CN104188979B

CN104188979B - 闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用

Info

Publication number: CN104188979B
Application number: CN201410392605.XA
Authority: CN
Inventors: 王平昌; 沈昕; 林华徒; 帅继山
Original assignee: Taizhou Xiangtai Hong Wah Medical Technology Co ltd
Current assignee: Taizhou Xiangtai Hong Wah Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-08-11
Also published as: CN104188979A

Abstract

本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone的O‑(吗啉基)乙基衍生物、制备方法及其在制备抗缺血性脑损伤药物上的用途。本发明合成了一个新的闭花木酮Cleistanone的O‑(吗啉基)乙基衍生物，并公开了其制备方法。药理学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone的O‑(吗啉基)乙基衍生物具有抗缺血性脑损伤的作用，具有开发抗缺血性脑损伤药物的价值。

Description

闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物、制备方法及其用途。

背景技术

脑缺血性病是一缓慢进行的病，并有突发性事件出现的可能。单纯用扩血管药物，其作用比较有限，甚至在用药的情况下还可能发生隐性脑梗死，手术治疗是最主要的治疗方式。脑缺血疾病的诊断主要依靠病史，神经系统体验和必要的辅助检查。

造成脑缺血的病因是复杂的，归纳起来有以下几类：①颅内、外动脉狭窄或闭塞；②脑动脉栓塞；③血流动力学因素；④血液学因素等。

脑缺血性病的临床表现如下：

1.暂时脑缺血

包括短暂缺血发作(TIA)和可逆性缺血神经障碍(RIND)。前者指因暂时缺血，引起脑、视网膜和耳蜗等功能障碍，少有意识改变。症状持续数分钟，少数可持续数小时，但均在24小时内完全恢复，不留后遗症。后者的发病同TIA，只不过神经功能障碍持续大于24小时，但不超过3周。如超过3周者，则属永久性脑缺血。

2.脑梗死

常起病突然，根据病情有稳定型和进展型之分，前者指病情稳定无进展，历时24～72小时，又称完全性脑卒中。11％～13％患者起病隐匿，无临床症状和体征，仅影像学发现有缺血灶。

3.边缘型梗死

边缘区位于大脑中动脉、大脑前动脉之间和大脑中动脉与大脑后动脉分支交汇处。此外，小脑供应血管之间、基底节区、皮质下都有类似边缘区。这些区域主要由各大血管末梢支供血，最易受到缺血损害，形成从额叶到枕叶的镰形缺血灶。

4.腔隙性梗死

由小穿通动脉病损引起的脑深部微小梗死，占脑梗死的12％～25％。梗死好发于基底节区以及丘脑、脑桥、内囊和白质内，可隐匿起病、无症状或表现为神经功能障碍。意识状态和高级皮质功能不受影响。

从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物具有重要价值。

目前对于缺血性脑损伤的治疗，临床上没有特效药物，大部分药物在缓解缺血性脑损伤症状的同时具有不可避免的毒副作用，从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物具有重要价值。

本发明涉及的化合物闭花木酮Cleistanone是一个2011年发表(Van Trinh ThiThanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis witha New Carbon Skeleton.Volume 2011,Issue 22,pages 4108–4111,August 2011)的化合物，我们对化合物闭花木酮Cleistanone进行了结构修饰，获得了一个新的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物，并对其抗缺血性脑损伤活性进行了评价，其具有抗缺血性脑损伤活性。

发明内容

本发明公开了一个闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物，其结构为：

本发明闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物(III)可通过下面方法制备：

(1)闭花木酮Cleistanone(I)与1,2-二溴乙烷反应得到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)；

(2)闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)与吗啉发生取代反应制得闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物(III)。

进一步的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物(III)的制备方法为：

(1)将440mg化合物闭花木酮Cleistanone(I)溶于10mL苯，向溶液中加入0.04g的四丁基溴化铵，3.760g的1,2-二溴乙烷和6mL的50％氢氧化钠溶液；混合物在25摄氏度搅拌24h；24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液；然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集黄色集中洗脱带即得到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的黄色固体。

(2)将273mg的闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)溶于20mL乙腈当中，向其中加入345mg的无水碳酸钾，84mg的碘化钾和1742mg的吗啉，混合物加热回流8h；反应结束后将反应液倒入30mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有机相；依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v，收集黄色集中洗脱带即得到闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物(III)的黄色固体185.3mg。

