CN104208719A - 一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体偶联药物（ADC）的阳离子交换层析纯化方法，所述阳离子交换层析可选用结合-洗脱模式或过载模式进行纯化，可将ADC药物的偶联比（DAR）控制在目标工艺范围内，同时起到去除多聚体的作用。这是一种新的ADC制备纯化工艺，可降低生产的成本和风险，同时实现对ADC药物的小分子/抗体的摩尔偶联比（DAR）和多聚体的控制，有助于开发可控性更强、成本和风险更低的ADC生产工艺，以获得质量更高的产品，保证用药安全和治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体而言，本发明涉及一种抗体偶联药物（ADC）的阳离子交换层析纯化方法。
技术背景
抗体-小分子药物偶联物（Antibody-drug conjugate，ADC）是新一代抗体靶向治疗药物，主要应用于癌症肿瘤的治疗。ADC药物由小分子细胞毒性药物（Drug）、抗体（Antibody）以及连接抗体和化药的接头（Linker）三部分组成，小分子毒素通过化学偶联的方法结合到抗体蛋白上。抗体会特异地识别并引导小分子药物到达表达癌症特异性抗原的癌细胞靶点，并通过细胞内吞效应进入癌细胞。接头部分在胞内低pH值环境或溶酶体蛋白酶的作用下断裂，释放出小分子细胞毒素，从而达到特异杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。因此，ADC药物同时结合了抗体的靶向专一性和小分子毒素对癌细胞的高毒性的特点，大大扩展了药物的有效治疗剂量窗口（Therapeutic window）。临床研究已证明，ADC抗体药效高、在血液中相对稳定，能有效地降低小分子细胞毒素（化药）本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前国际上抗癌药物的研发热点（Rachel S. Zolot, Satarupa Basu, Ryan P. Million. Antibody–drug conjugates. Nature reviews Drug Discovery. 2013, 12: 259-260）。
目前国外已有两个ADC药物获批上市销售。2011年8月19日，FDA批准Seattle Genetics公司开发的Brentuximab Vedotin（商品名Adcetris）上市，用于治疗CD30阳性的霍杰金淋巴瘤（HL）和罕见疾病系统性间变性大细胞淋巴瘤（SALCL)。2013年2月22日，Genentech公司开发的ado-trastuzumab emtansine（T-DM1，商品名Kadcyla）获FDA批准上市销售，主要用于治疗Her2阳性晚期（转移性）乳腺癌。另外，国际上还有超过30种ADC药物处在临床开发阶段（Asher Mullard. Maturing antibody–drug conjugate pipeline hits 30. Nature reviews Drug Discovery, 2013, 12: 329-332）。
目前ADC药物常用的偶联方式包括：赖氨酸偶联、轻重链间还原性二硫键偶联和定点偶联（Beck A，Reichert J M．Antibody-drug conjugates: Present and future. MAbs, 2014, 6:15-17）。赖氨酸随机偶联平台技术利用双功能团交联试剂，对抗体的赖氨酸残基进行随机修饰，再与美登素衍生物DM1、DM4或其它类似物的巯基反应实现偶联，已经上市的T-DM1（Kadcyla）即采用这一技术。轻重链间还原性二硫键偶联则通过还原抗体链间的二硫键产生的半胱氨酸残基，再与含多肽接头的海兔毒素衍生物甲基澳瑞他汀E（MMAE）、甲基澳瑞他汀F（MMAF）或其它类似物反应实现偶联，另一种市售的ADC药物Adcetris则采用了这种平台技术。定点偶联模式目前还处于早期研发阶段（Siler Panowski, Sunil Bhakta, Helga Raab, Paul Polakis and Jagath R Junutula. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs, 2014, 6: 34–45）。
