CN104177481B - 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 - Google Patents
植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104177481B CN104177481B CN201310189177.6A CN201310189177A CN104177481B CN 104177481 B CN104177481 B CN 104177481B CN 201310189177 A CN201310189177 A CN 201310189177A CN 104177481 B CN104177481 B CN 104177481B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- auxin
- protein
- ear
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 109
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 101000972483 Zea mays Protein LAZY 1 Proteins 0.000 title abstract description 33
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 77
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims abstract description 75
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims abstract description 75
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims 7
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 claims 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 claims 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 101
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 abstract description 55
- 230000005305 organ development Effects 0.000 abstract description 6
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 abstract description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 41
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 41
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 10
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 8
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100029462 Sodium-dependent lysophosphatidylcholine symporter 1 Human genes 0.000 description 6
- 101710185583 Sodium-dependent lysophosphatidylcholine symporter 1 Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 230000000238 gravitropic effect Effects 0.000 description 6
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 5
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 5
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 4
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 4
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100107607 Arabidopsis thaliana ABCB4 gene Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 230000032111 floral organ development Effects 0.000 description 3
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 3
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 3
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 101150093547 AUX1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100377791 Arabidopsis thaliana ABCB19 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100127669 Arabidopsis thaliana LAZY1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 101100367246 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SWA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108700038180 Arabidopsis AT5G14090 Proteins 0.000 description 1
- 108700040383 Arabidopsis YUC Proteins 0.000 description 1
- 101100190527 Arabidopsis thaliana PIN5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100190530 Arabidopsis thaliana PIN8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111720 EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032670 Endophilin-B1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000654648 Homo sapiens Endophilin-B1 Proteins 0.000 description 1
