CN104087532B - 一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌c1-6及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌(Clostridium？sp.)C1-6及在催化大豆素制备S-雌马酚中的应用；本发明雌马酚产生梭菌C1-6具有在BHI培养基中将大豆素转化为S-雌马酚的能力；动物实验结果表明梭菌C1-6具有抑制沙门氏菌在小鸡肠道繁衍和定殖的能力，并且对小鸡具有很好的促生长作用，有望开发成替代抗菌素添加剂的新型微生态制剂；另外，本发明发现S-雌马酚溶液在体外对鸡白痢沙门氏菌具有抑制作用。

Description

一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌C1-6及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种雌马酚产生梭菌，特别涉及一种来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌C1-6的分离鉴定及应用。

(二)背景技术

肠道内的微生物复杂多样，它们共同构成了一个动态平衡的微生态系统，然而同种动物消化道的不同位置所含微生物的数量和种类存在差异。对家禽肠道微生物的研究，目前主要集中在盲肠部位。有学者曾运用分子技术分析发现，鸡盲肠内的微生物最为丰富，但问题是目前只有约10％的微生物是已知的物种，这使我们研究肠道微生物种类和作用产生局限性。另外，Zhu等人(ApplEnvironMicrobiol,2002,68,1:124-37)利用从鸡盲肠内容物中筛选到的1656条16SrRNA序列，分析发现在鸡盲肠微生物中梭菌属细菌是数量上最占优势的细菌之一，其他大部分都是未知菌种，还需进一步研究。

梭状芽孢杆菌由硬壁菌门中的革兰式阳性杆状细菌组成。大部分的梭状芽孢杆菌都能产生内孢子，因此具有在恶劣条件下存活的生态优势。尽管有些种类的梭菌会产生毒素类物质且具有致病性，但大部分的梭菌与宿主之间维持着共生关系。其中梭菌属ⅩⅣa簇和梭菌属Ⅳ簇包含了多种梭形菌，它们构成了肠道微生物中总菌的10-40％，且能够产生大量不同的酶类来降解宿主无法消化的各种多糖和寡糖类物质，这些复合物降解之后的产物包括乙酸，丙酸和酪酸。另外最新研究发现梭菌属ⅩⅣa簇和Ⅳ簇细菌在宿主免疫系统的调控中发挥着重要作用，一个由梭菌属ⅩⅣa簇和Ⅳ簇中的46株梭菌组成的混合剂，具有诱导大肠上皮淋巴细胞(intraepitheliallymphocytes，IELs)T细胞受体和免疫球蛋白A(IgA)分泌细胞积累的作用，而且由这46株梭菌组成的混合剂还能影响CD4调节T细胞的数量和功能。因此分离培养鸡肠道内的梭状芽孢杆菌，进一步研究其功能显得尤为重要。

虽然目前已有很多分子生物学技术用于肠道微生物的研究，比如基于16SrRNA基因的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳技术(DGGE/TGGE)、原位杂交技术(FISH)、末端限制性片断长度多态性分析(T-RFLP)以及实时荧光定量PCR技术(Real-timePCR)，但传统的体外纯培养仍是研究肠道微生物的一种重要手段。目前，往往是将两种方法结合起来使用。首先，利用不同的培养条件在体外纯培养不同的细菌，再结合现有分子水平鉴定方法鉴定所分离得到的菌株种类，此方法快速准确又能得到纯培养细菌，具有广泛的应用前景。

对现有文献和专利进行检索发现，目前用于动物生产和饲料添加剂开发等的主要是丁酸梭菌。本实验利用NEOGEN提供的梭菌培养基，通过分离筛选从鸡盲肠内容物中分离到了一株新的梭状芽胞杆菌，作为影响新生小鸡肠道菌群定植的干涉组，为进一步研究其对小鸡生长及健康状态的影响做准备，将来也可为研制禽类微生态制剂、饲料添加剂等提供理论基础和科学依据。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种新的雌马酚产生梭菌(Clostridiumsp.)C1-6及其在催化大豆素产生S-雌马酚中的应用，以及其在小鸡饲养过程中促生长和抑制沙门氏菌定殖的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新的雌马酚产生梭菌(Clostridiumsp.)C1-6，保藏编号为CGMCCNo.9123，保藏日期2014年5月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供一种所述雌马酚产生梭菌C1-6在转化大豆素制备S-雌马酚中的应用，具体为：将雌马酚产生梭菌C1-6经扩大培养获得的种子液以体积浓度5％的接种量接种至含大豆素的BHI液体培养基，在厌氧条件下，37℃培养48h后，将培养液分离纯化(优选将培养液用乙酸乙酯进行液相萃取，取萃取层检测S-雌马酚含量)，获得S-雌马酚；所述BHI培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述大豆素的初始浓度为50μg/ml。

