CN104164473A - 糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种糖化白蛋白酶法检测试剂盒，包括GA试剂1和GA试剂2，GA试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc₂)、三水合亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆·3H₂O)、乙酸铜(CuAc₂)和胆汁酸(Cholic acid)；GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100(TritonX-100)和过氧化物酶。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法。

Description

糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

人体中的葡萄糖与血清蛋白的N-末端发生非酶促的糖基化反应，其中90％与血清蛋白链内第189位赖氨酸结合，形成高分子的酮胺结构，总称为糖化血清蛋白，其中90％以上为糖化白蛋白。因此，糖化白蛋白(Glycated Albumin，GA)可以反映糖化血清蛋白的总体水平。而在糖尿病的诊断与监测中，糖化蛋白质具有重要意义。血糖监测是糖尿病日常诊治工作中非常重要的一个环节，良好的血糖控制能有效延缓糖尿病急、慢性并发症的发生和发展。临床工作中要使血糖全面长期达标，短期平均血糖的良好控制非常重要。糖化白蛋白(glycatedalbumin，GA)是临床上血糖监测的指标之一，由于白蛋白在血液中的半衰期较短，所以在2-4周内即可观察到糖化白蛋白的变化，对于评价糖尿病患者近期血糖控制情况及反映短期内血糖水平的变化具有较高的临床价值。但现有的测定糖化蛋白质的组合物的特异性较低，灵敏度不高，获得检测结果的时间较长，操作方式复杂，检测结果不够准确可靠。 

发明内容

本发明的目的是的供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测到的糖化白蛋白(GA)浓度结果准确可靠的糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒及其检测方法。 

本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒，包括GA试剂1和GA试剂2，GA试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc₂)、三水合亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆·3H₂O)、乙酸铜(CuAc₂)和胆汁酸(Cholic acid)；GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100(Triton X-100)和过氧化物酶。 

本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒，其中所述GA试剂1采用如下步骤制成： 

(1)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(2)、称取0.4g氨基安替比林(4-AAP)、0.88g乙酸钙(CaAc2)、0.02g亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)和0.09g乙酸铜(CuAc2)，加入到步骤(1)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(3)、称取10g胆汁酸(Cholic acid)，加入到步骤(2)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(4)、称取3kU蛋白酶K，加入到步骤(3)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解。 

(5)、最后用纯化水将步骤(4)得到的溶液定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到GA试剂1； 

所述GA试剂2采用如下步骤制成： 

(一)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(二)、称取1.47g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，加入到步骤(一)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(三)、用移液器吸取0.5ml曲拉通X-100(Triton X-100)，加入到步骤(二)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(四)、称取100kU果糖氨基酸氧化酶和200kU过氧化物酶，加入到步骤(三)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(五)、最后用纯化水将步骤(四)得到的溶液中定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到GA试剂2。 

本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤： 

1、将6μl样本和240μl的GA试剂1混匀，37℃孵育5分钟； 

2、在546/700nm波长下测定吸光度A1，其中主波长为546nm，副波长为700nm； 

3、加60μl的GA试剂2混匀，37℃孵育5分钟； 

4、在546/700nm波长下测定吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2； 

5、使用校准品(标准血清)，选用与校准品对应的质控品，质控测定值应在规定的范围内，采用以下公式计算： 

本发明的糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒及其检测方法，其试剂盒其包括GA试剂1和GA试剂2，GA试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc₂)、三水合亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆·3H₂O)、乙酸铜(CuAc₂)和胆汁酸(Cholic acid)；GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100(Triton X-100)和过氧化物酶。实验表明，本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法，具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。 

下面对本发明的糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒及其检测方法作进一步详细说明。 

具体实施方式

本发明旨在建立一种准确快速测定糖化白蛋白(Glycated Albumin，GA)的方法，并在国内首次研发生产出商品化液体双试剂的糖化白蛋白检测试剂盒(酶法)，供临床实验室自动生化仪检测使用。本发明的主要原理是采用蛋白酶、果糖氨基酸氧化酶(Fructosyl amino acid oxidase，FAOD)等水解、催化反应测定血清GA含量，同时采用溴甲酚紫比色法对白蛋白进行定量，通过计算获得GA百分比。其关键技术主要有FAOD表达、纯化及大规模生产；蛋白酶筛选及活性测定技术；试剂盒稳定性研究(含缓冲液及稳定剂筛选)。主要解决的关键问题有：原料检定的稳定性(FAOD、蛋白酶等原料酶、化学试剂)；试剂研究体系，包括原理配方研究(考察所使用原料是否能实现反应原理)，实验配方研究(获得原理反应后，针对试剂各指标要求进行优化)，优化后试剂稳定性评价(主要针对长期使用稳定性研究)；产品临床检测适用性。 

