肿瘤表达。可由国立癌症研究所得到的称为B72.3的抗体识别由乳腺和结肠癌表达的抗原。
OKT3和OKT4是两种具有针对非肿瘤抗原有反应活性的有用抗体，它们分别与外围T细胞和人体T辅助细胞结合。它们分别由保藏于ATCC的杂交瘤CRL8001和CRL8002产生。
下面列出了可用于不同治疗目的的抗体的其他来源。可用于免疫调节和肿瘤治疗的抗人淋巴细胞和单核细胞抗体，由ATCC培养物HB2、HB22、HB44、HB78和HB136产生。可用于肿瘤治疗的抗转铁蛋白受体抗体，由ATCC培养物HB84产生。ATCC培养物HB8059产生针对结直肠癌单唾液酰神经节苷脂的抗体;培养物HB8136产生针对成熟的人T细胞表面抗原的抗体，它可用于免疫调节和T细胞白血病的治疗。
更进一步，ATCC杂交瘤HB9620将产生一种方便的抗癌胚抗原的抗体CEM231.6.7。
免疫学家或本领域的普通技术人员，借助于本领域的公知出版物和上述指导性实例和描述，可以方便地选择一种抗体，以将任何合适的药物定靶传递至需用该药物治疗的任何细胞。
药物
应当理解，本发明的实质是通过上述丙二酸酯连接子连接药物和抗体的方法，而药物和抗体都不限制本发明。因此，本发明的丙二酸酯连接子可有利地用于任何治疗或预防目的的药物，而只受到这样的限制：即药物必须具有与丙二酸酯连接的化学功能团，以及抗体必须定靶于该药物能发挥有益作用的细胞。本发明提供的亚甲基连接机理需要药物具有可参与反应的氨基、羟基或硫醇功能团。进一步，药物必须具有这样的特性，即可参与反应的功能团与连接子的反应不会破坏药物的活性。
因此，本发明的连接子可用于几乎所有种类的药物的连接，例如包括抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗癌药物、抗支原体药物等。这样构建的药物结合物能有效地实现相应药物的效力，并具有更优越的效能，因为抗体能够将药物传递给特别需要此药物的细胞。
美国专利4，671，958提供了可进行药物连接的药物和其他化合物的信息，该专利中有关药物的公开被作为本发明的参考文献。
如前所述，药物通过其氨基、羟基或硫醇基团反应。这些术语是以其扩展意义使用的;也就是说，术语“氨基”包括作为羧基酰胺、酰肼、氨基甲酸酯等的一部分的氨基，以及简单地附着于碳氢化合物结构上的氨基。一个氨基上可以有第三个小的取代基，只要该基团不产生阻止与丙二酸酯反应的空间障碍就行。这种基团可以是例如直链烷基等。
同样，羟基或硫醇基可以是羧酸或硫代酸的一部分。
虽然本发明包括使用任何化学类型以及任何治疗或预防效能的药物，但优选使用具有可参与反应的氨基的药物。更优选使用氨基是酰肼或酰肼半分子一部分的药物。
用于本发明的最有效的药物是细胞毒性药物，尤其是那些用于治疗癌症的药物。一般说来，这种药物包括烷基化剂、抗增殖剂、微管蛋白结合剂等。优选的细胞毒性药物包括例如柔毛霉素类药物、长春花碱药物、丝裂霉素、博菜霉素、细胞毒性核苷、蝶啶类药物、及鬼臼毒素等。而这些药物中特别有用的药物包括例如阿霉素、柔毛霉素、氨基蝶啶、氨甲蝶呤、甲蝶呤、二氯氨甲蝶呤、丝裂霉素C、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素、鬼臼乙叉甙、苯丙氨酸氮芥、长春花碱、长春新碱、长春西定、长春花碱酰胺、长春素等。应当理解，为了使反应更为方便地进行，普通专业人员可对优选的和一般的化合物作一些适当的化学修饰。
还应当理解，优选的结合物是由优选的药物制备的。
本发明中作为药物使用的一组更为高度优选的细胞毒性药物包括具有下列式子的药物。
其中R5是氢或羟基;
其中R6是氨基或羟基;
R7是氢或甲基;
R8是氢、氟、氯、溴或碘;
R9是羟基或构成羧酸盐的半分子;
Figure 89108469X_IMG25
其中R10是氢或甲基;
Figure 89108469X_IMG26
其中R11是氨基、C1-C3烷基氨基、二（C1-C3烷基）-氨基或C4-C6众亚甲基氨基;
其中，一个R12是一个键，而其他的则是氢;
Figure 89108469X_IMG29
其中R13是氢或甲基;
R14是甲基或噻嗯基;
其中R15是H、CH3或CHO;R17和R18单独看待时，R18是H，R16和R17之一是乙基，另一个则是H或OH;当R17、R18与它们与之结合的碳原子一起看待时，它们构成一个环氧乙烷环，此时R16是乙基;R19是氢、（C1-C3烷基）-CO或氯取代的（C1-C3烷基）-CO;
p是0或1;
R20是一个键或（C2-C4烷基）-X;
X是-O-、-S-或-NH-;
Figure 89108469X_IMG31
其中R21是一个具有下式的碱基
Figure 89108469X_IMG32
其中R22是氢、甲基、溴、氟、氯或碘;
R23是-OR12或-NHR12;
R24是氢、溴、氯或碘。
在以上的优选结构式中，式Ⅴ的化合物代表柔毛霉素（或亚德里亚霉素）组的化合物，式Ⅵ代表氨甲蝶呤组的化合物;式Ⅶ代表丝裂霉素;式Ⅷ代表博菜霉素;式Ⅸ代表苯丙氨酸氨芥;式Ⅹ代表6-巯基嘌呤;式Ⅺ代表阿糖胞苷;式Ⅻ代表鬼臼毒素;式ⅩⅢ代表长春花碱药物;式ⅪⅤ代表二氟核苷。
在这些优选的药物中，最优选的是长春花碱药物和柔毛霉素类的药物;另一类优选的药物包括长春花碱药物、柔毛霉素类和氨甲蝶呤类。
另一类优选药物包括6-巯基嘌呤、二氟核苷和阿糖胞苷。还有一类优选药物包括二氟核苷、长春花碱药物和柔毛霉素药物。
优选药物中的另一优选组包括通过氨基连接的那些药物。
用于本发明中的长春花碱药物是本领域内已知的，尤其可参阅Cullinan等人和Trouet等人的各种专利和出版物。关于本发明中所用长春花碱药物的合成，尤其可以参见Cullinan的4，203，898号美国专利。
最高度优选的药物是上述式ⅩⅢ的长春花碱化合物。应当理解，结构式所包括的化合物是具有若干不同普通名或俗名的药物或其衍生物。因此，为了简化长春花碱药物的复杂命名，它们在本申请文件中将作为长春花碱的衍生物命名。应当理解，长春花碱即是上式的化合物，其中，R15是甲基，R16是乙基，R17是羟基，R18是氢，R19是乙酰基，而C23处的羰基是甲酯的形式，而不是上面所示的羧基酰胺。
下表给出了一些本发明中所用的长春花碱药物。
表Ⅰ
R15R16R17R18R19P R20
H H C2H5H H O -
CH3C2H5OH H H 0 （CH2）2O-
CHO C2H5H H COCH31 -
CHO OH C2H5H COC2H51 （CH2）3S-
CH3C2H5环氧乙烷 COCH（CH3）21 （CH2）4NH-
H C2H5H H COCH2Cl 0 （CH2）2NH-
CH3C2H5环氧乙烷 COCHClCH2Cl 1 CH2CH2（CH3）CH2O-
H C2H5环氧乙烷 COCCl31 C（CH3）2CH2O-
CHO OH C2H5H CO（CH2）2CHCl20 C（CH3）CH2CH2NH-
CH3H C2H5H H 0 （CH2）2S-
CH3C2H5OH H H 1 CH（CH3）CH2NH-
美国专利4，692，434记载的二氟核苷提供了若干能够通过氨基或羟基与连接基团反应的位置。一种尤其优选的式ⅩⅣ的药物是2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷，它也可以命名为1-（2-氧代-4-氨基-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖。应当理解，该化合物可以在5′-羟基、3-羟基或碱基上的氨基处反应以形成结合物。
由于二氟核苷在本领域中相对来说比较新，为了确保理解给出下面一组二氟核苷。
