CN104099392B - 高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种利用可以用于稳定地提高Darbepoetin α表达量的无血清培养基的高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法。该方法包括采用无血清培养基在生物反应器中悬浮培养CHO细胞株，然后在CHO细胞中高效表达Darbepoetin α的步骤。本发明还揭示了上述的高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法所使用的一种无血清培养基。本发明的高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法中，利用可以用于稳定提高Darbepoetin α表达量的无血清培养基组分，同时CHO细胞能够高效稳定地表达Darbepoetin α，表达稳定、培养方法简洁、适合大规模培养。

Description

高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产 方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法，尤其涉及一种利用可以用于稳定地提高Darbepoetinα表达量的无血清培养基的高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法。

背景技术

促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白，分子量约为34kD，是人体内调节红系造血的主要激素，其与骨髓中红系祖细胞表面的EPO受体(EPOR)结合，刺激红系祖细胞(包括红系爆式集落形成单位(BFU-E)、红系集落形成单位(CFU-E)及原红细胞)的增殖、分化和成熟。肾功能受损导致EPO无法正常分泌，因此EPO是治疗慢性肾性贫血的有效药物，上市25年来已被国内外大量的临床试验研究所证实。

随着EPO的市场接受度逐年提高，我国对EPO的需求量逐年递增。由于EPO在体内的半衰期短，患者需要频繁的给药，因此如何延长其体内半衰期，减少病人的痛苦和治疗费用是国际上EPO药物研究的热点。遵循此思路，国际上已研发并成功上市了两种长效EPO产品，一种是Amgen通过氨基酸突变增加糖基化位点的长效产品Darbepoetinα，另一种是聚乙二醇修饰的EPO(PEG-EPO)。

Darbepoetinα(商品名Aranesp)是Amgen公司于2001年上市的多糖基化位点修饰的长效促红细胞生成素，其物质结构是通过对促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)进行基因改造，增加了两个N-糖基化位点，从而使其在体内半衰期比EPO延长了3倍。Darbepoetinα的使用方法与EPO(每周注射3次)明显不同的是，Darbepoetinα变为每周或每两周注射一次，从而简化了患者和保健服务提供的护理过程，明显降低了治疗成本，减轻了病人的痛苦。

目前国内EPO的规模化生产方式为两种，一种是采用有血清培养基在滚瓶中貼壁扩增细胞，待细胞生长满层后更换培养基至不含牛血清的培养基生产收获。这种生产方式对硬件投入要求低，但需要大量的人员操作。另外一种生产方式则是将细胞接种至含有固定载体基质的发酵罐中，通过一定时间的静置使细胞貼壁至固相载体上生长，待细胞密度达到最高后更换培养基至不含牛血清的培养基生产收获。由于固相载体形式的培养受限于固相载体的重量，因此放大生产存在困难，国内有厂家使用数十个20L规模以下的小罐平行进行生产。这两种生产方式都存在着由数十至上百个不同容器培养一个批次产品的问题，产品质量很难保证均一性。同时这两种生产方式都需要使用牛血清，增加未知病毒污染产品的可能性，给临床用药安全造成隐患。

名词解释：CHO细胞是指是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种利用可以用于稳定地提高Darbepoetinα表达量的无血清培养基工业化生产高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的方法，即多糖基化位点修饰的长效促红细胞生成素Darbepoetinα的工业化生产方法。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种无血清培养基，该培养基包括无血清基础培养基和添加剂，所述无血清基础培养基由SIGMA公司生产的Ex-cell302培养基和Hyclone公司生产的CP1027培养基组成，所述添加剂包括D-半乳糖、尿嘧啶、Mn²⁺中的一种或多种的组合。

上述的无血清培养基中，添加剂的溶剂可以为培养基中的水，但不限于此。

上述的无血清培养基中，理论上，无血清基础培养基还可以用其他市售的商业化无血清培养基中的一种或多种的组合。

上述的无血清培养基中，优选的，以重量比计，所述Ex-cell302培养基∶CP1027培养基组成＝9∶1-1∶1；优选的，所述Ex-cell302培养基∶CP1027培养基组成＝9∶1。