本发明中所采用果糖氨基酸氧化酶来源于烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)，该酶对游离的果糖氨基酸同样具有特异性酶促反应，可以达到测定糖化白蛋白的目的。另外，关于精确测定血清蛋白的方法，主要采用专一性更高的溴甲酚紫(BCP)染色法。通过两个反应的结合，通过测定计算后可以准确获得糖化白蛋白百分比。 

本发明的糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒，包括GA试剂1和GA试剂2，GA试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)和蛋白酶K；GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶和过氧化物酶。 

上述GA试剂1还包括乙酸钙(CaAc₂)，三水合亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆·3H₂O)，乙酸铜(CuAc₂)，胆汁酸(Cholic acid)；所述GA试剂2还包括曲拉通X-100(Triton X-100)。 

所述GA试剂1采用如下步骤制成： 

(1)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(2)、称取0.4g氨基安替比林(4-AAP)、0.88g乙酸钙(CaAc2)、0.02g亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)和0.09g乙酸铜(CuAc2)，加入到步骤(1)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(3)、称取10g胆汁酸(Cholic acid)，加入到步骤(2)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(4)、称取3kU蛋白酶K，加入到步骤(3)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解。 

(5)、最后用纯化水将步骤(4)得到的溶液定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到GA试剂1； 

所述GA试剂2采用如下步骤制成： 

(一)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐 酸调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(二)、称取1.47gN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，加入到步骤(一)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(三)、用移液器吸取0.5ml曲拉通X-100(Triton X-100)，加入到步骤(二)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(四)、称取100kU果糖氨基酸氧化酶和200kU过氧化物酶，加入到步骤(三)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(五)、最后用纯化水将步骤(四)得到的溶液中定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到GA试剂2。 

糖化白蛋白酶法检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤： 

1、将6μl样本和240μl的GA试剂1混匀，37℃孵育5分钟； 

2、在546/700nm波长下测定吸光度A1，其中主波长为546nm，副波长为700nm； 

3、加60μl的GA试剂2混匀，37℃孵育5分钟； 

4、在546/700nm波长下测定吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2； 

5、使用校准品(标准血清)，选用与校准品对应的质控品，质控测定值应在规定的范围内，采用以下公式计算： 

有了上述糖化白蛋白(GA)浓度，还需要通过其他实验得到白蛋白(ALB)浓度，利用上式得出白蛋白(ALB)浓度，再利用下式得出： 

上述检测试验的主要参数如下： 

方法：           终点法 

温度：           37℃ 

主波长：         546nm 

副波长：         700nm 

样本量：         6.0μl 

GA试剂1：        240μl 

GA试剂2：        60μl 

反应方向：       正向 

预孵育时间：     5分钟 

测定时间：       5分钟 

校准方式：       两点校准。 

Claims (3)

1.糖化白蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于：包括GA试剂1和GA试剂2，GA试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc₂)、三水合亚铁氰化钾(K₄Fe(CN)₆·3H₂O)、乙酸铜(CuAc₂)和胆汁酸(Cholic acid)；GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100(Triton X-100)和过氧化物酶。 

2.按照权利要求1所述的糖化白蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于： 

所述GA试剂1采用如下步骤制成： 

(1)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(2)、称取0.4g氨基安替比林(4-AAP)、0.88g乙酸钙(GaAc2)、0.02g亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)和0.09g乙酸铜(CuAc2)，加入到步骤(1)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(3)、称取10g胆汁酸(Cholic acid)，加入到步骤(2)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(4)、称取3kU蛋白酶K，加入到步骤(3)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解。 

(5)、最后用纯化水将步骤(4)得到的溶液定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到GA试剂1； 

所述GA试剂2采用如下步骤制成： 

(一)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(二)、称取1.47gN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，加入到步骤(一)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(三)、用移液器吸取0.5ml曲拉通X-100(Triton X-100)，加入到步骤(二)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； 

(四)、称取100kU果糖氨基酸氧化酶和200kU过氧化物酶，加入到步骤(三)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； 

(五)、最后用纯化水将步骤(四)得到的溶液中定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到GA试剂2。 

3.糖化白蛋白酶法检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤： 

1、将6μl样本和240μl的GA试剂1混匀，37℃孵育5分钟； 

2、在546/700nm波长下测定吸光度A1，其中主波长为546nm，副波长为700nm； 

3、加60μl的GA试剂2混匀，37℃孵育5分钟； 

4、在546/700nm波长下测定吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2； 

5、使用校准品(标准血清)，选用与校准品对应的质控品，质控测定值应在规定的范围内，采用以下公式计算： 

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