CN104066432B

CN104066432B - 用于治疗病毒性疾病的方法和组合物

Info

Publication number: CN104066432B
Application number: CN201280066275.4A
Authority: CN
Inventors: 希里特·埃伊纳夫; 里娜·巴鲁什-本托夫; 格里戈里·内沃; 阿莫茨·齐瓦夫
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2032-12-06
Also published as: CO7230337A2; AU2012347785A1; PH12014501268B1; US20150057267A1; AU2012347785B2; SG11201402899TA; MX349036B; MY171759A; WO2013086133A1; CR20140291A; US20170000802A1; MX2014006850A; PH12014501268A1; BR112014013649A2; EP2787999B1; EP2787999A1; US10869873B2; US9364484B2; PE20142102A1; CN104066432A

Abstract

本发明提供了用于通过使用阻止独特的病毒结构蛋白基序与来自网格蛋白衔接蛋白家族的宿主蛋白质结合并随后阻止病毒复制的抑制剂来治疗病毒感染和同时感染的方法。

Description

用于治疗病毒性疾病的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年12月6日提交的美国临时申请序列号61/567,491的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明得到国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同AI079406的政府支持。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本发明涉及病毒学。更具体地，本发明涉及通过抑制宿主细胞网格蛋白衔接蛋白(clathrin adaptor protein)与病毒YXXΦ或二亮氨酸基序(dileucine motif)之间的相互作用或者其调节来治疗病毒性疾病。

背景技术

人感染慢病毒亚科(Lentiviridae)病毒(如HIV)和黄病毒科(Flaviviridae)病毒(如HCV)对全球健康的造成了巨大挑战。尽管强效抗HIV药物处于临床开发中并且对于基于干扰素之方案的响应率因包含蛋白酶抑制剂(PI)而改善，但是抗性、药物-药物相互作用和累积的毒性延续了造成的挑战。因此，依然需要更有效的抗病毒策略以对抗HCV大流行。此外，为了治疗因抗性病毒而无法进行高活性抗逆转录病毒治疗(highly activeantiretroviral therapy，HAART)的患者，需要在补救方案中包含新的抗病毒策略。

发明概述

简单地说，本公开内容的实施方案包括治疗具有病毒感染的宿主的化合物、组合物、药物组合物和方法。在一个实施方案中，根据本公开内容易感染的病毒包括包含至少一种包含YXXΦ基序或二亮氨酸基序的蛋白质的病毒，其在本文中被称为“网格蛋白AP结合病毒”，黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(co-infection)(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒，治疗宿主中此类病毒的复制的方法，抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与宿主网格蛋白AP1-AP4复合物μ亚基(如AP2M1、AP1M1、AP3M1或AP4M1)结合的方法，治疗宿主中与病毒性肝炎有关的肝纤维化的方法等。

治疗具有来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染如(HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒等的病毒感染的宿主的一个示例性方法可包括：向所述宿主施用治疗有效量的抑制剂以降低所述宿主中的病毒载量。在一个实施方案中，所述抑制剂选自：竞争性抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与选自网格蛋白AP1至AP4的μ亚基的宿主蛋白质之间结合的药剂；以及抑制宿主蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自网格蛋白AP1至AP4的μ亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。治疗宿主中的网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒等的病毒感染的一个示例性方法可包括：向具有此类病毒感染的宿主施用抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自：竞争性抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1的宿主蛋白质之间结合的药剂，以及抑制宿主蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。在一些实施方案中，这些抑制剂抑制GAK(环G相关激酶)或AAK1(衔接子相关激酶1)，包括例如厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)或PKC-412的化合物。因此，有两类抑制剂：(1)结合的竞争性抑制剂；和(2)抑制宿主蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节宿主蛋白质(如AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)的活性的激酶。

抑制YXXΦ或二亮氨酸基序与宿主多肽等结合的一个示例性方法包括向具有病毒感染的宿主施用抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自：竞争性抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基之间结合的药剂；以及抑制蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。

用于治疗网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒等的病毒感染的宿主的一种示例性药物组合物可包含抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自：竞争性抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质之间结合的药剂，以及抑制蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。

一种示例性组合物包含抑制剂等。在一个实施方案中，所述抑制剂选自：竞争性抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质之间结合的药剂，以及抑制蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。

在一个方面，本发明提供了通过施用有效量的抑制HCV和HIV与选自AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白结合的药剂来治疗HCV-HIV同时感染的方法。在一个实施方案中，所述抑制剂抑制AAK1或GAK。在另一个实施方案中，所述药剂选自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412。在另一个实施方案中，所述药剂阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的慢病毒亚科病毒或黄病毒科病毒结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质结合。在又一个实施方案中，所述药剂抑制AAK。

在另一个方面，本发明提供了通过向需要的患者施用有效量的抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒的结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质结合的药剂来抑制除HCV以外的至少第一病毒、黄病毒科的另一种成员或慢病毒亚科的成员或其组合的感染的方法。在一个实施方案中，所述药剂抑制AAK1或GAK。在另一个实施方案中，所述药剂选自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412。

在另一个方面，本发明提供了通过使本文所述易感性病毒或病毒蛋白质与候选药剂和选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的蛋白质接触并确定所述候选药剂对病毒与宿主蛋白质结合的影响来筛选抗病毒药剂的方法。

在另一个方面，本发明提供了通过使本文所述易感性病毒与候选药剂和表达选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的蛋白质的细胞接触并确定所述候选药剂对病毒装配或出芽的影响来筛选抗病毒药剂的方法。在一个实施方案中，所述候选药剂抑制AAK1或GAK的活性。

在另一个方面，本发明提供了通过使宿主细胞与阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的宿主蛋白质结合的药剂接触来抑制宿主细胞中网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的装配或出芽的方法。在一个实施方案中，所述药剂阻断病毒结构蛋白与宿主蛋白质结合。在另一个实施方案中，所述药剂与病毒结构蛋白竞争与宿主蛋白质结合。在另一个实施方案中，所述药剂与宿主蛋白质竞争与病毒结构蛋白结合。在又一个实施方案中，所述方法包括筛选非黄病毒科病毒的AAK1和GAK抑制剂。

附图简述

以下附图形成本发明说明书的一部分，其被包含以进一步证明本发明的某些方面。参照一个或更多个这些附图并结合对本文给出的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明：

图1：示出了具有结合AP2M1的YXXΦ基序的病毒核心。(A)核心的示意图。指示了被识别的基序的位置。(B)-(C)来自典型人(B)和病毒(C)蛋白质的YXXΦ基序的共有序列。(D)所有HCV隔离种、在本研究中使用的克隆和设计的核心突变体的共有序列。(E)来自微流体芯片的荧光图像和示意图。左：AP2M1-V5-his通过其与抗His抗体的相互作用固定在装置表面并用抗V5-FITC抗体标记。中：将T7标记的核心或NS3与表面结合AP2M1一起孵育并用抗T7-Cy3抗体标记。通过MITOMI机械地捕获相互作用。在清洗后显示出表示结合病毒蛋白质的Cy3信号。右：Cy3和FITC信号重叠，表示结合病毒猎物(prey)与人诱饵(bait)的比例。F.核心-T7和NS3-T7与表面结合AP2M1的体外结合曲线。Y轴表示结合病毒蛋白质与表面结合AP2M1的比值。

图2：示出了在细胞中并且在HCV感染的背景下的病毒核心结合AP2M1。(A)PCA形式的示意图。A和B表示猎物蛋白质和诱饵蛋白质，GLuC1/2是Gaussia萤光素酶的片段。(B)利用图下方指示的质粒的组合共转染细胞，图例中具有这些指示。Y轴表示相对于核心-AP2M1信号的发光。右侧带状条表示与宿主货物蛋白(cargo protein)TFR结合的AP2M1。(C)在游离AP2M1、核心或NESI的存在下的核心-AP2M1结合。Y轴表示相对于在空白PUC19存在下核心-AP2M1结合的发光比值(在利用Gluc1-AP2M1和Gluc2-核心感染的细胞中检测的平均发光信号除以在利用Gluc1-AP2M1和空白Gluc2载体感染的对照孔中以及利用Gluc2-核心和空白Gluc1载体转染的那些中测量的平均发光)。(D)HCV感染细胞的膜中的免疫沉淀(IP)。左图：使用抗AP2M1抗体或IgG用于IP。利用抗磷酸-AP2M1、抗AP2M1、抗核心和抗肌动蛋白抗体对膜进行免疫印迹。Cal-A表示花萼海绵诱癌素-A(calyculin-A)。右图：使用抗核心抗体或IgG用于IP。利用抗核心、抗AP2M1和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。(E)利用J6/JFH HCVRNA电穿孔后3天Huh-7.5细胞中AP2M1和核心的代表性共聚焦IF显微图像。数据表示来自三个独立的一式三份实验的平均值±s.d.(误差条)(E中n＞20)。*p＜0.05，**p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。