所述培养液分离纯化的方法为：取1ml的培养液，8000r/min离心3分钟，获得上清a；取900μl上清a至另一干净的2mlEP管中，然后向管中加入900μl乙酸乙酯，充分混匀后静置5min，5000r/min离心5分钟，获得上清b和沉淀b；取900μl上清b至另一干净的2mlEP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重复离心1次，获得上清c；将上清b和上清c混合在一起，移到2ml离心管中，45℃真空冷冻浓缩成粉末；加入200μl无水甲醇到该EP管溶解浓缩粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜过滤，滤液即为S-雌马酚。

所述雌马酚产生梭菌C1-6经扩大培养获得的种子液按如下方法制备：将雌马酚产生梭菌C1-6接种至梭菌液体培养基，37℃培养过夜，取培养液在8000转/分离心3分钟后，弃上清，沉淀用质量浓度20％的甘油水溶液制成菌悬液，将菌悬液在-80℃保存；将-80℃保存的菌悬液以体积浓度2％的接种量接种到梭菌液体培养基中，37℃、厌氧静置培养48h后，获得种子液；所述梭菌液体培养基终浓度组成为：牛肉浸膏10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖5g/L、氯化钠5g/L、酵母提取物3g/L、醋酸钠3g/L、可溶性淀粉1g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、琼脂0.5g/L，以蒸馏水为溶剂，pH值6.8±0.2。

本发明所述上清a、上清b、上清c均为上清液，为了便于区分不同步骤获得的上清液不同而命名，字母本身没有含义。

本发明的重点是提供一种新菌株--雌马酚产生梭菌C1-6，且具有将大豆素转化为S-雌马酚的能力；此外雌马酚产生梭菌C1-6在小鸡饲养过程中能够促生长和抑制沙门氏菌定殖，同时将大豆素转化后产生的S-雌马酚在体外对鸡白痢沙门氏菌具有抑制作用(以甲醇为溶剂配制的5mg/ml的S-雌马酚溶液)。

本发明的有益效果是：本发明从小鸡肠道中分离纯化到一株新的功能梭菌--雌马酚产生梭菌(Clostridiumsp.)C1-6，它具有在BHI培养基中将大豆素转化为S-雌马酚的能力。动物实验结果表明梭菌C1-6具有抑制沙门氏菌在小鸡肠道繁衍和定殖的能力，并且对小鸡具有很好的促生长作用，有望开发成替代抗菌素添加剂的新型微生态制剂。另外，本发明发现S-雌马酚溶液在体外对鸡白痢沙门氏菌具有抑制作用。

(四)附图说明

图1是雌马酚产生梭菌C1-6的DAPI染色结果图。

图2是雌马酚产生梭菌C1-6的革兰氏染色结果图。

图3是雌马酚产生梭菌C1-616SPCR测序后获得的16S序列的BLAST比对分析结果。

图4是HPLC检测雌马酚产生梭菌C1-6生产S-雌马酚的高效液相色谱图，A为S-雌马酚标准品，B为梭菌C1-6发酵液样品。

图5是小鸡在接种沙门氏菌后盲肠内容物沙门氏菌的活菌计数结果图，C1-6组表示是用雌马酚产生梭菌C1-6处理组；四环素组表示是用四环素处理组；生理盐水组表示是用生理盐水处理的对照组。

图6是小鸡在接种沙门氏菌后的平均日增重结果图，C1-6组表示是用雌马酚产生梭菌C1-6处理组；四环素组表示是用四环素处理组；生理盐水组表示是用生理盐水处理的对照组。