- 101001047659 Homo sapiens Lymphocyte transmembrane adapter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000831616 Homo sapiens Protachykinin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043187 LAX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100093 LAX3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 102100024034 Lymphocyte transmembrane adapter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150013468 MDR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102000005591 NIMA-Interacting Peptidylprolyl Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010059419 NIMA-Interacting Peptidylprolyl Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001442050 Plagiobothrys Species 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000953909 Streptomyces viridifaciens Isobutylamine N-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000004577 ear development Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000025731 floral organ morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 108010079923 lambda Spi-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 150000003907 phosphatidylinositol monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000027870 phototropism Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000009648 positive gravitropism Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000033778 regulation of meristem development Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8294—Auxins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physiology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。所述蛋白ZmLA1来源于玉米（Zea mays L.），由序列表序列1所示的氨基酸序列组成。本发明所提供的蛋白质或所述基因可用于调控目的植物如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种。本发明所提供的基因和蛋白在植物茎秆抗倒伏性、理想株型、花器官形态等一系列与产量直接相关性状的改良中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。
背景技术
作为最早为人类认识的植物激素，生长素广泛参与植物生长发育过程的各个阶段。生长素的合成主要以两种方式进行：色氨酸依赖途径和非色氨酸依赖途径。其合成部位主要包括植物顶端分生组织、叶原基、萌发的种子及花粉等新形成的组织。相较于生长素局部区域合成这一特性，生长素极性运输(PAT)是引起植物生长素不均一分布的更主要原因。生长素运输不同于其它植物激素，是以一种极性运输的方式进行，即体内运输方向是单向的，只能从植物体形态学上端向形态学下端运输。通过这种极性运输建立起的生长素浓度梯度特异介导了植物一系列生物学反应，如：细胞伸长、细胞分化、根的伸长、向光性、重力性、顶端优势、花分化和果实形成等。这个过程需要两类生长素运输载体：输入载体和输出载体。拟南芥中已鉴定的生长素输入载体主要有四类：AUX1,LAX1,LAX2和LAX3(类AUX1蛋白)。而输出载体主要包括PIN蛋白家族，在拟南芥中现已鉴定出8个PIN基因，它们可分为两类：长PIN蛋白（PIN1,2,3,4和7）主要定位于细胞质膜上，介导生长素细胞间极性运输；短PIN蛋白（PIN5,6和8）则定位于内膜系统上，介导生长素的胞内运输。
拟南芥输出载体除了PIN蛋白家族外，最近研究发现多重抗药性/磷酸糖蛋白家族(multidrug-resistant/P-glycoprotein，MDR/PGP，ABCB)也参与了生长素极性运输。它是ATP结合盒(ATP—binding cassette，ABC)转运蛋白超级家族中的一个亚家族。其中，PGP1(ABCB1)是最早被发现与生长素极性运输相关的PGP家族成员。另外，PGP4（MDR4）和PGP19(MDR1/ABCB19)也分别被证明作用于植物生长素的极性运输。
植物重力性反应体现为地上部正向重力性反应和根负向重力性两部分，正常的重力性反应对根和地上部各器官的形态发育和生物学功能是必需的。早在近一个世纪之前，人们就提出Cholodny–Went假说，认为生长素的不对称分布是导致植物向重性和向光性等向性运动的原因。Li等也证明烟草向性运动相应部位发生了生长素的不对称分布。生长素还参与调节拟南芥根的重力性反应，这些结果都正面支持了Cholodny–Went假说的正确性。
近年来对于生长素介导植物根重力性生长的研究报道不断涌现。根中生长素的极性分布依赖于AUX1蛋白，aux1突变体表现为根重力性完全丧失。PGP4也参与拟南芥根中生长素运输，pgp4突变体根中生长素向基运输速度明显降低，根向重性反应也随之钝化。最近root growth factors(RGFs)分泌肽家族成员和phosphatidylinositolmonophosphate 5-kinase 2(PIP5K)分别被证明通过调控生长素输出载体的胞内循环来调节植物地上和地下多器官的重力性反应。水稻LAZY1负向调控生长素极性运输，相应的水稻和拟南芥lazy1突变体都表现为地上部重力性反应减弱并伴随分枝角度增大。最近研究者提出一个“tipping point”机制,证明在重力性弯曲生长过程中，一定倾斜角度可作为触发点，引起生长素极性运输流向发生反转，充分证明了生长素极性运输与重力性反应的直接相关性。
生长素极性运输参与的另外一个重要生物学过程是调控分生组织发育和花器官形态建成。以玉米为例，花器官包含雄穗，发育自顶端分生组织；雌穗，发育自雄穗数个节下的腋生分生组织。除着生位置不同外，雌雄穗表现出不完全相同的发育模式，其中雄穗发育包含四种类型的分生组织：特异的分枝分生原基(branch meristem，BM),小穗对分生原基(spikelet pair meristems，SPMs),小穗分生原基(spikeletmeristems，SMs)和小花分生原基(floral meristems，FMs)，然而雌穗发育仅包含SPMs,SMs和FMs。通过对一系列玉米雌雄穗生长素运输相关基因的研究，发现特异的生长素浓度梯度对各级分生原基的生长分化都是必不可少的。玉米生长素输出载体ZmPIN1a和ZmPIN1b特异定位于顶端分生组织和腋生组织的表皮细胞层中，预示着生长素极性运输在花器官起始发育中的重要作用。玉米Barren inflorescence2(Bif2)编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINOID(PID)同源蛋白，通过调控PIN蛋白亚细胞极性定位控制生长素极性运输，且此作用过程在玉米和拟南芥中是保守的。bif2突变则引起雌穗籽粒数减少且雄穗分枝数和小花数明显减少。另外一个半显性bif1突变体中，腋生分生组织的生长素运输速率降低，造成与bif2相似的表型。basic helix–loop–helix（bHLH）转录因子Barren stalk1(Ba1)参与了玉米腋生分生组织的起始过程，且ba1突变体表现为雌穗、雄穗分枝、小花完全缺失。BA1特异表达于花器官分生组织的边界处，并介导形成了局部的生长素浓度梯度，但BA1在生长素极性运输调控途径中的上下游位置尚存争议。