对于赖氨酸随机偶联技术，由于IgG单克隆抗体上有几十个赖氨酸残基可供修饰，因此双功能交联试剂与赖氨酸残基的连接是非特异的，小分子毒素与抗体结合数量和位置呈随机正态分布模式。而对于轻重链间还原性二硫键偶联，如IgG1单抗中有8个链间半胱氨酸可供偶联。偶联位点的多样性导致了ADC产品的异质性，偶联反应得到的产品实际是各种ADC的混合物，因此小分子药物和抗体的摩尔偶联比（Drug Antibody Ratio，DAR）是十分重要的质控参数。DAR值代表每个抗体上平均偶联的小分子个数，DAR值过低则导致ADC药物未能达到预期的生物活性，而DAR值过高则会影响ADC药物的安全性、稳定性及代谢特征，甚至药效也有可能随着DAR值的增加而降低（Hamblett KJ，Senter PD，Chace DF，et al． Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate． Clin Cancer Res，2004，10: 7063-7070）。对于目前已经上市的ADC药物而言，理想的DAR值应该控制在3～4之间，甚至更窄的范围。另外，由于偶联工艺过程常涉及有机溶剂的加入以及搅拌操作，不可避免地导致抗体蛋白产生交联物和多聚体，这些与工艺相关的杂质常可能引起免疫原性及其他副作用。
鉴于DAR值和多聚体含量均为ADC药物的关键质控参数，因此需要从偶联和纯化工艺着手，将DAR值控制在目标范围内，确保批间生产的一致性和稳定性，并尽可能控制和去除产品中副产物聚集体的含量。修饰偶联工艺非常复杂，尤其是随机偶联工艺。如要将DAR值控制在很窄的范围内相当具有难度，对工艺的要求极高。而偶联工艺失败的概率高（主要体现在DAR值的控制方面），若没有很好的手段避免DAR值控制失败的风险，则会使生产成本大量增加。对现有技术文献进行检索后发现，ADC药物的纯化工艺主要涉及采用G25葡聚糖凝胶层析或切向流过滤（UF/DF）的方式去除未偶联到抗体上的小分子接头和小分子毒素，其层析介质和膜介质均为非离子交换模式（CN 101267841 B；Brun MP, Gauzy-Lazo L. Protocols for lysine conjugation. Methods Mol Biol., 2013, 1045:173-87；Stefano JE, Busch M, Hou L, Park A, Gianolio DA. Micro- and mid-scale maleimide-based conjugation of cytotoxic drugs to antibody hinge region thiols for tumor targeting. Methods Mol Biol., 2013, 1045:145-71）。而阴离子层析介质在ADC药物纯化的应用发面，也仅涉及采用流穿模式的阴离子层析方法进行多聚体的去除（CN 103254311 A）。通过纯化手段控制DAR值的技术目前是空缺的。另外，无论随机偶联还是定点偶联技术，均存在修饰偶联反应过程中蛋白质聚集的问题。若能通过纯化的手段，降低抗体偶联药物的副产物，同时提高DAR值的可控性，对于提升ADC产品质量以及降低工艺风险和成本而言，具有十分重要的现实意义。
发明内容
针对ADC药物纯化方面现有技术的不足和空缺，本发明提供了一种抗体偶联药物（ADC）的阳离子交换层析纯化方法，通过所述阳离子纯化技术，同时实现对ADC药物的小分子/抗体的摩尔偶联比（DAR）和多聚体的控制，这有助于开发可控性更强、成本和风险更低的ADC生产工艺，以获得质量更高的产品，保证药物的安全性和治疗效果。
为了实现上述目的，本发明详细的技术方案如下：
一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，利用阳离子交换层析来纯化抗体偶联药物，控制小分子/抗体偶联比（DAR）和多聚体，所述纯化方法包括以下步骤：
调节ADC样品及平衡缓冲液至pH 4-7、电导2-8 mS/cm，选用结合-洗脱模式或过载模式进行纯化。
进一步的，所述的过载模式上样量不低于300 mg/mL介质；所述的过载模式的过程包括：平衡缓冲液平衡层析介质，然后进行抗体偶联药物上样，待ADC样品吸附饱和继而开始流穿后，收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白流穿液，杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则吸附在层析柱上。
进一步的，所述的结合-洗脱模式上样量不超过层析介质实际动态载量的90%；所述的结合-洗脱模式的过程包括：平衡缓冲液平衡层析介质，然后进行抗体偶联药物上样，并用洗脱缓冲液（pH 4-7，电导10-30 mS/cm）对结合的ADC抗体进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白洗脱液，而杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则在其后洗脱出来。