图7是PCR-DGGE分析小鸡在接种沙门氏菌后的菌群结构变化的电泳图，G1表示是用雌马酚产生梭菌C1-6处理组；G2表示是用四环素处理组；G3表示是用生理盐水处理的对照组，M为Marker。

图8是不同处理对沙门氏菌生长的体外抑制效果照片，C1-6liq代表雌马酚产生梭菌C1-6发酵上清对沙门氏菌生长的体外抑制效果图；C1-6代表雌马酚产生梭菌C1-6菌体对沙门氏菌生长的体外抑制效果图；Tet代表四环素对沙门氏菌生长的体外抑制效果图。A代表在有氧条件下的抑菌效果图；B代表在厌氧条件下的抑菌效果图。

图9是不同浓度S-雌马酚溶液对沙门氏菌生长的体外抑制效果照片，5代表5μl5mg/mlS-雌马酚对沙门氏菌生长的体外抑制效果图；1代表5μl1mg/mlS-雌马酚对沙门氏菌生长的体外抑制效果图；0.2代表5μl0.2mg/mlS-雌马酚对沙门氏菌生长的体外抑制效果图；0代表5μlS-雌马酚溶剂(甲醇)对沙门氏菌生长的体外抑制效果图。A代表在有氧条件下的抑菌效果图；B代表在厌氧条件下的抑菌效果图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌C1-6的分离鉴定

本发明通过使用梭菌分离培养基从鸡肓肠中分离到一种雌马酚产生梭菌C1-6，并通过使用革兰氏和DAPI染色、16SPCR测序和生化试验对其进行鉴定，主要包括以下步骤:

(1)雌马酚产生梭菌C1-6的分离培养

小鸡肓肠内容物样品的收集：用乙醚将小鸡麻醉，直接扭颈处死。然后用解剖剪将其腹部剪开，取出肠道，找到盲肠后，在其根部用棉线结扎，以保证盲肠内容物不暴漏在空气中。在结扎前端剪断盲肠，放入烧杯内迅速放入厌氧工作站内。在厌氧工作站内将盲肠结扎处剪下，用镊子将盲肠内容物挤压进5ml的离心管内，并将两个盲肠内容物混合在一起，按w:v＝10％溶于0.1MPBS(pH7.4)缓冲液中，充分混匀，以此为细菌原液。

梭菌培养基配方(g/L)：牛肉浸膏10；蛋白胨10；葡萄糖5；氯化钠5；酵母提取物3；醋酸钠3；可溶性淀粉1；L-半胱氨酸盐酸盐0.5；琼脂(液体培养基0.5，固体培养基15)；以蒸馏水为溶剂，pH值6.8±0.2(25℃)。

梭状芽胞杆菌的分离：在厌氧工作站内用1.5ml的离心管将细菌原液按照梯度稀释的方法用PBS(pH7.4)依次稀释成5个梯度，分别是原液、10^-2、10^-4、10^-6、10^-8，每管1ml的量。每个浓度各吸取100μl，用三角玻棒从低浓度到高浓度依次均匀涂布在倒好的梭菌固体平板培养基上，待完全吸收后做标记，静置放在厌氧工作站内培养。37℃固态静置培养三天后，用镊子夹取灭菌过的小号(10μl)白色枪头挑取单个白色菌落，记为菌株C1-6，放入提前准备好的液体梭菌培养基试管内。

梭状芽胞杆菌的液体培养与保存：将上述分离获得的菌株C1-6接种至液体梭菌培养基中，37℃培养三天后，分别取约1.5ml细菌培养液到离心管和冻存管中，离心机10000g，高速离心5min后，在厌氧工作站内倒掉上清，向冻存管内加入约1.5ml的10％脱脂奶粉充分混匀，然后将含有菌株C1-6的冻存管放入-80℃冰箱内进行菌种保存；将含有菌株C1-6的离心管冻存在-20℃，用于DNA提取和细菌鉴定。

(2)菌株C1-6的形态观察

1)涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层(事先在背面做好标记圆圈)即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。

2)干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。

3)固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3～4次，共约3～4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