除了生长素极性运输，通过生长素的局部合成建立的生长素浓度梯度也在玉米花器官发育中起重要作用。玉米sparse inflorescence1(spi1)编码黄素单氧酶，其介导催化Trp依赖性生长素合成途径中的限速步骤，与拟南芥YUCCA基因同源，参与腋生分生组织和侧生器官的生长分化，最终完成花器官的形态建成。另一个生长素合成基因vanishing tassel2(vt2)同样为花器官的腋生分生组织发育所必需。遗传学分析表明生长素极性运输与局部组织中的生物合成能协同作用于调控玉米花器官发育过程。
尽管大量研究已明确表明生长素在重力性反应和花器官发育中的重要作用，但还没有同时参与这两个过程调控基因的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。
本发明所述蛋白质ZmLA1，来源于玉米（Zea mays L.），是如下a）或b）的蛋白质：
a）由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物倒伏和/或花器官发育相关的由（a）衍生的蛋白质。
序列表序列1所示的氨基酸序列由413个氨基酸残基组成，其中，第70-90位氨基酸肽段为跨膜结构域，第275-298位、第338-345位两段肽段为罗宾逊（Robinson）核定位信号。
为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白质的编码基因为如下1）-4）基因中的任意一种：
1）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；
2）其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
序列表序列2为蛋白质ZmLA1的编码序列。序列表序列3为玉米基因组DNA上编码序列2的基因。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。
含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
所述重组载体具体可为在pCAMBIA3301-UbiN的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入所述基因得到的重组载体M。
本发明所提供的蛋白质和所述基因可用于调控目的植物如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；
所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种；
所述茎秆抗倒伏能力为遗传背景相同的植物在一定生长条件下，茎秆直立生长的植株的茎秆抗倒伏能力高于相同生长条件下茎秆匍匐生长的植株。
所述调控包括促进（如提高、增加或缩短）和抑制（降低、减少或延长）两个方面。
本发明提供一种获得具有如下至少一种表型植物的方法，包括降低所述植物中所述蛋白表达、和/或抑制所述基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率提高，生长素侧向运输效率降低，茎秆抗倒伏能力降低，雌穗花期延迟、雄穗花期延迟、雄穗分枝数减少、雌穗穗柄长度降低、花丝鲜重降低、果穗长度降低、结实率降低。
本发明还提供一种获得具有如下至少一种表型植物的方法，包括提高所述植物中所述蛋白表达、和/或促进所述基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。
本发明还提供一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有如下至少一种表型的转基因植物：
生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。
所述导入是通过所述重组载体M实现的。
在上述方法或应用中，所述目的植物或植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为玉米。
本发明还提供如下A）—C）中任一种引物对或引物对组合物及其在玉米育种中应用：
A）引物对M4和引物对M5；
B）引物对M4；
C）引物对M5；
所述引物对M4由序列表序列4所示的单链DNA和序列表序列5所示的单链DNA组成；
所述引物对M5由序列表序列6所示的单链DNA和序列表序列7所示的单链DNA组成。
本发明通过图位克隆获得控制玉米地上部重力性缺失突变体即匍匐（或倒伏）表型突变体的功能基因为序列表序列2和3所示的基因，该基因编码序列表序列1所示的蛋白，并通过表型研究及其表达模式研究揭示蛋白ZmLA1在花器官发育和生长素极性运输中的重要作用。本发明所提供的基因和蛋白在植物茎秆抗倒伏性、理想株型、花器官形态等一系列与产量直接相关性状的改良中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为玉米突变体ps1和玉米自交系Mo17的BC3F2分离群体中直立型（左）和匍匐型（右）单株在7—8叶期的植株表型。
图2为ZmLa1基因的精细定位图。
图3为等位基因突变位点图。
图4为直立型单株雌穗表型（左）和匍匐型单株雌穗表型（右）图。
图5为直立型单株雄穗表型（左）和匍匐型单株雄穗表型（右）图。
图6为ZmLA1蛋白的亚细胞定位结果。其中，图A为质壁分离前的结果，图B为质壁分离后的结果，图中的第一列为暗示场下的结果，第二列为明示场下的结果；标尺代表100μm；图A中，从上至下第一行为转化空载体35S：：EGFP的结果；第二行为转化全长ZmLA1与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LA）；第三行为转化去除NLS1的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LAΔ NLS1）；第四行为转化去除NLS1和NLS2的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LAΔ NLS1NLS2）；第五行为转化去除从NLS1至蛋白末尾的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体的结果（LAΔ NLS1-to-end）；第六行为转化去除TMD的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体（LAΔ TMD）；图B中，从上至下各行依次为LA、LAΔ NLS1、LAΔ NLS1NLS2、和LAΔ NLS1-to-end的质壁分离结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米自交系B73（以下简称B73）：文献：Schnable PS,et al.The B73 maize genome:complexity,diversity,and dynamics.Science.2009;326(5956):1112-5。公众可从中国农业大学获得。
玉米自交系Mo17（以下简称Mo17）：文献：Brunner S,Fengler K,Morgante M,et al.Evolution of DNA sequence nonhomologies among maize inbreds[J].ThePlant Cell,2005,17(2):343-360。公众可从中国农业大学获得。