图3：示出了介导AP2M1结合和病毒装配的核心YXXΦ基序，在功能上可与其他YXXΦ信号互换。(A)通过PCA的野生型(WT)和核心突变体与AP2M1结合。Y轴表示相对于WT核心-AP2M1结合的发光比值(在利用Gluc1-AP2M1和多种形式的Gluc2-核心转染的细胞中检测的平均发光信号除以在利用Gluc1-AP2M1和空白Gluc2载体转染的对照细胞以及利用各自Gluc2-核心和空白Gluc1载体转染的那些中测量的平均发光)。(B)在利用具有相应突变的J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔后第6小时(白色)和72小时(黑色)通过海肾萤光素酶测定的HCVRNA复制。ΔE1-E2是装配缺陷对照。GNN是复制缺陷聚合酶突变体。(C)在利用来自于电穿孔细胞的上清液感染的未经处理的(naive)Huh-7.5细胞中通过萤光素酶测定的细胞外感染性。(D)在利用来自于电穿孔细胞的澄清细胞裂解物感染的未经处理的Huh-7.5细胞中通过萤光素酶测定的细胞内感染性。(E)通过有限稀释测定测量的细胞内和细胞外感染性滴度。TCID₅₀是50％组织培养物感染剂量。(F)在电穿孔后第72小时通过qRT-PCR测量的释放到培养物上清液中的病毒RNA。(G)相对于WT对照，在电穿孔后第72小时通过ELISA确定的释放到培养物上清液中的HCV核心蛋白。(H)在具有相应突变的病毒感染的细胞制备的裂解物中通过western分析的核心蛋白的水平。示出了来自三个独立的一式三份实验的结果的平均值和s.d.(误差条)。水平虚线表示萤光素酶活性的背景水平。RLU是相对光单位。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。

图4：示出了AP2M1消耗对HCV装配的抑制。(A)在具有靶向AP2M1基因和非靶向(NT)序列的shRNA慢病毒构建体的稳定克隆中通过定量western分析的AP2M1蛋白水平。示出了代表性的膜和来自三个独立测量值的组合数据。Y轴表示相对于NT对照的AP2M1与肌动蛋白的比值。(B)相对于NT对照，在所选稳定克隆中通过qRT-PCR的AP2M1/S18RNA比值。(C)利用J6/JFH(p7-Rluc2A)对所指示的克隆电穿孔。在电穿孔后第9小时(白色)和第72小时(黑色)通过萤光素酶测定的这些克隆中HCVRNA的复制。(D)在利用来自于多个稳定细胞克隆的上清液接种的未经处理的细胞中通过萤光素酶测定测量的细胞外感染性。(E)在利用来自于电穿孔细胞的澄清细胞裂解物感染的未经处理的Huh-7.5细胞中通过萤光素酶测定的细胞内感染性。(F)通过有限稀释测定测量的细胞内和细胞外感染性。TCID₅₀是50％组织培养感染剂量。(G)在电穿孔后第72小时通过qRT-PCR测量的释放到培养物上清液中的病毒RNA。(H)在电穿孔后第72小时通过ELISA确定的释放到培养物上清液中的HCV核心。(I)在同时利用表达shAP2M1和抗性WT AP2M1cDNA(AP2M1-WT)的shRNA的慢性病毒转导的细胞中相对于NT对照的感染性病毒产生(上图)和通过western印迹分析的AP2M1蛋白的水平(下图)。示出了来自至少三个独立实验的结果的平均值和s.d.(误差条)。RLU是相对光单位。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。

图5：表明破坏核心-AP2M1结合消除了向LD招募AP2M1并改变了核心的亚细胞定位及其与E2的共定位。Huh-7.5细胞中核心和AP2M1的亚细胞定位和核心-E2共定位的定量共聚焦免疫荧光(IF)分析。(A)未经处理的Huh-7.5细胞中内源AP2M1(蓝色)和LD标记Bodipy(绿色)的代表性融合图像。(B)-(D)对核心(红色)、LD标记Bodipy(绿色)和AP2M1(蓝色)染色的利用J6/JFH HCV感染的Huh-7.5细胞的融合图像。(E)通过(A)-(D)的定量共定位分析的未经处理的(白色)或被感染(黑色)细胞中所示信号的共定位百分比。(F)四通道融合图像。插图中的黄色箭头指示核心和AP2M1向LD的共定位。(G)-(J)表示利用仅表达AP2M1-mCherry(G)或AP2M1-mCherry和WT核心(H)或核心Y136A突变体(I)的质粒转染的Huh-7.5细胞中AP2M1(红色)和脂质标记LipidTOX(蓝色)的代表性融合图像和定量共定位分析。图(H)和(I)中示出的细胞中核心表达(绿色)在各自下方的图中展示。(K)-(P)核心(红色)和(K)Bodipy(绿色)的代表性融合图像和定量共定位分析，表明与WT核心(左图)相比，在利用具有Y136A核心突变体(右图)的J6/JFH HCV RNA电穿孔的Huh-7.5细胞中核心向LD的定位提高。(L)对照(NT)细胞(左图)或者利用J6/JFH HCV RNA电穿孔的AP2M1消耗(右图)的Huh-7.5中的Bodipy(绿色)，表明在AP2M1消耗的细胞中核心大量定位在LD。(M).TGN46(绿色)，表明与WT核心(左图)相比，在利用具有Y136A核心突变(右图)的J6/JFH RNA电穿孔的Huh-7.5细胞中核心向TGN的定位降低。(N)对照(NT)细胞(左图)或者利用J6/JFH HCV RNA电穿孔的AP2M1消耗(右图)的Huh-7.5中的TGN46(绿色)，表明在AP2M1消耗的细胞中核心在TGN的定位降低。(O)E2(绿色)，表明与WT核心(左图)相比，在利用具有Y136A核心突变(右图)的J6/JFH RNA电穿孔的Huh-7.5细胞中核心和E2的共定位降低。(P)对照(NT)细胞(左图)或者利用J6/JFH HCV RNA电穿孔的AP2M1消耗(右图)的Huh-7.5中的E2(绿色)，表明在AP2M1消耗的细胞中核心和E2的共定位降低。示出了60×放大的代表性图。图表示使用Manders系数的Z叠置的定量共定位分析。值指示表示为共定位百分比(与红色强度重合的绿色强度的分数，或者在图(G)-(I)的情况下，与红色强度重合的蓝色强度的分数)平均M2值±s.d.(误差条)；n＝10至15。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。

图6：表明AAK1和GAK调节核心-AP2M1结合并参与HCV装配。(A)AP2M1与具有YXXΦ信号的宿主货物蛋白结合的调节机制。(B)通过PCA(黑色)和微流体(白色)，核心与野生型和T156A AP2M1突变体的结合。(C)-(E)利用编码WT和T156A AP2M1突变体的质粒转染Huh-7.5并在转染后第48小时利用J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔。(C)相对于WT AP2M1对照，在转染后第48小时通过基于阿尔玛蓝(alamarBlue)测定的细胞存活力。(D)在利用J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔后第6小时(黑色)和第72小时(白色)通过萤光素酶测定的过表达WT或T156AAP2M1突变体的细胞中HCV RNA的复制。(E)相对于WT对照，分别为在利用来自于所示细胞的上清液或细胞裂解物感染的未经处理的Huh-7.5细胞中通过萤光素酶测定的细胞外(黑色)和细胞内(白色)感染性。(F)-(G)利用相应siRNA转染Huh7.5细胞。(F)相对于NT序列，通过qRT-PCR的这些细胞中AAK1(左)或GAK(右)与S18RNA的比值。(G)定量western分析。数值表示相对于NT对照AAK1(上)或GAK(下)与肌动蛋白的比值。(H)在通过siRNA消耗AAK1或GAK的Huh-7.5细胞中通过PCA的核心-AP2M1结合。Y轴表示相对于NT对照的发光比值(在利用Gluc1-AP2M1和Gluc2-核心转染的细胞中检测的平均发光信号除以利用G1uc1-AP2M1和空白Gluc2载体转染的NT细胞以及利用Gluc2核心和空白Gluc1载体转染的那些中测量的平均发光)。(I)-(K)利用J6/JFH(p7-Rluc2A)对AAK1或GAK消耗的细胞电穿孔。(I)相对于NT对照，消耗的细胞中通过基于阿尔玛蓝测定的细胞存活力。(J)在电穿孔后第6小时(黑色)和第72小时(白色)通过萤光素酶测定的这些细胞中的HCV RNA复制。(K)相对于NT对照，分别为在利用来自于所示细胞的上清液或细胞裂解物感染的未经处理的Huh-7.5细胞中通过萤光素酶测定的细胞外(黑色)和细胞内(白色)感染性。(L)通过PCA的核心与AAK1和GAK结合。Y轴表示相对于核心-AP2M1结合的发光比值。数据表示来自至少两个一式三份实验的平均值和s.d.(误差条)。RLU是相对光单位。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。