4)DAPI染色与镜检：加DAPI染色液(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)一滴，避光染色15分钟后用体积浓度80％乙醇水溶液冲洗，再用水冲净乙醇溶液，干燥后迅速放入盒子存放以免荧光猝灭。将玻片放置在生物荧光显微镜油镜下观察，看到蓝色纤维状的菌体(图1)。

5)革兰氏染色与镜检：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗；滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗；将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒，立即用水冲净酒精；用番红液染1～2分钟，水洗。干燥后，置显微镜油镜下观察，发现紫色呈纤维状的菌体(图2)。

(3)菌株C1-6的分子生物学和生物化学鉴定

菌株C1-6的分子生物学鉴定：利用OMGA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株C1-6的基因组DNA，然后使用细菌16S基因通过引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行菌株C1-6的16S基因PCR扩增。PCR体系：TaKaRaExTaq(5U/μl)(宝生物工程(大连)有限公司)0.3μl；10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)5μl；dNTPMixture(各2.5mM)4μl；细菌基因组DNA模板2μl；引物27F：10pM；引物1492R：10pM；灭菌蒸馏水补足50μl。PCR条件：94℃，4分钟，1个循环；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，1.5分钟，35个循环；72℃，15分钟，1个循环。PCR扩增产物经胶回收后送上海生物工程有限公司测序，菌株C1-6的16S序列为SEQIDNO1所示。将菌株C1-6的16S序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析后发现，菌株C1-6与一种从人肠道中分离到的雌马酚产生梭菌亚种TM-40具有较高的同源性(图3)，初步鉴定为一种梭菌。

菌株C1-6的生物化学鉴定：采用梅里埃VITEKCompact全自动细菌检测仪、革兰氏阴性鉴定卡(GNcard)和厌氧菌-棒状杆菌鉴定卡(ANCcard)对菌株C1-6的生理生化指标进行检测。检测结果(表1)表明本发明所得的菌株C1-6具有梭菌相关的生理生化特性，结合菌株C1-6形态及生理生化特征，将菌株C1-6鉴定为一种梭菌，命名为雌马酚产生梭菌(Clostridiumsp.)C1-6。

表1菌株C1-6生化特性

(表1中-表示阴性，+表示阳性)

实施例2：梭菌C1-6生产S-雌马酚能力检测

本发明通过使用HPLC对雌马酚产生梭菌C1-6生产S-雌马酚的能力进行功能验证，产S-雌马酚功能验证主要包括以下步骤:

1.雌马酚产生梭菌C1-6的准备

从-80℃冰箱中将100μl雌马酚产生梭菌C1-6保存液接种到5ml梭菌液体培养基中，放置在Electrotek厌氧工作站(购自英国Electrotek公司)中，37℃静置培养48h后，获得种子液，用于接种。保存液制备方法：将雌马酚产生梭菌C1-6接种至梭菌液体培养基，37℃培养过夜，取2ml培养过夜的菌液8000转/分离心3分钟后，弃上清，然后往管中加入1ml质量浓度20％的甘油水溶液，混匀，将菌悬液放入-80℃冰箱保存，即为雌马酚产生梭菌C1-6保存液。

梭菌液体培养基终浓度组成(g/L)为：牛肉浸膏10；蛋白胨10；葡萄糖5；氯化钠5；酵母提取物3；醋酸钠3；可溶性淀粉1；L-半胱氨酸盐酸盐0.5；琼脂0.5；以蒸馏水为溶剂，pH值6.8±0.2(25℃)。

2.发酵用培养基和发酵条件

将250μg大豆素加入5ml的BHI培养基(装液量为20ml)中，然后将种子液以体积浓度5％的接种量进行接种，37℃下于厌氧工作站中静置培养48h，获得发酵液。

BHI培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，溶剂为水，pH值为7.0。

3.梭菌C1-6中S-雌马酚含量的HPLC检测

取1ml上述发酵培养液至1.5mlEP管，8000转每分钟离心3分钟后，将900μL上清a转移至一个新的2.0mlEP管，然后每管加入等量的乙酸乙酯，充分混匀后静置5分钟，5000转每分钟离心5分钟后，取上清b至另一干净的2mLEP管中；取上清b后剩下的下层液体用等量的乙酸乙酯再离心1次，获得上清c，然后将上清b和上清c混合在一起，45℃冷冻离心浓缩成粉末，加入200μL无水甲醇溶解粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)过滤，滤液用于HPLC检测。以S-雌马酚标准品(购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司)为对照。