1-（5-甲基-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（5-溴-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（5-氯-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（5-碘-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（4-氨基-5-氯-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（4-氨基-5-溴-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（4-氨基-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（4-氨基-5-甲基-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-〔5-（2-溴乙烯基）-4-羟基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-〔4-氨基-5-（2-溴乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-〔4-氨基-5-（2-碘乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-〔5-（2-氯乙烯基）-4-羟基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-〔4-羟基-5-（2-碘乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-〔4-氨基-5-（2-氯乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（2-氨基-6-氧-1H，9H-嘌呤-9-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（6-氨基-9H-嘌呤-9-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（5-氟-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（5-溴-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（5-氯-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（5-碘-2，4-二氧-1H，3H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（4-氨基-5-氟-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟核糖
1-（4-氨基-5-氯-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（4-氨基-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（4-氨基-5-氟-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（4-氨基-5-甲基-2-氧-1H-嘧啶-1-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-〔5-（2-溴乙烯基）-4-羟基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-〔4-氨基-5-（2-溴乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-〔4-氨基-5-（2-碘乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-〔5-（2-氯乙烯基）-4-羟基-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-〔4-羟基-5-（2-碘乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-〔4-氨基-5-（2-氯乙烯基）-2-氧-1H-嘧啶-1-基〕-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（2-氨基-6-氧-1H，9H-嘌呤-9-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖
1-（6-氨基-9H-嘌呤-9-基）-2-脱氧-2，2-二氟木糖。
由下列限制所描述的化合物是尤其优选的长春花碱药物。下面的各种不同限定能够结合起来，以形成进一步更加限制的优选类别。
A.R15是甲基;
B.R15是氢或甲酰基;
C.R16是乙基;
D.R18是氢;
E.R16和R17之一是乙基，另一者是氢或羟基;
F.R17是羟基;
G.R19是氢;
H.R19是乙酰基;
I.R19是C1-C3烷基-CO;
J.P是l;
K.R20是一个键;
L.R20是（C2-C4烷基）-X;
M.P是O;
N.X是-NH-;
O.X是-O-或-S-;
P.R20是乙氧基，乙基硫或乙氨基;
Q.R20是一个键;
R.R20是（C2-C4烷基）-NH-。
中间产物
本发明的中间产物丙二酸酯是与抗体和药物反应所产生的中间产物。因此，中间产物丙二酸酯是使抗体与药物结合的连接子的前体;因此，优选的中间产物丙二酸酯将其结构赋予优选的结合物。
此中间产物是丙二酸的衍生物，根据已知方法或者普通的有机化学专业人员很容易想象的方法制备。但为了保证使读者理解，下面根据不同的基团给出了一组化合物。
Figure 89108469X_IMG33
Figure 89108469X_IMG34
下面是优选的中间产物丙二酸酯的不同亚组。应当理解，优选的亚组可以结合起来以形成进一步限制的优选组。
A.R4是C2-C3烷氧基;
B.R4是乙氧基;
C.R2是羟基或形成盐的半分子;
D.R2是一个保护基团;
E.R2是一个通过氧原子连接的保护基团;
F.R2是一个通过氮原子连接的保护基团;
G.R2是一个烷氧基;
H.R2是一个氨基或烷基氨基;
I.R3是一个活化基团;
J.R3是一个保护基团;
K.R3是羟基或形成盐的半分子;
L.R3是N-琥珀酰亚胺氧基、N-苯二甲酰亚胺氧基或N-苯并三唑氧基;
M.n从1至大约3;
N.n从1至大约6;
O.n从大约3至大约8;
P.n从大约5至大约8;
Q.Y是-O-;
R.Y是-NH-;
S.Y是-NCH3-或-NC2H5-。
修饰抗体
修饰抗体是制备给合物的中间产物，它由除药物外的全体结合物构成。它们是通过中间产物丙二酸酯与抗体反应而制备的，所用方法将在本文下面的合成部分中描述。
优选的修饰抗体是由优选的各组丙二酸酯中间产物与优选抗体反应而制备的。为了便于理解，下面将给出一组典型的修饰抗体。由于很难对这些复杂分子命名，因此这些化合物不是用其化学名称，而是通过其组成的变化加以鉴别。此处提及的抗体是免疫学领域公知的。
〔表Ⅲ见27页〕
衍生药物
本发明的衍生药物是中间产物，通过使药物与中间产物丙二酸酯反应而形成，它用来通过与抗体反应而形成结合物。在上面的衍生药物的定义式中，R、R1、R3、Y和n的广泛定义和优选意义与上面讨论的一样，但应当清楚地理解，通过选择不同的所需可变基团，尤其是优选的中间产物丙二酸酯，能够制备任何所需的或优选的衍生药物。衍生药物按下面合成部分讨论的方法制备。
合成
有机化学家们将会理解，在本合成的许多步骤中，必须保护起始化合物和中间产物上的各种反应基团，当所需的反应在其他反应基团上进行时。而反应结束以后，则一般需要去除这些保护基团。这种保护和去保护作用在有机化学中完全是常规方法，本申请文件中无须对此多加说明。但应注意，在上述Greene的关于保护基团的教科书中，详细说明了所有常规的反应基团的保护基，包括羟基、硫醇基、氨基等，并概述了安置和去除这些保护基的方法。
中间产物丙二酸酯的合成
根据一般常识和普通文献，一个普通的有机化学工作者就能够制
Figure 89108469X_IMG35
备任一种中间产物丙二酸酯。但优选的制备方法是以丙二酸衍生物为起始，其中在一个羧基上有一个羧酸保护基，R2。另一个羧基可以相同或不同的方式取代。在不同的情况下，非R2基必须比R2基更易去除。使起始化合物与卤代链烷酸酯或氨基链烷酸酯反应，其烷基链的长度提供了几个亚甲基。卤代链烷酸酯用来制备Y是氧的中间产物，以产生一个酯键连接。这时卤素原子（或其他易去除基团）位于链的端部。氨基链烷酸酯中的氨基位于链的端部，它用来制备Y是氨基的中间产物。链烷酸酯的酯部分是一个酸保护基，R3。
该反应如下进行：去除起始化合物和非R2基，然后使这样形成的羧酸基与链烷酸酯反应。通过初始还原已成功地进行了此反应，例如，在环己二烯的存在下使用加氢催化剂。另外，可在合适的催化剂（例如贵重金属催化剂）存在下使用加氢作用。
也可以通过用强碱分解非R2酯而进行反应，尤其是使用在含水溶剂（如含水丙酮）中的氢氧化锂。羧酸根形成以后，加入卤代链烷酸酯，则中间产物丙二酸酯迅速形成，尤其是在一种酸清除剂的存在下。然而，如果用氨基链烷酸酯进行反应，则应当通过加入一种上述的活化基团而使羧酸根活化，然后进行反应以形成丙二酸酯。