图7：核心-AP2M1结合和HCV装配的药理学抑制。(A)AP2M1调节剂和所发现的抑制剂。(B)抑制剂与AAK1或GAK结合的Kd(Karaman等，Nat Biotechnol26：127-132，2008)。这些化合物影响核心-AP2M1结合的IC50，以及其影响细胞外感染性、细胞内感染性和利用细胞培养物生长HCV(HCVcc)的病毒感染的EC50。(C)通过PCA测量的化合物对核心-AP2M1结合的抑制。(D)-(G)利用厄洛替尼、舒尼替尼或PKC-412每日处理用J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔的Huh-7.5细胞，处理3天。在第72小时收集上清液和细胞裂解物并用于接种未经处理的Huh-7.5细胞。相对于未处理的对照，抑制剂对于细胞外(D)和细胞内(E)感染性的影响的剂量响应曲线。分别通过萤光素酶测定和基于阿尔玛蓝的测定，这些化合物不影响HCV RNA复制(F)或细胞存活力(G)(GNN是复制缺陷的聚合酶突变体)。(H)在利用J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔并在花萼海绵诱癌素A(Cal-A)的存在下利用化合物处理后，通过收集的细胞裂解物的western分析的抑制剂对于AP2M1磷酸化的影响。示出了利用抗磷酸-AP2M1(p-AP2M1)和抗肌动蛋白抗体印迹的典型膜以及来自3个实验的定量分析。Y轴表示相对于未处理的对照的pAP2M1/肌动蛋白比值。(I)在每天处理的72小时之后，相对于未处理的对照，HCVcc感染的细胞中抑制剂对病毒感染性(黑色)和细胞存活力(灰色)的影响。数据表示来自至少3个一式三份的实验的平均值和s.d.(误差条)。RLU是相对光单位。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。

图8：通过汇集的siRNA暂时消耗AP2M1抑制HCV装配。(A)相对于NT对照，转染后48小时在利用靶向AP2M1的四种siRNA的汇集物(ON-TARGETplusSMARTpool，Dharmacon)或者非靶向(NT)序列的汇集物转染的Huh-7.5细胞中通过qRT-PCR测量的AP2M1/S18RNA比值。(B)利用相应汇集的siRNA转染后48小时细胞中通过定量western分析的AP2M1蛋白水平。数值表示相对于NT对照AP2M1与肌动蛋白的比值。(C)相对于NT对照，在siRNA转染48小时后通过阿尔玛蓝测定的细胞生存力。(D)在利用所示汇集的siRNA转染48小时后利用J6/JFH(p7-Rluc2A)对细胞进行电穿孔。在电穿孔后第6小时(黑色)和第72小时(白色)通过萤光素酶测定的这些细胞中的HCV RNA复制。(E)分别为通过萤光素酶测定在利用源于具有所指示siRNA的电穿孔细胞的上清液或澄清细胞裂解物感染的未经处理的Huh-7.5细胞中测量的细胞外(黑色)和细胞内(白色)感染性。(F)通过有限稀释测定测量的感染性病毒产生。(G)在用来自于被siRNA暂时消耗AP2M1的Huh-7.5细胞的上清液或澄清裂解物感染和用培养物生长J6/JFH病毒(滴度：1.2×10⁵TCID₅₀/ml)感染的未经处理的Huh-7.5细胞中通过焦点形成测定(focus formation assay)测量的细胞外(黑色)和细胞内(白色)感染性。结果相对于NT对照。示出了来自至少两个独立实验的平均值±s.d.(误差条)。RLU是相对光单位。TCID₅₀是50％组织培养物感染剂量。

图9：示出AAK1和GAK的消耗或药理学上的抑制消除了TZM-b1细胞中的HIV-1复制(表达CD4和CCR5并且还包含完整的萤光素酶和大肠杆菌β-半乳糖苷酶的报道基因的CXCR4阳性HeLa细胞，所述二者报道基因都处于HIV长末端重复序列(tat基因)的控制之下)。(A)相对于NT对照，AAK1或GAK消耗的细胞中HIV的复制。(B)相对于未处理的对照，AAK1和GAK抑制剂对于HIV复制的抗病毒作用。

图10：示出了基于微流体的蛋白质-蛋白质结合测定。在该方案中示出了三个独立单元小室(微流体装置中几百个中的)。

(A)隔室和微机械阀。在控制通道和流动通道交叉处产生阀。在两个通道之间的交叉点的所得薄膜可通过液压驱动偏转。使用多路复用阀系统使得能够利用大量弹性体微阀在这些装置中执行复杂的流体操作。

(B)实验方案。表示表面结合生物素化抗组氨酸抗体(B1和B2中所示)。表示表面结合FITC标记的诱饵人蛋白质(B3中所示)。表示Cy3标记的猎物病毒蛋白质(B4和B5中所示)。1)使微流体装置与载玻片结合并对其进行了表面图案化，导致在每个单元小室中覆盖有生物素化的抗组氨酸抗体的圆形区域(见c)。2)使用体外转录/翻译(TNT)混合物从芯片表达V5-his标记的诱饵人蛋白质并且将其装载在装置中。3)这些蛋白质与表面抗his抗体结合。4)通过相同的哺乳动物体外TNT混合物在微粒体膜的存在下从芯片表达T7标记的病毒蛋白质并与FITC标记的抗V5和Cy3标记的抗T7抗体一起装载到装置中。5)关闭“夹心阀”以允许孵育病毒蛋白质和人蛋白质以及利用各自荧光抗体对其进行标记。6)然后通过“按钮膜”的驱动执行MITOMI，其有助于捕获表面结合复合物同时排出任何的溶液相分子。打开“夹心阀”，然后通过简单清洗以除去未捕获的未结合物质。7)通过阵列扫描仪扫描所述装置。检测捕获的病毒蛋白质和表面结合人蛋白质。通过测量Cy3的中值信号与FITC的中值信号来计算每一数据点结合的病毒蛋白质与表达的人蛋白质的比值(用表示，图B7中所示)。

(C)表面图案化。1)通过穿过全部流动通道的生物素化BSA溶液的流动来衍生化可接近的表面区域。2)装载亲和素溶液3)激活“按钮”膜。4)利用生物素化溶液钝化除了被按钮掩盖的60μm的圆形区域外的所有可接近的表面区域。5)打开“按钮”膜。6)装载生物素化抗his抗体的溶液其允许特异性功能化之前掩盖的圆形区域。7)体外表达的人蛋白质与覆盖离散圆形区域的生物素化抗体结合。在每一个所述步骤之后均通过PBS清洗。

图11：通过qRT-PCR测定表明核心的YXXΦ突变不影响HCV RNA复制。相对于WT对照，在利用具有相应的核心YXXΦ突变的J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔72小时后，Huh-7.5细胞中通过qRT-PCR的HCV RNA复制。ΔE1-E2是装配缺陷对照。GNN是复制缺陷聚合酶突变体。示出了来自两个独立的一式三份实验的结果的平均值和s.d.(误差条)。

图12：通过qRT-PCR测定表明AP2M1消耗对于HCV RNA复制没有影响。相对于NT对照，在利用J6/JFH(p7-Rluc2A)进行电穿孔72小时后，具有相应shRNA的Huh-7.5细胞中通过qRT-PCR的HCV RNA复制。示出了来自两个独立的一式三份实验的结果的平均值和s.d.(误差条)。

图13：表明通过汇集的siRNA暂时消耗AP2M1抑制HCV装配。(A)相对于NT对照，在利用靶向AP2M1的四种siRNA的汇集物(ON-TARGETplusSMARTpool)或者非靶向(NT)序列的汇集物转染的Huh-7.5细胞中于转染后48小时通过qRT-PCR测量的AP2M1/S18RNA比值。(B)利用相应的汇集的siRNA转染后48小时在细胞中通过定量Western分析的AP2M1蛋白水平。数值代表相对于NT对照AP2M1比肌动蛋白的蛋白质比值。(C)相对于NT对照，在siRNA转染48小时后通过阿尔玛蓝分析的细胞存活力。(D)利用所示汇集的siRNA转染48小时后利用J6/JFH(p7-Rluc2A)对细胞进行电穿孔。电穿孔后第6小时(黑色)和72小时(白色)通过萤光素酶测定的这些细胞中HCV RNA的复制。(E)分别为通过萤光素酶测定在未经处理的Huh-7.5细胞中测量细胞外(黑色)和细胞内(白色)感染性，所述细胞被用来自于具有所示siRNA的电穿孔细胞的上清液或澄清细胞裂解物感染。(F)通过有限稀释测定测量的感染性病毒产生。(G)通过焦点形成测定在用来自于被siRNA暂时消耗AP2M1的Huh-7.5细胞的上清液或澄清细胞裂解液感染和用培养物生长的J6/JFH病毒(滴度：1.2×10⁵TCID₅₀/ml)感染的未经处理的Huh-7.5细胞中测量的细胞外(黑色)和细胞内(白色)感染性。结果相对于NT对照。示出了来自至少两个独立实验的平均值±s.d.(误差条)。RLU是相对光单位。TCID₅₀是50％组织培养感染剂量。