高效液相色谱条件：

液相色谱系统：Waters2695；色谱柱：SunFireTMC185μm(4.6mm×205mmcolumn)。流动相：0.01％甲酸(50％)、甲醇(20％)和乙腈(30％)；洗脱程序：等度洗脱15min；流速0.8mL/min；柱温30±2℃，样品温度7℃；检测波长：S-雌马酚205nm，大豆素254nm。

从图4的HPLC检测结果可以看出，与S-雌马酚标准品相比，本发明所获得的雌马酚产生梭菌C1-6经过发酵后在其发酵液中检测到了S-雌马酚的产生。与S-雌马酚标准品相比，雌马酚产生梭菌C1-6发酵液中在约9.5分钟时也能检测到相对应的光谱吸收峰，说明该菌具有将大豆素转化生产为S-雌马酚的能力。

实施例3：雌马酚产生梭菌C1-6对沙门氏菌在小鸡肠道中的定殖及小鸡生长性能的影响

1、细菌培养用培养基配方

LB液体培养基配方(g/L)：酵母提取物5g；胰蛋白胨10；氯化钠10，溶剂为水，pH值为7.0。

胆硫乳琼脂(DHL)培养基配方(g/L)：蛋白胨20，牛肉浸粉3.0，乳糖10，蔗糖10，去氧胆酸钠2.0，硫代硫酸钠2.3，柠檬酸钠1.0，柠檬酸铁铵1.0，中性红0.03，琼脂17，溶剂为水，pH值为7.0。

2、细菌菌株和试验动物

鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum)CVCC519购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；Ross308肉鸡购于浙江大学海宁种鸡场。

3、动物实验用菌体的准备

雌马酚产生梭菌C1-6菌液：将冻存在-80℃冰箱内的100μl雌马酚产生梭菌C1-6保存液(实施例2方法制备)接种至装有5ml梭菌液体培养基的试管中，然后放入厌氧工作站中，37℃培养48h，取培养液用PBS(pH值为7.4)稀释1000倍，并涂布梭菌固体培养基平板，37℃、厌氧培养48h，挑单菌落至梭菌液体培养基中，在厌氧箱内37℃培养48h后，将培养液中菌体浓度用PBS(pH值为7.4)调整至10⁸CFU/ml，即为雌马酚产生梭菌C1-6菌液，取菌液10ml分装到5ml离心管内，用封口膜密封好后取出，用于动物试验对新生小鸡肠道菌群进行干涉。

沙门氏菌菌液：动物攻击当天，取100μl冻存在-80℃的鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)保存液(制备方法同实施例2)，超净工作台内接种到5mlLB液体培养基中，37℃摇床中培养3h，然后将培养液离心后用PBS(pH值为7.4)调整至10⁸CFU/ml，即为鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)菌液，取菌液10ml分装至5ml离心管内，用封口膜封好用于动物试验。

4、动物干预试验

将刚孵出的小鸡平均分成3组(组1为雌马酚产生梭菌C1-6菌液处理组，组2为四环素处理组，组3为生理盐水对照组)，每组设两个平行，每个平行10只，共20只，每组小鸡平均体重(44±1.1)g。组1用1ml注射器经口腔进行灌喂雌马酚产生梭菌C1-6菌液，每只鸡0.2ml菌液，即每只小鸡灌菌量为2×10⁷CFU，每天灌喂一次。组2按0.1g/L的量将四环素添加在饮水中，小鸡自由饮用，每天更换一次。组3不干涉初始菌群，小鸡自由采食饮水。连续饲喂5天后对组1～组3进行沙门氏菌的攻击，每只鸡灌喂0.2ml混匀的沙门氏菌菌液，灌菌量为2×10⁷CFU，每天一次，连续攻击两天。此后组1再次灌喂雌马酚产生梭菌C1-6菌液，每只鸡0.2ml菌液，组2再次引用含0.1g/L四环素的水，组3继续饮用水，连续两天后，不再进行干涉，组1、组2和组3的小鸡均自由采食饮水(即自来水)。共饲养4周，每周称量体重，并解剖取样，记录数据。