上述反应形成中间产物丙二酸酯，在R3上有一个酸保护基，但缺失R4-CH＝部分。该基团（即烷氧亚甲基）通过使第一个中间产物与适当的烷基原甲酸酯在路易斯酸（例如氯化锌）存在下反应而插入。该反应在较高的温度下进行，范围为100-200°，反应在几小时内完成。
在上述反应中，以及在下述的其他方法中，无须使用大为过量的起始化合物。就象有机化学中的一般情况那样，最好使用适度过量的相对廉价的反应剂，以确保更为昂贵的反应剂被完全消耗。在与抗体本身反应时这一原则尤为重要，因为抗体一般都相当昂贵并难于制备和纯化。但一般说来，过量反应剂的选择应考虑到使该方法最为经济，既要考虑到成分的费用还要考虑设备的生产能力，不应仅仅为了促使反应的发生而使用过量的反应剂。
与药物的反应
使中间产物丙二酸酯与药物在这样的条件下反应：该条件能使烷氧基R4切除，而使剩余的亚甲基与药物的活性氨基、羟基或硫醇基反应。一般说来，反应在温和条件下进行，从0°左右到50℃左右，在不与任一种反应剂反应的有机溶剂或这种有机溶剂的含水混合物中进行，并且通常存在有温和碱例如碱金属碳酸氢盐、碳酸盐和氢氧化物。反应一般是定量的，不需要大为过量的反应剂。但产物的分离可能需要在高压下层析或其他的复杂方法，因为非常小心地纯化衍生药物通常是很要的。由于衍生药物要与抗体反应才能构成结合物，因此伴随衍生药物的任何活性杂质都将消耗抗体的反应位点，从而浪费耗资昂贵而制备的抗体。
在药物具有多重反应位点的情况下，例如具有多羟基的核苷，通常必须阻断药物上不想使用的反应基团。这种阻断通过讨论过的保护基进行，这对于有机化学家来说并没有特殊的困难。
羧酸保护基R3可在与药物反应之前或之后从中间产物丙二酸酯上除去。如果必须在药物上使用保护基，则完全能够在除去R3保护基的同样条件下除去这些基团，从而以双倍的效率利用了去保护步骤。
修饰抗体的合成
使抗体与活性形式的中间产物丙二酸酯反应，即中间产物丙二酸酯的R3基团是上面说明过的羧酸活化基团。活化基团是通过使用常规的酯化剂如碳化二亚胺而连在羧酸（R3是氢）上的，尤其是二环己基碳化二亚胺。这种反应是在通过适当的方法（根据所用的保护基）除去酸保护基R3后进行的。与活化基团的反应是在惰性有机溶剂中进行的，例如二噁烷、四氢呋喃、氯化碳氢化合物等，并可在0-50°的适度温度下进行。
在选择使中间产物丙二酸酯与抗体反应的条件时，主要应考虑维持抗体的稳定性。反应必须在含水基质中进行，其组成不应伤害抗体。一种尤其合适的含水基质是硼酸缓冲液，其中，硼酸盐离子的浓度在0.1-0.5M的范围内。另一种可进行反应的合适的含水基质是生理缓冲盐水。反应基质的pH应是微碱性，在大约7-9的范围内。虽然反应基质应是水溶液，但少量有机溶剂的存在没有坏处，也许还非常有益。例如，最好是将中间产物丙二酸酯溶于少量有机溶剂例如二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、二噁烷或乙二醇醚中，并将有机溶液加至在基质水溶液中的抗体溶液中。
一般说来，必须以相对较低的浓度进行反应，因为抗体的溶解度一般都较低。例如，抗体浓度一般在大约5-25mg/毫升基质水溶液。
如上所述，每摩尔抗体结合有大约1至10摩尔的连接子和药物。为了达到这一结合比例，通常需要使用过量的连接子中间产物。抗体与活性酯在酰化条件下的反应活性略有不同，但一般说来，在该方法中，每摩尔抗体使用大约5至15摩尔左右的连接子中间产物。
使酰化反应在大约0°至40°左右的温度下进行几分钟至几小时。显而易见，较高的温度可能伤害抗体，因此最好在低温下进行反应，尤其是该反应本身很迅速。
制备好了具有连接基团的衍生抗体后，则如下面的实例所示，通过常规方法层析反应混合物，以从未反应的连接子中间产物中分离出衍生抗体。
结合物的合成
制备好修饰药物后，作为结合物制备的最后一步，使之与抗体反应，上述涉及与抗体反应时应注意的地方在这儿是完全适用的。选择抗体用量和衍生药物用量之间的比例时遵循同样的原则。一般说来，反应条件的选择必须考虑抗体的稳定性，因为药物可望忍受任何抗体能忍受的条件。
衍生药物必须转化为活性形式，即R3处是羧酸活化基团，转化反应在如上所述的修饰抗体合成条件下进行。
另一方面，制备好修饰抗体后，最后一步是使之与药物反应，必须小心确保抗体的稳定性。
因此，优选的方法是制备衍生药物，然后作为最终步骤使之与抗体反应。修饰抗体与药物的反应必须在较低温度下进行，例如从0°至40°左右，在抗体能够接受的基质中进行。例如，尤其合适的反应基质是硼酸缓冲液，尤其是pH为大约7至9的0.1-0.5M硼酸钠缓冲液。但反应也可以在硼酸缓冲液、微酸性磷酸缓冲液、生理盐水等中进行。反应基质中有少量有机溶剂没有害处，如上所述，只要该溶剂没有损伤抗体的倾向就行。
最后，常规地通过层析法分离和纯化药物结合物。有可能从层析基质中洗脱出适用于病人所需浓度的结合物。但在通常情况下，结合物是以其溶解度允许的最高浓度通过层析而纯化的，可用任何适宜的溶剂洗脱，但最优选使用生理盐水。通常使洗脱液冷冻干燥，以提供稳定的干燥形式的结合物，它能够安全地贮存和销售，并且最终能与无菌水重新配制以进行施用。
下述的制备和实例进一步说明了本发明各种中间产物和结合物的合成。
制备1        苄氧基羰甲基乙基丙二酸酯
在装有搅拌器的圆底烧杯中加入400ml丙酮和50g二乙基丙二酸酯。形成溶液后，加入200ml水，然后加入156ml        2N氢氧化锂溶液。混合物于室温下搅拌30分钟，然后在真空下浓缩成固体。在其中加入350ml二甲基亚砜，搅拌混合物，同时加入71.5g苄基2-溴乙酸酯。然后使混合物于室温下搅拌3小时，再用1000ml乙酸乙酯和盐水萃取，萃取液用盐水洗涤2次。萃取液在硫酸钠上干燥，过滤后在真空下浓缩过夜，产生76.4g粘液，使之在0.1mm汞柱下蒸馏，产生18.8g基本上纯化形式的所需中间产物。
制备2        苄氧基羰基甲基乙基丙二酸酯
在装有搅拌器的烧杯中加入60ml无水乙醇，使5g氢化催化剂钯碳悬浮于其中，加入25g苄基乙基丙二酸酯和16ml        1，4-环己二烯。混合物搅拌1.5小时，然后过滤，滤液在真空下浓缩成浆液。在残渣中加入60ml二甲基甲酰胺和15.6ml三乙基胺，然后加入17.7ml苄基2-溴乙酸酯。混合物于室温下搅拌1小时，然后用600ml乙酸乙酯和盐水萃取，萃取液用饱和的碳酸氢钠溶液、用盐水、用10%柠檬酸溶液、用盐水并再用饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤。洗涤过的萃取液在硫酸镁上干燥，过滤后在真空下浓缩，得到28.2g纯化的所需中间产物，它在薄层层析上只有一个物质点，用1∶1的乙酸乙酯∶己烷洗脱，Rf＝0.55。质谱结果为m/e＝280。
制备3        苄氧基羰甲基
乙基2-乙氧基亚甲基丙二酸酯
在装有搅拌器的烧杯中加入11.1ml乙酸酐，使10g制备1的产物溶于其中，加入7.8ml三乙基原甲酸酯。混合物在140-50°下加热6.5小时，然后真空下除去挥发物质。残渣溶于11.1ml乙酸酐和7.8ml三乙基原甲酸酯中，加入50mg氯化锌。然后，混合物于140-150°下加热回流16小时，然后冷却，用600ml乙酸乙酯和盐水萃取，用2份盐水洗涤。洗涤过的萃取液在硫酸镁上干燥，过滤和浓缩，残渣溶于最少量的乙酸乙酯中，将此溶液与己烷搅拌。使此溶液通过充满硅胶的漏斗，用1升含10%乙酸乙酯的己烷洗脱，然后再用1升含20%乙酸乙酯的己烷洗脱。所需产物在另外2升含20%乙酸乙酯的己烷中得到，使之在真空下浓缩，得到4.9g无色浆液，它基本上是纯化的所需产物。
分析计算：C，60.71;H，5.99;
测得：C，60.98;H，6.03;
制备4        羧甲基乙
基2-乙氧基亚甲基丙二酸酯
在装有搅拌器的烧杯中加入15ml无水乙醇，使1g氢化催化剂钯碳悬浮于其中，加入4.9g在10ml乙醇中的制备3产物的溶液，然后加入2.8ml        1，4-环己二烯。将混合物搅拌5分钟，然后加热至45°，在这一点开始放热。然后除掉加热，混合物搅拌45分钟，在此时达到室温。然后使混合物过滤，在真空下浓缩后得到3.6g黄色液体，它通过质谱鉴别即是所需的中间产物。m/e＝246。
制备5        羧甲基乙基2-
亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物
此制备的产物是加成物，其中，阿霉素通过道诺胺环（daunosamine        ring）的氨基与中间产物丙二酸酯的亚甲基连接。