进一步的，所述的平衡缓冲液和洗脱缓冲液选自但不限于醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述的阳离子交换层析介质选自但不限于Eshmuno CPX（Millipore）、 POROS HS（AB）、POROS XS（AB）、Toyopearl Gigacap S-650M（TOSOH）、Toyopearl SP-650M（TOSOH）、Nuvia HR-S（Bio-Rad）和SP Sepharose（GE），优选Eshmuno CPX和POROS XS这两种新型的高载量阳离子层析介质。
进一步的，所述的抗体偶联药物由小分子毒素通过接头与抗体偶联构成，其中偶联比（DAR）为2-5。尤其适用于处理DAR值偏高（≥3.7）的ADC样品。
进一步的，所述的抗体为单克隆抗体，优选的，所述的单克隆抗体为人源化单克隆抗体。
进一步的，所述的小分子毒素选自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍生物。
进一步的，所述的抗体偶联药物的偶联方式包括但不限于赖氨酸偶联、轻重链间还原性二硫键偶联和定点偶联。
收集的样品分别采用紫外（UV）分光光度法进行DAR值监测，采用分子排阻液相色谱法（SEC-HPLC）进行多聚体含量监测。
本发明中，ADC样品的定义为：将抗体通过接头与小分子毒素进行共价结合后所形成的抗体偶联药物，涉及赖氨酸偶联、轻重链间还原性二硫键偶联和定点偶联等不同的偶联方式。所述的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。小分子毒素可选自美登素衍生物DM1（N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基）-美登素）、DM4（N2’-脱乙酰-N2’-4-甲基-4巯基-1氧代戊基）-美登素）及其类似物、海兔毒素衍生物MMAE（Monomethyl Auristatin E，甲基澳瑞他汀E）、MMAF（Monomethyl Auristatin F，甲基澳瑞他汀F）及其类似物。优选的小分子毒素为DM1。所述的接头优选为SMCC（4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）。
本发明通过pH 4-7、电导2-8 mS/cm范围内的动态载量DOE实验确定所述的阳离子交换层析法的上样条件。
在本发明中，所述的过载阳离子交换层析法采用流穿模式，适用于大规模样品的处理，层析载量超过300 mg/mL介质。
在本发明中，所述的阳离子交换层析法采用结合-洗脱模式，上样量不超过层析介质实际动态载量的90%。对于高载量阳离子层析介质而言，通过控制收集范围可将DAR值维持在极窄的目标范围（3.5±0.1）内。对于赖氨酸偶联的ADC样品，多聚体的去除率可达到40%以上，回收率可维持在86%以上；对于半胱氨酸偶联的ADC样品，多聚体的去除率可达到60%以上，回收率也可维持在79%以上。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明提供了一种ADC制备和纯化的新思路。ADC药物的DAR值决定了产品的有效性和毒性，因此需将其控制在一个稳定的范围内。另外，作为工艺相关杂质，多聚体的存在会引起免疫原性，应尽可能使产品中多聚体的含量降至最低。本发明通过一种纯化的手段，即采用阳离子交换层析的方法，对修饰偶联工艺的关键中控指标DAR值实施有效地控制和纠偏，同时实现多聚体的大比例去除；本发明有别于传统裸抗体的纯化策略，首次将阳离子交换层析应用于ADC样品的DAR值控制，扩展了阳离子交换层析方法的应用范围和用途；
2、本发明还提供过载模式与结合-洗脱模式这两种不同的纯化方案，在实际研发和生产过程中，可根据工艺规模、处理量、产品的状态灵活地选择最适合的纯化方式。如过载模式尤其适用于大量ADC样品的纯化，因其受纯化介质的载量限制较少，而且操作简便。而结合-洗脱模式虽然处理量不如过载模式，但可通过控制收集范围对DAR值和多聚体含量实现更为精细的控制。综上所述，本发明可起到降低ADC产品的生产成本和控制风险、提高工艺可控性和产品质量的作用。
附图说明
图1为实施例5中三种层析介质POROS HS（A）、POROS XS（B）和Eshmuno CPX（C）的动态载量（DBC）等高线图，横坐标为pH，纵坐标为电导。颜色越深的区域DBC越高，亦即选用颜色越深的区域所对应的pH和电导，介质对样品的吸附载量越高。DOE实验的考察范围为pH 4-7，电导2-8 mS/cm。