5、小鸡肓肠内容物中沙门氏菌活菌计数

每周从各个试验组随机选取4只鸡，每个平行各2只，分别在攻击沙门氏菌后2天，9天，16天和23天进行解剖获取盲肠内容物，用电子天平称取0.1g盲肠内容物后迅速加入0.9mlPBS(pH值7.4)充分混匀，即为盲肠内容物悬液，其余盲肠内容物都冻存-20℃冰箱内待提取DNA用。

将盲肠内容物悬液再用PBS(pH值7.4)依次进行梯度稀释，稀释到10^-7倍，每只鸡的盲肠内容物选择10^-4，10^-5，10^-6，10^-7四个浓度各取100μl涂布DHL琼脂培养基平板，37℃过夜培养后，记录单菌落数目，即为鸡肠道内沙门氏菌的活菌数。如图5所示，在攻菌后第2天，雌马酚产生梭菌C1-6的沙门氏菌活菌数就少于阳性对照组；到攻菌后第9天梭菌C1-6组的沙门氏菌活菌数与四环素组接近，且均明显低于阳性对照组；一直到攻菌后23天，雌马酚产生梭菌C1-6组的沙门氏菌活菌数仍明显低于生理盐水对照组，说明鸡肠道梭菌C1-6对体外抵御沙门氏菌的繁衍和定殖具有很好的效果。

6、鸡肠道梭菌C1-6对小鸡体重的影响

试验过程中记录小鸡初生时体重和每周体重，然后计算小鸡每日增重情况。结果如图6所示，在攻击沙门氏菌后第2天，梭菌组和四环素组与生理盐水对照组之间小鸡的平均日增重没有明显差异，到攻菌后第9天，四环素组的平均日增重明显优于生理盐水对照组，梭菌组略好于生理盐水对照组，到攻菌后第16天和23天梭菌组与四环素组间平均日增重相近，且均明显高于生理盐水对照组。这些结果表明雌马酚产生梭菌C1-6在攻菌后16天对小鸡生长表现出很好的促生长作用。

2.2.3鸡肠道菌群的PCR-DGGE检测

用QIAGEN公司的粪便DNA提取试剂盒提取盲肠内容物样品中的细菌(即步骤5制备的盲肠内容物悬液)基因组DNA，然后利用细菌16SV3区引物(P1:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；P2:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)进行PCR反应后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)。PCR反应体系具体如下：模板DNA(20ng/μl)2μl，P1(20pmol/μl)0.5μl，P2(20pmol/μl)0.5μl，ExTaq酶(Takara)0.125μl，10×PCRbuffer3μl，dNTP3μl，最后补无菌水至25μl。PCR反应程序为Touchdown程序：94℃预变性3min；94℃变性lmin，65℃退火lmin(每2个循环退火温度降1℃)，72℃延伸lmin，执行20个循环；94℃变性lmin，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，执行5个循环；72℃延伸5min；4℃保存。PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。DGGE结果如图7所示，在攻菌后第2天，小鸡的肠道菌群有点紊乱，即使是同一试验组内的两只鸡间，其菌群结构也存在较大差异，但到攻菌后第9天，所有试验组鸡的盲肠内容物菌群趋向一致，各试验组间DGGE电泳带型基本一致。到攻菌后第16天和23天，各试验组间DGGE电泳带型也保持基本一致。说明梭菌C1-6及少量四环素的干预对小鸡整个肓肠菌群的影响并不大。但从图7可以看出，随着年龄的增长，小鸡盲肠中的DGGE电泳条带增多，说明随着年龄的增长，小鸡肠道菌群的多样性增加并日趋成熟。

实施例4雌马酚产生梭菌C1-6和S-雌马酚对鸡沙门氏菌生长的体外抑制试验

选用雌马酚产生梭菌C1-6菌悬液、雌马酚产生梭菌C1-6发酵液上清和S-雌马酚标准品在LB平板上对鸡白痢沙门氏菌CVCC519做抑菌圈试验，从而判断C1-6和S-雌马酚在体外对沙门氏菌的抑制作用。具体方法如下：

