CN113215039B - 一株乳杆菌w8173及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳杆菌（lactobacillus sp.）W8173，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.21787，该菌种能改善蜜蜂欧洲幼虫腐臭病症状，在体外抑菌实验中，可以直接抑制蜂房蜜蜂球菌；在体内实验中，喂食有乳杆菌的单菌蜜蜂对蜂房蜜蜂球菌具有较好的抑制效果；通过对乳杆菌W8173培养液的上清液的分离，发现乳杆菌W8173的分泌产物对蜂房蜜蜂球菌有抑制作用，本发明制剂环保，无污染，不会影响蜂产品品质，适用于工业化生产和市场推广应用。

Description

一株乳杆菌W8173及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种乳杆菌（lactobacillus sp.）W8173及其应用。

背景技术

蜜蜂（Apis mellifera）是重要的农业授粉昆虫，不仅在构建生态农业、蜂产品供给中扮演重要角色，其对于不同植被的传粉作用在维持生物多样性及生态平衡上发挥了重要作用。目前我国苹果、棉花、油菜、大豆等约36 种农作物大量依赖蜜蜂的授粉作用，每年的授粉价值达到3042 亿元。然而，近年来由于蜜源植物多样性和栖息地的减少、种间竞争、病原微生物和寄生虫的感染等，导致全球蜜蜂种群数量呈逐年下降趋势。其中，病原微生物和寄生虫感染是蜜蜂种群数量锐减的主要诱因，具有破坏性强、发病具有明显季节性、不同地区发病情况差异性大等特点，往往导致蜂群在发病初期难于预测、无法进行针对性控制，从而导致滥施滥用化学药物使蜂群健康状态进一步恶化，并且造成产品药物残留问题，对蜂农饲养积极性和授粉行业造成了极大的影响。

欧洲幼虫腐臭病在西方蜜蜂中危害仅次于美洲幼虫腐臭病，欧洲幼虫腐臭病的病原菌为蜂房蜜蜂球菌 (Melissococcus pluton)，革兰氏阳性菌，是蜜蜂的专性病原体。蜂房蜜蜂球菌主要侵害1～2日龄的蜜蜂幼虫，使3～4日龄幼虫在未封盖时大量死亡。患病幼虫陷塌于巢房底部且位置错乱，虫体变松软并腐烂，会造成空房与子房相间的“插花子脾”现象。欧洲幼虫腐臭病的发生具有明显的季节性，蜂群易在早春及秋季发病，虽然蜂房蜜蜂球菌主要感染蜜蜂幼虫阶段，但成年工蜂会携带蜂房蜜蜂球菌，导致欧洲幼虫腐臭病在蜂群内甚至是不同蜂群和蜂场间传播，而目前对于蜂房蜜蜂球菌的致病机理尚不明确。

通常蜂场在治疗时因没有有效的治疗手段，而滥用抗生素，不仅导致病源菌产生抗药性，而且会破坏蜜蜂肠道微生态平衡，使疾病进一步恶化。同时抗生素施用会导致蜂产品中残留，影响产品品质，带来食品安全性威胁。

目前未见任何关于乳杆菌用于欧洲幼虫腐臭病防治的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种乳杆菌（lactobacillus sp.）W8173，其于2021年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21787，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明乳杆菌W8173是从吉林获得的西方蜜蜂（Apis mellifera Linnaeus）中分离纯化得到的，提取菌株的总DNA，用细菌16S rRNA通用引物扩增目的片段，对片段进行回收、克隆、测序，16s rRNA序列如SEQ IDNo:1所示；对细菌16S rRNA基因片段序列使用NCBI的BLAST进行16S rRNA的相似性比对，结果显示与乳杆菌Firm5的关系最近，相似性达到99.72%，因此，鉴定为该菌株为乳杆菌，命名为乳杆菌W8173。