在圆底烧杯中加入134mg阿霉素盐酸和8.5ml二甲基甲酰胺，加入1ml水以溶解药物。加入264mg制备4的产物（在0.5ml二甲基甲酰胺的溶液中），混合物搅拌10分钟。然后加入含有115mg碳酸氢钠的1.25ml水溶液，混合物于室温下搅拌2小时。在真空下除去挥发物质，残渣溶于最少量的0.1M乙酸钠缓冲液（pH5.4）中。溶液加到C18（J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.）快速层析柱（1.75×6cm）中，柱子用含有增量甲醇的乙酸缓冲液洗脱。在含有50%以上甲醇的组分中得到所需产物，合并含有产物的组分并在真空下浓缩。残渣溶于几毫升水中，加到同样的柱上，用40ml水洗脱，然后用80ml        50%含水甲醇，再用20ml甲醇洗脱。所需产物在50%甲醇洗脱的组分中，使之合并后在真空下浓缩。残渣溶于最少量的甲醇中，加入5倍体积的苯，使溶液冷冻干燥过夜，得到146mg橙色固体，FAB质谱结果为m/e＝744。通过高效液相层析表明该产物是纯化形式的，该层析法使用C18径向柱，在5ml/分的流速和含有3%乙酸铵的70%含水甲醇下洗脱产物。
制备6        乙基N-琥珀酰亚胺氧基
羰基甲基2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物
在装有干燥管和搅拌器的圆底烧杯中加入17.6mg制备5的产物，溶于1.5ml无水二甲基甲酰胺中。溶液冷却至-5°，加入在0.1ml无水二甲基甲酰胺中的5.2μl        N-甲基吗啉，混合物于-5°搅拌5分钟，然后加入0.1ml无水二甲基甲酰胺中的6.14ml异丁基氯甲酸酯，混合物在恒定温度下搅拌30分钟以上。然后加入在0.1ml无水二甲基甲酰胺中的5.45mg N-羟基琥珀酰亚胺，混合物搅拌20小时，同时使之加热至室温。然后在真空下浓缩成红色残渣，将其溶于最少体积的二氯甲烷中，加到用二氯甲烷平衡的硅胶柱上（0.75×4cm）。柱子用50ml二氯甲烷洗脱，然后用在二氯甲烷中的10%异丙醇洗脱。第二洗脱液在真空下浓缩，残渣溶于最少体积的异丙醇中，在其中加入少量苯。使溶液冻干燥，得到15.9mg所需产物，m/e＝742。在300mHz仪器上通过在CDCl3中的核磁共振谱（NMR）分析证实其身份，该分析在2.8ppm处显示出N-羟基琥珀酰亚胺的信号。
实例1        抗体007B与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
抗体007B由一杂交瘤产生，该杂交瘤是由产生抗体KS1/4的杂交瘤衍生的亚克隆，它在本说明书的上述抗体部分已讨论过。在3ml的装有搅拌器的管瓶中，加入508μl的0.34M硼酸钠缓冲液（pH8.6），其中抗体的含量为19.7mg/ml。将0.56mg溶于56.4μl无水二甲基甲酰胺中的制备6的产物在室温下加至抗体溶液中，搅拌2小时。然后使混合物在室温下离心，弃掉红色沉淀，上清液加至用生理磷酸缓冲液平衡的1.75×25cm        SephadexG-25M柱中（Pharmacia，Inc.，Piscataway，N.J.）。柱子用同样的缓冲液洗脱，收集洗脱柱子的第一个峰。该组分通过Millex-GV（Millipore，Bedford，MA）0.22μ滤器过滤，于4°下贮存3天。然后以同样方式再次过滤，用紫外光谱进行测定，显示出抗体浓度为1.54mg/ml，表明回收到7.6mg结合物。结合比例为每摩尔抗体2.2摩尔药物。
实例1A        抗体007B与羰甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
按照实例1的方法，用7.5mg抗体和1.0mg制备6的产物开始。回收的结合物为4.94mg，结合比例为每摩尔抗体3.1摩尔药物，形式为1.10mg/ml浓度的溶液。
实例2        抗体HB21与羰甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
抗体HB21是由杂交瘤ATCC        HB21产生。在3ml装有搅拌器的管瓶中，加入在0.875ml上述实例1提及的硼酸缓冲液中的17.5mg抗体HB21，在其中加入溶于97.2μl无水二甲基甲酰胺中的1.3mg制备6的产物。搅拌反应液，如实例1分离结合物，得到浓度为2.57mg/ml的14.9mg结合物，结合比例为3.8。
实例2A        抗体HB21与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
按照实例2的方法，用12mg抗体和1.30mg制备6的产物开始。过滤后的产物溶液通过真空透析而浓缩，得到含有3.25mg结合物的0.82ml溶液，结合比例为每摩尔抗体4.5摩尔药物。
实例2B        抗体HB21与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
按照实例2A的方法，用12mg抗体和2.60mg制备6的产物开始。产物为含有1.37mg结合物的0.72ml溶液，结合比例为每摩尔抗体5.6摩尔药物。
实例3        抗体L4KS与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
如Starling等人（J.Cell.Biochem.Supp.11B：1982，1987）所述，抗体L4KS透析至0.34M硼酸钠缓冲液（pH8.6）中，产生在0.875ml缓冲液中的17.5mg抗体溶液。在其中加入在97.2μl无水二甲基甲酰胺中的1.3mg制备6的产物。如实例1进行反应和分离产物，得到浓度为2mg/ml的11.6mg结合物。结合比例为每摩尔抗体2.6摩尔药物。
实例3A        抗体L4KS与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
重复实例3的方法，用10mg抗体和0.59mg制备6的产物开始。产物溶液通过真空透析而浓缩，得到1.16ml含有4.03mg结合物的溶液，结合比例为2.9。
制备7        L/lC2抗体的生产
从美国典型培养物收集中心以HB9682的保藏号得到L/lC2杂交瘤的冷冻小瓶。使小瓶在37℃水浴中旋转而融化其内容物，收集存活细胞。细胞悬浮液用平衡盐溶液（Grand        Jsland        Biologicol        Company（GIBCO），3175        Staley        Road，Grand        Island，New        York        14072）以1∶2稀释，使悬浮液通过血清垫层离心，从冷冻基质中分离出细胞。吸出上清，沉淀中的细胞在5%二氧化碳和37℃下，悬浮于在T75组织培养瓶中的培养基中（Ventrex        HL-1        Ventrex        Laboratories，Portland，ME），该培养基补充有10%小牛血清，2mM        L-谷氨酰胺（GIBCO）和50μg/ml庆大霉素硫酸盐（GIBCO）。从几乎汇合的培养物中收集上清，通过离心去除残留的细胞。使无细胞的上清通过蛋白A        Sepharose柱（Pharmacia）而从中纯化抗体。抗体与柱子结合，而培养基被0.01M磷酸钠（pH8.0）洗掉。然后用0.1M磷酸钠缓冲液（pH3.5）从柱中洗脱抗体。洗脱的抗体立即用pH7.4的1M        Trizma缓冲液（Sigma，St.Louis，MO）中和，在含有0.01M磷酸钠（pH7.4）和0.15M氯化钠的真空透析仪（Bio-Molecular        Dynamics，Beaverton，OR）中透析和浓缩。使抗体制剂通过0.2μm孔经过滤而消毒，贮存在4℃备用。
实例4        抗体L/lC2与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
使在0.94ml        0.34M硼酸钠缓冲液中的10.1mg抗体L/lC2与在54.7μl无水二甲基甲酰胺中的0.85mg制备6的产物合并。反应混合物在室温下搅拌1.5小时，然后如实例1分离产物，产生的溶液在大约5升生理磷酸缓冲液于4°真空透析大约16小时，得到9.16mg结合物，浓度为5.33mg/ml。结合比例为每摩尔抗体1.7摩尔药物。
实例4A        抗体L/lC2与羰基甲基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
