CN104254544A - Cdim结合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞死亡诱导分子(“CDIM”)结合蛋白及其药物组合物。特别是，本发明提供可用于选择性耗尽和杀灭B细胞的CDIM结合蛋白，所述B细胞包括肿瘤性B细胞以及非B细胞来源的表达CDIM样抗原的肿瘤样细胞。此外，本发明包含编码所公开的抗原结合蛋白的多核苷酸，以及用于产生其的表达系统。本发明另包含通过施用所述CDIM结合蛋白以治疗具有B细胞增生性及B细胞介导的疾病的患者的方法，以及用于鉴别与CDIM结合的蛋白质的诊断试验。本发明另包含用于鉴别可以CDIM结合蛋白治疗的患者群的诊断试验。

Description

CDIM结合蛋白及其用途

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并据此以参照方式将其整体并入。所述ASCII副本于2013年2月7日制作，其名称为0155-005WO1_SL.txt，大小为225,619字节。

I.技术领域

本发明涉及细胞死亡诱导分子(以下称为CDIM)结合蛋白及其药物组合物。特别是，本发明提供可用于选择性耗尽及杀灭B细胞的CDIM结合蛋白，所述B细胞包括肿瘤性B细胞以及表达CDIM或CDIM样抗原的其他肿瘤细胞。本发明还提供编码本发明的CDIM结合蛋白的多核苷酸，以及用于产生其的表达系统。本发明还包含通过施用该CDIM结合蛋白治疗患有B细胞增生性疾病及B细胞介导的疾病的患者的方法。本发明还涉及用于鉴别可以用CDIM结合蛋白治疗的患者群的诊断试验。

II.背景技术

免疫系统的功能主要是由称为淋巴细胞的白血球负责进行。淋巴细胞可被分成两大类，即T细胞和B细胞。T细胞(即T淋巴细胞)源自骨髓中的干细胞，其在胸腺中发育，并负责分泌淋巴因子。B细胞(即B淋巴细胞)源自骨髓中的干细胞，其为抗体的来源。事实上，B细胞产生五种不同类型的抗体，包括IgM、IgG、IgA、IgD及IgE。这些抗体可中和可诱发免疫反应的物质，也就是抗原，抗体通过与抗原上的特定位点连接以阻断抗原。IgM是最大的抗体，并且为针对红血球上的A抗原及B抗原的主要抗体。在结构上，IgM形成聚合物，其中多个免疫球蛋白经二硫键共价连接，主要形成五聚体，但也可能形成六聚体。IgM的五聚体形式的分子量大约为900kDa。由于每个单体具有二个抗原结合位点，因此五聚体IgM具有十个结合位点。

许多疾病与B细胞改变或功能异常有关，包括但不限于自身免疫疾病及癌症。B细胞的增殖及分化是由位于细胞表面的受体调节。这些受体的结合诱导细胞内信号传导蛋白的活化，因而传递受体信号至细胞内控制细胞反应的特定靶标。许多信号传导蛋白是肿瘤基因的产物，而许多肿瘤基因与肿瘤发生有关。控制B细胞增殖及分化的信号传导途径的分子机制仍在研究中(Jumaa et al.(2005)Annu.Rev.Immunol.23:415-445)。

一种涉及肿瘤性B淋巴细胞的疾病的实例是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。在对抗此疾病上的一些进展可归因于化学疗法的强化，以及对于幼年型及成人型ALL更好的支持疗法。虽然幼年型ALL的复发风险较低，但若是复发，不论幼年或成人病患皆面临严重后果。尽管采取积极疗法及干细胞移植，但是只有不到三分之一的ALL复发病童及少数ALL复发成人可以存活。因此需要能超越常规化疗的新的疗法。一些关于ALL的单克隆抗体包括利妥昔单抗(Rituximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)及吉妥珠单抗(gemtuzumab)的临床前及早期临床数据指出，单独使用单克隆抗体或与标准化疗组合使用是可行的治疗选择。

美国专利第5,593,676号描述通过使用与特定B细胞表位(称为细胞死亡诱导分子(CDIM))结合的试剂来诱导肿瘤性B细胞的细胞死亡的方法。其中，B细胞特定寡糖表位CDIM被用来作为肿瘤性B细胞标记。对此标记特异的IgM抗体被施用至宿主体内以诱导肿瘤性B细胞的死亡。相同概念可被应用于体外临床情况以选择性移除B细胞。识别B细胞表位CDIM的人单克隆抗体(即MAb 216)对于肿瘤性B细胞及正常B细胞具有细胞毒性，并且与人外周血液及脾脏中所有的CD19+及CD20+B淋巴细胞结合。另外，MAb 216无法区别B细胞表达的同种型，其以相同强度与IgG+及IgM+细胞结合。MAb 216亦与所有B细胞结合，不论它们的CD5表达如何。因此，MAb 216可用于诊断及治疗。亦见Bhat et al.(2000),Scand.J.Immunol..51:134-140。

然而，本领域当中仍然需要鉴别对B细胞具有特异性的抗体，以选择性杀灭和/或移除宿主体内的B细胞，并且减少靶标外的结合和/或组织损伤的不良反应。癌症治疗仍然亟需这类治疗性抗体。本申请可解决该需求。

III.附图简介

本发明当与附图一起解读时能得到最好地理解，所述附图作为说明实施方案之用。然而应当了解，本发明并不限于附图中所公开的特定实施方案。

图1A-D描述代表性的本文公开的CDIM结合蛋白的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:1至22)。显示了三个重链互补决定区(CDRH1、CDRH2及CDRH3)和重链可变区的框架区(FR1、FR2及FR3)以及J_H(链接区)。

图1E描述代表性的本文公开的CDIM结合蛋白的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:23及24)。显示了三个轻链互补决定区(CDRL1、CDRL2及CDRL3)和轻链可变区的框架区(FR1、FR2及FR3)以及J_L(链接区)。

图1F描述在本文公开的代表性实施例中使用的重链恒定区(Igμ)(SEQ IDNO:25)和两个轻链恒定区(分别为Igλ和Igκ)(SEQ ID NO:26和27)的氨基酸序列。

图2A-2V描述本文公开的44种抗CDIM抗体(命名为IGM1至IGM44)的完整氨基酸序列。该44种公开的抗体是通过将22种所公开的重链(SEQ IDNO:28至49)的每一个与2种所公开的轻链(SEQ ID NO:50和51)的每一个组合形成。

图3描述本文公开的代表性H1至H22 CDIM结合蛋白的CDR3序列。各序列中的精氨酸残基被加以下划线。

图4A-K描述编码本文公开的抗原结合蛋白的22种重链的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO:52至73)。

图4L描述编码本文公开的抗原结合蛋白的2种轻链(λ及κ)的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO:74及75)。

图5描述分别得自表达H1至H7(A图)及H9至H21(B图)的CHO细胞的粗制细胞提取物的天然SDS凝胶。在1,048 kD处的条带代表IgM五聚体，在1,236 kD处的条带代表IgM六聚体。

图6说明CDIM结合蛋白与人B细胞系上所表达的CDIM的结合，以及所公开的抗体造成的后续细胞毒性结果。收集细胞培养物，利用流式细胞技术分析，使用(1)平均荧光强度以定量结合，以及(2)碘化丙啶的摄取以区别活细胞与死细胞。如图6A所示，在广泛剂量范围内，所有被测试的抗体皆与表达CDIM的人B细胞系NALM-6结合。图6B显示所述抗体与CDIM表位结合后的细胞毒性结果。

图7显示所述抗体与CDIM表位结合后的细胞毒性结果。

图8的A-E图描述基于ELISA的结合数据，其代表CDIM结合蛋白与非CDIM抗原的结合。使用单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、脂质A、心脂(cardiolipin)及丙二醛LDL(MDA-LDL)抗原的结果分别显示于A至E图。如图所示，在广泛剂量范围内，MAb 216与所有抗原结合，相较之下，所有公开的抗体显示与这些选定抗原的结合显著减少或完全缺乏。

图9的A-F图描述基于ELISA的结合数据，其代表CDIM结合蛋白与非CDIM抗原的结合。使用单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、软骨素及乙酰肝素抗原的结果分别显示于A至F图。如图所示，在广泛剂量范围内，MAb 216与所有抗原结合，相较之下，所有公开的抗体显示与这些选定抗原的结合显著减少或完全缺乏。

IV.实施方案详述

本文使用的段落标题仅供组织的目的，不可被视为限制本发明的主题。

除非本文另外加以定义，关于本申请所使用的科学术语和技术用语应具有本领域普通技术人员通常理解的意义。另外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。

一般来说，与本文所描述的细胞培养、组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质及核酸化学和杂交有关所使用的命名法及技术是本领域所熟知和经常使用的。本申请的方法和技术通常根据该领域所熟知的常规方法进行，除非另外说明否则如同本说明书各处引述的讨论的各种一般性及更具体的参考文献所述。见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001),Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates(1992),和Harlow and Lane Antibodies:A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，此类文献通过引用并入本文。酶反应及纯化技术是根据制造商说明书，以本领域经常完成或本文所描述的方式进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学、医学及制药化学有关所使用的术语和实验室方法及技术是本领域所熟知且经常使用的。标准技术可被用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送及患者的治疗。