本发明另一目的是将上述乳杆菌W8173或其发酵产物应用在制备治疗欧洲幼虫腐臭病菌剂或饲料中。

本发明所述的用途，是将乳杆菌W8173或其发酵产物用作制备防治欧洲幼虫腐臭病菌剂或饲料中，即以乳杆菌W8173或其发酵产物为活性成分，在制备防治欧洲幼虫腐臭病菌剂或饲料中的应用；

本发明防治欧洲幼虫腐臭病致病菌菌剂或饲料的成分（或有效成分）为乳杆菌W8173或其发酵产物，还可以加入一种或多种防治菌剂或饲料上可接受的辅料，制成菌剂或饲料适用的剂型，按常规添加量添加使用，菌剂或饲料中有效活菌数不低于10¹¹cfu/g。

本发明的有益效果在于：

本发明旨在为蜜蜂的疾病防治和新型益生菌的市场化开发和产业化应用奠定基础；本发明提出的乳杆菌W8173可以通过分泌抗菌肽，从而抑制蜂房蜜蜂球菌的作用，在治疗欧洲幼虫腐臭病中有巨大潜力。

本发明提供的乳杆菌W8173，能改善蜜蜂欧洲幼虫腐臭病症状，在体外抑菌圈实验中，可以直接抑制蜂房蜜蜂球菌；在体内实验中，喂食有乳杆菌W8173的单菌蜜蜂对蜂房蜜蜂球菌具有较好的抑制效果；通过对乳杆菌W8173的上清液的分离，发现乳杆菌通过分泌产物达到对蜂房蜜蜂球菌的抑制作用；且本发明菌剂或饲料环保，无污染，不会影响蜂产品品质，适用于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为乳杆菌W8173上清液对蜂房蜜蜂球菌的体外抑菌实验结果；

图2为乳杆菌W8173浓缩上清液对蜂房蜜蜂球菌的体外抑菌实验结果；

图3为乳杆菌W8173对蜂房蜜蜂球菌的体内实验结果；

图4为乳杆菌W8173培养上清液中抗菌物质的纯化结果（上图）以及抑菌实验结果（下图）。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂，培养基均为市售产品，按使用说明使用；

其中MRS培养基为：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.25 g，琼脂粉15 g，用蒸馏水定容至1L，将pH调至6.2-6.4。

实施例1：乳杆菌W8173的分离及鉴定

从吉林捕获西方蜜蜂，并解剖取出蜜蜂完整肠道，在100 μL 25%（v/v）甘油中用研磨棒手动研磨将肠壁研磨破碎，并保存在-80℃超低温医用冰箱中；将肠道样品于乳酸细菌培养基（MRS）上三区划线，于35 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养2-3天。观察菌落形态，从中挑取单菌落重新在MRS培养基上八个分区域划线，于35 ℃、5%二氧化碳培养箱中纯化培养；在培养基上选取若干个单菌落，分别进行编号，选取20个单菌落进行16S rRNA测序。

细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取，采用16S rRNA的通用引物（27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），在50 μL的PCR体系（ddH₂O 19μL、2×SanTaq PCR Mix 25 μL、Primer F 2 μL、Primer R 2 μL、模板DNA 2 μL）中扩增；PCR条件为：94 ℃预变性2 min；94℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5min。

本实施例16srDNA扩增测序结果显示，编号为W8173的菌株，其16s rRNA测序结果如SEQ ID NO:1所示；用BLAST工具在数据库中进行比对，结果显示本发明涉及的菌株W8173与乳杆菌Firm-5关系最近，相似性达到100%。因此，鉴定该菌株为乳杆菌，命名为乳杆菌W8173。