重复实例4的方法，省掉透析步骤，用24mg抗体和1.75mg制备6的产物开始。回收到在2.69ml溶液中的8.56mg结合物，结合比例为2.8。
制备8        苄氧基
羰基戊基乙基丙二酸酯
在装有搅拌器的圆底烧杯中加入200ml丙酮、100ml水和25.3g二乙基丙二酸酯。在5分钟内，向溶液中加入78.9ml        2N氢氧化锂溶液。在室温下搅拌75分钟后，除去挥发物质，残渣悬浮于35ml无水二甲基甲酰胺中。向其中加入38.3g苄基6-溴己酸酯，混合物于65°搅拌20小时。然后使混合物冷却至室温，用1000ml乙酸乙酯和盐水萃取。萃取液用盐水洗涤2次，然后在真空下浓缩。液体残渣倒在硅胶上，用500ml庚烷洗涤，用1升含10%乙酸乙酯的庚烷洗脱。然后，用1升含15%乙酸乙酯的己烷洗脱所需产物，通过真空浓缩得到22g产物。m/e＝336。
制备9        苄氧基羰
基戊基乙基2-亚甲基丙二酸酯
在装有冷凝器和搅拌器的烧杯中加入15g制备8的产物，再加入8.4ml三乙基原甲酸酯和8.6ml乙酸酐。然后加入48mg氯化锌，混合物于125°搅拌16小时，然后于150-160°搅拌3.5小时。然后冷却，萃取至600ml乙酸乙酯和盐水中。萃取液用盐水洗涤2次，在真空下浓缩。液体残渣用500ml庚烷洗涤，用1500ml在庚烷中的15%乙酸乙酯，再用500ml在庚烷中的20%乙酸乙酯洗涤。然后，通过用500ml在庚烷中的40%乙酸乙酯洗脱而分离所需产物，数量为2.78g。m/e＝392。
制备10        5-羧
基戊基乙基2-亚甲基丙二酸酯
在装有搅拌器的小瓶中，加入在2ml无水乙醇中的0.49g10%钯碳催化剂、1g制备9的产物和1ml        1，4-环己二烯。盖上小瓶，在60°搅拌5分钟，然后冷却至室温，搅拌30分钟以上。然后过滤，使溶液在真空下浓缩。液体残渣溶于最少体积的乙酸乙酯中，与庚烷混合，然后通过硅胶层析纯化，首先用250ml含10%乙酸乙酯的庚烷洗涤，然后用250ml含30%乙酸乙酯的庚烷洗涤。500ml含50%乙酸乙酯的庚烷洗脱掉0.56g所需产物，m/e＝303。
制备11        5-羧基戊基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物
以与上述制备5的产物相同的方法，使此处的中间产物丙二酸酯与阿霉素分子共价结合。
以与上述制备5的同样方式进行反应，用142mg阿霉素盐酸、159mg制备10的产物和75.5mg碳酸氢钠开始。按制备5所述分离产物，用60ml        70%甲醇的乙酸缓冲液从柱中洗脱产物。该产物如制备5所述进一步纯化，得到95mg红色固体产物，m/e＝403，398。
制备12        乙基N-琥
珀酰亚胺氧基羰基戊基2-
亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物
基本上如制备6所示，在N-甲基吗啉和异丁基氯甲酸酯的存在下，使12.5mg制备11的产物与3.6mg        N-羟基琥珀酰亚胺反应，得到9.7mg所需产物，m/e＝896。
实例5        抗体007B与羰基戊基乙基
2-亚甲基丙二酸酯的阿霉素加成物的结合物
进行两种结合反应。在每一种结合反应中，抗体007B都是0.862μl在0.34M硼酸钠缓冲液（PH8.6）中的溶液，其中抗体的含量为17.4mg/ml。
1.加入溶于95.8μl无水二甲基甲酰胺中的1.17mg制备12的产物。
2.加入溶于95.8μl无水二甲基甲酰胺中的1.79mg同样的中间产物。
两种反应都在室温下进行1.5小时，然后在1.75×25cm        Sephadex        G-25M柱上层析。收集每一种中的含有产物的组分，通过Millex-GV0.22μ滤器过滤，在4℃下贮存16小时。再次使产物过滤，通过紫外分光光度法测定。
1.回收到浓度为1.75mg/ml的11.1mg结合物。结合比例为每摩尔抗体3.8摩尔药物。
2.回收到浓度为1.33mg/ml的6.7mg产物，结合比例为4.5摩尔药物/摩尔抗体。
制备13        羧基戊基乙基
2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧
基长春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯
60.2mg        4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长春花碱-23-肼硫酸盐溶于1ml无水二甲基甲酰胺中，向其中加入48.6mg溶于0.5ml无水二甲基甲酰胺中的制备10产物。混合物于室温下搅拌16小时，然后在真空下除去挥发物质。残渣溶于最少量的甲醇中，加水使其产生15%的含水甲醇溶液。溶液加在用10%甲醇水溶液平衡的C18快速层析柱（1.5×6cm）中。柱子用浓度逐渐增高的含水甲醇洗脱，发现产物在含有60%甲醇和100%甲醇的组分中洗脱出。合并含有产物的组分并在真空下浓缩，残渣溶于最少量的甲醇中。加入大量的苯（100ml），使溶液冷冻干燥后得到46mg所需中间产物，m/e＝952。
制备14        乙基N-琥珀酰亚胺
氧基羰基戊基2-（4-脱乙酰基-23-
脱甲氧基长春花碱-23-肼撑）亚甲基丙二酸酯
36.9mg制备13的产物溶于2ml无水二甲基甲酰胺中，在10.8μl        N-甲基吗啉和8.5μl异丁基氯甲酸酯的存在下及在-20°下，使之与在无水二甲基甲酰胺中的7.56mg        N-羟基琥珀酰亚胺反应5分钟，混合物缓慢加热至室温，然后加热至40°30分钟。然后冷却至室温并搅拌16小时，在真空下除去挥发物质。残渣溶于二氯甲烷中，并加到0.75×6cm硅胶柱上。柱子用20ml二氯甲烷洗脱，然后用30ml        1∶1的乙酸乙酯∶二氯甲烷洗脱掉产物。洗脱液在真空下浓缩后得到28.3mg所需产物，通过NMR进行鉴别，呈现出2.88ppm处的N-羟基琥珀酰亚胺信号。
实例6        抗体L4KS与羰基戊基
乙基2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长
春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
进行两种结合反应。在每一种结合反应中，抗体L4KS都是625μl含有16mg/ml的0.34M硼酸钠缓冲液（pH0.6）。
1.在抗体溶液中加入0.75mg溶于51μl无水二甲基甲酰胺中的制备14的产物。
2.加入1.2mg溶于51μl无水二甲基甲酰胺中的同样的中间产物。
两种反应混合物都在室温下搅拌1.5小时，然后离心分离出白色沉淀。上清都用1.75×25cm        Sephadex        G-25M柱层析，该柱用生理磷酸缓冲液平衡并用同样的缓冲液洗脱。收集每个柱中含有产物的组分，通过Millex-GV        0.22μ滤器过滤，在4℃下贮存17天。然后以同样方式再次过滤，通过紫外分光光度法测定。
1.回收到浓度为1.26mg/ml的6.3mg结合物，结合比例为2.5摩尔/摩尔。
2.产物为0.68mg/ml浓度的4.5mg结合物，结合比例为3.6摩尔/摩尔。
实例6A抗体L4KS与羰基戊基
乙基2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长
春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
重复实例6的方法，用595mg抗体和57.9mg制备14的产物开始。通过真空透析浓缩产物溶液，浓缩液再次无菌过滤，得到17.8ml含有125mg结合物的溶液，结合比例为2.8摩尔/摩尔。
实例7        抗体007B与羰基戊基
乙基2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长
春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
进行3种结合反应。在每一种结合反应中，都是以0.5ml        0.34M硼酸钠缓冲液（pH8.6）的形式提供10mg抗体007B。
1.加入0.89mg在41μl无水二甲基甲酰胺中的制备14的中间产物。
2.加入1.20mg在41μl无水二甲基甲酰胺中的同样的中间产物。
3.加入1.49mg在41μl无水二甲基甲酰胺中的同样的中间产物。