上述的无血清培养基中，优选的，所述D-半乳糖在无血清培养基中的含量为500mg/L-5000mg/L，所述尿嘧啶在无血清培养基中的含量为100mg/L-500mg/L，所述Mn²⁺在无血清培养基中的含量为1μmol/L-50μmol/L。

本发明还提供一种利用上述的无血清培养基来工业化生产高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的方法，该方法包括采用无血清培养基在生物反应器中悬浮培养CHO细胞株，然后在CHO细胞中高效表达Darbepoetinα的步骤。

上述的方法中，优选的，该方法包括采用无血清培养基，在生物反应器中，采用无血清悬浮灌注培养工艺悬浮培养CHO细胞株，在CHO细胞中高效表达Darbepoetinα，然后收获培养液的步骤。

本发明通过培养CHO细胞，用CHO细胞表达Darbepoetinα，细胞所表达的Darbepoetinα会释放在培养液中，通过不断收获培养液来实现重组蛋白的生产。

上述的方法中，优选的，所述无血清悬浮灌注培养工艺包括细胞接种阶段控制，细胞生长阶段控制和细胞生产阶段控制；所述细胞接种阶段控制为将CHO细胞接种到无血清培养基中，其起始接种密度为4-8×10⁵cells/ml，接种体积为工作体积的1/6-1/3，搅拌转数为100-200转/分钟，得到接种了CHO细胞的无血清培养基。

上述的方法中，细胞生长阶段为细胞在无血清培养基中的扩增阶段，优选的，所述细胞生长阶段控制为在温度35℃-37℃、pH6.90-7.20、溶解氧20％-60％的条件下，以100-200转/分钟的搅拌转数搅拌接种了CHO细胞的无血清培养基，培养接种在该无血清培养基中的CHO细胞，培养4天-6天，直到生物反应器中的CHO细胞的细胞密度长至6×10⁶cells/ml，进入稳定期，得到增殖CHO细胞的无血清培养基。

上述的方法中，优选的，所述细胞生产阶段控制为向生物反应器中的增殖CHO细胞的无血清培养基中灌注生物反应器工作体积的0.8-1.2倍的无血清培养基，在温度35-37℃、pH6.90-7.20、溶解氧20％-60％的条件下，以搅拌转数100-200转/分钟的转速搅拌培养25天-30天，收集培养液。

上述的收集培养液后剩下的CHO细胞可以继续灌注无血清培养基，以实现连续生产。

上述的方法中，在培养过程中需要监测培养条件，以保证培养过程的精准和稳定控制，优选的，所述无血清悬浮灌注培养工艺还包括对整个培养周期中每天的温度、pH、葡萄糖浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量的监控。

上述的方法中，监控的目的控制上述指标的参数不发生剧烈的波动，其可以通过本领域的常规方法进行调控。

本发明的突出效果为：

本发明中高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白Darbepoetinα的生产采用连续灌注悬浮培养方式，这种生产方式有以下三点优势：

1)发酵罐中的细胞通过截流系统使细胞保留在反应器内，因此整个生产过程中能维持较高的细胞密度，从而较大的提高了产品的产量；

2)由于不断有新鲜培养基补充到发酵罐中，代谢废物可及时排出，因此细胞稳定的处在较好的营养环境中，细胞培养周期较长，目标产品回收率高，产品均一性能得到保证。

3)产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。

本发明通过无血清培养基连续灌注培养方式生产Darbepoetinα，不仅使生产工艺稳定且易于放大，同时大大减轻了生产者的劳动强度，提高了产品的安全性和均一性。

本发明的高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法中，利用可以用于稳定提高Darbepoetinα表达量的无血清培养基组分，同时CHO细胞能够高效稳定地表达Darbepoetinα，表达稳定、培养方法简洁、适合大规模培养。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1是实施例1中不同培养基组合对细胞生长的影响结果图；

图2是实施例1中不同培养基组合对细胞表达量的影响结果图；

图3是实施例1中不同培养基组合对细胞表达产物酸性比例的影响结果图；

图4是实施例1中培养基添加剂对细胞表达产物酸性比例的影响结果图；

图5是实施例2中5L反应器中细胞的生长及表达情况图；

图6是实施例3中30L反应器中细胞的生长及表达情况图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例提供一种无血清培养基，其包括无血清基础培养基和添加剂。