实施例2：冻干菌剂的制备

将蜜蜂乳杆菌W8173用MRS培养基活化，接种量为3%，将活化好的菌种，按照4%接种量转接到MRS液体培养基中在37℃培养25h，离心(5000 g，15 min)收获菌体，备用。将上述菌体按照体积比为3∶1加入保护剂（海藻糖1%、谷氨酸钠0.5%、脱脂乳1%、抗坏血酸0.25%、葡聚糖0.25%，g/100mL蒸馏水），混合均匀备用。在进行冷冻干燥之前，样品需在-80℃超低温冰箱预冻3h，随后采用三段式冷冻干燥，在512 Pa压力下冻干6 h，随后在256 Pa压力下冻干5 h，之后在103 Pa下冻干直至获得粉末产品。将冻干的菌剂分别在4 ℃和25 ℃保存菌粉，每隔2月测每种菌粉的活菌数，平行3次实验。结果如下表所示；由表可知，冻干的菌剂在4 ℃和25 ℃保存10个月后，活菌数仍保持在较高的水平；在25 ℃保存下的稳定性较4 ℃保存下虽然有一定的差距，但是仍然保持在90%的存活水平；乳杆菌W8173菌粉的有效菌数不低于2×10¹¹ cfu/g；

。

实施例3：乳杆菌W8173体外抑菌实验

（1）受试品乳杆菌W8173无菌上清液的配置：将上述实验中的乳杆菌W8173冻干菌剂，接种于乳酸菌细菌培养基（MRS肉汤培养基粉52 g加蒸馏水至1 L，121 ℃灭菌15 min）中培养5天，将培养液通过低温高速离心机8000 g离心10 min，取上层清液，最后将上清通过0.22 μm孔径滤膜过滤，即得乳杆菌W8173无菌上清液；

（2）受试品乳杆菌 W8173浓缩无菌上清液的配置：将1 L乳杆菌W8173无菌的上清液，通过旋转蒸发仪（55 ℃）浓缩成100 mL，即获得乳杆菌W8173浓缩无菌上清液；

（3）致病菌蜂房蜜蜂球菌的培养及抑菌圈实验

在10 mL离心管中加入5 mL 1×PBS缓冲液，将在平板上处于最佳生长状态的蜂房蜜蜂球菌全部用接种环刮于离心管中，用涡旋振荡器振荡均匀，制备成菌悬液，取50 μL菌悬液置于KSBHI平板上，涂布均匀；在涂布后的琼脂培养基上制备10 mm的孔；取乳杆菌W8173无菌上清液及其浓缩无菌上清液100 μL置于制备好的孔洞中；将平板置于5% CO₂培养箱35 ℃培养3-4天；观察孔周围是否有抑制区域的形成。

结果见图1、图2，从图中可以看出乳杆菌W8173的无菌上清液和浓缩液对蜂房蜜蜂球菌具有较好的抑制作用，通过对图1和图2的比较可以看出10倍的浓缩液比无菌上清液有更好的抑制作用。

实施例4：乳杆菌W8173对蜂房蜜蜂球菌的动物实验

1、材料

受试品乳杆菌W8173混悬溶液的配置：取冻干菌剂1 g（其中有效活菌数不低于10¹¹ cfu/g），置于1 L的烧杯中，加入450 mL质量浓度50%蔗糖溶液与450mL 1×PBS缓冲液的混合溶液搅拌混悬，同时加入100 g花粉继续混悬，即得乳杆菌W8173混悬溶液。

2、蜜蜂饲养及试验

蜜蜂饲养条件：群养，饲养温度与湿度：35 ℃、40%-70%，采用避光培养；培养箱条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性，将蜜蜂分成无菌蜜蜂组和乳杆菌W8173单菌蜜蜂组；

无菌蜜蜂模型的构建：从蜂脾中取出未羽化的成虫放入无菌饭盒中，并置于无菌培养箱中35℃培养1-2天，每个饭盒中加入一管含有2 mL 50%蔗糖溶液的离心管，约一天后羽化，待其羽化后，将打孔的一次性杯子用75%酒精或84消毒液擦拭并在紫外下杀菌15min；随后从饭盒中挑出25只蜜蜂转移到无菌一次性杯子中（3组平行试验），在杯子中分别放入装有50%无菌蔗糖水溶液和无菌花粉的离心管用于饲喂蜜蜂，并用胶带固定；置于无菌环境中培养7天后，即可获得无菌蜜蜂。