图14：示出Y136A核心突变似乎不影响核心在HCV感染的细胞中ER膜上的定位。(A)利用培养物生长HCV感染的Huh-7.5细胞中核心在ER膜上的定位的定量共聚焦免疫荧光(IF)分析。(A)和(B)表示核心(红色)和ER标记物钙网蛋白(绿色)的融合图像，表明了在利用WT病毒(A)或具有Y136A核心突变的病毒(B)感染的Huh-7.5细胞中核心在ER膜上的可比较的部分定位。示出了60×放大的典型图。(C)使用Manders系数的Z叠置(Z stack)的共定位分析(更高的值代表更多共定位)。值指示表示为共定位百分比(与红色强度相符的绿色强度的分数)的平均M2值±s.d.(误差条)；n＝10至15。

发明详述

在极为详细地描述本公开内容之前，应理解的是，本公开内容不限于所描述的具体实施方案，当然，本发明的实施方案本身可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本公开内容的范围仅由所附权利要求限制。

如本领域技术人员在阅读本公开内容的基础上将理解的，本文描述和举例说明的每一个独立的实施方案具有离散的部分和特征，这些部分和特征可容易地分开或与任意其他数个实施方案的特征组合，而不脱离本公开内容的范围和精神。可以以所描述事件的次序或逻辑上合理的任何其他次序来实施任何所描述方法。

在详细描述本公开内容的实施方案之前，应理解的是，除非另外说明，否则本公开内容不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造过程等，因为其可以改变。还要理解，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制。在本公开内容中还可能的是，可以以逻辑上可能的不同顺序来执行步骤。如在本说明书和所述权利要求中使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则无数量词修饰形式的名词包括复数的指示物。因此，例如，提及“化合物”包括多种化合物。在本说明书和所附权利要求书中将提及若干术语，其应定义为具有以下含义，除非明显是相反含义。

定义

在所公开的主题的描述和权利要求中，将根据下文给出的定义来使用以下术语。

“黄病毒科病毒”是指黄病毒科的任意病毒，包括感染人和非人动物的那些病毒。编码这些病毒的多核苷酸和多肽序列是本领域中公知的，并且可在NCBI的GenBank数据库中找到，例如Genbank登记号NC_004102、AB031663、D11355、D11168、AJ238800、NC_001809、NC_001437、NC_004355、NC_004119、NC_003996、NC_003690、NC_003687、NC_003675、NC_003676、NC_003218、NC_001563、NC_000943、NC_003679、NC-003678、NC_003677、NC_002657、NC_002032和NC_001461，其数据库条目的内容通过引用整体并入本文。

本文使用的术语“治疗(treatment、treating和treat)”定义为利用药剂对疾病、紊乱或病症所进行的旨在减轻或缓减所述疾病、紊乱或病症和/或其症状的药理学和/或生理学作用的动作。本文使用的“治疗”涵盖对宿主(例如，哺乳动物，通常为人或兽医感兴趣的非人动物)中疾病的任何治疗，包括：(a)降低被确定为易感疾病但是尚未被诊断为受所述疾病感染的对象中出现所述疾病的风险，(b)阻止疾病的发生，和(c)减轻疾病(即，导致疾病消退)和/或减轻一种或更多种疾病症状。“治疗”还旨涵盖甚至在不存在疾病或病症的情况下递送抑制剂以提供药理学作用。例如，“治疗”涵盖递送在对象中提供提高的或期望的作用(例如，降低病原体载量、减轻疾病症状等)的疾病或病原体抑制剂。

本文使用的术语“预防性治疗”是指完全地或部分地预防疾病或其症状，和/或可以是在部分地或完全地治愈疾病和/或疾病引起的不利影响方面的治疗。

本文使用的术语“宿主”、“对象”、“患者”或“生物体”包括人和哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。可以施用本发明化合物的典型宿主将是哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人。对于兽医应用，很多种对象将是合适的，例如家畜，如牛、绵羊、山羊、牛、猪等；家禽，如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及驯化的动物，特别是宠物，例如狗和猫。对于诊断或研究应用，很多种哺乳动物可能是合适的对象，包括啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物和猪，例如近交系猪等。术语“活宿主”是指活着的上述宿主或其他生物体。术语“活宿主”是指整个宿主或生物体而不仅仅是来自活宿主离体的一部分(例如，肝或其他器官)。

术语“分离的化合物”是指与和其一起存在于自然界中的其他化合物基本分离或相对于所述其他化合物富集的化合物。分离的化合按重量计通常为至少约80％、至少90％纯、至少98％纯或至少约99％纯。本公开内容旨在包括非对映体，以及其外消旋的或拆分的对映体纯形式及其可药用盐。

本文使用的术语“单位剂型”是指适于作为单一剂量用于人和/或动物对象的物理离散单位，每一个单位包含与可药用稀释剂、载体或载剂联合的以足以产生预期效果的量计算的预定量的化合物(例如，本文中描述的抗病毒化合物)。单位剂型的规格取决于所使用的特定化合物、施用的途径和频率、待实现的效果、以及与宿主中每一种化合物相关的药物效应动力学。

“可药用赋形剂”、“可药用稀释剂”、“可药用载体”或“可药用辅料”是指可用于制备通常为安全、无毒性和生物学或其他方面期望的药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和/或辅料，包括兽医用途和/或人用药物用途可接受的赋形剂、稀释剂、载体和辅料。本说明书和权利要求书中使用的“可药用赋形剂、稀释剂、载体和/或辅料”包括一种或更多种这样的赋形剂、稀释剂、载体和辅料。

本文使用的术语“药物组合物”旨在包括适于向有此需要的对象如哺乳动物特别是人施用的组合物。通常来说，“药物组合物”是无菌的，并且优选不含能够在对象中引起不期望的响应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是药用级)。可以将药物组合物设计成通过多种不同施用途径向对象或患者施用，所述施用途径包括经口、静脉内、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、鞘内、肌内、皮下、吸入等。

本文使用的术语“治疗有效量”是指将在一定程度上减轻被治疗疾病(即，感染)的一种或更多种症状和/或将在一定程度上预防被治疗的已经发生或处于发生的危险之下的宿主的疾病(即，感染)的一种或更多种症状的被施用的药剂(其可被称为化合物、抑制剂和/或药物)的实施方案的量。

病毒是小的细胞内感染剂，其通过使用宿主细胞的机构进行复制。对于黄病毒科病毒的装配和出芽依然了解的不多，但是最近的数据表明可能包括胞内吞途径，例如丙型肝炎病毒(HCV)。宿主蛋白质参与这些过程，然而在本公开内容之前，未将参与介导晚期装配和出芽的宿主蛋白质作为抗病毒剂目标。但是，本公开内容提供了以用于晚期装配和出芽的宿主蛋白质为目标的抗病毒方法和组合物。具体地，参与内吞或分泌途径的宿主网格蛋白衔接蛋白及其调节剂是有效的靶标。以前并不知道网格蛋白衔接蛋白及其调节物在感染性黄病毒科病毒的产生中的作用。本公开内容证明宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1、AP1M1、AP3M1和AP4M1及其调节蛋白质(例如，但不限于AAK1和GAK)是抗病毒治疗的合适的靶标。此外，本公开内容提供了介导与宿主蛋白质的相互作用的新的病毒氨基酸基序。

在HCV的核心蛋白形成病毒衣壳的191个氨基酸的膜蛋白内发现了保守的YXXΦ基序(图1)。该YXXΦ基序在迄今数据库中可得的全部HCV隔离种中都是保守的。该基序也被发现于来自其他黄病毒科病毒和其他病毒的结构蛋白中。该YXXΦ基序与膜宿主货物蛋白内的YXXΦ序列分选信号一致，被网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物的μ亚基识别(图1a)。AP2M1介导网格蛋白依赖的内吞作用，通过该过程，货物蛋白被分选到网格蛋白包被的小窝中转运以与早期内体融合。已经发现AP2M1或AP1M1对逆转录病毒蛋白质中的YXXΦ或二亮氨酸基序的识别参与介导逆转录病毒的装配和出芽(图1b)(Batonick等，Virology342：190-200，2005；Camus等，Molec Biol Cell18：3193-3203，2007；Berlioz-Torrent等，J Virol73：1350-1361，1999；Byland等，Molec Biol Cell18：414-425，2007；Wyss等，J Virol75：2982-2992，2001；Ohno等，Virology238：305-315，1997；Boge等，J Bior Chem273：15773-15778，1998；Egan等，J Virol70：6547-6556，1996；Rowell等，J Immunol155：473-488，1995；Lodge等，EMBO J16：695-705，1997；Deschambeault等，J Virol73：5010-5017，1999)。但是，未研究AAK1和GAK在HIV感染中的作用，这些机制未被用作药理学靶标。因此，本公开内容提供了用于治疗或预防来自HCV、黄病毒科病毒、除HCV以外的黄病毒科病毒、HIV、除HIV以外的慢病毒亚科病毒、网格蛋白AP结合病毒、除黄病毒科病毒以外网格蛋白AP结合病毒、除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染或同时感染(如HCV/HIV同时感染)的方法和组合物。