图2为实施例6中采用层析介质POROS HS的过载模式进行不同流速纯化ADC样品的结果。其中图A为AKTA谱图，横坐标为ADC样品的上样量，纵坐标为UV280nm处的吸收值（mAU），样品吸附饱和后开始流穿，P1和P2分别为400 mM醋酸钠缓冲液（pH 5，电导24 mS/cm）洗脱峰和0.5 M NaOH洗脱峰。其中图B为多聚体及DAR值的测定结果，横坐标为经纯化的ADC样品的合并收集量（mg），左纵坐标为收集的样品合并后的多聚体含量与原液中多聚体含量的比值（C/C0），右纵坐标为收集的样品所对应的合并后DAR值。先流穿出来的ADC样品，多聚体含量和DAR值均较低。不同流速下，DAR值曲线均呈上升趋势，而C/C0曲线上升的速率不同，低流速下C/C0到达平台期更缓慢，有利于多聚体的去除。
图3-图7均为实施例7中的结合-洗脱模式纯化结果，其中图3、图4、图5分别为层析介质POROS 50 HS（图3）、POROS XS（图4）和Eshmuno CPX（图5）在赖氨酸偶联ADC样品中的应用，图6、图7分别为层析介质POROS XS（图6）和Eshmuno CPX（图7）在半胱氨酸偶联ADC样品中的应用。其中A图为纯化AKTA色谱图，横坐标为流出体积（mL），左纵坐标为UV280nm处的吸收值（mAU），右纵坐标为溶液的电导值，ADC样品随着电导逐渐升高不断被洗脱下来。其中B图为分段收集ADC样品的多聚体（HMW）和DAR值测定结果，横坐标为收集的体积，左纵坐标为收集的样品中多聚体含量与原液中聚体含量的比值（C/C0），右纵坐标为收集的样品所对应的DAR值。先洗脱出来的样品多聚体含量低，DAR值也较低；而多聚体含量高、DAR值较高的组分则在其后洗脱下来，这样就可达到分离多聚体组分和控制样品DAR值的目的。图C为分子排阻色谱（SEC-HPLC）的色谱图，横坐标为蛋白质出峰时间（min），纵坐标为UV280nm处的吸收值（mAU），单体目标蛋白在15-16 min出峰，多聚体在12-14 min出峰，后洗脱出来的样品多聚体比例明显升高。
具体实施方式
实施例1
一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，利用阳离子交换层析来纯化抗体偶联药物，控制小分子/抗体偶联比（DAR）和多聚体，所述纯化方法包括以下步骤：
调节ADC样品及平衡缓冲液至pH 4-7、电导2-8 mS/cm，选用结合-洗脱模式或过载模式进行纯化。
进一步的，所述的过载模式上样量不低于300 mg/mL介质；所述的过载模式的过程包括：平衡缓冲液平衡层析介质，然后进行抗体偶联药物上样，待ADC样品吸附饱和继而开始流穿后，收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白流穿液，杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则吸附在层析柱上。
进一步的，所述的结合-洗脱模式上样量不超过层析介质实际动态载量的90%；所述的结合-洗脱模式的过程包括：平衡缓冲液平衡层析介质，然后进行抗体偶联药物上样，并用洗脱缓冲液（pH 4-7，电导10-30 mS/cm）对结合的ADC抗体进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，收集DAR值和多聚体含量符合要求的目标蛋白洗脱液，而杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则在其后洗脱出来。
进一步的，所述的平衡缓冲液和洗脱缓冲液选自但不限于醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述的阳离子交换层析介质选自但不限于Eshmuno CPX（Millipore）、POROS HS（AB）、POROS XS（AB）、Toyopearl Gigacap S-650M（TOSOH）、Toyopearl SP-650M（TOSOH）、Nuvia HR-S（Bio-Rad）和SP Sepharose（GE），优选Eshmuno CPX和POROS XS这两种新型的高载量阳离子层析介质。
进一步的，所述的抗体偶联药物由小分子毒素通过接头与抗体偶联构成，其中偶联比（DAR）为2-5。尤其适用于处理DAR值偏高（≥3.7）的ADC样品。
进一步的，所述的抗体为单克隆抗体，优选的，所述的单克隆抗体为人源化单克隆抗体。
进一步的，所述的小分子毒素选自但不限于美登素衍生物和海兔毒素衍生物。
进一步的，所述的抗体偶联药物的偶联方式包括但不限于赖氨酸偶联、轻重链间还原性二硫键偶联和定点偶联。
收集的样品分别采用紫外（UV）分光光度法进行DAR值监测，采用分子排阻液相色谱法（SEC-HPLC）进行多聚体含量监测。
本发明通过pH 4-7、电导2-8 mS/cm范围内的动态载量DOE实验确定所述的阳离子交换层析法的上样条件。
实施例2 抗体偶联药物（ADC）的制备