本实施例的无血清基础培养基比例是这样确定的：

将种子细胞复苏并扩增培养，制备细胞悬液，分别接种于1、2、3三种无血清培养基，培养基1、2、3分别为重量份数比是9:1、3:1、1:1的Ex-cell302培养基和CP1027培养基的组合培养基。在36+0.2℃培养，进行6天的糖批实验，培养第4天开始，每日取细胞计数，收集培养上清液，离心去除细胞后冻存，应用ELISA的方法检测细胞的表达量，应用IEF的方法检测细胞表达产物酸性部分比例。在评价中，以酸性部分比例作为首要考虑指标。评价结果如图1、图2和图3所示，培养基1中细胞生长和表达尚可，并且产物酸性部分比例明显比另外两者高。

本实施例的添加剂是这样确定的：

将种子细胞复苏并扩增培养，制备细胞悬液，接种，将细胞分别于不含添加剂和含D-半乳糖1000mg/L，尿嘧啶100mg/L，Mn²⁺2μM的添加剂的无血清培养基培养，无血清培养基为分数比9：1的Ex-cell302培养基和CP1027培养基。在36+0.2℃培养6天后收集上清液，用IEF的方法检测细胞表达产物酸性部分比例。结果如图4所示(图中A：未加添加剂；B：加添加剂)，添加剂能够明显增加产物酸性比例。

所以本实施例的无血清培养基为重量份数比是9:1的Ex-cell302培养基和CP1027培养基的组合组成的基础培养基和添加剂组成的无血清培养基，其中添加剂D-半乳糖的浓度为1000mg/L，添加剂尿嘧啶的浓度为100mg/L，添加剂Mn²⁺的浓度为2μM。

实施例2

本实施例提供一种高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法，使用实施例1的无血清培养基，采用动物细胞5L反应器，进行高密度、悬浮灌注培养，包括如下步骤：

1、细胞接种阶段控制

复苏一支20mL的CHO种子细胞至摇瓶，每3天传代扩增，至细胞扩增到500mL，细胞处在对数生长期(密度在3×106cells/mL左右)，将该500ml种子细胞接种至5L NBSCELLIGEN310生物反应器内的无血清培养基，搅拌转数为100-200转/分钟。接种后细胞密度为5.1×10⁵cells/mL，反应器起始工作体积为3L，得到接种了CHO细胞的无血清培养基。

2、细胞生长阶段控制

在温度36+0.2℃、pH6.90-7.20、溶解氧20％-60％的条件下，以120转/分钟的搅拌转数搅拌接种了CHO细胞的无血清培养基，培养接种在该无血清培养基中的CHO细胞，培养4天，直到生物反应器中的CHO细胞的细胞密度长至6×10⁶cells/ml，得到增殖CHO细胞的无血清培养基。

3、细胞生产阶段控制

当细胞密度超过6×10⁶cells/mL，进入表达期，降温至35+0.2℃，向生物反应器中的增殖CHO细胞的无血清培养基中灌注生物反应器工作体积的1倍的无血清培养基。再以搅拌转数100-200转/分钟的转速搅拌培养30天后，终止培养，收集培养液。

4、监测培养条件

培养过程中需要监测后控制的指标有：温度、pH值、葡萄糖浓度(每升大于两克)、摩尔渗透压浓度(控制在280-350之间)。

上述方法培养的CHO细胞能够在5L反应器中高效稳定地表达Darbepoetinα。细胞生长及表达结果如图5所示。可见在5L反应器中细胞能保持高密度及高活率，细胞的平均密度为1×107cells/mL，平均活率为93％，Darbepoetinα的平均表达量为50mg/L。

实施例3

本实施例提供一种高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的工业化生产方法，使用实施例1的无血清培养基，采用动物细胞30L反应器的高密度、悬浮灌注培养，包括如下步骤：