1.雌马酚产生梭菌C1-6菌悬液和雌马酚产生梭菌C1-6发酵液上清的准备：将冻存在-80℃冰箱内的100μl雌马酚产生梭菌C1-6保存液接种至装有5ml梭菌液体培养基的试管中，在厌氧箱内37℃培养48h后，取1ml培养液8000转离心3分钟后，收集上清为雌马酚产生梭菌C1-6发酵液上清。离心后获得的细菌沉淀，用1mlPBS(pH值为7.4)重悬后获得雌马酚产生梭菌C1-6菌悬液(6×10⁸cfu/ml)。

2.S-雌马酚溶液的配制：将购买自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司的S-雌马酚标准品以甲醇为溶剂，按质量体积比配制成5mg/ml、1mg/ml和0.2mg/ml的S-雌马酚溶液。

3.鸡白痢沙门氏菌CVCC519的准备：取100μl冻存在-80℃的鸡白痢沙门氏菌(CVCC519)保存液，超净工作台内接种到5mlLB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜后备用。

4.配置含质量终浓度1.2％琼脂的LB培养基，灭菌后倒平板，室温晾干后备用。

5.用一次性细菌接种环将过夜培养的沙门氏菌划线接种到已经晾干的LB平板上，然后将灭菌过的直径6mm滤纸片轻轻放入平板中，取C1-6菌悬液、C1-6上清及不同浓度的S-雌马酚溶液，依次滴加5μl到滤纸片上，另外用四环素水溶液(浓度为2mg/ml)做阳性对照。

6.加完样品后，将一份平板放置在37℃培养箱内培养，将另一份平板放置在37℃厌氧培养箱内培养，培养14h后观察有无抑菌圈出现。通过平板抑菌圈试验结果显示，无论是在有氧还是厌氧条件下，四环素的抑菌圈明显，而分离的梭菌C1-6菌悬液及其上清液周围都没有明显的抑菌圈(图8)。说明梭菌C1-6在体外对沙门氏菌的抑制效果不明显。从图9可以看出无论是在有氧还是厌氧条件下，S-雌马酚溶液对沙门氏菌体外的生长均有一定的抑制作用，但S-雌马酚溶液对沙门氏菌的抑制作用具有浓度依赖性，只有5mg/mlS-雌马酚溶液周围出现明显的抑菌圈。

Claims (5)

1.来源于鸡肠道的雌马酚产生梭菌(Clostridiumsp.)C1-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9123，保藏日期2014年5月4日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.一种权利要求1所述雌马酚产生梭菌C1-6在催化大豆素制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述的应用为：将雌马酚产生梭菌C1-6经扩大培养获得的种子液以体积浓度5％的接种量接种至含大豆素的BHI培养基，在厌氧条件下，37℃培养48h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述BHI培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，溶剂为水，pH值为7.0。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述大豆素的初始浓度为50μg/ml。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：取1ml的培养液，8000r/min离心3分钟，获得上清a；取900μl上清a至另一干净的2mlEP管中，然后向管中加入900μl乙酸乙酯，充分混匀后静置5min，5000r/min离心5分钟，获得上清b和沉淀b；取900μl上清b至另一干净的2mlEP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重复离心1次，获得上清c；将上清b和上清c混合在一起，移到2ml离心管中，45℃真空冷冻浓缩成粉末；加入200μl无水甲醇到该EP管溶解浓缩粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜过滤，滤液即为S-雌马酚。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述种子液按如下步骤制备：将雌马酚产生梭菌C1-6接种至梭菌液体培养基，37℃培养过夜，取培养液在8000转/分离心3分钟后，弃上清，沉淀用质量浓度20％的甘油水溶液制成菌悬液，将菌悬液在-80℃保存；将-80℃保存的菌悬液以体积浓度2％的接种量接种到梭菌液体培养基中，37℃、厌氧静置培养48h后，获得种子液；所述梭菌液体培养基终浓度组成为：牛肉浸膏10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖5g/L、氯化钠5g/L、酵母提取物3g/L、醋酸钠3g/L、可溶性淀粉1g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、琼脂0.5g/L，以蒸馏水为溶剂，pH值6.8±0.2。