三种反应都在室温下搅拌1.5小时，然后离心，上清如实例6所述进行层析。收集含有产物的组分，通过紫外分光光度法测定。
1.回收到浓度为1.35mg/ml的结合物5.95mg，结合比例为3.0摩尔/摩尔。
2.回收到浓度为0.76mg/ml的结合物3.76mg，结合比例为3.6摩尔/摩尔。
3.回收到浓度为0.34mg/ml的结合物1.54mg，结合比例为6.1摩尔/摩尔。
实例7A        抗体007B与羰基戊基
乙基2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长
春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
重复实例7的方法，用396mg抗体和35.6mg制备14的产物开始。使产物真空透析和消毒过滤后得到含有307mg结合物的39.4ml溶液，结合比例为2.6摩尔/摩尔。
实例8        抗体9.2.27与羰基戊
基乙基2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长
长春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
抗体9.2.27可参见Bumol和Reisfeld（Proc.Natl.Acad.Sci.VSA        79∶1245，1982）。与该抗体进行3种结合反应，在每一种反应中，都是以0.36ml        0.34M硼酸钠缓冲液（pH8.6）形式的10mg抗体开始。
1.加入0.6mg溶于41μl无水二甲基甲酰胺中的制备14的中间产物。
2.加入0.89mg溶于41μl无水二甲基甲酰胺中的同样的中间产物。
3.加入1.2mg溶于41μl无水二甲基甲酰胺中的同样的中间产物。
搅拌反应混合物，离心并如实例7所述层析，通过紫外分光光度法测定产物。
1.回收到浓度为0.95mg/ml的结合物5.2mg，结合比例为3.4摩尔/摩尔。
2.回收到浓度为0.32mg/ml的结合物1.5mg，结合比例为6.1摩尔/摩尔。
3.回收到浓度为0.16mg/ml的结合物0.6mg，结合比例为7.3摩尔/摩尔。
实例9        抗体L/1C2与羰基戊
基乙基2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基
长春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
将2.9ml含有43mg抗体L/lC2的0.34M硼酸钠缓冲液（pH8.6）与含有10.7mg/ml制备14中间产物的238μl无水二甲基甲酰胺溶液合并。如上述实例7进行反应，分离并测定产物。回收到浓度为0.69mg/ml的结合物9.35mg，结合比例为2.6摩尔/摩尔。
制备15        乙基N-
（2-苄氧基羰基乙基）丙二酸酯
在100ml烧杯中加入2g        5%的钯碳氢化催化剂、10g苄基乙基丙二酸酯和8.6ml        1，4-环己二烯。在室温下搅拌混合物，在大约40分钟后反应开始放热。继续搅拌，直到反应混合物再次冷却至室温，然后使混合物过滤，在真空下从滤液中除去溶剂。得到的浆液残渣溶于最少量的乙酸乙酯中，倒入150ml的硅胶漏斗中。用400ml含20%乙酸乙酯的己烷洗涤硅胶，然后用400ml乙酸乙酯洗涤所需的中间产物。洗脱液在真空下浓缩，得到5.48g作为粘液的中间产物。
上述中间产物溶于100ml无水二甲基甲酰胺中，加入并溶解4.77g        N-羟基琥珀酰亚胺。然后，分步加入8.56g二环己基碳化二亚胺，反应混合物开始放热。然后在室温下搅拌过夜，过滤。加入8.95g苄基3-氨基丙酸酐并溶于滤液中，然后加入4.56mlN-甲基吗啉。混合物在室温下搅拌1.5小时，然后用乙酸乙酯和盐水萃取混合物。有机层用10%的含水柠檬酸、盐水、饱和的含水碳酸钠洗涤，再用盐水洗涤后干燥，过滤并在真空下浓缩。浆液残渣溶于乙酸乙酯中，加入己烷直至溶液呈现混浊。然后倒入硅胶中，用含10%、20%和30%乙酸乙酯的乙烷各200ml洗涤硅胶。然后，用600ml的含40%乙酸乙酯己烷洗脱所需产物。使产物溶液在真空下浓缩，得到5.05g浅黄色粘液状的所需产物。用质谱进行鉴定，显示出重293的分子离子。元素分析如下。
理论：C，61.42;H，6.57;N，4.78;
测定：C，61.21;H，6.31;N，4.76。
制备16        乙基N-（2-苄氧
基羰基乙基）-2-乙氧基亚甲基丙二酸酯
5.05g制备15的产物溶于10.7ml乙酸酐中，加入7.45ml三乙基原甲酸酯。然后在混合物中加入80mg氯化锌，在140-150°回流下搅拌混合物16小时。然后冷却至室温，在真空下除去挥发物质。用乙酸乙酯和盐水萃取残渣，有机层用盐水洗涤后干燥，过滤并在真空下浓缩。残渣溶于最少量的乙酸乙酯中，通过加入己烷使溶液呈现混浊。然后倒在硅胶中，用乙酸乙酯含量逐渐升高的己烷洗脱硅胶。用30%和50%乙酸乙酯得到含有产物的组分，收集后在真空下浓缩，得到3.4g所需产物，质谱中的分子离子重为349。
制备17        乙基N-（2-羧
基乙基）-2-乙氧基亚甲基丙二酸酯
1.64g制备16的产物加至10ml乙醇和0.5g5%钯碳氢化催化剂中。加入0.89ml1，4-环己二烯，使混合物加热回流，冷却后在室温下搅拌1小时。然后再加热，冷却并搅拌1小时以上。然后使混合物过滤，滤液在真空下浓缩。残渣用乙酸乙酯研制，通过过滤收集固体，用乙醚洗涤后得到0.61g所需产物，质谱分析显示260、244、214和171的分子离子。
制备18        乙基N-（2-羧基乙基）
-2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长
春花碱-23-肼撑）亚甲基丙二酸酯
将67mg制备17的产物加至含有196mg 4-脱乙酰基-23-脱甲氧基长春花碱-23-肼硫酸盐的1ml无水二甲基甲酰胺溶液中。混合物在室温下搅拌过夜，在真空下除去溶剂。残渣溶于含有20%甲醇的0.5M KH2PO4缓冲液（pH7）中，并加到C18反相硅胶柱上。用甲醇浓度逐步上升的同样缓冲液洗脱柱子，合并含有产物的组分，在真空下浓缩。然后使残渣溶于几毫升水中，溶液加到同一类型柱上，用甲醇含量逐步上升的水洗脱。合并含有产物的组分，在真空下浓缩后得到197mg所需的中间产物。
制备19        乙基N-（2-琥珀酰亚
胺氧基羰基乙基）-2-（4-脱乙酰基-23-脱
甲氧基长春花碱-23-肼撑）亚甲基丙二酸酯
159mg制备18的产物溶于2ml无水二甲基甲酰胺中，向其中加入20.5mg        N-羟基琥珀酰亚胺，33.4mg二环己基碳化二亚胺和30.8mg对甲苯磺酸水合物。混合物在室温下搅拌24小时，在真空下除去溶剂。残渣溶于二氯甲烷中，并加到用二氯甲烷平衡的硅胶柱上。柱子用1∶1的异丙醇∶二氯甲烷洗脱，合并含有产物的组分，在真空下浓缩后得到45.2mg所需的中间产物。
实例10        抗体007B与乙基N-（2-
羰基乙基）-2-（4-脱乙酰基-23-脱甲
氧基长春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
进行3种结合反应，基本上采用实例6的方法，在每一种反应中都用15mg在1.03ml硼酸缓冲液中的抗体开始。在3种反应中使用下列数量的制备19的产物。
1.0.86mg
2.1.08mg
3.1.30mg
3种反应混合物都在室温下搅拌1小时，进行离心和层析，使产物溶液灭菌过滤后得到下列产物。
1        2        3
结合物        14.9mg        14.9mg        13.6mg
体积        6.2ml        6.5ml        7.2ml
结合比例        3.3        4.1        4.9
实例11        抗体007B与乙基N-（2-
羰基乙基）-2-（4-脱乙酰基-23-脱甲氧基
长春花碱-23-肼撑）-亚甲基丙二酸酯的结合物
基本上根据实例6进行结合反应，用200mg抗体007B（14.6mg/ml的溶液）和18mg制备19的产物开始。使产物灭菌过滤，真空透析后得到163mg形式为12.0mg/μl溶液的结合物，结合比例为4.3。
实例12 抗体007B的F（ab′）2片段与乙
基N-（2-羰基乙基）-2-（4-脱乙酰基-23-脱
甲氧基长春花碱-23-肼撑）亚甲基丙二酸酯的结合物