抑制病毒YXXΦ基序和宿主衔接蛋白(例如，但不限于AP2M1)的相互作用导致降低HCV、黄病毒科病毒、除HCV以外的黄病毒科病毒、网格蛋白AP结合病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒、除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒或同时感染(如HCV/HIV同时感染)的感染性病毒的产生。此外，抑制调节网格蛋白衔接蛋白的蛋白质活性可导致降低HCV、黄病毒科病毒、除HCV以外的黄病毒科病毒、网格蛋白AP结合病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒、除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒或同时感染(如HCV/HIV同时感染)的感染性病毒的产生。因此，旨在破坏病毒YXXΦ基序与网格蛋白衔接蛋白(如AP2M1等)的相互作用的方法可用于抑制感染性病毒的产生。

许多蛋白质活性的调节通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶的作用进行。GAK和AAK1是调节AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的活性的两种蛋白激酶，表明施用蛋白激酶抑制剂(如厄洛替尼、舒尼替尼或PKC-412)可消除AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基与病毒YXXΦ或二亮氨酸基序之间的相互作用，从而抑制来自HCV、黄病毒科病毒、除HCV以外的黄病毒科病毒、网格蛋白AP结合病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒、除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒、HIV、除HIV以外的慢病毒亚科病毒的病毒感染或同时感染(如HCV/HIV同时感染)，如下文详细描述。

因此，本公开内容的实施方案提供了治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒或者劫持AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基/AAK1/GAK的任意其他包膜病毒的病毒感染的方法，用于治疗这样的病毒的感染的组合物(包含抑制剂和所述药剂与其他抗病毒治疗剂的组合)等。特别地，本发明的实施方案提供了治疗由网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒造成的感染的方法，以及用于治疗这些感染或与网格蛋白衔接蛋白如AP2M1结合或者由AAK1或GAK调节的任意其他包膜病毒的感染的组合物。

本公开内容的一些实施方案提供了预防性治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的方法，用于预防性治疗由这些病毒造成的感染的组合物(包含抑制剂和所述药剂与其他抗病毒治疗剂的组合)等。特别地，本发明的实施方案提供了用于预防性治疗HCV和/或HIV的方法，以及用于治疗HCV和/或HIV的组合物。在一个作为替代的实施方案中，本发明提供了用于治疗HCV/HIV感染或除HCV以外的黄病毒科病毒的方法。尽管本文的讨论可能针对HCV来描述本发明，但是应注意的是本公开内容不仅涉及HCV，还涉及网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒，以及用于治疗这些感染的或者与AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合或者由AAK1或GAK调节的任意其他包膜病毒或者与网格蛋白衔接蛋白如AP2M1等或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合或者由AAK1/GAK调节这种相互作用的任意其他包膜病毒的组合物。

鉴于包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质可介导与宿主蛋白质的相互作用的认识，本发明的一些实施方案提供了包含可用于治疗被黄病毒科的病毒感染的宿主的抑制剂的组合物(包括药物组合物)。特别地，所述抑制剂可用于治疗具有来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的宿主或者遭受同时感染特别是HCV和HIV或除HCV以外的黄病毒科病毒的患者。因此，两种抑制剂可用于本文：(1)抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基之间的相互作用的那些；以及(2)抑制调节宿主蛋白质的激酶活性的那些。在一些实施方案中，所述抑制剂抑制AAK1或GAK。

如在实施例中描述的，已观察到结构蛋白中的HCV YXXΦ基序与宿主蛋白质AP2M1结合。这种相互作用已被用于鉴别干扰这种相互作用的抑制剂，因此可以是临床开发用于治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的药物的候选物。

本文中描述的抑制剂可用于治疗病毒感染，其中所述病毒是包含YXXΦ基序的病毒，Y是酪氨酸残基，X是任意氨基酸，Φ是大体积疏水残基。这些可包括但不限于：苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。本文中描述的抑制剂可用于治疗病毒感染，其中所述病毒包括含有二亮氨酸基序的病毒。二亮氨酸基序可包括但不限于：亮氨酸-亮氨酸、异亮氨酸-亮氨酸、亮氨酸-异亮氨酸、[D/E]XXXL[L/I]或DXXLL(其中X是任意氨基酸)。包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒包括慢病毒亚科病毒如HIV和黄病毒科病毒等。示例性黄病毒科病毒包括但不限于：黄病毒、瘟病毒和丙型肝炎病毒。其他包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒包括：黄热病毒(YFV)；登革热病毒，包括1至4型登革热病毒；日本脑炎病毒；墨累溪谷脑炎病毒(Murray valley Encephalitis virus)；圣路易脑炎病毒(St.LouisEncephalitis)；西尼罗河病毒(West Nile virus)；蜱传脑炎病毒；丙型肝炎病毒(HCV)；昆津病毒(Kunjin virus)；中欧脑炎病毒；俄罗斯春夏脑炎病毒(Russian spring-summerencephalitis virus)；波瓦桑病毒(Powassan virus)；库阿撒鲁尔森林病病毒(KyasanurForest disease virus)；伊尔乌斯病毒(Ilheus virus)；Apoi病毒；A型和B型GB病毒；跳跃病病毒(Louping ill virus)和鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)。

在一个实施方案中，特别令人感兴趣的是用于抑制HCV复制和治疗HCV感染的抑制剂(抗HCV剂)。除HCV以外的黄病毒科病毒和除黄病毒科病毒以外的包膜病毒也是令人感兴趣的。本公开内容考虑的HCV可以是任何基因型(基因型1、2、3、4、5、6等)以及HCV基因型的亚型(例如，1a、1b、2a、2b、3a等)。由于HCV基因型1通常最难以治疗，因此用于治疗HCV基因型1和基因型1亚型的感染的本发明方法和组合物是特别令人感兴趣的。在一个实施方案中，令人感兴趣的是HCV同时感染。特别地，令人感兴趣的是HCV/HIV同时感染。

尽管以下描述引用的是HCV，但是这样的引用仅是为了清楚，而非旨在将下文更详细描述的本公开内容局限于HCV。如上文提到的，本发明的方法和组合物可应用于任何在结构蛋白中具有YXXΦ或二亮氨酸基序的任何病毒(例如，来自HCV、黄病毒科病毒、除HCV以外的黄病毒科病毒、网格蛋白AP结合病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒、除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染，同时感染(如HCV/HIV同时感染))、慢病毒亚科病毒或HIV。所述组合物和方法还可应用于同时感染以及除HCV以外的黄病毒科病毒和除黄病毒科病毒以外的包膜病毒的感染。

本公开内容还描述了鉴别调节包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质和宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基之间结合的药剂(抑制剂)的体外无细胞方法。还可在基于细胞的测定中进一步测试抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主蛋白质包括网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合的测试药剂抑制病毒复制的能力。例如，可以使目标测试药剂与具有全部或一部分HCV基因组的哺乳动物细胞接触，并可确定所述测试药剂对HCV复制的影响。合适的细胞包括允许HCV复制的哺乳动物肝细胞，例如，允许HCV的永生化人肝细胞系。例如，合适的哺乳动物细胞是Huh7肝细胞或Huh7肝细胞的亚克隆，例如Huh-7.5。合适的细胞系描述在例如Blight等(J Virol76：13001，2002)和Zhang等(J Virol78：1448，2004)中。在一个实施方案中，细胞中的HCV基因组包含报道基因，例如，编码萤光素酶、荧光蛋白或其他提供可检测信号的蛋白质的核苷酸序列；并通过检测来自报道基因的信号来确定测试药剂对HCV复制的影响(如果有的话)。其他病毒测定系统是本领域中已知的。

在一个实施方案中，测试药剂是有机部分。在该实施方案中，如在被通过引用并入本文的WO94/24314中一般描述的，测试药剂由一系列可进行化学修饰的底物合成。本文的“化学修饰”包括常规化学反应以及酶促反应。这些底物通常包括但不限于：烷基(包括烷烃、烯烃、炔烃和杂烷基)、芳基(包括芳烃和杂芳基)、醇、醚、胺、醛、酮、酸、酯、酰胺、环状化合物、杂环化合物(包括嘌呤、嘧啶、苯并二氮、β-内酰胺、四环素、头孢菌素和碳水化合物)、类固醇(包括雌激素、雄激素、可的松、蜕化素(ecodysone)等)、生物碱(包括麦角、长春花、马钱子(curare)、吡咯里西啶(pyrollizdine)和丝裂霉素)、有机金属化合物、具有杂原子的化合物、氨基酸和核苷。可在所述部分上进行化学(包括酶促)反应以形成新物质或候选药剂，其随后可使用本发明方法测试。