应了解的是，本发明并不限于本文所描述的特定方法、步骤及试剂等，因此可能有所差异。本文所使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书所限定。

除了在操作实施例中或另外说明的地方以外，应了解所有表示本文所使用的成分的量或反应条件的数字在所有情况下由术语“约”所修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可能表示+/-1％。

一般概况

本发明提供与治疗或诊断涉及表达CDIM抗原的细胞的增生性疾病有关的材料和方法。特别是，本发明提供体外及体内性能增强的CDIM结合蛋白，其可用于选择性杀灭和/或耗尽肿瘤性B细胞，特别是用于罹患特征为B细胞增生的疾病及B细胞介导的疾病的病况的患者。此外，CDIM结合蛋白可用于治疗表达CDIM抗原的实体肿瘤。本发明公开的CDIM结合蛋白可单独使用或与小分子化学治疗剂组合使用。由于本发明的CDIM结合蛋白具有独特的孔诱导效应，也就是造成细胞膜损伤，因此使得化疗分子更容易进入靶细胞。因此，本发明的结合蛋白特别适用于治疗原本对于与其组合的小分子化合物具抗性的细胞。

定义

本文使用的下列术语应具有下文指定的意义。

术语“抗原”是指能诱导特定免疫反应且能与特定抗体反应的任何物质。

本文使用的“抗原结合蛋白”或“CDIM结合蛋白”是一种具有抗体样结合活性的支架蛋白或为一种抗体，即抗CDIM抗体。

本文使用的术语“CDIM”(“细胞死亡诱导分子”)是指附着于细胞表面分子的聚n-乙酰基乳糖胺糖化形式。CDIM表位可见于几乎所有外周B淋巴细胞及脾脏B淋巴细胞以及某些经培养的B细胞淋巴瘤细胞系上。该表位亦可见于不同组织病理学分类的原发B细胞淋巴瘤，以及某些实体肿瘤的细胞上。

在更特定的术语中，CDIM表位是一线性B细胞乳糖胺抗原(即，聚-N-乙酰基乳糖胺第2型决定簇，有或无末端唾液酸)，其具有立体结构构型并对内-β-半乳糖苷酶敏感。该表位不具分支或取代基，并且它可附着于糖脂或糖蛋白。在糖蛋白上，该表位可自甘露糖框架(例如，酶MGAT4)伸出，或可为自一“大I”结构伸出的长链，但在分支Gal β1-4 GlcNac β1-3 Gal β1-4 Glc β1之后的直链中通常至少有约4个己糖部分(第2型)；至少约6个己糖以具有良好亲和性；及最长形式中至少约12个己糖。该链是由酶(例如B3GNT1、B4GALT1)制成，该酶添加交互糖至该表位。应注意的是，该糖基化表位CDIM存在于多种蛋白质上，从分子量约20KD至大于约200KD的蛋白质都有。

该CDIM表位已被进一步阐释，该抗原的糖化形式是由唾液酸加帽的，使其成为更成熟的糖基化形式。

术语“表位”通常指抗原(即，分子的抗原决定簇)的一部分，其由免疫系统识别。表位可由糖、脂质和/或氨基酸或其混合物组成。所述表位由免疫细胞如特定T细胞、B细胞和/或B细胞产生的抗体识别。当免疫细胞识别特定表位并由该特定表位活化时，它们启动免疫反应。或者，当抗体识别并结合特定表位时，携带该表位的细胞可能会被耗尽、杀灭、失活、受伤、移除和/或改变。

本文所使用的术语“支架蛋白”或“抗原结合蛋白”是指具有暴露的表面区域的多肽或蛋白，而该暴露的表面区域对氨基酸插入、取代或删除具有高度耐受性。可用于本发明的支架蛋白的实例包括来自金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白质A、来自大菜粉蝶(Pieris brassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其他脂质运载蛋白(lipocalin)、锚蛋白(ankyrin)重复蛋白及人纤维粘连蛋白(fibronectin)(于Binz and Plückthun(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16:459-69中综述)。支架蛋白的工程化可被视为移植或嵌入亲和性功能至稳定折叠的蛋白的结构框架之上或之中。亲和性功能是指如本发明所述的蛋白结合亲和性。支架在结构上可与授予结合特异性的氨基酸序列分开。一般来说，似乎适用于发展这类人工亲和性试剂的蛋白质可能通过合理或最常见的组合蛋白质工程技术获得，诸如体外表达的人工支架库中筛选针对CDIM的结合剂(不论是经纯化的蛋白或在细胞表面表达的蛋白)，该技术为本领域已知的(Skerra,A.(2000)J.Mol.Recog.13:167-187；Binz and Plückthun，同上)。此外，具有抗体样结合活性的支架蛋白可源自包含该支架结构域的受体(acceptor)多肽，该受体多肽可接受供体(donor)多肽的结合结构域的移植以将供体多肽的结合特异性赋予包含受体多肽的支架结构域。所述插入的结合结构域可以为例如抗体(特别是抗CDIM抗体)的互补决定区(CDR)。插入可通过本领域技术人员已知的各种方法完成，所述方法包括例如多肽合成、核酸合成编码氨基酸以及本领域技术人员所熟知的各种形式的重组方法。重要的是，术语“重链”或“轻链”应被广义地理解为嵌入一个或数个已公开的CDR的支架蛋白，而非限制于该术语在抗体技术范畴内的传统意义。

另外，本文使用的术语“抗体”或“CDIM结合抗体”意为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等.(1986)Nature 321:522-525；Riechmannet al.(1988)Nature 332:323-329；及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596)、嵌合抗体(Morrison等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855)、由至少二个抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或它们的抗体片段。术语“抗体片段”包含前述抗体的任何部分，优选它们的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab’片段、(Fab’)₂片段、Fv片段、双价抗体(diabodies)(Hollinger等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448)、单链抗体分子(Plückthun in:The Pharmacology of MonoclonalAntibodies 113,Rosenburg and Moore,EDS,Springer Verlag,N.Y.(1994),269-315)及其他片段，只要它们表现出与CDIM结合的期望的能力。

此外，本文使用的术语“抗体”或“CDIM结合抗体”可包括含有抗体的工程化亚结构域的抗体样分子或天然存在的抗体变异体。这些抗体样分子可以为单结构域抗体，诸如源自天然来源如骆驼(Muyldermans et al.(2001)Reviews inMolecular Biotechnology 74:277-302)或通过来自人、骆驼或其他物种的体外表达文库(Holt et al.2003 Trends Biotechnol.21:484-90)的仅V_H或仅V_L的结构域。

根据本发明，“Fv片段”是包含完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。此区域由一个重链可变结构域及一个轻链可变结构域以紧密、非共价连接所形成的二聚体组成。在这种配置下，各可变结构域的三个CDR(重链CDRH1、CDRH2及CDRH3；轻链CDRL1、CDRL2及CDRL3)相互作用以定义在V_H-V_L二聚体的表面上的抗原结合位点。整体来说，这六个CDR赋予抗原结合特异性给抗体。然而，即使单一可变结构域(或仅包含3个具抗原特异性的CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力。“Fab片段”还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。“Fab片段”与“Fab’片段”的不同处在于Fab’片段的重链CH1结构域的羧基端增加数个残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱胺酸。“F(ab’)₂片段”本来被产生为一对“Fab’片段”，它们之间具有绞链半胱胺酸。制备这类抗体片段的方法(诸如木瓜酶或胃蛋白酶消化)是本领域技术人员已知的。

在本发明的一些实施方案中，抗CDIM抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型抗体，优选为IgG或IgM型抗体，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1和IgM2型抗体。在大部分实施方案中，该抗体为IgM型抗体。该轻链可以为λ-1、λ-2或κ。可以包括或不包括J链。

IgG具有数种亚型，包括但不限于IgG1、lgG2、lgG3及lgG4。IgA亚型包括IgA1及lgA2。在人类中，IgA同种型包含四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型包含二条重链和二条轻链；而IgM同种型包含10条或12条重链和10条或12条轻链(五聚体或六聚体)。在天然存在的IgM分子中，该J链稳定该五聚体构型。

重链C区通常包含一个或多个可能负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的数量将依同种型而定。在一个实施方案中，该CDIM结合蛋白为IgM亚型。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区可由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。(见例如FundamentalImmunology,2nd ed.,Ch.7(Paul,W.,ed.)(1989)New York:Raven Press)。