玉米突变体la1-PI239110（以下简称la1-1）：玉米遗传协作种质资源库（MaizeGenetics Cooperation Stock Center，http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaystockrecord.cgi?id=14199突变体编号405B）；
玉米突变体la1-MTM4659（以下简称la1-2）：玉米遗传协作种质资源库（MaizeGenetics Cooperation Stock Center，http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaystockrecord.cgi?id=9018815突变体编号406F）；
玉米突变体la1-05HI-RnjxW22GN-333（以下简称la1-3）：玉米遗传协作种质资源库（Maize Genetics Cooperation Stock Center，http://www.maizegdb.org/cgi-bin/displaystockrecord.cgi?id=9018817突变体编号406E）。
实施例1、ZmLA1蛋白及其编码基因的获得
一、玉米突变体ps1的获得及其突变表型的遗传分析
1、玉米突变体ps1的获得
本发明研究小组以玉米自交系综31（Hui Y,Guoying W,Jingrui D.Transformation of Maize Elite Inbred Lines[J].Journal of AgriculturalBiotechnology,2001,4:008.）为背景材料，通过Mu9转座子系统构建了玉米突变体库，发现其中一个突变体（命名为ps1），通过与Mo17连续回交，BC3F2分离群体中具有正常和突变两种表型：
突变型（以下称匍匐表型或倒伏表型）：苗期植株地上部逐渐倾斜，至7片-8片叶期表现为重力性丧失，完全匍匐（或倒伏）于地面（如图1中的右图所示），近地端第一节间出现弯曲，两侧细胞伸长速度不一致。
正常型（以下称直立表型）：植株整个生长期均表现为茎秆直立（如图1中的左图所示）。
以下实验中的直立或匍匐表型均为在7片-8片叶期进行调查的结果。
2、玉米突变体ps1突变表型的遗传分析
杂交组合1及其衍生后代：以纯合突变体ps1（即自交后代匍匐表型不分离）为父本、与母本玉米自交系B73杂交，获得F1代，将该F1代自交获得F2代，将该F1代与母本B73回交获得BC1群体；
杂交组合2及其衍生后代：以纯合突变体ps1为父本、与母本玉米自交系Mo17杂交，获得F1代，将F1代自交获得F2代，将该F1代与母本Mo17回交获得BC1群体；
分别统计上述杂交组合其衍生后代中F2代群体中7片-8片叶期表现为匍匐或直立的单株数和分离比，结果如表2所示。
表2
表2的结果表明，玉米突变体ps1的7-8片叶期匍匐表型受隐性单基因（命名为ps1基因）控制。
二、ps1基因的初步定位及精细定位
1、初步定位
1）定位群体
取步骤一中杂交组合1的杂交F2代群体（其中具有匍匐表型的共609个单株）、杂交组合2的杂交F2代群体（其中具有匍匐表型的共678个单株）、纯合突变体ps1、玉米自交系B73和玉米自交系Mo17单株，分别取叶片按常规方法提取基因组DNA。
2）SSR多态性筛选
在F2代群体中，按表型性状随机抽取10个匍匐单株的DNA，混合，获得匍匐表型DNA池，随机抽取10个直立单株的DNA，混合，获得直立表型DNA池。用408个已公布的玉米SSR标记的引物对、分别以各杂交组合1和2中的父本和母本的基因组DNA和两个DNA池为模板，按照SSR标记所在的染色体为序，进行PCR扩增，选择扩增产物在各杂交组合中父本和母本间存在SSR多态性的引物对，并记录两个DNA池的带型。
3）SSR与目标性状或目标基因的连锁分析
用步骤2）的方式筛选至4号染色体，SSR标记umc2176和umc1117扩增产物在父本和母本间存在SSR多态性，且匍匐表型DNA池的带型与亲本纯合突变体ps1带型一致，直立表型DNA池的带型为两亲本的杂合。为了验证此结果，在F2代群体中，按表型为匍匐和直立的数量之比为1:3的性状比随机抽取62个单株的基因组DNA，使用SSR标记umc2176和umc1117的引物对以及umc2176和umc1117之间的新开发的SSR标记M1和M7的引物对，分别进行PCR扩增，记录每个引物对对每个单株的扩增结果（即带型或产物大小），将带型结果与匍匐或直立表型性状进行比对，结果显示，在这62个单株中，这4个引物对的带型结果与性状均相一致（即带型和性状均与母本、父本或F1代之一的带型和性状相同），证明这4个引物对与目的基因是连锁的，SSR标记umc2176和umc1117以及其M1和M7在玉米4号染色体上的位置如表3所示。
表3.初步定位得到的与ps1基因连锁的SSR标记
注：表中的产物大小是指以B73的基因组DNA为模板的扩增结果。
然后，取F2群体中的所有匍匐表型植株的基因组DNA，分别用M1和M7引物对进行PCR扩增，记录带型并统计SSR标记与ps1基因之间发生单交换植株数、双交换植株数、不交换植株数，计算重组率，结果如表4和表5所示。
不交换：带型与匍匐表型的父本的带型一致；
双交换：带型与直立表型的母本的带型一致；
单交换：带型与F1单株的带型一致；
重组率=（单交换数+2×双交换数）/总数；
表4.初步定位得到的SSR标记在杂交组合1的F2代匍匐表型植株中重组情况
| SSR引物对 | 单交换数 | 双交换数 | 不交换数 | 总数 | 重组率（%） |
| M1 | 8 | 0 | 603 | 609 | 1.31 |
| M7 | 5 | 0 | 604 | 609 | 0.82 |
表5.初步定位得到的SSR标记在杂交组合2的F2代匍匐表型植株中重组情况
| SSR引物对 | 单交换数 | 双交换数 | 不交换数 | 总数 | 重组率（%） |
| M1 | 11 | 0 | 667 | 678 | 1.62 |
| M7 | 7 | 0 | 671 | 678 | 1.03 |
表3—5的结果表明：ps1基因在SSR标记M1和M7之间，距离是980Kb。
2、精细定位
1）根据玉米自交系B73全基因组物理图谱，在M1和M7两个SSR标记之间的980Kb区域，使用SSR Hunter软件查找SSR位点，设计SSR引物，获得35对SSR引物；
2）按照步骤1中2）的方法，从步骤1）获得的35对SSR引物中筛选得到在杂交组合1的亲本间具有多态性的引物4对，分别为M2、M3、M4和M6；在杂交组合2的亲本间存在多态性的引物4对，分别为M2、M3、M5和M6。该4对引物或标记的信息如表6所示。
表6.精细定位得到的在亲本间具有多态性的SSR标记
注：表中的产物大小是指以B73的基因组DNA为模板的扩增结果。
3）按照步骤1中3）的方法，将步骤2）筛选得到引物与F2群体中所有匍匐表型单株进行连锁性分析，结果如表7和表8所示。
表7.精细定位得到的SSR标记在杂交组合1的F2匍匐表型植株中的重组情况
| SSR引物对 | 单交换数 | 双交换数 | 不交换数 | 总数 | 重组率（%） |
| M2 | 4 | 0 | 605 | 609 | 0.66 |
| M3 | 1 | 0 | 608 | 609 | 0.16 |
| M4 | 1 | 0 | 608 | 609 | 0.16 |
| M6 | 1 | 0 | 608 | 609 | 0.16 |
表8.精细定位得到的SSR标记在杂交组合2的F2匍匐表型植株中的重组情况
| SSR引物对 | 单交换数 | 双交换数 | 不交换数 | 总数 | 重组率（%） |
| M2 | 7 | 0 | 671 | 678 | 1.03 |
| M3 | 3 | 0 | 675 | 678 | 0.44 |
| M5 | 1 | 0 | 677 | 678 | 0.15 |
| M6 | 2 | 0 | 676 | 678 | 0.29 |