600mg抗体007B的F（ab′）2片段溶于30ml 0.34M的硼酸缓冲液（pH8.6）中。在其中滴加含有51mg制备19中间产物的3.75ml无水二甲基甲酰胺，混合物在室温下搅拌30分钟。然后离心，上清在Phenyl Sepharose CL-4B（Pharmacia）柱上层析，先用0.1M pH6.2磷酸缓冲液，然后用40%含水乙腈洗脱。通过在生理缓冲盐水中透析浓缩含有产物的组分，得到214mg所需的结合物，结合比例为2.9摩尔/摩尔。
测试Ⅰ        体外测试
在离体系统中测试本发明的代表性结合物，以证实结合物的活性。在这些测试中，通过测定结合物对来自人癌细胞的组织培养物的细胞毒性，以确定细胞毒性药物结合物的效力。所用细胞为UCLA/P3细胞系（一种人肺腺癌）和T222细胞系（一种人鳞状癌）。下表以结合物中的药物含量为基础，以50%的抑制浓度给出了结合物的活性。
实例        UCLA/P3        T222
2A        0.1μg/ml        ＞10μg/ml
2B        ＞10        ＞10
3A        ＞10        ＞10
4        ＞10
4A        ＞10        3.3
6A        ＜0.0001
11        0.26
测试Ⅱ        小鼠中的UCLA/P3
体内测试实例6A的结合物，在Charles River雌性裸鼠中测定它对于UCLA/P3肺腺癌的异体移植物的活性。测试开始时，在每只小鼠中皮下移植107UCLA/P3肿瘤细胞。在移植后的第2、5和8天，对每只小鼠注射结合物，或对未处理对照注射生理缓冲盐水。结合物的剂量范围为0.09mg/kg至3mg/kg，以药物量为基础。在移植后的第15、21和28天，测定由移植诱导的肿瘤的大小。每个处理组由5只小鼠组成，而未处理对照组由10只小鼠组成。
在第28天，0.38mg/kg或大于此剂量的处理均对肿瘤产生100%的抑制。0.19mg/kg的处理对肿瘤生长产生大约60%抑制，0.09mg/kg的处理对肿瘤生长产生大约25%的抑制。
测试Ⅲ        小鼠中的UCLA/P3肿瘤
基本上根据测试Ⅱ所述，测试实例7A的结合物针对小鼠中由UCLA/P3细胞移植而诱导的肿瘤的活性。在此测定中，在移植后的第16、19、22和25天，以0.25、0.5、1和2mg/kg（以药物量为基础）的剂量施用结合物。并在同一天测量肿瘤的大小。
发现0.25mg/kg的剂量对肿瘤稍有抑制，在移植后第50天，给予该剂量的小鼠的肿瘤平均重约7500mg。而此时对照小鼠的肿瘤平均重约8000mg。而其他剂量基本上能抑制肿瘤生长。
在移植后第70天，接受0.5mg/kg剂量的小鼠的肿瘤平均重约4000mg;接受1mg/kg剂量的小鼠的肿瘤平均重约2000mg;而接受2mg/kg剂量的小鼠的肿瘤平均重仅约500mg。
组合物及使用方法
本发明的结合物可用于治疗方法中，这是本发明的重要方面。因此，本发明还包括用于治疗方法中的非肠道施用的药物组合物。这种组合物由药物化学领域中的常规方法制备。本发明的组合物能够以可接受的溶解度溶于生理上可接受的液体（例如生理盐水和其他能够安全地进行非肠道施用的水溶液）。
非肠道施用的产品通常配制并分散于固体中，优选冷冻干燥的固体，在使用前临时再构成。这种制剂是本发明的有用组合物。药物化学家非常熟悉其制备;一般说来，它们含有无机盐混合物，以提供等渗性，以及分散剂如乳糖，以使干燥制剂在再构成时迅速溶解。在使用时，用高度纯化的水以已知浓度再配制这种制剂。
用结合物和含有结合物的组合物治疗需用结合物中的药物治疗的病人。治疗的特殊目的和给药的剂量范围，根据药物的种类及待治疗病人的状况确定。从标准的医学文献中，可找到药物的特殊效应及其适当的剂量范围的指南。

Claims (16)

1、一种具有下式的药物结合物
Figure 89108469X_IMG1
其中
Ab是一种抗体或其识别抗原的片段，它可识别与需要传递药物的细胞相结合的抗原；
Q是-NH-，-O-，或-S-；
R-Q-是药物残基，它具有可参与反应的氨基、羟基或硫醇基团；
R1是羧酸保护基；
Y是-O-，-NH-，-NCH3-或-NC2H5-；
n是从1至大约8的整数；
m是从1至大约10的整数。
2、权利要求1的结合物，其中，药物是具有下式之一的细胞毒性药物
Figure 89108469X_IMG2
其中R5是氢或羟基;
其中R6是氨基或羟基;
R7是氢或甲基;
R8是氢、氟、氯、溴或碘;
R9是羟基或一种构成羧酸盐的半分子;
其中R10是氢或甲基;
其中R11是氨基、C1-C3烷基氨基、二（C1-C3烷基）-氨基或C4-C6聚亚甲基氨基;
Figure 89108469X_IMG6
其中，R12半分子中的一个为一个键，其它的则为氢;
Figure 89108469X_IMG8
其中R13是氢或甲基;
R14是甲基或噻吩基;
其中，R15是H、CH3或CHO;当R17和R18单独看待时，R18是H，R16和R17之一是乙基，而另一个是H或OH;当将R17和R18与它们与之结合的碳一起看待时，它们构成一个环氧乙烷环，此时R16是乙基;R19是氢，（C1-C3烷基）-CO或氯取代的（C1-C3烷基）-CO;
P是0或1;
R20是一个键或（C2-C4烷基）-X;
X是-O-，-S-或-NH-;
Figure 89108469X_IMG10
其中，R21是下式之一的碱基
其中，R22是氢、甲基、溴、氟、氯或碘;
R23是-OR12或-NHR12;
R24是氢、溴、氯或碘。
3、权利要求1或2的结合物，其中的抗体是单克隆抗体。
4、权利要求1-3中任何一项的结合物，其中的m为大约3至大约8。
5、权利要求1-4中任何一项的结合物，其中的n为1至大约6。
6、权利要求5的结合物，其中的n为1至大约3。
7、前述权利要求中任何一项的结合物，其中的药物为式Ⅴ、式Ⅵ或式ⅩⅢ的药物。
8、一种药物组合物，它含有非肠道施用的基质及权利要求1-7中任何一项的结合物。
9、权利要求1-7中任一项的结合物作为药物使用。
10、一种制备如权利要求1-7中任何一项所要求的式Ⅰ的药物结合物的方法，包括
（A）使具有下式的修饰抗体
Figure 89108469X_IMG12
其中R1、Y、n、m和Ab都如权利要求1所定义，R4是C1-C4烷氧基，与式子为R-QH的药物反应，其中Q和R-Q-都如权利要求1所定义;或
（B）使具有下式的衍生药物
Figure 89108469X_IMG13
其中Q、R-Q-、R1、Y和n都如权利要求1所定义，R3是羟基、羧酸保护基团或构成羧酸盐的半分子，与如权利要求1所定义的式子为Ab的抗体或抗体片段反应。
11、一种具有下式的丙二酸酯
其中n和Y如权利要求1所定义;
R2是羟基、一个羧酸保护基团或构成羧酸盐的半分子;
R3是羟基、一个羧酸保护基团、一个羧酸活化基团或一个构成羧酸盐的半分子;
R4是C1-C4烷氧基。
12、权利要求11的丙二酸酯，其中的R2是一个羧酸保护基团，R3是一个羧酸保护基团或羧酸活化基团，n是从1至大约6。
13、一种具有下式的修饰抗体或抗体片段
其中R1、Y、n、m和Ab如权利要求1所定义，R4是C1-C4烷氧基。
14、一种具有下式的衍生药物
Figure 89108469X_IMG16
其中Q、R-Q-、R1、Y和n都如权利要求1所定义，R3是羟基、一个羧酸保护基团、一个羧酸活化基团或一个构成羧酸盐的半分子。
15、一种制备如权利要求13所定义的式Ⅲ的修饰抗体或抗体片段的方法，包括使具有下式的丙二酸酯与如权利要求1定义的式子为Ab的抗体或抗体片段反应，
Figure 89108469X_IMG17
其中Y和n如权利要求1所定义;
R2是一个羧酸保护基团;
R3是羟基、一个羧酸活化基团或一个构成羧酸盐的半分子;
R4是C1-C4烷氧基;
16、一种制备如权利要求14定义的式Ⅳ的衍生药物的方法，包括使具有下式的丙二酸酯
Figure 89108469X_IMG18
其中R2是一个羧酸保护基团;R4、Y、n和R3如权利要求12所定义，与式子为R-QH的药物反应，其中的Q和R-Q-如权利要求1所定义。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA914625B (en) * 1990-06-22 1993-02-24 Lilly Co Eli In vivo targeting with bifunctional antibodies