CDIM结合蛋白

本发明的第一方面涉及一种分离的结合蛋白，该结合蛋白与人外周B淋巴细胞、脾脏B淋巴细胞、肿瘤性B淋巴细胞和一些实体肿瘤上的CDIM表位结合。

在一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含重链和/或轻链，该重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3中的至少一个，该CDRH1、CDRH2及CDRH3具有如SEQ ID NO:1至22中任一个所示的序列，该轻链包含如SEQ ID NO:23或24所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3中的至少一个。在一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含重链和轻链，该重链包含至少一个如SEQ ID NO:1至22所示的CDRH3。在另一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含如SEQ ID NO:1至22所示的CDRH1、CDRH2及CDRH3各一个，以及轻链。在其他实施方案中，该抗原结合蛋白另外包含SEQ ID NO:23或24的CDRL1、CDRL2和CDRL3，该CDRL1、CDRL2和CDRL3嵌入轻链之中。在一些实施方案中，该抗原结合蛋白另外具有如SEQ ID NO:1至22中所示的FR1，该FR1嵌入重链之中。

在另一个实施方案中，该抗原结合蛋白包含如SEQ ID NO:1至22中任一个所示的重链可变区。此外，本发明包括其中该抗原结合蛋白包含具有如SEQ IDNO:23或24所示序列的轻链可变区的实施方案。另外，本发明考虑包含如SEQID NO:1至22中任一个所示的重链可变区和如SEQ ID NO:23或24所示的轻链可变区的抗原结合蛋白。图1A至D说明本文公开的CDIM结合蛋白的22种示例性的独特的重链可变区。图1E说明两种轻链可变区(SEQ ID NO:23和24)。图1F显示重链恒定区(Igμ)(SEQ ID NO:25)，以及轻链恒定区(Igλ和Igκ)(SEQ ID NO:26及27)。SEQ ID NO:108代表MAb 216(Bhat et al,2000，同上)，一种CDIM结合抗体，其被用来作为评估效价和特异性的试验参照抗体。见以下的实施例。

各重链可变区可与重链恒定区连接以形成全长重链，以及各轻链可变区可与轻链恒定区连接以形成全长轻链。本文公开的示例性全长重链的氨基酸序列具有如SEQ ID NO：28至49所示的序列。本文公开的示例性轻链的氨基酸序列具有如SEQ ID NO：50和51所示的氨基酸序列。如上所述，两个重链和两个轻链序列可形成一个全长抗体四聚体。本文特别公开的示例性CDIM结合抗体四聚体，命名为IGM1、IGM2、IGM3、IGM4、IGM5、IGM6、IGM7、IGM8、IGM9、IGM10、IGM11、IGM12、IGM13、IGM14、IGM15、IGM16、IGM17、IGM18、IGM19、IGM20、IGM21、IGM22、IGM23、IGM24、IGM25、IGM26、IGM27、IGM28、IGM29、IGM30、IGM31、IGM32、IGM33、IGM34、IGM35、IGM36、IGM37、IGM38、IGM39、IGM40、IGM41、IGM42、IGM43和IGM44(本文也统称为“IGM1-IGM44”)。如图2A至2V所示，这44个公开的CDIM结合蛋白包含SEQ ID NO:28至49的重链，该重链的每一个与SEQ ID NO:50至51的轻链的任一个组合。下表3显示各种多肽及多核苷酸SEQ ID NO与IGM1至IGM44抗原结合蛋白之间的关系。

在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白与CDIM结合，并其包含重链CDR3序列X₁X₂X₃AX₄GX₅SX₆X₇，其中：

X₁为G、A或R；

X₂为R、G或A；

X₃为M、T或R；

X₄为R、W或Y；

X₅为A、S或G；

X₆为I、V或Y；且

X₇为N或无氨基酸；

且其中在位置1至3(相对于重链可变区的位置98至100，位置97是位于该CDR3区之前的不可变的精氨酸)存有一个且不超过一个精氨酸。

在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白与CDIM结合，并且包含重链CDR3序列X₁X₂X₃AX₄GX₅SX₆X₇，其中：

X₁为G、A或R；

X₂为R、G或A；

X₃为M、T或R；

X₄为R或W；

X₅为A或S；

X₆为I或V；且

X₇为N或无氨基酸；

且其中在位置1至3(相对于重链可变区的位置98至100，位置97是位于该CDR3区之前的不可变的精胺酸)存有一个且不超过一个精氨酸。

根据本发明，应了解本发明的结合蛋白的氨基酸序列并不限于20种常规氨基酸(见Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用并入本文)。举例来说，所述氨基酸可能包括该20种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常规的氨基酸。非常规氨基酸的实例(其也可能为本发明的结合蛋白的适当成分)包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸，例如4-羟基脯氨酸。

另外，根据本发明，在SEQ ID NO:1至51中所示的氨基酸序列中的轻微变异被认为包含于本发明，只要该氨基酸序列中的变异维持如SEQ ID NO:1至51中所示序列的至少75％、更优选至少80％、90％、95％和最优选99％。该变异可发生在框架区内(即CDR之外)、CDR内或在框架区及CDR之内。在SEQ IDNO:1至51中所示的氨基酸序列中的优选的变异(即删除、插入和/或取代至少一个氨基酸)发生在靠近功能性结构域的边界。结构性和功能性结构域可通过比较该核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专用序列数据库加以确认。计算机比较法可被用来鉴别发生在其他已知结构和/或功能的结合蛋白中的序列基序(motif)或预测的蛋白质构型结构域。鉴别折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法为本领域所已知。见例如Bowie等.(1991)Science 253:164；Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；以及Thornton等.1991 Nature354:105，上述文献均通过引用并入本文。因此，本领域技术人员可识别可能用来定义本发明所述的结构性及功能性结构域的序列基序和结构构型。

在SEQ ID NO:1至51中所示的氨基酸序列中，特别优选的变异为导致对蛋白水解或氧化的敏感性降低、改变糖基化模式或改变结合亲和性或授予或修饰该结合蛋白的其他物理化学或功能特性的那些变异。特别是可考虑保守性氨基酸取代。保守性取代是指发生于侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。优选的氨基酸家族包括下列：酸性家族＝天冬氨酸、谷氨酸；碱性家族＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；及不带电极性家族＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族为：脂肪族-羟基家族＝丝氨酸及苏氨酸；含酰胺家族＝天冬酰胺及谷氨酰胺；脂肪族家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；及芳香性家族＝苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸。举例来说，可以合理期待以异亮氨酸或缬氨酸独立取代亮氨酸、以谷氨酸独立取代天冬氨酸、以丝氨酸独立取代苏氨酸或以结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸将不会对所形成的结合蛋白的结合或特性产生重大影响，特别是如果该取代并未牵涉在框架区内的氨基酸。氨基酸改变是否会导致功能性结合蛋白，即是否导致与CDIM结合的抗原结合蛋白可通过ELISA或FACS试验容易地测定。

在一些实施方案中，所述CDIM结合蛋白为具有抗体样结合活性的“支架蛋白”，其中SEQ ID NO:1至24中的一个或多个CDR如上文定义地嵌入支架中。在一些实施方案中，至少CDRH3和CDRL3嵌入支架中。在一些实施方案中，所有六个CDR嵌入支架中。所述支架蛋白是否具有CDIM结合活性可通过与MAb 216竞争结合的ELISA或FACS试验(MAb 216是一种天然存在的CDIM结合抗体)或体外或体内功能性试验容易地测定。

另外，根据本发明，应了解的是本发明的CDIM结合抗体为全人或人源化抗体。人抗体避免与异种抗体有关的某些问题，例如具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体。异种源性蛋白如小鼠或大鼠源性蛋白的存在可导致患者产生针对该抗体的免疫反应，继而导致快速清除该抗体、通过中和该抗体而丧失治疗效用和/或严重、甚至致命的过敏反应。

本文描述的抗原结合蛋白可以是抗体或可以源自抗体。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白的多肽结构是基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体(minibodies)、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合(本文有时称为“抗体共轭物”)和它们的片段。本文提供的抗原结合蛋白已显示能与所有B细胞(包括肿瘤性B细胞和一些实体肿瘤细胞)上的CDIM表位结合。如实施例所示，受伤B细胞的自行修复和存活的能力下降或受到抑制。因此，本发明的抗原结合蛋白能耗尽和杀灭B细胞，包括肿瘤细胞。本文公开的抗原结合蛋白具有多种用途。举例来说，这些抗原结合蛋白中有些能用于特定结合试验以亲和纯化CDIM表达细胞，有些可用于筛选试验以鉴别CDIM表达细胞包括实体肿瘤细胞和B细胞来源的细胞。此外，本发明的抗原结合蛋白可被用于诊断和/或治疗疾病，如B细胞增生性疾病及自身免疫疾病。就此而言，本发明公开的抗原结合蛋白可单独使用或与小分子化学治疗剂组合使用。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白为多价CDIM结合蛋白(即，具有两个或更多个CDIM表位的结合位点的CDIM结合蛋白)。因此，该结合蛋白可作为对CDIM表位具有特异亲和性和亲合力的受体，通常至少约10^-6M，更优选为至少约10^-7M。所述受体的多价特性允许同时结合在细胞膜表面上的至少两个CDIM表位。可使用来自任何免疫球蛋白家族的抗体，如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM；所述抗体不需要具有与特定Fc启动作用有关的各种细胞毒性作用。在一个实施方案中，所述抗体将为IgM，因为此分子的五聚体或六聚体结构允许不受立体位阻干扰的交联。在一些实施方案中，所述抗体组合物为IgM五聚体和IgM六聚体的混合物，包括至少20％六聚体、或至少30％六聚体、至少40％六聚体、至少50％六聚体、或至少60％六聚体、或至少70％六聚体、或至少80％六聚体。或者，可使用抗体片段或它们的类似抗体作用的合成性替代物。举例来说，可设计允许与CDIM表位特异结合和交联的小型合成分子。