表6—8的结果表明：ps1基因位于M4和M5两个SSR标记之间，距离是56Kb。
三、目标区域中候选基因的分析
对ps1基因所在的56kb区间进行基因注释以及候选基因的生物信息学分析，结果表明该区域有8个潜在的开放阅读框（图2），其中只有一个有对应的EST序列GRMZM2G135019支持，其功能注释未知。对纯合突变体ps1、玉米自交系Mo17和B73、以及杂交组合1和2中的F2代群体中的匍匐表型和直立表型单株中编码GRMZM2G135019的基因组DNA进行测序分析。结果表明：ps1纯合突变体的扩增产物为在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第四个外显子上存在一个Mudr转座子插入（图3）。基于此，将GRMZM2G135019作为候选基因进行以下功能研究。
四、三个等位突变体的等位测验分析
1、等位性测验
玉米la1突变体是20世纪30年代首次报道的经典突变体，其地上部重力性缺失的表型与ps1突变体极为相似。将三个la1等位突变体la1-1、la1-2和la1-3，分别与ps1纯合突变体正反交，F1代植株均为匍匐表型。已知这三个la1突变体与ps1突变体均为隐性突变，综上可证明la1和ps1为等位突变，将发生突变的基因命名为ZmLa1基因，由于在步骤三中将GRMZM2G135019作为ps1基因的候选基因，因此，这里的ZmLa1基因即为GRMZM2G135019及编码该EST的基因组DNA。
2、突变位点差异分析
对三个la1突变体的基因组DNA分别在编码GRMZM2G135019的位置进行测序分析，结果：la1-1突变体是在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第三个外显子上存在4bp插入，造成转录提前终止；la1-2突变体是在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第四个外显子上存在25bp插入，造成转录提前终止；la1-3突变体是在编码GRMZM2G135019的基因组DNA的第一个内含子的剪接受体G单碱基突变为T，造成无法正确剪接（图3）。
步骤三和四的结果表明，所述四个等位突变体均在编码GRMZM2G135019的基因组DNA上发生了突变，证明ZmLa1基因及其表达的蛋白控制相同的匍匐突变性状。
五、蛋白ZmLa1及其编码基因的获得
提取玉米自交系B73的近地端第三茎节总RNA，反转录得到cDNA，然后以该cDNA为模板，使用引物pla-F:ATGAAGCTCCTGGGTTGGA和pla-R:CTACAGCTCCAGCACCAAGTATT进行PCR扩增，回收纯化1.2kb的扩增产物进行测序，结果该1.2kb的扩增产物的序列如序列表序列2所示。
将序列表的序列1所示的蛋白命名为ZmLA1蛋白（由413个氨基酸残基组成）。将ZmLA1蛋白的编码基因命名为ZmLa1基因。ZmLa1基因的开放阅读框（1242bp）如序列表的序列2所示。ZmLa1基因的基因组DNA如序列表的序列3所示，其中，含5个外显子，长度分别为：6bp（序列3的第2711-2818位），73bp（序列3的第3144-3216位），869bp（序列3的第4707-5572位），274bp（序列3的第8202-8475位），20bp（序列3的第8728-8747位）；含4个内含子，长度分别为：319bp（序列3的第2825-3143位），1487bp（序列3的第3217-4703位），2628bp（序列3的第5573-8201位），252bp（序列3的第8476-8727位），5’UTR（非翻译区）长度为108bp（序列3的第2711-2818位），3’UTR长度为501bp（序列3的第8748-9248位）。
实施例2、ZmLA1介导生长素的极性运输
一、生长素IAA向基极性运输测定
玉米自交系Mo17作轮回父本与纯合突变体ps1连续回交三代，再自交获得BC3F2群体。取分离出现的匍匐和直立单株的种子，28℃暗培养3天，取胚芽鞘，分别截取顶端2mm以下的2cm长的区段，每0.5cm用记号笔标记。将截取的区段放入1/2MS液体培养基中，在摇床上100转/分钟漂洗2.5小时，以去除内源IAA。用滤纸吸干胚芽鞘区段表面液体，将胚芽鞘区段的顶端分别进行如下三种处理（每个处理设三次重复，每个重复设5个胚芽鞘）：
处理A：插入10ul含有500nM的3H-IAA的0.35%的植物凝胶培养基中；
处理B：插入10ul含有500nM的3H-IAA和500nM生长素极性运输抑制剂NPA的0.35%的植物凝胶培养基中；
处理C：插入10ul含有500nM生长素类似物14C-BA的0.35%的植物凝胶培养基中（为了排除弱酸自由扩散对生长素的运输的影响）；
为避免胚芽鞘干燥失水，在胚芽鞘区段未施加生长素的一端涂抹少量的凡士林。然后将胚芽鞘区段于室温暗处放置2.5h，从未插入到培养基的一端截取0.5cm的胚芽鞘，放入新的离心管中，用1/2MS液体培养基快速漂洗2次，然后转入到含有2ml闪烁液（美国Perkin-Elmer/珀金埃尔默，产品目录编号6013591）的闪烁管中浸泡18-24h，用液闪仪（1450MicroBeta TriLux,Perkin-Elmer）计数，三次重复的平均值±标准差的结果如表10所示。
表10、3H标记的生长素（3H-IAA）的极性运输检测结果（单位：射线每分钟衰变次数，简称DPM）
| 处理 | 正常型（直立） | 突变型（匍匐） |
| A（3H-IAA） | 10057.5±5350 | 41928±9563 |
| B（3H-IAA+NPA） | 2794±260 | 5619±233 |
| C（14C-BA） | 1083±327 | 1120±20.5 |
向基运输是地上部中最主要的生长素极性运输形式。表10的3H标记的生长素（3H-IAA）极性运输实验结果表明，突变型向基运输效率明显提高，为野生型的4倍；且在生长素极性运输抑制剂NPA的影响下，这种向基运输效率明显提高的变化仍然存在。
二、IAA侧向运输测定
玉米自交系Mo17作轮回父本与纯合突变体ps1连续回交三代，再自交获得BC3F2群体。取分离出现的匍匐和直立单株的种子，28℃暗培养3天，取胚芽鞘，分别截取顶端2mm以下的1cm长的区段，放入1/2MS液体培养基中，在摇床上100转/分钟漂洗2.5小时，以去除内源IAA。用滤纸吸干胚芽鞘区段表面液体，将胚芽鞘区段水平放置于载玻片上，并使其顶端紧贴于含有500nM 3H-IAA的琼脂块（0.4×0.4×0.2cm）（设三次重复，每个重复设5个胚芽鞘），室温暗处放置2.5h后，将水平放置的胚芽鞘区段沿水平方向均分为上下两段，在2ml闪烁液的闪烁管中浸泡18-24h后，用液闪仪（1450MicroBeta TriLux,Perkin-Elmer）计数。结果如表11所示。
表11、3H标记的生长素（3H-IAA）的侧向运输检测结果（单位：DPM）
注：**表示同一类型单株上下两段的结果在p<0.01差异显著。
表11的结果表明，侧向运输过程中，正常型（直立）植株水平放置的胚芽鞘上下两侧（即竖直放置时的左右两侧）生长素呈不对称分布，而在突变型（匍匐）植株中仍为均匀分布，即突变型（匍匐）植株的生长素侧向运输效率降低。
实施例3、ZmLA1蛋白调控植物营养生长及生殖生长的组织发育
玉米自交系Mo17作轮回父本与纯合突变体ps1连续回交三代，再自交，将获得的BC3F2群体种植于大田，进行正常水肥管理，期间对分离出现的匍匐和直立表型的单株进行性状考察。结果表9所示，与直立表型单株相比，匍匐表型单株的株高极显著降低；通过对散粉和吐丝期的考察，匍匐单株雌雄穗花期分别延迟5天和7天以上；扫描电镜观察分化中的雌雄穗，发现同时期匍匐表型单株的小穗原基分化阶段滞后于直立表型单株，并出现穗行不整齐现象；分别统计雄穗分枝数，发现突变导致雄穗分枝数减少近3个；匍匐表型单株中雌雄穗小花数目明显减少，且各雄穗分枝顶端和雌穗顶端小花多退化（图5）；匍匐表型单株雌穗穗柄长度降低为直立表型单株的一半，花丝数目和鲜重也显著减少，果穗明显缩短，结实率显著降低（图4）。
表9、ZmLA1蛋白调控植物营养生长及生殖生长的组织发育的统计结果