因此，在一些具体实施方案中，与不存在测试药剂时HCV复制的水平相比，目标测试药剂(例如，本发明抑制剂)使病毒复制被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或者更多。

特别地，本发明的一些实施方案包括以下抑制剂，与不存在所述测试药剂时包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的结合相比，所述抑制剂使包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的结合被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。

在又一个实施方案中，所述抑制剂是以下的一种，其抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合，其50％抑制浓度(IC₅₀)为约100μM至50μM、约50μM至25μM、约25μM至10μM、约10μM至5μM、约5μM至1μM、约1μM至500nM、约500nM至400nM、约400nM至300nM、约300nM至250nM、约250nM至200nM、约200nM至150nM、约150nM至100nM、约100nM至50nM、约50nM至30nM、约30nM至25nM、约25nM至20nM、约20nM至15nM、约15nM至10nM、约10nM至5nM或小于约5nM。

在又一个实施方案中，所述抑制剂抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合。在一个实施方案中，所述抑制剂抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合，其IC₅₀小于约500nM，例如，在一些实施方案中，所述抑制剂抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合，其IC₅₀为约500nM至400nM、约400nM至300nM、约300nM至250nM、约250nM至200nM、约200nM至150nM、约150nM至100nM、约100nM至50nM、约50nM至30nM、约30nM至25nM、约25nM至20nM、约20nM至15nM、约15nM至10nM、约10nM至5nM或小于约5nM。

在又一个实施方案中，当所述抑制剂与病毒感染的细胞(例如，HCV感染的肝细胞)接触时，和不与所述抑制剂接触时病毒感染细胞中病毒复制的水平相比，所述抑制剂使细胞中病毒的复制被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。

在又一个实施方案中，当所述抑制剂与病毒感染的细胞(例如，HCV感染的肝细胞)接触时，和不与所述抑制剂接触时细胞产生的感染性病毒颗粒的数量相比，所述抑制剂使被感染细胞产生的感染性病毒颗粒的数量降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。

在又一个实施方案中，除了确定测试药剂对抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的结合的影响外，还使用公知的测定如台盼蓝染料排除、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物)测定等评估测试药剂可能对活真核细胞表现出的任何细胞毒活性。不表现出显著的细胞毒活性的药剂可被认为是优选药剂用于进一步作为药物的开发。

在又一个实施方案中，当将所述抑制剂以一个或更多个剂量向本文所述受病毒感染的个体(例如，人)施用时，与不利用所述抑制剂进行治疗的个体中的病毒载量相比，所述抑制剂使所述个体中的病毒载量下降至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。

抑制剂

本公开内容的一些实施方案提供了可用于治疗受黄病毒科病毒的病毒感染的宿主的抑制剂。特别地，除HCV以外的黄病毒科病毒。特别地，所述抑制剂可用于治疗受丙型肝炎病毒感染或同时感染(特别是HCV+HIV同时感染)的宿主。所述抑制剂可以是以下组中的一种或更多种：蛋白激酶AAK1或GAK的抑制剂，其调节病毒蛋白质-网格蛋白衔接子如AP2M1(或者网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合并介导病毒装配和/或出芽。由于AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基介导多种病毒的生命周期中的多个阶段，所以抑制AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他μ亚基(例如通过抑制其调节蛋白激酶或磷酸酶)可影响或抑制多种病毒。因此，调节这些宿主蛋白质的蛋白激酶可在其他病毒科中功能相关。尽管不排除特殊情况(如大部分化合物一样)，但是与其其他靶标相比，所发现的蛋白激酶抑制剂与AAK1或GAK高亲和力地结合，并且对HCVRNA的复制没有影响，证明了其相对好的选择性。

可用做GAK和AAK1的抑制剂的其他药剂包括但不限于：与厄洛替尼、舒尼替尼或PKC-412竞争与GAK或AAK1结合的RNAi、反义、核酶或小分子。此外，能够与YXXΦ或二亮氨酸基序竞争与宿主蛋白质结合的抑制剂包括但不限于：针对YXXΦ或二亮氨酸或者抗AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的结合剂，例如抗体。此外，显性负结合蛋白质或适体可抑制GAK或AAK1。在另一个实施方案中，符合AP2M1网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的YXXΦ或二亮氨酸结合位点的诱饵受体或多肽可抑制GAK或AAK1。

本发明的一些实施方案包括抑制剂的盐。本发明的一些实施方案包括抑制剂的前药。本发明的一些实施方案包括组合物、药物组合物、液体组合物、凝胶组合物等，其每一种都包含本文鉴定的抑制剂，并且在一个实施方案中，这些组合物中的每一种都可以是控制释放或持续释放制剂的形式。在一个实施方案中，所述抑制剂可以与前述用于治疗黄病毒科病毒感染的其他药剂组合使用，任一种药剂(抑制剂和其他药剂)或两种药剂都可以是控制释放或持续释放制剂的形式。在某些情况下，术语“抑制剂”可指被称为活性剂或药物。

药物制剂和施用途径

本公开内容的一些实施方案包括本文中鉴定并且与一种或更多种可药用赋形剂、稀释剂、载体和/或辅料一起配制的一种或更多种抑制剂。此外，本发明的一些实施方案包括利用一种或更多种可药用辅助物质配制的抑制剂。特别地，可利用一种或更多种可药用赋形剂、稀释剂、载体和/或辅料配制一种或更多种抑制剂以提供本发明组合物的一个实施方案。

在一个实施方案中，所述抑制剂可与另外的抗病毒剂组合以制备本发明组合物，并且所述组合物可包含一种或更多种可药用赋形剂、稀释剂、载体和/或辅料。

在一个实施方案中，可以利用一种或更多种可药用赋形剂、稀释剂、载体和/或辅料配制抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合的抑制剂(下文称为“主题活性剂”或“药物”)。

很多种可药用赋形剂在本领域中是已知的。可药用赋形剂已经在多个出版物中被充分描述，包括例如：Gennaro(2000)，“Remington：The Science and Practice ofPharmacy”；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000)。

可药用赋形剂(例如载剂、辅料、载体或稀释剂)是公众容易获得的。此外，可药用辅助物质(如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等)是公众容易获得的。

在本公开内容的一个实施方案中，使用能够导致预期效果(例如，降低病毒载量、降低肝纤维化、提高肝功能等)的任何手段向宿主施用所述抑制剂。因此，可以将所述抑制剂引入到多种制剂中用于治疗性施用。例如，可以通过与合适的可药用载体或稀释剂组合来将所述抑制剂配制成药物组合物，以及可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。

在药用剂型中，可以以其可药用盐的形式施用所述抑制剂，或者可以单独使用或与其他药物活性化合物联合以及组合使用所述主题活性剂。以下方法和赋形剂仅是示例性的而绝不是限制性的。

对于口服制剂，可以将所述抑制剂单独使用或与合适的添加剂组合使用以制备片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，例如与常规添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与黏合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂如滑石或硬脂酸镁；以及如需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和矫味剂组合使用。

通过将所述抑制剂的一些实施方案溶解、混悬或乳化在水性或非水溶剂(如植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇)中，并且若需要与常规添加剂(如增溶剂、等张剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)一起，可将所述抑制剂的一些实施方案配制成用于注射的制剂。

可将所述抑制剂的一些实施方案应用在气雾剂制剂中以通过吸入施用。可将所述抑制剂的一些实施方案可配制到可加压的抛射剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

此外，通过与多种基质(如乳化基质或水溶性基质)混合，可将所述抑制剂的一些实施方案制备成栓剂。可将所述抑制剂的一些实施方案通过栓剂经直肠施用。所述栓剂可包含在体温下熔化而在室温下为固体的载剂，例如可可豆脂、碳蜡(carbowax)和聚乙二醇。

可提供用于经口或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位(例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂)含有预定量的组合物，所述组合物含有一种或更多种抑制剂。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可包含在作为无菌水、生理盐水或另外的可药用载体中的溶液的组合物中的抑制剂。

根据本发明，可将所述抑制剂的一些实施方案配制成可注射组合物。通常，将可注射组合物制备成液体溶液或悬液；也可制备成适合于在注射前溶解或混悬在液体载剂中的固体形式。根据本发明，所述制剂也可是乳化的或封装在脂质体载剂中的活性成分(抑制剂)。

在一个实施方案中，所述抑制剂被配制成用于通过持续递送系统递送。术语“持续递送系统”在本文中可与“受控递送系统”互换使用，并且包括与导管、注射装置等组合的持续(例如，受控)递送系统(例如，泵)，其中很多种是本领域中已知的。