在一个实施方案中，所述抗体具有J链，在另一个实施方案中，所述抗体无J链。

在一个方面中，所述抗原结合蛋白为基于VH4-34种系序列构建的重组抗体。VH4-34基因(重链可变区)为已鉴别的53个人功能性抗体种系基因的其中之一。VH4-34基因存在于所有单体型，并且从不相关个体分离的种系DNA中并未发现序列变异。抗B细胞VH4-34抗体对B细胞具有细胞毒性(Bhat等.(1997)Clin.Exp.Immunol.108:151 and Bhat et al.(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:59)。如上文所暗示，由抗体诱导的细胞膜缺损或破洞比其他广为周知的孔形成蛋白所形成的大。通过使细胞通透，本发明的CDIM结合蛋白能有效显著地耗尽靶细胞(也见于专利公开号20100322849)。已通透的B细胞更容易受其他细胞毒性剂的影响，所述细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素、细胞毒性抗体、免疫共轭物、配体共轭物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素和/或其混合物。受到破坏的细胞膜能让细胞毒性剂如化学治疗剂进入，因而增加该化学治疗剂的疗效，甚至对该剂具有抗性或该剂无法穿透的细胞亦如此。任何分别表达CDIM表位或类CDIM表位的B细胞或癌细胞可利用CDIM结合蛋白处理，且可经由本发明的抗原结合蛋白耗尽和杀灭。

本发明的CDIM结合蛋白识别人周边B淋巴细胞、脾脏B淋巴细胞、肿瘤性B淋巴细胞及一些实体肿瘤上的CDIM表位。许多IgM抗体为多反应性，即它们可与许多不同且结构不相关的自体及非自体外来抗原结合。然而，发现本发明公开的抗原结合蛋白相较于一些天然存在的CDIM抗体具有更少的多反应性。因此，本发明的抗原结合蛋白比较不会发生非靶标结合，这使它们成为体内应用上较佳的治疗和诊断候选物。它们的多反应性的减少在图5A至5E中有说明，这些图显示本发明公开的抗原结合蛋白实例减少或丧失对多种非CDIM抗原(特别是ssDNA、dsDNA、脂质A、心脂和MDA-LDL)的结合亲和性。这表示本发明的CDIM结合蛋白在治疗应用上比较安全，因为结合靶细胞所需的剂量将较低，因为这些抗体没有所谓的“抗原水槽(antigen sink)”(与CDIM以外的抗原结合)。多反应性抗体对不同抗原的亲和性可相差至1000倍之多，并且该亲和性通常低于单反应性抗体对其抗原的亲和性。许多多反应性抗体通常为种系或近种系抗体，虽然有些具有少量取代。多反应性抗体会比单反应性抗体更快地自循环清除。多反应性抗体的快速清除可能是因为这些抗体与内源性宿主抗原结合(见例如Zhou等.(2007)J.Autoimmun.29(4):219-228)。许多天然抗体为多反应性抗体，其具有广泛的抗菌活性。这部分地解释了新生儿血清在无已知抗原性刺激存在下的抗菌活性(亦见Zhou等.(2007)，同上)。然而，以治疗目的而言，通常希望采取单特异性且不要太快被清除的抗体，以达到结合和杀灭表达CDIM表位的B细胞和癌细胞。

在特定治疗应用中，例如在治疗自身免疫疾病中，理想的是该CDIM结合蛋白选择性结合和杀灭B细胞，因为B细胞通过许多机制造成多种自身免疫疾病(Browning,J.L.(2006)Nature(Reviews)5:564-576)。快速耗尽B细胞减少免疫系统的活性，因而减少许多相关不良反应，如炎症和组织损伤。在癌治疗中，最好能杀灭选择性细胞族群，诸如肿瘤性B细胞或癌细胞，以停止这些细胞的过度增殖以及癌扩散至其他器官。在本发明中，与其他剂及癌药物的组合疗法可有利地引导对特定细胞的杀灭。因此，CDIM结合蛋白在自身免疫疾病和癌症治疗中具有治疗应用。

如上文讨论的，本发明的抗原结合蛋白与其线性乳糖胺配体的结合，导致细胞膜的破坏和形成大型膜孔洞，造成细胞溶解。组合例如长春新碱(vincristine)与本发明的抗原结合蛋白的组合，相较于各单一剂单独使用的加成效应，导致对B细胞的细胞毒性程度增强。因此，所述CDIM结合蛋白可单独施用给患者，也可与其他剂和/或癌药物组合施用，以达到肿瘤靶向和疗效。另外，所述CDIM结合蛋白可单独施用给患者，也可与其他剂及/或癌药物组合施用，以治疗和/或诊断各种疾病包括癌症和自身免疫疾病。可与CDIM结合蛋白组合使用的其他剂的实例如下表1所示：

在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是与标记基团偶合的。这样的结合蛋白特别适用于诊断应用。本文使用的术语“标记基团”是指可检测的标记，例如，放射性标记的氨基酸或可通过共轭的抗生物素蛋白检测的生物素基部分(例如，与荧光标记结合的链霉抗生物素蛋白或可由光学或比色方法检测的酶活性)。多种用于标记多肽和糖蛋白(诸如抗体)的方法是本领域已知的且可被用于实施本发明。合适的标记基团的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明、镧系磷光体)、酶基团(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团，或预先确定的由第二报告子识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标记)。在某些方案中，可能希望所述标记基团通过不同长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。

或者，本文公开的抗原结合蛋白在本发明的另一优选的实施方案中可能与效应物基团偶合。此类结合蛋白特别适用于治疗应用。本发明所使用的术语“效应基团”是指细胞毒性基团诸如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗性基团或其他本领域已知的效应基团。合适的效应基团的实例为放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、卡里奇霉素(calicheamicin)、尾海兔素(dolastatin)类似物诸如耳抑素(auristatin)及化学治疗剂诸如格尔德霉素(geldanamycin)及美登素(maytansine)衍生物包括DM1。在某些方案中，可能希望所述效应基团通过不同长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。

编码CDIM结合蛋白的多核苷酸和表达系统

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明的结合蛋白。在本发明的上下文中，术语“分离的核酸分子”是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或它们的某些组合，就其来源而言，所述“分离的核酸分子”(1)不与在天然中发现该“分离的多核苷酸”的多核苷酸的所有或部分相连，(2)与在天然中不相连的多核苷酸可操作地连接，或(3)不以较大序列的部分在天然中出现。另外，本文所使用的术语“核酸分子”是指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一核苷酸类型的修饰形式，诸如具有修饰的或取代的糖基诸如此类的核苷酸。该术语也包括单链和双链形式的DNA。

编码IGM1至IGM44的重链序列的示例性完整核酸序列(SEQ ID NO:52至73)在图3A至K中提供。编码IGM1至IGM44的轻链序列的示例性完整核酸序列(SEQ ID NO:74及75)在图3L中提供。当然，由于遗传密码的简并性，其他编码本文所述的CDIM结合蛋白的核酸可被考虑。

在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸分子与控制序列可操作性连接。本文所使用的术语“控制序列”是指使其所连接的编码序列得以表达和处理所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质依宿主有机体而异。在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。根据本发明，术语“控制序列”意图起码包括其存在为表达和处理所必需的所有成分，且也可包括其存在具有好处的额外成分，例如前导序列和融合伙伴序列。另外，本文所使用的术语“可操作性连接”是指所描述的成分的位置的关系允许它们以预定方式发挥功能。另外，根据本发明，与编码序列可操作性连接的表达控制序列的连接方式，可使该编码序列的表达在与该表达控制序列兼容的条件下达成。

本发明的另一方面为一种载体，其包含编码本发明的结合蛋白的核酸分子。所述核酸分子可与控制序列可操作性连接。另外，所述载体可能额外包含复制起点或筛选标志基因。可以根据本发明被使用的载体的实例包括例如质粒、黏质体(cosmids)、噬菌体及病毒等。

本发明的另一方面涉及一种宿主细胞，其被本发明的核酸分子或载体所转化。转化可通过将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法进行，包括例如将多核苷酸包装进病毒(或病毒载体)中并将该病毒(或载体)转导至宿主细胞，或通过本领域已知的转染方法进行，如美国专利第4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455号所示，这些专利通过引用并入本文。特别是，将异源性多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域所广为周知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封至脂质体及直接显微注射DNA至细胞核。可根据本发明使用的宿主细胞的实例为杂交瘤、真核细胞(例如哺乳动物细胞，诸如仓鼠、兔、大鼠、猪、小鼠或其他动物细胞)、植物细胞及真菌细胞(例如玉米、烟草、啤酒酿母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、原核细胞诸如大肠杆菌，以及本领域用于生产抗体的其他细胞。特别是，可用来作为表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域所广为周知的，且其包括许多可得自美国菌种保存中心(ATCC)的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)及许多其他细胞。