赖氨酸偶联ADC样品的制备：进行修饰反应前，将抗体（Ab）原液置换至修饰反应缓冲溶液中。加入双功能交联试剂SMCC（接头）对赖氨酸进行修饰，反应持续2-3小时。修饰反应结束后，通过G25葡聚糖凝胶层析或切向流过滤（UF/DF）系统除去未与抗体连接的SMCC，并将修饰后的中间产物Ab-MCC置换到偶联缓冲液（pH 5-6）中。随后加入小分子毒素DM1，与抗体上的接头偶联，反应持续3-15小时，得到备用的赖氨酸偶联ADC样品（Ab-DM1），紫外分光光度法测得DAR值为3.7-3.8。
半胱氨酸偶联ADC样品的制备：将Ab原液置换至反应缓冲液中（pH 7-8）。加入还原剂TCEP反应1-2小时，使得抗体的链间二硫键被打开，形成游离的巯基。随后加入连有接头的小分子毒素MMAE（MC-VC-PAB-MMAE），与抗体上被还原的巯基偶联。反应结束后，加入N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）终止反应。调节pH至5-6，得到备用的半胱氨酸偶联ADC样品（Ab-MMAE），紫外分光光度法测得DAR值为4.1-4.2。
实施例3 DAR值测定
实施例2制备所得的ADC样品，采用紫外（UV）分光光度法测定小分子药物/抗体的偶联比。根据抗体和药物在不同波长处的消光系数不同，由二元一次方程求导药物抗体偶联比（DAR）。具体为：将抗体偶联物稀释至0.3~0.5 mg/mL，在230～330 nm波长内对稀释后的ADC样品进行吸光度扫描。抗体的最大吸收峰在280 nm，小分子DM1的最大吸收峰在252 nm，小分子MMAE的最大吸收峰在248 nm。对于Ab-DM1样品分别选取252 nm和280 nm处的吸光度，对于Ab-MMAE样品则分别选取248 nm和280 nm处的吸光度，按照文献（于传飞等. 一种抗体药物偶联物中药物抗体偶联比的测定.药学学报, 2014, 49 (3): 363-367）所述的方法，计算DAR值以及ADC样品的浓度。
实施例4 多聚体检测
实施例2制备所得的ADC样品，通过分子排阻色谱法（SEC）测定其多聚体的含量。所使用的液相色谱柱为TSKG3000SWXL，使用的高效液相系统为Agilent HPLC系统。流动相为含15％异丙醇的磷酸盐缓冲液（pH 7），检测波长为280 nm。充分平衡色谱柱，待基线稳定后进样。进行等度洗脱，流速为0.5 mL/min，柱温25℃。按照面积归一法计算ADC样品中多聚体和单体所占的比例。
实施例5 不同的层析介质中ADC样品的动态载量
将实施例2中制得的ADC样品置换到65 mM醋酸钠缓冲液中（pH 5-6，电导5 mS/cm）。置换后的样品等分后，分别用1 M醋酸或1 M NaOH将ADC样品的pH调整至4-7，用相应pH的400 mM醋酸钠缓冲液或纯化水调节电导至2-8 mS/cm。分别将层析介质POROS HS、POROS XS和Eshmuno CPX装填到层析柱中。利用AKTA Purifier 100层析系统，以相应pH和电导的醋酸钠缓冲液（10倍柱体积以上）充分平衡层析柱后，以120 cm/hr的流速上样，通过UV280nm处的吸收值监测样品的流穿情况。待UV280nm曲线上升趋于平缓，结束上样。流动相切换成400 mM醋酸钠缓冲液进行洗脱，最后用0.5 M NaOH溶液清洗层析柱。计算10%穿透时的动态载量。利用JMP 10软件，绘制不同的层析介质、不同的pH和电导条件下测得的ADC样品动态载量结果的等高线图，结果如附图1所示。依此确定阳离子交换层析的上样条件，上样载量控制为不超过层析介质实际动态载量的90%。可以看到，Eshmuno CPX和POROS XS这两种新型的阳离子纯化介质具有较高的动态载量。
实施例6 采用过载模式的阳离子交换层析方法纯化ADC样品
将实施例2中制得的ADC样品置换到90 mM 醋酸钠缓冲液中（pH 5，电导6 mS/cm）。将层析介质POROS 50HS装填到层析柱中，利用AKTA Purifier 100层析系统进行过载模式的阳离子层析实验。用90 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5，电导6 mS/cm）充分平衡层析柱后上样，上样量为1100-1300 mg/mL介质。为了考察流速对试验结果的影响，流速分别设定为120 cm/hr和80 cm/hr。待ADC抗体吸附饱和继而开始流穿后，按5-7 mL/管收集流穿液。待上样完成后，用90 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5，电导6 mS/cm）冲洗平衡至基线，400 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5，电导24 mS/cm）洗脱，最后利用0.5 M NaOH溶液清洗层析柱。分段收集的样品分别采用实施例3的紫外（UV）分光光度法以及实施例4的分子排阻液相色谱（SEC-HPLC）法进行检测。色谱图、SEC和DAR值的测定结果参见附图2。