机械或电动机械输注泵也可适于本公开内容使用。这样的装置的实例包括在例如美国专利No.4,692,147、4,360,019、4,487,603、4,360,019、4,725,852、5,820,589、5,643,207、6,198,966等中描述的那些。通常，可使用多种可再填充泵系统中的任意一种来完成抑制剂的递送。泵提供随时间恒定受控的释放。在一些实施方案中，抑制剂是在药物不可渗透的容器中的液体制剂，并且以持续方式向个体递送。

在一个实施方案中，药物递送系统是至少部分地可植入的装置。可使用本领域中公知的方法和装置将所述可植入装置植入在任何合适的植入部位。植入部位是对象的身体内被引入和放置药物递送装置的部位。植入部位包括但未必限于：真皮下(subdermal)、皮下、肌内或对象身体内的其他合适部位。在一些实施方案中，由于便于植入和移除药物递送装置，使用皮下植入部位。

适于在本公开内容中使用的药物释放装置可基于多种操作模式中的任一种。例如，药物释放装置可基于扩散系统、对流系统或可腐蚀系统(例如，基于腐蚀的系统)。例如，所述药物释放装置可以是电化学泵、渗透泵、电渗泵、蒸汽压力泵或渗透破裂基质，例如，其中药物被并入聚合物，伴随着被药物浸渍的聚合物材料(例如，生物可降解、药物浸染的聚合物材料)的降解，所述聚合物提供药物制剂的释放。在另一些实施方案中，所述药物释放装置基于电扩散系统、电解泵、泡腾泵、压电泵、水解系统等。

基于机械或电动机械输注泵的药物释放装置也可适于本公开内容使用。这样的装置的实例包括在例如美国专利No.4,692,147、4,360,019、4,487,603、4,360,019、4,725,852等中描述的那些。通常，可使用多种可再填充非交换泵系统中的任一种来完成主题治疗方法。通常优选泵和其他对流系统，这是因为其通常随时间更恒定受控的释放。在一些实施方案中使用渗透泵，这是因为其更恒定受控的释放和相对小尺寸的组合优点(参见例如PCT公开申请no.WO97/27840以及美国专利No.5,985,305和5,728,396)。适于本公开内容使用的示例性渗透驱动的装置包括但未必限于在以下专利中描述的那些：美国专利No.3,760,984、3,845,770、3,916,899、3,923,426、3,987,790、3,995,631、3,916,899、4,016,880、4,036,228、4,111,202、4,111,203、4,203,440、4,203,442、4,210,139、4,327,725、4,627,850、4,865,845、5,057,318、5,059,423、5,112,614、5,137,727、5,234,692、5,234,693、5,728,396等。

在一些实施方案，药物递送装置是可植入装置。可使用本领域中公知的方法和装置将所述药物递送装置植入在任何合适的植入部位。如本文提到的，植入部位是对象的身体内被引入和放置药物递送装置的部位。植入部位包括但未必限于：真皮下、皮下、肌内或对象身体内的其他合适部位。

在一些实施方案中，使用可植入药物递送系统来递送活性剂，如可编程以提供药剂的施用的系统。示例性可编程可植入系统包括可植入输注泵。示例性可植入输注泵或可用于与这样的泵连接的装置描述在例如美国专利No.4,350,155、5,443,450、5,814,019、5,976,109、6,017,328、6,171,276、6,241,704、6,464,687、6,475,180和6,512,954中。可适于本公开内容的进一步的示例性装置是Synchromed输注泵(Medtronic)。

用于所述抑制剂的合适的赋形剂载剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，若需要，所述载剂可包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂或者pH缓冲剂。制备这样的剂型的方法是本领域技术人员已知的或在考虑了本公开内容后将是明显的。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985。待施用的组合物或制剂无论如何将包含足以在被治疗对象中取得期望状态的量的抑制剂。

本发明的组合物包括含有持续释放或控制释放基质的那些。此外，可联合使用持续释放制剂的其他治疗来使用本发明的一些实施方案。本文中使用的持续释放基质是由可通过酶或酸基水解或通过溶解来降解的材料(通常是聚合物)制备的基质。一旦插入到体内，所述基质通过酶或体液起作用。持续释放基质期望地选自生物相容性材料，例如脂质体、聚乳酸(聚合乳酸)、聚乙交酯(羟基乙酸的聚合物)、乳酸乙交酯共聚物(乳酸和羟基乙酸的共聚物)、聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂质、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。举例说明性的生物可降解基质包括聚乳酸基质、聚乙交酯基质和乳酸乙交酯共聚物(乳酸和羟基乙酸的共聚物)基质。

在另一个实施方案中，在控制释放的系统中递送本公开内容的药物组合物(以及组合的组合物)。例如，可使用静脉内输注、可植入渗透泵、经皮贴剂、脂质体或其他施用模式来施用所述抑制剂。在一个实施方案中，可使用泵(Sefton1987；Buchwald等1980；Saudek等.1989)。在另一个实施方案中，使用聚合物材料。在又一个实施方案中，将控制释放系统放置在治疗靶(即，肝)附近，从而只需要全身剂量的一部分。在又一实施方案中，将控制释放系统放置在治疗靶附近，从而只需要全身剂量的一部分。另一些控制释放系统在Langer的综述(1990)中讨论。

在另一个实施方案中，本发明的组合物(以及组合的组合物分别或一起)包括通过将本文中描述的抑制剂浸入吸收性材料(如缝合线、绷带和纱布)或涂覆在固相材料(如外科钉、拉链和导管)的表面上以递送组合物所形成的那些。鉴于本公开内容，其他的此类递送系统对本领域技术人员将是明显的。

治疗方法

本发明的一些实施方案包括治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的方法。特别地，本文中描述的抑制剂可用于治疗黄病毒科病毒的病毒感染。在一个实施方案中，本公开内容提供了通过向宿主施用一个或多个剂量的治疗有效量的抑制剂以降低所述宿主中的病毒载量来治疗受上述病毒感染的宿主的方法。

本发明的一些实施方案包括预防性治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的方法。特别地，本文中描述的抑制剂可用于预防性治疗黄病毒科病毒的病毒感染。在一个实施方案中，本公开内容提供了通过向宿主施用一个或多个剂量的治疗有效量的抑制剂以降低所述宿主中的病毒载量来预防性治疗来自黄病毒科病毒的病毒感染的宿主的方法。在一个实施方案中，预防性治疗受来自黄病毒科病毒的病毒感染的宿主的方法，所述方法包括向所述宿主施用治疗有效量的抑制剂以降低所述宿主中的病毒载量。上文描述了对于克立咪唑(clemizole)和克立咪唑的剂量的其他细节。

在一个实施方案中，本文中描述的抑制剂被与另一种药剂(例如，抗病毒剂)组合使用以治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染。在一个实施方案中，本文中描述的抑制剂被与另一种药剂(例如，抗病毒剂)组合使用以预防性治疗来自黄病毒科病毒的病毒感染。所述方法的实施方案包括向有此需要的个体施用抑制包含YXXΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与宿主网格蛋白衔接蛋白如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合的一种或更多种抑制剂。在一个实施方案中，本发明提供了治疗黄病毒科病毒感染如HCV感染的方法，以及降低可能作为HCV感染的后遗症发生的肝纤维化的方法。

在一个实施方案中，所述抑制剂包括上述一种或更多种抑制剂。在多个实施方案中，所述抑制剂是调节病毒蛋白质-AP2M1结合或者病毒蛋白质与网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合以及介导病毒装配和/或出芽的蛋白激酶或者这些蛋白质的变体的抑制剂，例如AAK1或GAK的抑制剂。

在一个实施方案中，抑制剂的有效量是以下量：当以一个或更多个剂量中向有此需要的宿主(例如，人)施用时，与不用所述抑制剂治疗的个体中的病毒载量相比，其使所述个体的病毒载量下降至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％或更多。

病毒载量可通过测量血清中病毒的滴度或水平来测量。这些方法包括但不限于定量聚合酶链式反应(PCR)和支化DNA(branched DNA，bDNA)测试。已经开发了用于测量HCVRNA的病毒载量(滴度)的定量测定。许多这样的测定是商业上可得的，包括定量逆转录PCR(qRT-PCR)(Amplicor HCV Monitor.TM.，Roche Molecular Systems，New Jersey)；和支化DNA信号扩增测定[Quantiplex^TM HCV RNA Assay (bDNA)，Chiron Corp.，Emeryville，CA.]。参见例如Gretch等.(1995)。令人感兴趣的还有Chiron公司以商品名Procleix^TM出售的核酸测试(NAT)，其NAT同时检测HIV-1和HCV的存在(Vargo等.2002)。