注：**表示同一性状的两种表型单株的结果在p<0.01差异显著。
实施例2和3的结果表明，蛋白ZmLA1通过调控生长素极性运输，建立特异的生长素浓度梯度，在玉米各组织发育和形态建成过程中起关键作用。
实施例4、蛋白ZmLA1的亚细胞定位
通过生物信息学预测得知序列表序列1所示的ZmLA1蛋白中的第70-90位氨基酸肽段为潜在的跨膜结构域（TMD），预示着该蛋白可能为膜定位；第275-298位、第338-345位两段肽段为潜在的罗宾逊（Robinson）核定位信号（NLS）。分别将上述预测的跨膜结构域（序列表序列1的第70-90位）和核定位信号（序列表序列1的第275-298位和第338-345位）特异敲除后，与GFP形成融合蛋白，通过亚细胞定位实验证明ZmLA1全长蛋白特异定位于细胞膜和细胞核上，TMD缺失的ZmLA1残段仅定位细胞核，而两段NLS同时缺失的ZmLA1残段仅定位于细胞膜上。
具体操作方法如下：
1、重组表达载体的构建
1）以载体pEGFP（Clontech）为模板，用引物5’-GTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’和5’-CTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’PCR扩增绿色荧光蛋白EGFP的基因片段，测序证实后用SalⅠ和PstⅠ双酶切，回收酶切片段，与经过SalⅠ和PstⅠ双酶切的载体pCAMBIA1300的骨架片段连接获得重组载体35S：：EGFP，经测序证实，重组载体35S：：EGFP为在载体pCAMBIA1300（CAMBIA）的SalⅠ和PstⅠ位点间插入了绿色荧光蛋白EGFP的基因。
2）将序列表序列2所示的DNA片段连入载体35S::EGFP的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得全长ZmLA1与GFP融合蛋白的重组表达载体35S::La1:GFP，并经测序证实。
3）将敲除第822—894位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得去除NLS1的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体La1ΔNLS1:GFP，并经测序证实。
4）将敲除第822-894位和第1012-1035位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP BamHⅠ和XbalⅠ酶切位点间，获得去除NLS1和NLS2的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体La1ΔNLS1NLS2:GFP，并经测序证实。
5）将敲除第822-1242位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得去除从NLS1至蛋白末尾的ZmLA1残段重组表达载体La1ΔNLS1-to-end:GFP，并经测序证实。
6）将敲除第208-270位序列后的序列表序列2所示的DNA片段残段连入载体35S::EGFP BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点间，获得去除TMD的ZmLA1残段与GFP融合蛋白的重组表达载体La1ΔTMD:GFP，并经测序证实。
2、金粉洗涤与分装
按10倍量称取15mg金粉放入灭菌后的1.5ml的离心管中，向离心管中加入500μl冰冻（-20℃）无水乙醇，震荡15秒，收集金粉到离心管管底部，静止30分钟，直到金粉全部沉淀；然后转速3000rpm离心60秒，以彻底去除乙醇；再向离心管中加入冰浴的无菌ddH2O，用手指轻弹混匀，然后转速3000rpm离心60秒。重复上述步骤2-3次，最后一次用转速5000rpm离心15秒,弃上清，再用500μl ddH2O悬浮。震荡15秒，然后快速悬浮混匀，边混边分装至10个离心管中，用25ul的量分装，重复分装两次，第一遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50μl水，1.5mg金粉。然后密封于-20℃保存备用。
3、DNA包裹
先把分装好的金粉(-20℃)（每管1.5mg并保存在50μl超纯水当中）放在冰上，同时把CaCl2浓度为2.5M(4℃)和亚精胺浓度为0.1M(-20℃)也放在冰上融化，其中CaCl2和亚精胺分装成一次性使用的包装；用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入60-200ng目的DNA（步骤1中2）—6）中制备的重组载体之一）,迅速用手指轻弹使之混匀，然后加入50μl CaCL2并用枪头轻轻吸打使之混匀，然后加入20μl亚精胺，静置30秒把离心管放在漩涡振荡器上面震荡10分钟；离心管放到冰上静置5分钟，然后2000rpm离心15秒，用吸头吸掉上清，加入预冷（-20℃）的无水乙醇250μl，并用枪头轻轻吸打混匀重复以上步骤3-4次，然后加入无水乙醇120-140μl使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因枪轰击。
4、受体材料的轰击
取新鲜洋葱，用镊子撕取内层表皮，切成2cm×2cm左右的小片，将其摆放在MS培养基中央区域，紧密平铺贴合培养基并无气泡。选用650psi的破裂膜，用移液器将包裹后的15μl金粉-DNA混合物点在轰击膜中央，采用PDS-1000/He（Gene GunSystem）型基因枪（Bio-Rad）进行轰击，轰击距离6cm，真空度为28In·Hg。轰击后的洋葱表皮细胞28℃暗培养24h后在共聚焦显微镜（Confocal:Carl Zeiss LSM 510）下后观察GFP荧光。
5、荧光观察
小心的把基因枪轰击后的洋葱表皮从MS培养基中取下，背面朝上平铺在加有水的载玻片上，盖上盖玻片，用激光扫瞄共聚焦显微镜（Confocal:Carl Zeiss LSM 510）观察GFP荧光。参数：激发光波长488nm，GFP荧光通过505-530nm的滤光片接收。若细胞膜上分布有特异的GFP信号，则在盖玻片一侧滴一滴0.35mol/L蔗糖溶液，用吸水纸从另一侧轻吸，至洋葱表皮完全接触蔗糖溶液。静置10分钟后观察质壁分离后的GFP信号。
结果：如图6所示。对照35S::EGFP分布于细胞膜、细胞质和细胞核等整个细胞中，无特异；35S::La1:GFP融合表达的绿色荧光蛋白定位于细胞膜和细胞核中。NLS缺失的Zm LA1残段仅定位细胞核中，缺失其中一段NLS并不影响核定位特性，而两段NLS同时缺失的Zm LA1残段仅定位于细胞膜上。TMD缺失的Zm LA1残段仅定位细胞核中。
实施例5、ZmLA1编码基因的过表达对植物性状的影响
一、重组表达载体的构建
1、以B73胚芽鞘cDNA为模板，利用引物5’-CGGGATCCATGAAGCTCCTGGGTTGGAT-3’和5’-GGGGTACCCTACAGCTCCAGCACCAAGT-3’进行PCR扩增，回收纯化1.2kb的DNA片段，用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切，与用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切的质粒pCAMBIA3301-UbiN（参考文献：Yu B,Lin Z,Li H,et al.TAC1,a major quantitativetrait locus controlling tiller angle in rice[J].The Plant Journal,2007,52(5):891-898.公众可从中国农业大学获得）的载体骨架相连，获得重组载体pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1,经测序证实，该载体为在pCAMBIA3301-UbiN的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA片段，其中，目的基因ZmLA1的启动子为玉米泛素启动子。