结果显示，不同流速下收集的目标蛋白C/C0均呈上升趋势，说明先流穿出来的ADC样品多聚体含量低，可以达到去除多聚体的效果。不同流速下C/C0曲线上升的速率不同，低流速下C/C0到达平台期更缓慢，有利于多聚体的去除。不同流速下，DAR值曲线均呈上升趋势。在过载模式下，我们可以通过控制ADC样品的上样量实现DAR值的控制。过载模式的处理量大，层析载量超过300 mg/mL介质，适用于大规模ADC样品的纯化。而且通过流穿模式收集样品，操作相对简单。
实施例7 采用结合-洗脱模式的阳离子交换层析方法纯化ADC样品
将实施例2中制得的ADC样品置换到90 mM醋酸钠缓冲液中（pH 5，电导6 mS/cm）。分别装填三种不同的层析介质（POROS HS、POROS XS和Eshmuno CPX）的层析柱，利用AKTA Purifier 100层析系统进行结合-洗脱模式的阳离子层析实验。首先用A液：90 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5，电导6 mS/cm）充分平衡层析柱后上样，上样量为60 mg/mL介质，流速为120 cm/hr。待上样完成后，用90 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5，电导6 mS/cm）冲洗至基线。然后用B液：400 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5，电导24 mS/cm）按0→100% B液、20 CV的梯度进行线性洗脱，分段收集洗脱液。最后利用0.5 M NaOH溶液清洗层析柱。分段收集的样品分别采用实施例3的紫外（UV）分光光度法以及实施例4的分子排阻液相色谱（SEC-HPLC）法进行检测。各层析介质的色谱图、SEC和DAR值的测定结果分别见附图3-7及表1-5。
如表1-5的结果所示，在结合-洗脱模式的阳离子交换层析中，合并不同阶段收集的样品，可得到DAR值不同且多聚体去除率各异的样品。尤其对于POROS XS和Eshmuno CPX这两种新型的高载量阳离子层析介质而言，通过控制收集范围可将DAR值维持在较窄的目标范围（3.5±0.1）内。如表2和表3所示，对于通过赖氨酸偶联的ADC样品（Ab-DM1），多聚体的去除率可达到40%以上，回收率可保持在86%以上。如表4和表5所示，对于通过半胱氨酸偶联的ADC样品（Ab-MMAE），多聚体的去除率可达到60%以上，回收率也可保持在79%以上。
本发明能够有效地去除ADC产品中的多聚体，提高ADC产品的质量；也能够有效地控制ADC产品的DAR值，使得ADC产品的生产风险和成本降低、工艺可控性提高。因此，本发明对于ADC产品的研发和生产具有重要的意义。
表1 层析介质POROS HS的结合-洗脱模式纯化结果（赖氨酸偶联ADC样品）
| 合并体积（mL） | 合并后的DAR | 合并后多聚体的整体去除率（%） | 合并后的整体回收率（%） |
| 13.0-23.0 | 3.39 | 62 | 3.46 |
| 13.0-28.0 | 3.37 | 70 | 6.61 |
| 13.0-33.0 | 3.16 | 84 | 35.92 |
| 13.0-38.0 | 3.33 | 59 | 84.72 |
| 13.0-40.0 | 3.40 | 29 | 93.33 |
| 13.0-45.0 | 3.45 | 9 | 99.08 |
表2 层析介质POROS XS的结合-洗脱模式纯化结果（赖氨酸偶联ADC样品）
| 合并体积（mL） | 合并后的DAR | 合并后多聚体的整体去除率（%） | 合并后的整体回收率（%） |
| 21.0-26.0 | 3.29 | 84 | 7.25 |
| 21.0-31.0 | 3.31 | 79 | 61.75 |
| 21.0-33.5 | 3.47 | 42 | 86.84 |
| 21.0-39.0 | 3.54 | 11 | 93.92 |
表3 层析介质Eshmuno CPX的结合-洗脱模式纯化结果（赖氨酸偶联ADC样品）
| 合并体积（mL） | 合并后的DAR | 合并后多聚体的整体去除率（%） | 合并后的整体回收率（%） |
| 27.5-32.5 | 3.20 | 2 | 16.59 |
| 27.5-37.5 | 3.35 | 74 | 77.52 |
| 27.5-39.5 | 3.47 | 44 | 95.27 |
| 27.5-44.5 | 3.55 | 16 | 101.99 |