本发明公开的化合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。

药效学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物(III)具有较好的抗缺血性脑损伤作用。本发明的药学上可接受的盐与其化合物具有同样的药效。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

具体实施方式

实施例1 化合物闭花木酮Cleistanone的制备

化合物闭花木酮Cleistanone(I)的制备方法参照Van Trinh Thi Thanh等人发表的文献(Van Trinh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid fromCleistanthus indochinensis with a New Carbon Skeleton.Volume 2011,Issue 22,pages 4108–4111,August 2011)的方法。

实施例2 闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的合成

将化合物I(440mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化铵(TBAB)(0.04g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氢氧化钠溶液。混合物在25摄氏度搅拌24h。24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集黄色集中洗脱带即得到化合物II的黄色固体(344mg，63％)。

1H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.04(s,1H),4.82(s,1H),3.94(d,J＝26.5Hz,1H),3.87(d,J＝26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J＝14.0Hz,1H),2.39(d,J＝14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1.57(d,J＝3.3Hz,1H),1.54(d,J＝3.3Hz,1H),1.50(d,J＝1.2Hz,1H),1.47(d,J＝1.2Hz,1H),1.39(d,J＝15.3Hz,2H),1.34(d,J＝15.3Hz,1H),1.26(dd,J＝32.6,13.7Hz,4H),1.13(d,J＝18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78(s,3H),0.74(s,1H)。

13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s),69.85(s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),42.25(s),41.73(s),40.64(s),40.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J＝1.1Hz),32.96(s),29.91(s),27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s),17.98(s),16.93(s)。

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₂H₅₂BrO₂:547.3151；found 547.3159.

实施例3 闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物(III)的合成

将化合物II(273mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(345mg，2.5mmol)，碘化钾(84mg，0.5mmol)和吗啉(1742mg，20mmol)，混合物加热回流8h。反应结束后将反应液倒入30mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有机相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集黄色集中洗脱带即得到Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物的黄色固体(185.3mg,67％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.11(s,1H),4.81(s,1H),4.39(s,1H),3.51(d,J＝17.7Hz,6H),2.59(s,2H),2.47(s,4H),2.32(t,J＝36.5Hz,2H),2.24(s,1H),2.20(s,1H),2.11(s,1H),1.79(d,J＝90.0Hz,3H),1.59(d,J＝7.0Hz,2H),1.40(d,J＝4.2Hz,2H),1.35(d,J＝14.5Hz,3H),1.30–1.16(m,4H),1.11(d,J＝6.5Hz,2H),1.02(s,6H),0.82(d,J＝8.5Hz,13H),0.73(s,3H),0.65(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.37(s),154.55(s),105.98(s),73.28(s),69.13(s),66.17(s),58.23(s),54.02(s),53.01(s),52.77(s),51.83(s),48.12(s),46.23(s),42.97(s),41.13(s),40.99(s),39.93(s),38.92(s),38.67(s),37.13(s),36.59(s),33.21(s),32.13(s),29.41(s),27.38(s),26.01(s),24.33(s),23.12(s),20.13(s),19.13(s),17.25(s),16.16(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₃₆H₆₀NO₃:554.4573；found:554.4579。

实施例4 Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物抗缺血性脑损伤活性

实验例1：Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物对大鼠局部脑缺血损伤的影响

(1)实施材料：SD大鼠，雌雄兼用，体重190～210g。阳性对照药：天保宁，康恩贝集团制药有限公司生产，每片含银杏叶精提取物40mg。

(2)方法与结果

1)Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物对大鼠中动脉血栓(MCAT)模型试验

将40只大鼠随机分为四组，即假手术对照组、MCAT模型组、Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物组，阳性药物组(天保宁，20mg/kg)。造模前灌胃给药，一日一次，共给药七次，假手术对照组、MCAT模型组、给予等量的饮用水(1ml/100g)，造模后灌胃给药一次。造模：大鼠腹腔注射12％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉，大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处做一直径215mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。将吸有50％氯化铁溶液10ul的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上30min后，取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。