二、转基因植物的获得
1、将步骤一获得的重组载体pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1转化根癌农杆菌EHA105，获得含有pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1。
将载体pCAMBIA3301-UbiN转化根癌农杆菌EHA105，获得含有pCAMBIA3301-UbiN的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN。
2、利用步骤1的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1转化玉米杂交种HiⅡ（文献：Armstrong C L,Green C E,Phillips R L.Development and availabilityof germplasm with high Type II culture formation response[J].Maize geneticscooperation news letter,1991.，公众可从中国农业大学获得，为玉米自交系B73与玉米自交系A188的杂交F1代），获得转基因植株；利用步骤1的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN转化HiⅡ，获得转空载体对照植株。
具体转化方法如下：
（1）把刚剥离的HiⅡ植株的幼胚完全浸泡入重组农杆菌EHA105/pCAMBIA3301-UbiN-ZmLA1或pCAMBIA3301-UbiN的菌液（OD550=0.3-0.4）中10分钟。
（2）把浸染过的幼胚转移到共培养培养基（N6盐4g/L、2,4-D1.5mg/L、脯氨酸0.7g/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8；121℃灭菌15分钟后加入硝酸银至终浓度为0.85mg/L,乙酰丁香酮至终浓度为100mM，半胱氨酸至终浓度为300mg/L，1000×N6维生素至1ml/L）,使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌，用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。
（3）把幼胚转移到静息培养基（共培养培养基+100mg/L羧苄青霉素）上，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。
（4）把幼胚转移到选择培养基甲（N6盐4g/L、2,4-D 1.5mg/L、脯氨酸0.7g/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8；121℃灭菌15分钟后加入硝酸银至终浓度为0.85mg/L,半胱氨酸至终浓度为300mg/L，1000×N6维生素至1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L,潮霉素至终浓度为50mg/L）上，培养两周；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。
（5）把幼胚转移到选择培养基乙（N6盐4g/L、2,4-D 1.5mg/L、脯氨酸0.7g/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8；121℃灭菌15分钟后加入硝酸银至终浓度为0.85mg/L,半胱氨酸至终浓度为300mg/L，1000×N6维生素至1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L,潮霉素至终浓度为100mg/L）上，培养至产生明显的愈伤组织（约3周）；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。
（6）将愈伤组织转移到在再生培养基I（MS盐4.3g/L、2,4-D 1.5mg/L、葡萄糖60g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8；121℃灭菌15分钟后加入1000×MS维生素至终浓度为1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L,潮霉素至终浓度为100mg/L）上培养3周；培养条件为：28℃，黑暗条件下培养。
（7）然后转移到再生培养基II（MS盐4.3g/L、2,4-D 1.5mg/L、葡萄糖30g/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8；121℃灭菌15分钟后加入1000×MS维生素至终浓度为1ml/L，羧苄青霉素至终浓度为100mg/L）上培养至发芽，即为转基因植株或转空载体对照植株；培养条件为：26℃，光照强度为10000LUX条件下培养。
3、表型结果
与转化空载体和未转基因的野生型植株相比，转基因植株或含有序列表序列2所示基因的玉米植株的表型如下：
生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高；同时，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。
Claims (7)
1.一种蛋白质或其编码基因在调控目的玉米如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；
所述蛋白质为由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)：
1)序列表序列2所示的DNA分子；
2)序列表序列3所示的DNA分子。
3.一种获得具有如下至少一种表型玉米的方法，包括降低所述玉米中由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质表达、和/或抑制所述蛋白质编码基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率提高，生长素侧向运输效率降低，茎秆抗倒伏能力降低，雌穗花期延迟、雄穗花期延迟、雄穗分枝数减少、雌穗穗柄长度降低、花丝鲜重降低、果穗长度降低和结实率降低。
4.一种获得具有如下至少一种表型玉米的方法，包括提高所述玉米中由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白表达、和/或促进所述蛋白质编码基因的转录的步骤：生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加和结实率提高。
5.一种培育转基因玉米的方法，是将由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的玉米中，得到与所述目的玉米相比具有如下至少一种表型的转基因玉米：
生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎秆抗倒伏能力增强，茎秆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加和结实率提高。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述导入是通过重组载体实现的；
所述重组载体为在pCAMBIA3301-UbiN的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因得到的重组载体。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)：
1)序列表序列2所示的DNA分子；