表4 层析介质POROS XS的结合-洗脱模式纯化结果（半胱氨酸偶联ADC样品）
| 合并体积（mL） | 合并后的DAR | 合并后多聚体的整体去除率（%） | 合并后的整体回收率（%） |
| 33.0-35.0 | 3.25 | 100 | 2.31 |
| 33.0-37.0 | 2.98 | 94 | 15.58 |
| 33.0-39.0 | 3.09 | 92 | 46.43 |
| 33.0-42.0 | 3.49 | 63 | 79.39 |
| 33.0-45.0 | 3.86 | 0 | 94.35 |
| 33.0-50.0 | 3.96 | 0 | 98.95 |
表5 层析介质Eshmuno CPX的结合-洗脱模式纯化结果（半胱氨酸偶联ADC样品）
| 合并体积（mL） | 合并后的DAR | 合并后多聚体的整体去除率（%） | 合并后的整体回收率（%） |
| 34..0-36.0 | 2.91 | 100 | 6.77 |
| 34.0-38.0 | 2.97 | 95 | 34.88 |
| 34.0-40.0 | 3.14 | 92 | 59.18 |
| 34.0-42.0 | 3.36 | 84 | 75.99 |
| 34.0-43.0 | 3.49 | 60 | 81.99 |
| 34.0-44.0 | 3.64 | 34 | 87.98 |
| 34.0-46.0 | 3.86 | 0 | 95.26 |
| 34.0-51.0 | 4.00 | 0 | 100.11 |
上述的实施例中的描述仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明。任何针对本发明做出的变化和改进，皆应视为不脱离本发明专利的范畴，这些变化和改进都将落入本发明要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，利用阳离子交换层析来纯化抗体偶联药物，控制小分子/抗体偶联比（DAR）和多聚体，所述纯化方法包括以下步骤：
调节ADC样品及平衡缓冲液至pH 4-7、电导2-8 mS/cm，选用结合-洗脱模式或过载模式进行纯化。
2.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的过载模式上样量不低于300 mg/mL介质；
所述的过载模式的过程包括：平衡缓冲液平衡层析介质，然后进行抗体偶联药物上样，待ADC样品吸附饱和继而开始流穿后，收集目标蛋白流穿液，杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则吸附在层析柱上。
3.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的结合-洗脱模式上样量不超过层析介质实际动态载量的90%；
所述的结合-洗脱模式的过程包括：平衡缓冲液平衡层析介质，然后进行抗体偶联药物上样，并用pH 4-7、电导10-30 mS/cm的洗脱缓冲液对结合的ADC抗体进行梯度洗脱，收集目标蛋白洗脱液，而杂质多聚体以及DAR值偏高的蛋白质则在其后洗脱出来。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液和洗脱缓冲液选自但不限于醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的阳离子交换层析介质选自但不限于Eshmuno CPX、POROS HS、POROS XS、Toyopearl Gigacap S-650M、Toyopearl SP-650M、Nuvia HR-S和SP Sepharose。
6.如权利要求1所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的抗体偶联药物由小分子毒素通过接头与抗体偶联构成，其中偶联比（DAR）为2-5。
7.如权利要求6所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的单克隆抗体为人源化单克隆抗体。
9.如权利要求6所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的小分子毒素选自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍生物。
10.如权利要求6-9所述的抗体偶联药物的阳离子交换层析纯化方法，其特征在于，所述的抗体偶联药物的偶联方式包括但不限于赖氨酸偶联、轻重链间还原性二硫键偶联和定点偶联。
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