乳杆菌W8173单菌蜜蜂的构建：从蜂脾中取出未羽化的成虫放入无菌饭盒中，并置于无菌培养箱中35 ℃培养1-2天，每个饭盒中加入一管含有2 mL 50%蔗糖溶液的离心管，约一天后羽化。待其羽化后，将打孔的一次性杯子用75%酒精或84消毒液擦拭并在紫外下杀菌15 min；随后从饭盒中挑出25只蜜蜂转移到无菌一次性杯子中（3组平行试验），将乳杆菌W8173混悬溶液加入2 mL离心管中，喂食给无菌蜜蜂，同时喂食无菌花粉，置于无菌培养箱中35 ℃培养7天，即获得乳杆菌W8173单菌蜜蜂模型。

致病菌侵染：将无菌蜜蜂组和乳杆菌W8173单菌组蜜蜂分别培养七天后，随后分别用蜂房蜜蜂球菌进行浸染试验；

样品采集及处理：在感染蜂房蜜蜂球菌后七天，将所有蜜蜂进行取肠道处理；并进行蜜蜂肠道基因组提取，采用CTAB方法对每个蜜蜂肠道提取基因组。

将解剖后的肠道转移至728 μL CTAB缓冲液和20 μL 20mg/mL 的蛋白酶K溶液中，研磨杵均质30s，并转移至含有500 μL 0.1mm无菌氧化锆珠的2 mL管子中；使用MO BIOVortex Genie 裂解3 min，并12000 g离心5 min；取上清液并转移至无菌1.5 mL试管中，并56 ℃下孵育30 min，加入5 μL RNase A，在37 ℃下孵育30 min后加入400 μL苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）有机相，并14000 rpm离心5 min，将上清液转移至新的1.5 mL试管中，并加入50 μL乙酸钠和500 μL异丙醇，14000 rpm离心30 min后，将沉淀物用70％乙醇洗涤两次，最终将其悬浮在50 μL去除核酸酶的水中，于-20℃保存。

蜂房蜜蜂球菌检测方法：用Thermo Fisher公司生产的QuantStudio 1实时荧光定量聚合酶链式反应仪器进行蜂房蜜蜂球菌菌量的测试实验；使用设计的蜂房蜜蜂球菌特异性的引物扩增蜜蜂肠道所提取的基因的总拷贝，通过荧光CT值和总拷贝数的对数值的对应关系来衡量。其中正向引物是MP-qpcr-69-f（5'- TGTTGTTAGAGAAGAATAGGGGAA-3'），反向引物是MP-qpcr-69-r（5'-CGTGGCTTTCTGGTTAGA-3'），同时使用蜜蜂的肌动蛋白（actin,AB023025）基因拷贝数进行样品间的标准化处理，正向引物actin-F（5'-TGCCAACACTGTCCTTTCTG-3'），反向引物actin-R（5'-AGAATTGACCCACCAATCCA-3'）；采用染料法进行qPCR试验，选用南京诺唯赞生产的AceQ® Universal SYBR qPCR Master Mix染料法试剂盒配制qPCR体系，其中体系总量为20 μL，包括10 μL的2 × ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix（Vazyme Biotech公司）、0.4 μL的正向引物、0.4 μL的反向引物、1 μL的待测样品和8.2 μL的双蒸水。将不同稀释浓度的模板加入配好的体系进行qPCR试验，通过计算可得到绝对拷贝数的对数值和每个孔内样品荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（CT值）的对应关系；接着将待测样品适量稀释后，加入配好的体系进行qPCR试验，将得到的CT值带入已绘制好的标准曲线内即可得到样品对应的绝对拷贝数；qPCR采用三步法，上述的循环条件为95 ℃、30 s，95 ℃下3-10 s和60 ℃下10-30 s（40个循环），95 ℃下15s和60 ℃下60 s和95 ℃下15 s。

结果见图3，由图3结果可知，相比于感染蜂房蜜蜂球菌的无菌蜜蜂，乳杆菌W8173混悬溶液对蜂房蜜蜂球菌具有较好的抑制作用。

实施例5：乳杆菌 W8173培养上清液的分离及抑菌性验证

将乳杆菌W8173在MRS液体培养基中于37 ℃培养5天，并在高速冷冻离心机（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）中以8000 rpm在4 ℃下离心15 min以去除细菌细胞；随后，将剩余液体通过一个0.22 μm孔径的膜过滤以产生无细胞上清液；