CDIM结合蛋白的药物组合物及治疗和诊断的方法

本发明的另一方面涉及CDIM结合蛋白的药物组合物。所述结合蛋白被配制成可用于本发明的方法的药剂。任何可刺激与该CDIM结合蛋白和B淋巴细胞的CDIM表位的结合有关的生物反应的组合物或化合物可被用来作为本发明的药剂。有关配制和施用技术的一般细节详述于科学文献(见“Remington’sPharmaceutical Sciences”,Maack Publishing Co,Easton Pa.)。CDIM结合蛋白药物制剂可根据本领域已知的任何用于制造药剂的方法制备。所述CDIM结合蛋白可被配制为以任何常规可接受的方式施用，包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、口服、局部或通过其他途径施用。示例性实例在下文进行阐述。

用于口服施用的药物制剂可使用本领域广为周知的药学上可接受的载体配制成适合用于口服施用的剂量。此类载体使该药物制剂得以配制成适合由患者摄取的单位剂量形式，如片剂(tablet)、丸剂、粉剂、胶囊、液剂、锭剂(lozenge)、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液及类似形式。口服使用的药物制剂可通过所述CDIM结合蛋白与固体赋形剂的组合获得，任选地研磨所得到的混合物，并且在添加适当的额外化合物之后(若有需要)处理该颗粒混合物，以获得片剂或丸剂。适当的固体赋形剂为碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)、来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物的淀粉、纤维素(如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧基甲基纤维素钠)和胶(包括阿拉伯胶和黄蓍胶)以及蛋白质(如明胶和胶原蛋白)。若有需要，可添加崩解剂或助溶剂，如经交联的聚乙烯基吡咯烷酮、洋菜胶、藻酸或它们的盐，如藻酸钠。还可经口服使用的本发明的药物制剂为例如由明胶制成的推入适配(push-fit)胶囊，以及由明胶和包衣如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入适配胶囊可包含与填料或粘结剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)及任选地稳定剂混合的CDIM结合蛋白。在软胶囊中，所述CDIM结合蛋白可被溶解或悬浮于适当液体中，如有或无稳定剂的脂质油、液体石蜡或液体聚乙二醇。

本发明的水性悬浮液包含与适用于制造水性悬浮液的赋形剂混合的CDIM结合蛋白。此类赋形剂包括悬浮剂(如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶及阿拉伯胶)及分散剂或润湿剂如天然存在的磷脂质(如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物(如十七亚乙基氧乙醇)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己醣醇的部分酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己醣醇酐的部分酯的缩合产物(如聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯)。该水性悬浮液也可包含一种或多种防腐剂(如对羟苯甲酸乙酯或对羟苯甲酸正丙酯)、一种或多种增色剂、一种或多种增味剂及一种或多种甜味剂(如蔗糖、阿斯巴甜或糖精)。制剂可经渗透压的调整。

油悬浮液可通过将CDIM结合蛋白悬浮于植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中配制。油悬浮液可包含增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡基醇。甜味剂可被添加以提供适口的口服制剂。这些制剂可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸加以保存。

适合通过添加水以制备水性悬浮液的本发明的分散粉剂和颗粒，可由与分散剂、悬浮剂和/或润湿剂和一种或多种防腐剂混合的CDIM结合蛋白配制。适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂以上文公开的那些为例。其他赋形剂，例如甜味剂、增味剂及增色剂，也可存在。

所述CDIM结合蛋白药物制剂也可呈油在水中的乳剂形式。该油相可为植物油(如橄榄油或花生油)、矿物油(如液体石蜡)或它们的混合物。适当的乳化剂包括天然存在的胶(如阿拉伯胶和黄蓍胶)、天然存在的磷脂质(如大豆卵磷脂)、衍生自脂肪酸与己醣醇酐的酯或部分酯(如去水山梨醇单油酸酯)以及这些部分酯与环氧乙烷的缩合产物(如聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯)。该乳剂也可包含甜味剂和增味剂。糖浆和酏剂可与甜味剂一起配制，如甘油、山梨醇或蔗糖。此类制剂也可包含缓和剂、防腐剂、增味剂或增色剂。

当CDIM结合蛋白通过静脉注射递送时，该药物制剂可为无菌注射制剂形式，如无菌注射水性或油性悬浮液。此悬浮液可根据已知技术，使用如上述的适当分散剂或润湿剂及悬浮剂配制。该无菌注射制剂也可为在无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可使用的可接受性载具和溶剂为水和林格氏(Ringer)液(等张氯化钠溶液)。此外，无菌不挥发油可被常规地作为溶剂或悬浮介质。就此目的而言，任何缓和不挥发油皆可被使用，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，脂肪酸(如油酸)同样可被用于制备注射用剂。

本发明的方法治疗人和非人患者，所述患者罹患淋巴样癌或白血病(如B细胞急性淋巴母细胞性白血病或ALL)、任何形式的涉及B细胞的自身免疫疾病(如类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮或SLE)、任何形式的B细胞过度增生如淋巴瘤和骨髓瘤(如非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤)、某些形式的表达CDIM抗原的实体肿瘤和/或相关病况。可适当达成此目的的CDIM结合蛋白的量被认为是治疗有效剂量。或者，足以达成此目的的与另一剂或另一药物组合的CDIM结合蛋白的量也被认为是治疗有效剂量。其他剂为(例如)细胞毒性剂，包括但不限于放射性同位素、细胞毒性抗体、免疫共轭物、配体共轭物、免疫抑制剂、细胞生长调节剂和/或抑制剂、毒素或它们的混合物。化学治疗剂或化合物(亦见表1)通常为干扰微管聚合或去聚合化微管的剂，如紫杉烷(taxane)、长春花生物碱或秋水仙碱(colchicine)，或它们的混合物。长春花生物碱包括长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)或长春瑞滨(vinorelbine)，或它们的混合物。紫杉烷包括但不限于太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)，或它们的混合物。可与本发明公开的抗原结合蛋白组合施用的细胞毒性抗体通常能与B细胞上的细胞表面受体特异性结合，这些受体包括CD11a、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD34、CD37、CD38、CD40、CD45、CD52、CD80、CD86、IL-4R、IL-6R、IL-8R、IL-13、IL-13R、α-4/β-1整合素(VLA4)、BLYS受体、细胞表面个体基因型Ig、肿瘤坏死因子(TNF)，或它们的混合。因此，细胞毒性抗体可为依法利珠单抗(efalizumab)(RAPTIVA)、利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN)、达利珠单抗(daclizumab)(ZENAPAX)、依帕珠单抗(epratuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)(SIMULECT)、抗CD52(CAMPATH)、那他珠单抗(natalizumab)、英利昔单抗(infliximab)(REMICADE)及类似物。免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素、钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂、抗增生/抗代谢剂或免疫抑制抗体。在一个实施方案中，所述剂为依托泊苷(etoposide)(VP-16)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(taxol)、ara-C(阿糖胞苷(cytarabine))、长春新碱(vincristine)、噻氨酯哒唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicine)、正定霉素(daunorubicin)、细胞松弛素(cytochalasin)、海绵环肽(jasplakinolide)及类似物。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物所包含的至少一种本文公开的结合蛋白为与效应物偶合，如卡里奇霉素(calicheamicin)、耳抑素-PE(Auristatin-PE)、放射性同位素或毒性化学治疗剂如格尔德霉素(geldanamycin)及美登素(maytansine)。特别是，这些结合蛋白共轭物可用于靶向表达CDIM的细胞，例如癌细胞以供清除。

另外，使本文公开的结合蛋白与放射性同位素连接，提供肿瘤治疗的优点。与化学治疗和其他形式的癌治疗不同的是，放射性免疫治疗或施用放射性同位素-结合蛋白的组合可直接以癌细胞为靶标，因此对周围正常健康组织的伤害最小。利用这种“神奇子弹(magic bullet)”，患者可以远少于目前可用的其他形式的治疗的放射性同位素的量治疗。一些放射性同位素包括钇⁹⁰(⁹⁰Y)、铟¹¹¹(¹¹¹In)、¹³¹碘、⁹⁹鎝、放射性银-111、放射性银-199和铋²¹³。放射性同位素与结合蛋白的连接可利用例如常规的双官能性螯合剂进行。由于银和金可以单价状态存在，因此在连接放射性银-111和放射性金-199时可使用基于硫的连接剂(Hazra等.(1994)Cell Biophys.24-25:1-7)。银放射性同位素的连接可能涉及以抗坏血酸还原免疫球蛋白。另外，替坦(tiuxetan)是一种与伊莫单抗(ibritumomab)连接以形成替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(泽娃灵(Zevalin))的MX-DTPA连接螯合剂(Witzig,T.E.(2001)Cancer Chemother.Pharmacol.48 Suppl 1:91-5)。替伊莫单抗可分别与放射性同位素诸如铟¹¹¹(¹¹¹In)或⁹⁰Y反应以形成¹¹¹In-替伊莫单抗和⁹⁰Y-替伊莫单抗。