1、细胞接种阶段控制

复苏一支20mL的CHO种子细胞至摇瓶，每3天传代扩增，至细胞扩增到5000mL，细胞处在对数生长期(密度在3×10⁶cells/mL左右)，将该5000ml种子细胞接种至SartouriusStedium C-Plus30L生物反应器内的无血清培养基，搅拌转数为100-200转/分钟。接种后细胞密度为6.6×10⁵cells/mL，反应器起始工作体积为30L，得到接种了CHO细胞的无血清培养基。

2、细胞生长阶段控制

在温度36+0.2℃、pH6.90-7.20、溶解氧20％-60％的条件下，以120转/分钟的搅拌转数搅拌接种了CHO细胞的无血清培养基，培养接种在该无血清培养基中的CHO细胞，培养5天，直到生物反应器中的CHO细胞的细胞密度长至6×10⁶cells/ml，得到增殖CHO细胞的无血清培养基。

3、细胞生产阶段控制

当细胞密度超过6×10⁶cells/mL，进入表达期，降温至35+0.2℃，向生物反应器中的增殖CHO细胞的无血清培养基中灌注生物反应器工作体积的1倍的无血清培养基。再以搅拌转数100-200转/分钟的转速搅拌培养30天后，终止培养，收集培养液。

4、监测培养条件

培养过程中需要监测后控制的指标有：温度、pH值、葡萄糖浓度(每升大于两克)、摩尔渗透压浓度(控制在280-350之间)。

上述方法培养的CHO细胞能够在30L反应器中高效稳定地表达Darbepoetinα，成功实现从3L规模至30L规模的放大。细胞生长及表达结果如图6所示。在30L反应器中细胞能保持高密度及高活率，细胞的平均密度为9.9×106cells/mL、平均活率为95％、Darbepoetinα的平均表达量为57mg/L。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1. 一种无血清培养基，该培养基包括无血清基础培养基和添加剂，所述无血清基础培养基由 SIGMA公司生产的Ex-cell 302培养基和Hyclone公司生产的CP1027培养基组成，以重量比计，所述Ex-cell302培养基∶CP1027培养基组成=9∶1-1∶1；所述添加剂包括D-半乳糖、尿嘧啶和Mn²⁺。

2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述Ex-cell302培养基∶CP1027培养基组成=9∶1。

3. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述D-半乳糖在无血清培养基中的含量为500mg/L-5000mg/L，所述尿嘧啶在无血清培养基中的含量为100mg/L-500mg/L，所述Mn²⁺ 在无血清培养基中的含量为1μmol/L-50μmol/L。

4. 一种利用权利要求1-3任一项所述的无血清培养基来工业化生产高糖基化修饰的重组人红细胞生长刺激蛋白的方法，该方法包括采用无血清培养基在生物反应器中悬浮培养CHO细胞株，然后在CHO细胞中高效表达Darbepoetin α的步骤。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：该方法包括采用无血清培养基，在生物反应器中，采用无血清悬浮灌注培养工艺悬浮培养CHO细胞株，在CHO细胞中高效表达Darbepoetin α，然后收获培养液的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述无血清悬浮灌注培养工艺包括细胞接种阶段控制，细胞生长阶段控制和细胞生产阶段控制；所述细胞接种阶段控制为将CHO细胞接种到无血清培养基中，其起始接种密度为4-8×10⁵cells/ml，接种体积为工作体积的1/6-1/3，搅拌转数为100-200转/分钟，得到接种了CHO细胞的无血清培养基。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述细胞生长阶段控制为在温度35℃-37℃、pH 6.90-7.20、溶解氧20%-60%的条件下，以100-200转/分钟的搅拌转数搅拌接种了CHO细胞的无血清培养基，培养接种在该无血清培养基中的CHO细胞，培养4天-6天，直到生物反应器中的CHO细胞的细胞密度长至6×10⁶ cells/ml，进入稳定期，得到增殖CHO细胞的无血清培养基。

8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述细胞生产阶段控制为向生物反应器中的增殖CHO细胞的无血清培养基中灌注生物反应器工作体积的0.8-1.2倍的无血清培养基，在温度35-37℃、pH 6.90-7.20、溶解氧20%-60%的条件下，以搅拌转数100-200转/分钟的转速搅拌培养25天-30天，收集培养液。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述无血清悬浮灌注培养工艺还包括对整个培养周期中每天的温度、pH、葡萄糖浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量的监控。