获得的上清液用Superdex™ 30 Increase 10/300 GL在ÄKTA纯蛋白分离纯化平台（GE Healthcare，Marlborough，USA）中进行纯化；运行参数为：平衡体积为2柱体积（CV）；在pH值为5.2时洗脱；洗脱体积为1.5 CV；紫外280 nm；流速为0.3 mL/min；每3 min收集一次液体；采用液体抑制实验（将100μL分离液与MRS液体1:1混合，并接种OD=0.8的蜂房蜜蜂球菌10 μL）测定每种收集物质的抗菌活性。

实验结果见图4，通过纯化后的Helveticin-J（第3个峰）对蜂房蜜蜂球菌有明显的抑制作用；

本发明的实验结果表明，乳杆菌 W8173的蜜蜂其肠道内蜂房蜜蜂球菌个数少于对照组，可以更好地将蜂房蜜蜂球菌的个数控制在10⁶ 个；乳杆菌W8173通过分泌产物对蜂房蜜蜂球菌有较好的抑制作用，从而达到对蜜蜂一定保护作用；动物实验结果与体外抑菌圈试验结果一致。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一株乳杆菌W8173及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> DNA

<213> 乳杆菌W8173(lactobacillus sp. W8173)

<400> 1

gctgactcct ttgcaggtta tcctaccggc tttgggcatt acagactctc atggtgtgac 60

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 120

gcgattccag cttcatgcac tcgagttgca gagtgcaatc cgaactgaga ttagctttca 180

gagattcgct tgcctttgca ggttcgctgc tcgttgtact aaccattgta gcacgtgtgt 240

agcccaggtc ataaggggca tgatgacttg acgtcgtccc caccttcctc cggtttgtca 300

ccggcagtct cattagagtg cccaacttaa tgctggcaac taataataag gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc accacctgtc 420

ttagtgttcc cgaaggaaac atcctatctc taggactcgc actagatgtc aagacctggt 480

aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540

caattccttt gagttttaac cttgcggtcg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600

gctgcagcac tgagaggcgg aaacctccca acacttagca ctcatcgttt acggcatgga 660

ctaccagggt atctaatcct gttcgctacc catgctttcg aacctcagcg tcagttacag 720

accagagagc cgccttcgcc actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca 780

catggagttc cactctcctc ttctgcactc aagaaaaata gtttcagctg cagttcccca 840

gttaagctga gggctttcac agctgactta ttctcccgcc tgcgttcgct ttacgcccaa 900

taaatccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960

tgactttctg gttgattacc gtcaaacaag aatcagttgc tatccctgtc cttcttcacc 1020

aacaacagag ctttacgatc cgaaaacctt cttcactcac gcggcgttgc tccatcagac 1080

ttgcgtccat tgtggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg gccgtgtctc 1140

agtcccaatg tggccggtca gtctctcaac tcggctatgc atcatcgcct tggtaggccg 1200

ttaccttgcc aactagctaa tgcaccgcgg gcccatcctt tagtgacagc tttaaagccg 1260

ccttttacag cttgagcatg cgctcgtgct gcttatttgg tattagcacc tgtttccaag 1320

tggtatccca agctataggg caggttgccc acgtgttact cacccatc 1368

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tgttgttaga gaagaatagg ggaa 24

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

cgtggctttc tggttaga 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

tgccaacact gtcctttctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

agaattgacc caccaatcca 20

Claims (3)

1.一种乳杆菌（lactobacillus sp.）W8173，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.21787。

2.权利要求1所述的乳杆菌W8173在制备治疗欧洲幼虫腐臭病菌剂中的应用。

3.权利要求1所述的乳杆菌W8173在制备治疗欧洲幼虫腐臭病饲料中的应用。

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