2)序列表序列3所示的DNA分子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310189177.6A CN104177481B (zh) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310189177.6A CN104177481B (zh) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104177481A CN104177481A (zh) | 2014-12-03 |
| CN104177481B true CN104177481B (zh) | 2016-10-12 |
Family
ID=51958849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310189177.6A Active CN104177481B (zh) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104177481B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108893487A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-11-27 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法 |
| CN109206494B (zh) * | 2018-10-29 | 2021-01-01 | 中国农业大学 | ZmRPH1基因在调控植物株高及抗倒伏能力中的应用 |
| CN115851755B (zh) * | 2022-07-11 | 2024-05-24 | 内蒙古农业大学 | 一种蒙农杂种冰草分蘖角度调控因子及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1274386A (zh) * | 1997-08-13 | 2000-11-22 | 植物生物科学有限公司 | 植物生长和发育的遗传调控 |
| WO2011094247A1 (en) * | 2010-01-26 | 2011-08-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic loci on maize chromosomes 3 and 4 that are associated with fusarium ear mold resistance |
-
2013
- 2013-05-21 CN CN201310189177.6A patent/CN104177481B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1274386A (zh) * | 1997-08-13 | 2000-11-22 | 植物生物科学有限公司 | 植物生长和发育的遗传调控 |
| WO2011094247A1 (en) * | 2010-01-26 | 2011-08-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic loci on maize chromosomes 3 and 4 that are associated with fusarium ear mold resistance |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ACCESSION：NP_001132334;GenPept;《GenPept》;20130417;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104177481A (zh) | 2014-12-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109153988B (zh) | 植物的基因组编辑方法 | |
| WO2019062895A1 (zh) | 玉米基因ZmABCG20在调控作物雄性育性中的应用以及与玉米雄性生育力相关的DNA分子标记及其应用 | |
| CN106399323A (zh) | 一种水稻叶色调控基因yl1及其应用 | |
| CN108137658A (zh) | 产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物 | |
| BR112020015033A2 (pt) | Composições e métodos para aprimorar os rendimentos de cultura através do empilhamento de traços | |
| CN102618510A (zh) | 一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN109295246B (zh) | 与玉米雄性生育力相关的dna分子标记及其应用 | |
| CN110724183A (zh) | GmXTH91蛋白在调控植物抗逆性和株高中的应用 | |
| WO2019129145A1 (en) | Flowering time-regulating gene cmp1 and related constructs and applications thereof | |
| KR20220161020A (ko) | 벼 Os03g52870 유전자 유래 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도 | |
| CN115011631B (zh) | 调控玉米苗期抗旱性的蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN104177481B (zh) | 植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用 | |
| CN103173485B (zh) | 一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法 | |
| CN104745600B (zh) | 水稻基因OsVHA1在延缓植物叶片衰老和提高植物耐盐性中的应用 | |
| ES2949396T3 (es) | Generación de plantas haploides | |
| CN112522283B (zh) | 一种花粉发育相关基因及其应用 | |
| CN102168083B (zh) | 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 | |
| NO885091L (no) | Spleisede gener samt fremstilling derav. | |
| CN106337041B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN106367433B (zh) | 提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用 | |
| CN103172714B (zh) | 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 | |
| WO2011153822A1 (zh) | 一种植物氮吸收和耐旱相关蛋白及其编码的基因和应用 | |
| CN118895294A (zh) | ZmRIN4蛋白在调控玉米株型中的应用 | |
| CN117586363A (zh) | 蛋白ZmRBOHC在调控植物产量中的应用 | |
| CN103374063A (zh) | 植物根毛发育相关蛋白TaRHD6及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |