CN103172714B - 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 - Google Patents
水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片卷曲性状相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明中的水稻叶片卷曲相关基因过量表达引起水稻叶片发生内卷，但对转基因水稻的育性等性状没有显著影响，也没有观察到其他不良的农艺性状，对进一步提高水稻产量具有重要的潜在作用。本发明公开的基因及其编码的蛋白质对培育叶片适度卷曲的植物品种、改良株型具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，提高产量一直是水稻育种的主要目的。株型是水稻高产的一个重要影响因素，而叶片又是植物株型构成的重要组成部分，在水稻高产育种及株型改良过程中，叶片性状一直是育种家们关注的重点，叶片形态的改良也一直是株型育种的重要目标之一。
目前认为叶片的适度卷曲是水稻理想株型的一个重要因素，而且这一性状已被直接或间接的应用于水稻的株型改良和杂交水稻的育种。叶片的适度卷曲有利于使叶片保持挺直，同时减少叶倾角，改善植物的受光姿态，特别是在密植情况下可改善群体内部通风透光状况，提高光能利用效率，增进物质生产，从而增加水稻的产量。
水稻中可遗传的卷叶种质资源相对比较丰富，深入了解各种卷叶材料的遗传特性，具有重要的理论意义和应用价值。但目前的研究多关注叶片的生理机能，而对遗传控制及分子水平的机制研究相对较少。已有许多可能控制水稻卷叶的基因被报道，但大多数仅被初步定位在水稻染色体的某个区段中。在水稻经典遗传图谱上标定的控制卷叶性状的6个基因(r11-r16)，分别被定位在经典遗传图的1、4、12、1、3和7号染色体上。随着分子标记技术和水稻突变体遗传学的快速发展，近年来又有更多的基因[如：r17、r18、r19、r110、r111(t)和r112(t)等]和QTL也被定位到水稻的染色体上。
仍有大量控制叶形的基因有待于被发现和研究，水稻叶形及株型的遗传改良也迫切需要丰富的基因资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质(OsMYB103L蛋白)，来自粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Nipponbare)，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片卷曲性状相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因(OsMYB103L基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因是具体可为如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)序列表的序列2所示的DNA分子；
2)序列表的序列3所示的DNA分子；
3)序列表的序列4所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物叶片卷曲性状相关蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物叶片卷曲性状相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选目的植物。
所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pTCK303的多克隆位点得到的重组质粒。
扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到叶片卷曲程度高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如籼稻品种Kasalath。
本发明还保护所述蛋白质作为转录因子的应用。
本发明的水稻叶片卷曲相关基因在过量表达的条件下可引起水稻叶片发生内卷，因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节和控制水稻叶片的卷曲程度，进而改良水稻的株型。本发明中的水稻叶片卷曲相关基因过量表达对转基因水稻的育性等性状没有显著影响，也没有观察到其他不良的农艺性状，对进一步提高水稻产量具有重要的潜在作用。本发明公开的基因及其编码的蛋白质对培育叶片适度卷曲的植物品种、改良株型具有重要意义。
附图说明
图1为OsMYB103L蛋白在洋葱表皮细胞里的亚细胞定位。
图2为OsMYB103L蛋白转录激活活性分析。
图3为水稻OsMYB103L基因的组织表达分析(水稻的Actin1基因作为内参)；1：根；2：茎；3：叶片；4：幼穗；5：成熟穗。
图4为重组质粒ProUbi::OsMYB103L的结构示意图。
图5为野生型植株和转基因植株(也可称过表达植株)的表型比较(T0代)。
图6为野生型植株和转基因植株(也可称过表达植株)的表型比较(T1代)。
图7为OsMYB103L基因在野生型植株和转基因植株(也可称过表达植株)中的表达分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
粳稻品种日本晴：参考文献：International Rice Genome Sequencing Project(2005).The map-based sequence of the rice genome.Nature 436，793-800.。
籼稻品种Kasalath：参考文献：Nishimura，A.，Ashikari，M.，Lin，S.，Takashi，T.，Angeles，E.R.，Yamamoto，T.，and Matsuoka，M.(2005).Isolation of a riceregeneration quantitative trait loci gene and its application totransformation systems.Proc Natl Acad Sci U S A 102，11940-11944.。
载体pTCK303：参考文献：Wang et al.，2004，Plant Mol Biol Reporter 22：409-417。
实施例1、水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因的发现
对多个从粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Nipponbare)预筛选得到的水稻MYB基因进行系统地反向遗传学研究，主要研究策略是对目标基因进行过量表达和(或)RNAi分析。在对转基因水稻群体进行表型分析时发现一个新蛋白及其编码基因。
将序列表的序列1所示蛋白质命名为OsMYB103L蛋白(由359个氨基酸残基组成)。将OsMYB103L蛋白在蛋白保守结构域分析网站上进行结构域分析，结果显示在其N端有两个串联的MYB DNA结合结构域(R2和R3)。将OsMYB103L蛋白与拟南芥(Arabidopsis thalina L.)的相关R2R3MYB蛋白进行系统进化，发现与AtMYB103(At1g63910)同源性最高，二者在预测的R2和R3MYB DNA结合区高度保守。
将编码OsMYB103L蛋白的基因命名为OsMYB103L基因，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列2所示，基因组DNA如序列表的序列3所示(由3个外显子和2个内含子组成)。OsMYB103L基因位于水稻第8号染色体。过量表达OsMYB103L基因获得的转基因水稻叶片发生向近轴面的卷曲(内卷)，并且该表型能稳定遗传。
实施例2、OsMYB103L蛋白作为转录因子的功能验证
一、OsMYB103L蛋白在植物细胞中的定位
转录因子一般在细胞核内行使其生物学功能。为分析OsMYB103L蛋白在细胞中的定位情况，将OsMYB103L基因的全长ORF(序列表的序列2所示DNA去除终止密码子)的3’末端与双元载体pEZR(K)-LN(Brown et al，PNAS，2005，102：18225-18230)中的绿色荧光蛋白基因eGFP融合，并置于CaMV 35S启动子的控制之下，从而构建成35S::OsMYB103L-eGFP表达载体。利用基因枪介导的方法将该重组载体及对照空载体分别导入洋葱内表皮，培养24小时后，在激光共聚焦显微镜下观察eGFP荧光信号。OsMYB103L-eGFP融合蛋白产生的绿色荧光信号主要分布在细胞核中，而作为对照空载体(35S::eGFP)的荧光信号在细胞质和细胞核中都被检测到(见图1)。说明OsMYB103L蛋白可定位在植物细胞核中，这与推测其作为转录因子的功能是一致的。
二、OsMYB103L蛋白的体外转录活性
用GAL4酵母双杂交噬菌粒载体试剂盒系统(Stratagene)对OsMYB103L的转录激活进行分析。GAL4酵母双杂交噬菌粒载体试剂盒系统包括如下组件：含酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域的载体pBD-GAL4Cam(简称载体pBD-GAL4Cam)、pGAL4质粒(阳性对照)和酿酒酵母YRG-2菌株(含有His3报告基因和LacZ报告基因)。
1、提取粳稻品种日本晴的总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-CTCGAGGAATGGGGCATCACTCTTG-3’；
R1：5’-CTCGAGTTAATCATGGTCATTTGGTCCC-3’。
3、用限制性内切酶Xho I单酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Xho I单酶切载体pBD-GAL4 Cam，得到载体骨架(约6500bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pBD-OsMYB103L。根据测序结果，对重组质粒pBD-OsMYB103L进行结构描述如下：在载体pBD-GAL4 Cam的Xho I酶切位点正向插入了序列表的序列2所示的DNA片段。
6、将步骤5的重组质粒pBD-OsMYB103L，载体pBD-GAL4 Cam(阴性对照)和pGAL4质粒(阳性对照)分别转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YRG-2菌株的感受态细胞，得到重组酵母菌。
7、重组酵母菌先在YPAD培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，腺嘌呤硫酸盐0.04g/L，琼脂20g/L)进行培养。转化重组质粒pBD-OsMYB103L的重组酵母菌、转化阴性对照的重组酵母菌和转化阳性对照的重组酵母菌均可正常生长(见图2)。
8、分别挑单克隆在SD-His培养基[minimal SD Base 26.7g/L(购自Clontech公司)，-His Do supplement 0.69g/L(购自Clontech公司)，琼脂20g/L]上划线使其生长。结果表明，转化重组质粒pBD-OsMYB103L的重组酵母菌和转化阳性对照的重组酵母菌能生长，而转化阴性对照的重组酵母菌不能生长(见图2)。
9、将YPAD培养基上的菌落进行X-gal显色，X-gal显色结果见图2，转化重组质粒pBD-OsMYB103L的重组酵母菌和转化阳性对照的重组酵母菌均可使lacZ基因表达，其表达产物β-半乳糖苷酶降解X-Gal形成蓝色克隆。
实施例3、OsMYB103L基因的表达分析
为了研究OsMYB103L基因的表达模式，首先通过定量RT-PCR分析它在籼稻品种Kasalath(Oryza sativa L.subsp.indica cv.Kasalath)的根、茎、叶片、幼穗(长度小于5mm)和成熟的穗等组织中的表达。将OsMYB103L基因的荧光信号(以Ct值表示)与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2-ΔCt，其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为OsMYB103L基因的相对表达量，结果见图3。结果表明，OsMYB103L基因在根、茎、叶和成熟穗中都有表达，在茎中的表达量最高，在根、叶片和成熟穗子中的表达量相对较低，而在幼穗中基本上没有检测到它的表达。
实施例4、过表达OsMYB103L基因的转基因水稻的获得和表型分析
一、重组质粒的制备
1、提取粳稻品种日本晴的总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤2的cDNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-GGATCCTGCTAGCAGCTAGATCAAG-3’；
R2：5’-ACTAGTGTCATCCTCCTGTGTTTATT-3’。
3、用限制性内切酶BamH I和Spe I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和Spe I双酶切载体pTCK303，得到载体骨架(约14100bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒ProUbi::OsMYB103L。根据测序结果，对重组质粒ProUbi::OsMYB103L进行结构描述如下：在载体pTCK303的BamH I和Spe I酶切位点之间正向插入了序列表的序列4所示的DNA片段(自5’末端第139-1218位核苷酸为开放阅读框)。重组质粒ProUbi::OsMYB103L的结构示意图见图4。重组质粒ProUbi::OsMYB103L中，OsMYB103L基因由玉米Ubi启动子启动表达。
二、转基因水稻的获得
1、将步骤一构建的重组质粒ProUbi::OsMYB103L转化农杆菌(Agrobactericumtumefaciens)菌株LBA4404(购自Invitrogen公司)得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌转化籼稻品种Kasalath(野生型，WT)，得到51株单株(T0代)。农杆菌介导的水稻转化方法参见文献：Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal6：271-282.。
3、将步骤2的单株分别进行PCR鉴定，48株为转基因植株(OE)，阳性率为94％以上。转基因植株最明显的表型变化是叶片发生内卷，自叶缘两侧沿中脉向近轴面卷曲，呈半圆筒状(见图5)。
4、将载体pTCK303代替重组质粒ProUbi::OsMYB103L进行步骤1和步骤2，获得转空载体植株，转空载体植株的表型与野生株一致，不发生叶片内卷。
三、T1代植株的获得和鉴定
1、将转基因植株进行自交，收获种子(T1代)。
2、将步骤1收获的种子培育为植株，卷叶植株和正常植株的比例接近3∶1，呈现显著的性状分离现象。卷叶植株叶片卷曲的性状在水稻幼苗期就出现并在整个植株生长过程中一直保持为卷叶状态(见图6，a为植株表型图，b为叶片横截面)。
3、随机挑选了三个株系的T1代卷叶植株(每个株系30株)进行叶片卷曲度分析，对这两株系的旗叶、倒二叶和倒三叶的统计分析表明：旗叶的卷曲度在50％-60％之间，倒二叶和倒三叶较旗叶稍低，但也在50％左右。
4、从步骤2的卷叶植株中，随机选取6个株系(OE1、OE3、OE4、OE6、OE8和OE11)的植株(以籼稻品种Kasalath为对照)，分别提取总RNA，进行定量RT-PCR鉴定。
用于鉴定OsMYB103L基因的引物对为F3和R3组成的引物对，靶序列约239bp。
F3：5’-CTTAGAAGATGGCCAAACAGCC-3’；
R3：5’-TGGCCTCCAAGTTGGATGAT-3’。
用于鉴定Actin1基因的引物对为F4和R4组成的引物对，靶序列约435bp。
F4：5’-AGCAACTGGGATGATATGGA-3’；
R4：5’-CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’。
将OsMYB103L基因的荧光信号(以Ct值表示)与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2，其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为OsMYB103L基因的相对表达量，结果见图7。
结果表明，卷叶植株叶片中OsMYB103L基因的表达量都有明显增强。由此可以认为，转基因水稻叶片向内卷曲表型是由强启动子驱动下OsMYB103L的过量表达造成的。
转基因水稻的育性等性状也野生型相比没有显著差异，也没有观察到其他不良的农艺性状。
Claims (3)
1.一种培育转基因植物的方法，是将编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因导入目的植物中，得到叶片卷曲程度高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为水稻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列2所示的DNA分子；
2）序列表的序列3所示的DNA分子；
3）序列表的序列4所示的DNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为将所述编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因插入载体pTCK303的多克隆位点得到的重组质粒。
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