MCAT大鼠神经症状和梗塞范围的评定：在手术不同时间(6h，24h)，按Bederson等方法并加以改进，对动物进行行为评分。1.提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、时屈曲、肩内旋或既有腕时的屈曲又有内旋者，记为1分。2.将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检测阻力。如双侧阻力对等且有力者记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。3.将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分；手术对侧前肢肌张力下降记为1分。4.提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转着，记为1分；否则记为0分。根据以上标准评分，满分为4分，分数越高动物的行为障碍越严重。对行为检测打分值进行组间比较，t检验。结果见表1。动物经末次行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4℃下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30min，再取出置于10％甲醛液中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占右侧半脑重量的百分比作为脑梗塞范围。结果进行组间比较，t检验，结果见表1。

表1 Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物对MCAT大鼠脑梗塞范围及神经症状的影响(n＝10)

注：与模型组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

结果显示，除假手术未见行为异常改变，MCAT模型组大鼠在术后6h出现偏瘫样症状。给药组与天保宁组的大鼠在术后6h其神经症状均有不同程度的改善(P<0.01，P<0.05)。Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物可显著减轻梗塞灶。

实验例2：Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物对大鼠局部脑缺血/再灌注损伤的影响

(1)实验材料：SD大鼠，雌雄兼用，体重190～210g。MDA，SOD，蛋白定量(考马斯亮蓝)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

(2)方法与结果

1)实验方法：30只大鼠随机分为3组，即假手术组、模型组、Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物给药组，每组10只。除假手术组不插线外，其余组造模(MCAO)。给药组ig每天1次，连续13d。术前1h ig再给药1次。6％水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎颈总动脉近心端、颈外动脉起始端后，在颈总动脉处剪一“V”形小口，沿颈总动脉插入线栓(线栓采用直径为0.235mm的鱼线，头端烧成球状，并于距线球18.5mm处作标记)经颈内动脉向颅内插至大脑中动脉分支叉处，插入深度为18～20mm，将线与颈内动脉一起结扎。术中维持体温(37±015)℃。在灌注时外拉线使球端回至ECA，拔除插线，结扎ECA即可。假手术组除不插线外，其余步骤同上。大脑中动脉栓塞后2h恢复血供，神经行为学评分参照ZeaLonga5分制标准，术后出现左前肢屈曲，行走时向左侧转圈即视为造模成功，然后保温常规饲养，至24h断头处死取材。实验过程中，因麻醉意外、MCAO手术失败、造模不成功及24h内死亡的均弃去不用。

脑梗塞体积测定：断头取脑，将大脑作连续2mm冠状切片，共5片，然后将脑片放入2％TTC磷酸盐缓冲液中37℃恒温孵育30min，正常脑组织染为红色，梗死灶呈白死。滤纸吸去表面液体后用刀片小心刻取未着色部分的质量百分比，以此反应梗死体积比。

脑组织匀浆SOD活力、MDA含量的检测：右侧半脑称重后按1：10加入冰生理盐水制成匀浆，参照SOD、MDA试剂盒说明书，检测脑组织中SOD、MDA含量。

应用SPSS 13.0 for windows软件对数据进行处理；计量数据以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析。

2)结果

脑梗塞体积：模型组脑组织脑梗塞体积高于各组(P<0.05)，给药组可显著降低模型脑组织梗死体积(P<0.05)。

表2 Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物对脑梗死体积、SOD、MDA含量的影响

与模型组相比*p<0.05

结论：Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物可缩小梗死体积，提高SOD活性，降低MDA含量，减轻自由基反应对脑组织的损害，对缺血脑组织具有明显的保护作用。Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物可以用于制备治疗缺血性脑损伤药物。

实施例5 本发明所涉及Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物片剂的制备

取20克Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例6 本发明所涉及Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物胶囊的制备

取20克Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。

Claims

1.如式III所示的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，其特征为：所述缺血性脑损伤为动脉血栓所致的缺血性脑损伤，

2.根据权利要求1所述的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，其特征为：所述闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物减轻梗塞灶。

3.根据权利要求1所述的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，其特征为：所述闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物改善缺血性脑损伤引起的神经症状。

4.如式III所示的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，其特征为：所述闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物缩小梗死体积，

5.如式III所示的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，其特征为：所述闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物提高脑部SOD活性，

6.如式III所示的闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗缺血性脑损伤药物中的应用，其特征为：所述闭花木酮Cleistanone的O-(吗啉基)乙基衍生物降低脑部MDA含量，