ES2049656B1 (es) * 1992-10-08 1994-11-16 Lilly Co Eli Grupos de conjugados de farmacos con anticuerpos.
US5556623A (en) * 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
JPH072895A (ja) * 1993-04-28 1995-01-06 Eli Lilly & Co 抗体−薬物複合体
US20030119724A1 (en) * 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US6521431B1 (en) 1999-06-22 2003-02-18 Access Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable cross-linkers having a polyacid connected to reactive groups for cross-linking polymer filaments
CN1110322C (zh) * 1999-07-21 2003-06-04 中国医学科学院医药生物技术研究所 单克隆抗体Fab'－平阳霉素偶联物及其抗肿瘤作用
EP1355672A2 (en) 2000-12-01 2003-10-29 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide, bifunctional linker, and nucleotidic monomers/polymers, and related compositions and methods of use
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
FR2862134B1 (fr) * 2003-11-12 2007-07-27 Sebia Sa Analyse et typage de proteines monoclonales par electrophorese capillaire et immunodeplacement
DE102006037786A1 (de) 2006-08-11 2008-03-20 Resprotect Gmbh Nukleoside, diese enthaltendes Arzneimittel und deren Verwendung
US7825267B2 (en) * 2006-09-08 2010-11-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of FR901464 and analogs with antitumor activity
EP3492488A1 (en) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
EP2042496A1 (de) * 2007-09-18 2009-04-01 Bayer CropScience AG Verfahren zur Herstellung von 4-Aminobut-2-enoliden
BRPI1006141B8 (pt) 2009-01-12 2021-05-25 Cytomx Therapeutics Llc composições de anticorpo modificado, métodos para preparar e usar as mesmas
CA2753294A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Proproteins and methods of use thereof
US9771377B2 (en) 2012-12-21 2017-09-26 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Synthesis of FR901464 and analogs with antitumor activity
MX2018014927A (es) 2016-06-02 2019-04-09 Abbvie Inc Agonista del receptor de glucocorticoides e inmumoconjugados del mismo.
MA49796A (fr) 2017-12-01 2020-06-03 Abbvie Inc Agoniste du récepteur des glucocorticoïdes et immunoconjugués de celui-ci
CN114874214B (zh) * 2022-05-31 2023-03-21 南京航空航天大学 可偶联巯基的双功能大环螯合剂衍生物及其制备方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3905871A (en) * 1971-05-14 1975-09-16 Syva Co Lactam conjugates to enzymes
DE2635841C2 (de) * 1976-08-10 1983-02-24 Dynamit Nobel Ag, 5210 Troisdorf Verfahren zur Herstellung von Alkoxymethylenmalonsäurenitrilen
US4230805A (en) * 1977-04-15 1980-10-28 Syva Company Theophylline antigens and antibodies
US4631190A (en) * 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
GB2181126B (en) * 1983-03-30 1987-08-26 Lilly Industries Ltd Novel pharmaceutical compounds
DK167884A (da) * 1983-03-30 1984-10-01 Lilly Industries Ltd Immunoglobulinkonjugater
US4695624A (en) * 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4764368A (en) * 1984-08-29 1988-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4762915A (en) * 1985-01-18 1988-08-09 Liposome Technology, Inc. Protein-liposome conjugates
GB8610551D0 (en) * 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IL82579A0 (en) * 1986-05-27 1987-11-30 Lilly Co Eli Immunoglobulin conjugates
US4997913A (en) * 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
US4793986A (en) * 1987-02-25 1988-12-27 Johnson Matthey, Inc. Macromolecular platinum antitumor compounds
US5028697A (en) * 1988-08-08 1991-07-02 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
GB8903021D0 (en) * 1989-02-10 1989-03-30 Celltech Ltd Chemical compounds

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Publication number Publication date
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DE68927610D1 (de) 1997-02-13
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