另外，本文公开的结合蛋白，特别是当用于治疗癌时，可与毒性化学治疗药物共轭，诸如卡里奇霉素(calicheamicin)(Hamann等.(2002)Bioconjug.Chem.13:40-46)、格尔德霉素(Mandler等.(2002)J.Natl.Cancer Inst.,92:1549-1951)及美登素例如类美登素药物DM1(Liu等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:8618-8623)。在酸性或还原条件下或暴露至特定蛋白酶时释放该药物的不同连接子可被用于此技术。根据本发明，本文公开的结合蛋白可如常规技术所述加以共轭。

举例来说，耳抑素-PE是一种抗微管剂，其为海洋无壳软体动物肽组成分尾海兔素(dolastatin)10的结构修饰物。耳抑素-PE具有抗肿瘤活性和抗肿瘤血管活性(Otani等.(2000)Jpn.J.Cancer Res.91:837-44)。举例来说，耳抑素-PE抑制胰腺癌细胞系的细胞生长并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡(Li et al.(1999)Int.J.Mol.Med.3:647-653)。因此，为了使耳抑素-PE的抗肿瘤活性和抗肿瘤血管活性特异性地针对特定肿瘤，耳抑素-PE可与本文公开的结合蛋白共轭。

欲有效达成此用途的给药时程及量，即“给药方案”，将依许多因素而定，包括疾病或病况的阶段、疾病或病况的严重性、不良反应的严重性、患者整体健康状态、患者身体状况、年龄及类似因素。在计算患者的给药方案时，施用模式也应列入考虑因素。给药方案也必须考虑药物动力学，即吸收速率、生物可利用性、代谢、清除及类似因素(见例如Liedtke等.(2012)Haematologica 97(1):30-37)。

现有技术能让医师决定每位个别患者的给药方案。CDIM结合蛋白可被单独施用或与其他化合物组合施用。若与其他化合物组合施用，将可预期较佳的病患反应和更持久的结果。该组合的化合物可能以协同或加成方式作用。

以下提供作为示范性实例的CDIM结合蛋白使用指南，当实施本文公开的方法时，其可被用来据以决定给药方案，即任何施用的CDIM结合蛋白的投药时程及给药量。CDIM结合蛋白的临床疗效可通过共同施用第二化合物如长春新碱(vincristine)或类似剂加以增强。同样地，小分子化学治疗剂的疗效也可通过与CDIM抗原结合蛋白共同施用加以增强。CDIM结合蛋白的有效剂量范围约自0.25mg/kg至100mg/kg。单次或多次施用CDIM结合蛋白制剂，可依照患者所需和可耐受的剂量和频率施用，所述患者罹患淋巴样癌或白血病(如B细胞急性淋巴胚细胞白血病或ALL)、任何形式的涉及B细胞的自身免疫疾病(如类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮或SLE)，或任何形式的B细胞过度增生如淋巴瘤和骨髓瘤(如非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤)和/或相关病况。所述制剂应提供足够量的CDIM结合蛋白以有效改善该病况。举例来说，本文公开的44种抗原结合蛋白中之任一种可通过单一疗法(即无其他医药)或与例如长春新碱(vincristine)或其他剂(见上)组合施用给患者。对B细胞上的CDIM表位具有特异结合性的抗原结合蛋白可以自约2.5至约3000mg/m²、或更优选地自约25至1000mg/m²，或特别是约75、150、300或600mg/m²的剂量施用。在其他方面中，该抗体以自约0.25mg/kg至约100mg/kg的剂量施用，且更优选地为1.25、2.5、5、10或20mg/kg。该抗CDIM抗体通常是每周施用一次，在一些实施方案中，每周施用超过一次，以每天一次的频率施用。其他细胞毒性抗体可以组合疗法的形式，以每周10至375mg/m²之量施用四周，或以每周0.4至20mg/kg施用2至10周。在一个实施方案中，CDIM结合蛋白目前以单一疗法的形式，每天以自约0.25mg/kg至约100mg/kg的量施用给患者。在另一个实施方案中，CDIM结合蛋白以自约0.15mg/kg至约50mg/kg的量，与第二剂以组合疗法的形式每天施用给患者，该第二剂选自长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)或它们的混合物。

值得注意的是，施用给患者的特定CDIM结合蛋白的剂量可随年龄、疾病程度、药物耐受性、共投药物及共病状况而异。CDIM结合蛋白可与另一药物组合施用给患者，以增强该CDIM结合蛋白的效应并减少不良反应。使用第二药物时，共同施用的CDIM结合蛋白的活性可被增强自10％至90％，该组合疗法将持续进行，直到认为该组合疗法不再有利或必要。所述CDIM结合蛋白可同时施用给患者，或彼此在特定时间间隔内施用。不同的CDIM结合蛋白可以分开的丸剂或片剂或以组合丸剂的形式同时施用给患者。

病症和疾病

本发明的CDIM结合蛋白可用于治疗罹患下列疾病或病状的患者：淋巴样癌或白血病、任何形式的涉及B细胞的自身免疫疾病，或任何形式的B细胞过度增生，如急性或慢性白血病、淋巴瘤及骨髓瘤和/或相关病症。特征为B细胞过度增生的任何病况，包括淋巴样癌、病毒感染、免疫缺陷或自身免疫疾病，皆可利用CDIM结合蛋白治疗。类似地，任何表达CDIM表位或类CDIM抗原的肿瘤细胞或癌细胞，皆可利用CDIM结合蛋白治疗。

本发明提供改进的CDIM结合蛋白，以用于选择性杀灭及耗尽与自身免疫有关的疾病中的B细胞，所述疾病包括但不限于多发性硬化症、类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力、寻常天疱疮、葛瑞夫兹(Grave)病及自身免疫血小板减少症。自身反应性B细胞会分泌以自身蛋白为目标的自身抗体。B淋巴细胞不仅产生自身抗体，还具有与它们产生抗体的功能无关的重要调节功能。这与自身免疫有重要关系，因为自身反应性B细胞具有活化致病性T细胞，使之产生促炎性细胞因子的能力。重症肌无力、寻常天疱疮、葛瑞夫兹(Grave)病及自身免疫血小板减少症即为由致病性抗体驱动临床表型的疾病的良好实例(见Browning,J.F，同上)。此外，自身免疫疾病导致B细胞的过度活化和B细胞的数量增加，这些B细胞应该被移除，以防止大量发炎和组织损伤。因此，耗尽B淋巴细胞可用于治疗此类自身免疫疾病。由于许多风湿性自身免疫疾病如类风湿性关节炎的治疗主要依赖使用细胞毒性免疫抑制剂和皮质类固醇，患者通常会出现其他严重不良反应。除此之外，患者复发率仍然很高。因此需要提供更安全且更有效的药物，像是本发明的CDIM结合蛋白。

淋巴样癌是指B细胞来源的任何急性或慢性白血病或淋巴瘤，包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、伯奇(Burkitt)氏淋巴瘤、B祖细胞ALL、成年ALL、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)及瓦登斯壮(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症。所述CDIM结合蛋白与被发现位于癌性B细胞上的表位CDIM结合。

为了能够预测将对本发明的CDIM抗原结合蛋白治疗有反应的患者，可进行体外或体内分析。在治疗前可进行体内造影，通过施用CDIM抗原结合蛋白作为共轭物，能看见感兴趣的组织上的CDIM抗原。可建立特定水平的反应性，以允许预测患者对治疗的反应。或者，这种类型的分析可能有助于基于肿瘤负荷建立投药参数。体外分析可在治疗前于患者的淋巴样细胞(外围血液、骨髓或其他)样本上进行。细胞将以CDIM抗原结合蛋白染色，利用标准流式细胞分析测定。将建立一个截留值，得以预测治疗后的正面结果。举例来说，可建立预测正面结果的最小平均荧光强度。

V.实施例

下列具体实施例意图说明本发明，不应被视为对权利要求范围的限制。

实施例1：示例性CDIM结合蛋白的产生和序列测定

质粒DNA构建。所有H系列的μ链构建物重链可变区(命名为H1至H22)是由Genscript合成，在5’及3’端分别具有Xba1-Kpn1位点。所有H系列的μ链构建物的组合，是通过将各个重链可变区分离为Xba1-Kpn1片段，并以三部分连接方式，将它们与带有μ恒定区的Kpn1-BamH1片段和经Xba1及BamH1酶切的表达载体AB11连接。将该连接的质粒转化至感受态细菌中。所产生的克隆质粒通过直接测序进行证实。利用Qiagen制备质粒midi-preps，以提供适当量的用于转染至CHO-S细胞的DNA。

以类似方式构建轻链质粒。λ插入物是以三部分连接的方式进行克隆，该可变λ区被命名为XbaI-EcoRI片段，其与EcoRI-BamHI λ恒定区片段混合，并且被连接至AB2载体中介于XbaI及BamHI位点之间。L2 κ插入物被分离为XbaI-BamHI片段，并且被连接至AB2-κ载体之中。

以H1-H22/L2质粒DNA转染CHO-S细胞。制备对应重链和轻链的DNA以用于使用PEI技术的共转染(等量的L2和H1-22)。用于转染的CHO-S细胞(1E⁸的对数期生长)于RPMI1640培养基中生长。DNA与PEI是以1:2混合，并且此DNA:PEI混合物被加至添加0.5x Pen/Strep、Glutamax和HT的CDOptiCHO培养基中的CHO-S细胞。于摇瓶中隔夜培养后，将培养基更换成含有0.5x P/S及Glu的CD OptiCHO培养基。在转染后第7天，通过离心细胞以获得细胞培养上清液(100ml)。为了表征这些IgM实例，取15ml的细胞培养上清液，利用Centricon浓缩离心管浓缩10倍。

22种不同的重链可变区的氨基酸序列如图1A-D所示。2种不同的轻链可变区的氨基酸序列如图1E所示。该重链及轻链的恒定区的氨基酸序列如图1F所示。应了解，不论κ或λ恒定区皆可被使用。经鉴别和分离的CDIM结合蛋白IGM1至IGM44的氨基酸序列如图2A-2V所示。H1至H22的CDR3序列如图3所示。

可被用于编码该44种所公开的CDIM结合蛋白的多核苷酸序列实例如图4A-L所示。应了解的是，由于基因密码的简并性，其他序列亦可被用于编码该相同的氨基酸序列。测定所述抗体的重链可变区的各种互补决定区(CDRH)及框架区(FR)的序列，包括框架区1(FR1)、互补决定区1(CDRH1)、架构区2(FR2)、互补决定区2(CDRH2)、框架区3(FR3)及互补决定区3(CDRH3)。

实施例2：制备CDIM结合蛋白

此实施例说明如何制备一些本发明的结合蛋白。序列是由重链和轻链可变区变异体组成(编码κ及λ恒定区)。将重链和轻链变异体的特定组合转染至CHO细胞，即DG44 CHO细胞，并进行瞬时转染。自该初步转染获得10至100μg/ml的表达水平。IgM抗体通过亲和性层析纯化、通过凝胶电泳评估，并且通过细胞结合、细胞毒性试验测试生物活性，及由ELISA试验测试与多种生物分子的结合。由功能性试验获得的结果可用于指导优先候选物的选择。一经选定后，该优先候选物被稳定转染至CHO细胞，并被亚克隆至20个盘(约2000个孔)，并由ELISA筛选最高分泌水平。将前50个克隆株扩展至T75培养瓶，然后将转移至摇瓶的最佳的24株克隆进行扩增。将来自这24株克隆的IgM进行纯化和定量，并将前6株克隆(通过IgM抗体分泌水平选择的)在甲胺喋呤(methotrexate)(50nM,100nM,200nM,400nM)的进一步筛选下生长，以促进高分泌细胞系的生长。

实施例3：利用非还原性SDS-PAGE评估IgM表达

非还原性凝胶电泳是一种通常用于蛋白质组的分离方法，其根据分子质量及寡聚结构拆分蛋白质。在非还原性的条件下，蛋白双硫键被完整保留，因此IgM寡聚体可被拆分成五聚体或六聚体结构。

为了证实瞬时转染的CHO-S细胞上清液的IgM抗体表达，我们进行非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，如Vorauer-Uhl等,J Immunol.Methods 359(2010):21-27所述。此实施例描述如何检测瞬时转染的IgM mAb的纯度和多聚结构。将感兴趣的蛋白样本与NuPage SDS样本缓冲液一起于室温孵育5分钟。在孵育后，将分子量标准物和测试样本加至所述凝胶，以100V恒定电压电泳约2小时，直到染料前端到达凝胶底部。在电泳后，将凝胶自XCell Mini-Cell设备取出，固定处理，并以Colloidal Blue染料染色。

为了显示五聚体和六聚体形成，使用SDS PAGE,Life Technologies’(Carlsbad,CA)Native Page Novex 3-12％ Bis-Tris凝胶，对用不同的CDIM结合蛋白样本(分别为L1至L7和L9至L21)转染的CHO细胞的浓缩上清液进行非还原性SDSPAGE电泳。

图5显示根据Colloidal Blue染色程序(Life Technologies,Carlsbad,CA)所染色的SDS凝胶，在1,048 kD处的明显条带代表IgM五聚体，在1,236 kD处的明显条带代表IgM六聚体。如图中所示，IgM样本的五聚体形成(实线箭头)比六聚体形成更为明显。类似地，所分离的人IgM 216主要呈现五聚体形式(虚线箭头)，然而其分子量似乎较低，这是因为此IgM形式中包含较小的λ轻链。

实施例4：CDIM结合蛋白与CDIM抗原的结合

此实施例说明如何检测所公开抗体的结合特性。所述抗体通过亲和性层析制备。在图6A中，在细胞表面表达CDIM抗原的人原B细胞系NALM-6是经一系列重组IgM抗体染色的。所述抗体被用来测定剂量反应，该剂量始于20μg/试管，经2倍逐步稀释至终浓度0.039μg。细胞以100μl体积于3％FBS/PBS于冰上染色1小时，然后用与DyLight-488共轭的抗人IgM(Jackson Immuno)1μg/ml于4C染色20分钟。

CDIM结合的分析是于FACScan流式细胞仪，利用CellQuest分析软件进行的。结果显示为原始数据点，Y轴为平均荧光强度(MFI)，X轴为一级抗体的浓度(μg/100μl)。

该数据利用GraphPad分析程序进行再分析，以利用非线性回归曲线拟合适配结果。各抗体的EC₅₀(μg/100μl)为：(a)IGM1 10.6，(b)IGM23 2.2，(c)IGM34 2.2，及(d)IGM36 1.7。

实施例5：由CDIM结合蛋白的细胞结合导致的细胞毒性

此实施例说明如何检测所述CDIM结合蛋白的细胞毒性。人原B细胞系NALM-6以如上图6A所述的相同方式染色。在图6B中，细胞杀灭通过测量染色1小时后的细胞存活性进行评估。通过定量未摄取碘化丙啶的细胞比例，可计算存活细胞百分比。结果显示为原始数据，Y轴为存活％，X轴为浓度(μg/100μl)。

相同结果利用GraphPad分析程序作图，利用非线性回归曲线拟合适配数据。利用上述相同方法计算各抗体的EC₅₀。各抗体的EC₅₀(μg/100μl)为：(a)IGM13.0，(b)IGM23 0.6，(c)IGM34 0.6，及(d)IGM36 0.3。

由图6A和6B的结果显示，在广泛剂量范围内，所公开的抗体皆与人B细胞结合，并且这些抗体对B细胞具有细胞毒性，导致细胞死亡。

实施例6：由人补体依赖性细胞毒性试验测试CDIM结合蛋白的细胞毒性

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在时溶解靶细胞。经典补体途径的活化始于补体系统的第一成分(C1q)与抗体的结合，所述抗体与它们的同源抗原结合。为了评估补体活化，可进行例如Hinton等,J.Immunol.2006Jan 1；176(1):346-56所述的CDC检测。简言之，此实施例说明如何检测CDIM结合蛋白的细胞毒性。将人原B细胞NALM-6(50,000)接种于96孔平底微量滴定板。添加最佳测试稀释倍数的人补体，并添加或不添加含有感兴趣的表达抗体的连续稀释上清液。经24小时后，添加比色底物CCK8反应3小时，然后在微量滴定板读取仪上测量在450nm波长的光学密度(OD)。该OD定量的增加与存活的增生性NALM-6细胞成正比。不含上清液的未经处理的Nalm6的OD被用来当作100％计算，再据此标准化上清液OD值以获得存活百分比。在图8中，结果以Y轴的存活百分比及X轴的上清液抗体浓度(ug/ml)作图显示。这些结果利用GraphPad程序进行分析，并且数据利用四参数非线性回归曲线拟合模型化。利用上述相同方法计算各抗体的IC50。

实施例7：CDIM结合蛋白与非CDIM抗原的结合

此实施例说明CDIM结合蛋白与非CDIM抗原的结合特异性。使抗体经亲和性层析纯化。利用市售ELISA试剂盒测试广泛剂量范围的抗体与多种可得抗原的结合。使ELISA板预先经这些抗原包被：ssDNA(Inova Diagnostics,Inc,SanDiego,CA)、dsDNA(Inova Diagnostics,Inc.,San Diego,CA.)、心脂(InovaDiagnostics,Inc.,San Diego,CA.)、MDA-LDL(经丙二醛修饰之低密度脂蛋白)(Rocky Mountain Diagnostics,Colorado Springs,CO.)，这些抗原购自不同厂商。脂质A(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)是买来作为抗原，将其溶解于乙醇，以100mM碳酸钠缓冲液pH 9.5稀释，然后将其包被于ELISA板上。抗CDIM抗体以所示浓度使用，并根据厂商建议实施ELISA。简言之，将板用BSA奶粉封闭1小时，然后清洗。添加所示浓度的所公开抗体。让该抗体于室温中结合1.5小时，然后进行清洗步骤。添加经HRP共轭的抗人IgM抗体，然后添加底物。结果以450nm的吸光度定量(Bio-Tek Synergy HT)。如图8和9所示，MAb216与所有受测抗原结合，然而每种所公开抗体皆显示结合降低(ssDNA)或完全清除对抗原(即，心脂)的特异性。这些结果显示，所公开的抗体比MAb 216具有更严格的抗原结合特异性。

表2总结了本文公开的各种CDIM结合蛋白的效价和特异性特征。

表2

各种样本的名称和特征总结

表2总结了图6和图7显示的分别包含重链可变区H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20和H21的CDIM结合蛋白的数据。所述ELISA值是指在瞬时转染IgM重链和轻链后的条件培养基中测得的IgM浓度。所述细胞毒性IC₅₀是指在培养IgM抗体与人补体和Nalm-6细胞时，导致50％细胞死亡的抗体的半数最大浓度(亦见图6)。该IC50值代表本文公开的各种CDIM结合蛋白的效价。

与其他抗原(LPS、ssDNA、dsDNA等)的额外结合是如ELISA形式中观察到的结合(亦见图9A-9F)。IgM样本与各种抗原的相对反应性是根据当IgM为10μg/ml时的最大反应(OD₄₅₀nm)。所显示的值代表各种CDIM结合蛋白非特异性反应的值。相对反应性的得分如下：OD₄₅₀为0至0.3，得分给予(-)负分。当最大ELISA值分别为0.3至1、1至2、2至3及3以上，给予(+)、(++)、(+++)及(++++)的得分。

本发明的各种修饰和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的，其不背离本发明的范围和精神。虽然本发明已结合具体实施方案进行了描述，然而应当理解要求保护的本发明不应被不当限制于该具体实施方案。事实上，用于实施本发明的所述模式的各种修饰为本领域技术人员所理解，且意图属于权利要求范围之内。

Claims (55)

1.一种与CDIM结合的分离的抗原结合蛋白，其包含：

重链，该重链包含互补决定区3(CDRH3)，该CDRH3具有如SEQ IDNO:78-99任一项所示的序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其还包含轻链，该轻链包含互补决定区3(CDRL3)，该CDRL3具有如SEQ ID NO:104或105的任一项所示的序列。

3.如权利要求1或2所述的分离的抗原结合蛋白，其实质上不与单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、软骨素及乙酰肝素交叉反应。

4.如权利要求1、2或3所述的分离的抗原结合蛋白，其另包含：

重链，该重链包含如SEQ ID NO:1至22中任一个所示的框架区1(FR1)。

5.如权利要求1、2、3或4所述的分离的抗原结合蛋白，其另包含：

(a)包含CDRH1和CDRH2的重链，所述CDRH1具有如SEQ ID NO:76所示的序列，且所述CDRH2具有如SEQ ID NO:77所示的序列；及

(b)包含CDRL1和CDRL2的轻链，所述CDRL1具有如SEQ ID NO:100或102所示的序列，且所述CDRL2具有如SEQ ID NO:101或103所示的序列。

6.如权利要求5所述的分离的抗原结合蛋白，其另包含重链，该重链包含FR1，该FR1具有如SEQ ID NO:1至22中任一个所示的序列。

7.一种与CDIM结合的分离的抗原结合蛋白，其包含选自由SEQ ID NO:1至22组成的组的重链可变区。

8.一种与CDIM结合的分离的抗原结合蛋白，其包含选自由SEQ ID NO:23或24组成的组的轻链可变区。

9.一种与CDIM结合的分离的抗原结合蛋白，其包含选自由SEQ ID NO:1至22组成的组的重链序列和选自由SEQ ID NO:23或24组成的组的轻链序列。

10.一种与CDIM结合的分离的抗原结合蛋白，其包含重链CDR3序列X₁X₂X₃AX₄GX₅SX₆X₇，

其中：

X₁是G、A或R；

X₂是R、G或A；

X₃是M、T或R；

X₄是R、W或Y；

X₅是A、S或G；

X₆是I、V或Y；且

X₇是N或无氨基酸；

且其中在位置1至3(相对于重链可变区的位置98至100，位置97是位于所述CDR3区之前的不可变的精氨酸)存有一个且不超过一个精氨酸。

11.如权利要求10所述的分离的结合蛋白，

其中：

X₁是G、A或R；

X₂是R、G或A；

X₃是M、T或R；

X₄是R或W；

X₅是A或S；

X₆是I或V；且

X₇是N或无氨基酸。

12.如权利要求10或11所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含重链CDR2序列：EINHSGSTNYNPSLKS，编号为50至65，且其中位置53的His53可由酪氨酸取代。

13.如权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含重链CDR1序列：FSGYYWS，编号为29至35，且其中位置35的Ser35可由苏氨酸取代。

14.如权利要求1-13任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其实质上不与单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、软骨素和乙酰肝素交叉反应。

15.一种与CDIM结合的分离的抗原结合蛋白，其包含

(a)选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14组成的组的重链可变区；及

(b)选自由SEQ ID NO:23和SEQ ID:24组成的组的轻链可变区。

16.一种分离的抗原结合蛋白，其与包含SEQ ID NO:1至22的重链可变区序列中的任一个的抗体竞争与CDIM的结合。

17.如权利要求1-16任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其与CDIM结合的效力比MAb 216强五倍。

18.如权利要求1-16任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其与CDIM结合的效力比MAb 216强十倍。

19.如权利要求1-18任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、软骨素和/或乙酰肝素的结合比MAb 216低两倍。

20.如权利要求1-19任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或它们的抗体片段。

21.如权利要求1-20任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。

22.如权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为人抗体。

23.如权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为单克隆抗体。

24.如权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白选自由IgA、IgD、IgM、IgG和IgE组成的组。

25.如权利要求24所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为IgM。

26.如权利要求25所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与标记基团偶合。

27.如权利要求26所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述标记基团为放射性同位素、放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。

28.如权利要求10所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与效应物基团偶合。

29.如权利要求28所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述效应物基团为放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗性基团。

30.如权利要求29所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述治疗性或化学治疗性基团选自由卡里奇霉素、耳抑素-PE、格尔德霉素、美登素和它们的衍生物组成的组。

31.如权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的特征为：(a)存在J链；或(b)不存在J链。

32.一种根据权利要求25的抗原结合蛋白的混合物，其中所述混合物为包含五聚体和六聚体的混合物。

33.一种药物组合物，其包含作为活性剂的至少一种如权利要求1所述的分离的结合蛋白，以及药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂。

34.如权利要求33所述的组合物，其是用于治疗用途。

35.如权利要求33所述的组合物，其是用于诊断用途。

36.一种试剂盒，其包含如权利要求1所述的分离的结合蛋白。

37.如权利要求36所述的试剂盒，其包含其他治疗剂。

38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述其他治疗剂为抗肿瘤剂。

39.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述抗肿瘤剂为抗肿瘤抗体或化学治疗剂。

40.一种治疗与异常B细胞增生有关的疾病的方法，其包含向需要其的患者施用权利要求33所述的药物组合物。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述疾病选自由淋巴样癌和白血病组成的组。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述白血病为B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。

43.如权利要求33所述的方法，其中所述疾病为涉及B细胞的自身免疫疾病。

44.如权利要求40所述的方法，其中所述疾病为类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮(SLE)、多发性硬化症或B细胞过度增生的形式。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述B细胞过度增生的形式包括急性或慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及非霍奇金氏淋巴瘤。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述疾病为以B细胞过度增生为特征的任何病况，其包括淋巴样癌、病毒感染、免疫缺陷及自身免疫疾病。

47.如权利要求29所述的方法，其中选自依托泊苷(VP-16)、太平洋紫杉醇(Taxol)、Ara-C(阿糖胞苷)、长春新碱、噻氨酯哒唑、秋水仙碱、正定霉素、细胞松弛素和海绵环肽的化学治疗性化合物与所述药物组合物共同施用。

48.如权利要求40所述的方法，其中所述疾病的特征为与如权利要求10所述的抗原结合蛋白结合的实体肿瘤。

49.一种诊断与异常B细胞增生有关的疾病的方法，其包含使含有B细胞的患者样本与如权利要求10所述的抗原结合蛋白接触。

50.一种多核苷酸，其编码如权利要求10所述的抗原结合蛋白。

51.一种重组表达系统，其包含如权利要求45所述的多核苷酸，该多核苷酸与使其有效表达的序列可操作性连接。

52.重组宿主细胞，其包含如权利要求51所述的表达系统。

53.如权利要求52所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核宿主细胞。

54.如权利要求53所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

55.一种制备抗原结合蛋白的方法，该方法包含培养如权利要求44所述的细胞并收集所述蛋白。