在一些实施方案中，抑制剂的有效量是以下量：当在一个或更多个剂量中向有此需要的宿主(例如，人)施用时，与不用所述抑制剂治疗的个体中的肝功能相比，其使所述个体的肝功能提高至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％或更多。

在一些实施方案中，抑制剂的有效量是以下量：当在一个或更多个剂量中向有此需要的宿主(例如，人)施用时，与不用所述抑制剂治疗的个体中的肝纤维化的程度相比，其使所述宿主中肝纤维化降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％或更多。

本公开内容的实施方案提供了可用于治疗患有来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的患者的方法、抑制剂和药物制剂。在一个实施方案中，所述患者被除HCV以外的黄病毒科病毒同时感染。在一个实施方案中，所述患者被HCV感染，但是未知是否被另外的病毒感染，所述另外的病毒包括但不限于HIV。在另一个实施方案中，患者被HCV和一种或更多种另外的病毒感染，所述另外的病毒包括但不限于HIV。在一个实施方案中，仅通过施用单种本文中描述的可用作于治疗HCV感染的抑制剂来治疗患者的病毒感染。在另一个实施方案中，通过施用本文中描述的可用作于治疗HCV感染的抑制剂和已知可用于治疗病毒感染的一种或更多种另外的药剂二者来治疗患者的病毒感染，所述另外的药剂包括但不限于用于治疗HIV的药物，例如Atripla、Complera、双汰芝(Combivir)、立妥威(Retrovir)、特鲁瓦达(Truvada)、奈非那韦(Viracept)、恩夫韦地(Fuzeon)、马拉维若(Selzentry)、拉替拉韦(Isentress)等。在一个实施方案中，所述一种或更多种另外的药剂不包括CCR-5拮抗剂。在另一个实施方案中，所述一种或更多种另外的药剂不包括CCR-5拮抗剂，所述患者被HCV感染，但是不知是否被HIV感染(或未感染)。

剂量

可以在一个或更多个剂量中向宿主施用抑制剂的一些实施方案。在一个实施方案中，可以以每剂量约10mg至1000mg的量施用所述抑制剂，例如每剂量约10mg至20mg、约20mg至25mg、约25mg至50mg、约50mg至75mg、约75mg至100mg、约100mg至125mg、约125mg至150mg、约150mg至175mg、约175mg至200mg、约200mg至225mg、约225mg至250mg、约250mg至300mg、约300mg至350mg、约350mg至400mg、约400mg至450mg、约450mg至500mg、约500mg至750mg或约750mg至1000mg。

在一个实施方案中，在每一体重基位确定每个剂量的抑制剂的量。例如，在一个实施方案中，可以施用约0.5mg/kg至100mg/kg的量的抑制剂，例如约0.5mg/kg至1mg/kg、约1mg/kg至2mg/kg、约2mg/kg至3mg/kg、约3mg/kg至5mg/kg、约5mg/kg至7mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至15mg/kg、约15mg/kg至20mg/kg、约20mg/kg至25mg/kg、约25mg/kg至30mg/kg、约30mg/kg至40mg/kg、约40mg/kg至50mg/kg、约50mg/kg至60mg/kg、约60mg/kg至70mg/kg、约70mg/kg至80mg/kg、约80mg/kg至90mg/kg、或约90mg/kg至100mg/kg，或者超过约100mg/kg。

本领域技术人员将容易地理解，可作为根据所施用的特定抑制剂、症状的严重程度和对象对副作用的敏感性的函数来改变剂量水平。本领域技术人员可通过多种方式容易地确定给定化合物的优选剂量。

在一个实施方案中，施用多剂量抑制剂。可根据多种因素(例如，症状的严重程度等)中的任一种来改变抑制剂的施用频率。例如，在一个实施方案中，每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)或每天三次(tid)地使用施用抑制剂。如上文讨论的，在一个实施方案中，持续施用所述抑制剂。

可根据多种因素(例如，患者响应等)中的任一种改变施用抑制剂的持续时间(例如，施用抑制剂的一段时间)。例如，可施用抑制剂约1天至1周、约2周至4周、约1个月至2个月、约2个月至4个月、约4个月至6个月、约6个月至8个月、约8个月至1年、约1年至2年、或约2年至4年或更久的一段时间。

施用途径

本发明的一些实施方案提供了用于使用任何可利用方法和适合于药物递送的途径来向宿主(例如，人)施用抑制剂的方法和组合物，包括体内和离体方法以及系统的和局部的施用途径。

施用途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部施用、静脉内、经直肠、经鼻、经口以及其他经肠和肠胃外施用途径。可根据药剂和/或期望的效果组合(若需要)或调节施用途径。可以单剂量或多剂量施用活性剂。

可使用可利用的常规方法和适于递送常规药物的途径(包括全身的或局部的途径)向宿主施用抑制剂的一些实施方案。通常，本公开内容预期的施用途径包括但不限于经肠、肠胃外或吸入途径。

吸入施用以外的肠胃外施用途径包括但不限于：局部、经皮、皮下、肌内、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内和静脉内途径，即，除了通过消化道以外的任何施用途径。可进行肠胃外施用以有效地全身或局部递送抑制剂。当需要全身递送时，施用通常包括侵入性或系统性吸收的局部或黏膜施用药物制剂。

也可以通过肠内施用向对象递送抑制剂。肠内施用途径包括但不限于经口和直肠(例如，使用栓剂)递送。

通过皮肤或黏膜施用抑制剂的方法包括但不限于：局部施用适当的药物制剂、经皮传递、注射和表皮施用。对于经皮传递，吸收促进剂或离子电渗疗法(iontophoresis)是合适的方法。离子电渗传递可使用市售“贴剂”完成，其通过在数天或更久的时期内穿过未破损皮肤的电脉冲递送其产品。

组合治疗

本发明的一些实施方案包括用于治疗病毒感染的方法、抑制剂和药物制剂。可用在本公开内容的方法中的抑制剂和药物制剂的一些实施方案可与其他抗病毒剂组合使用以治疗病毒感染。在一个实施方案中，根据本发明的方法，将用于治疗来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的抑制剂与一种或更多种其他抗病毒剂组合使用以治疗感染。在一个实施方案中，根据本发明的方法，也将阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂(本文也称为“HCV YXXΦ或二亮氨酸拮抗剂”)与一种或更多种其他抗病毒剂组合使用以治疗感染。

例如，当前治疗HCV感染的医疗实践通常使用与利巴韦林(Rebetol或Copegus)或干扰素-α(例如，干扰素α2b)或聚乙二醇化干扰素(例如，由Roche出售的Pegasys，或由Schering Plough出售的PEG-Intron)和蛋白酶抑制剂的组合治疗。根据本公开内容的方法，可将抑制性化合物与这些标准治疗组合使用以治疗HCV感染。

若干HCV蛋白酶和聚合酶抑制剂被批准或正在开发用于治疗HCV感染，并且根据本公开内容的方法，共施用阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂和HCV蛋白酶抑制剂可有效治疗HCV。在一个实施方案中，在这种组合治疗中也使用干扰素α和/或核苷类似物如利巴韦林。合适的HCV蛋白酶抑制剂包括但不限于：特拉匹韦(VX-950，Vertex)、BILN2061和BI12202(Boehringer Ingelheim)、波西普韦(SCH503034，Schering Plough)、ITMN191(Roche/InterMune/Array BioPharma)、MK-7009(Merck)、TMC435350(Tibotec/Medivir)、ACH-1095和ACH-806(Achillion/Gilead)以及NS3/NS4A蛋白酶的其他抑制剂，包括但不限于由Presidio开发的化合物。

根据本公开内容的方法，共施用阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂和HCV RNA聚合酶抑制剂可有效治疗HCV。在一个实施方案中，在这种组合治疗中也使用干扰素α和/或核苷类似物如利巴韦林和/或HCV蛋白酶抑制剂。合适的HCV RNA聚合酶抑制剂包括但不限于：瓦洛他滨(valopicitabine)(NM283，Idenix/Novartis)、HCV-796(Wyeth/ViroPharma)、R1626(Roche)、R7128(Roche/Pharmasset)、GS-9190(Gilead)、MK-0608(Merck)、PSI-6130(Pharmasset)和PFE-868，554(PFE)。在一个实施方案中，所述方法提供了与抑制AAK1和GAK的药剂的组合治疗。

正在开发若干toll样受体(TLR)激动剂以治疗HCV感染，并且根据本公开内容的方法，共施用阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的YXXΦ或二亮氨酸拮抗剂和TLR激动剂可有效治疗HCV。在一个实施方案中，在这种组合治疗中也使用干扰素α和/或核苷类似物如利巴韦林和/或HCV蛋白酶抑制剂和/或HCV RNA聚合酶抑制剂。合适的TLR激动剂包括但不限于：TLR7激动剂[即，ANA245和ANA975(Anadys/Novartis)]和TLR9激动剂[即，Actilon(Coley)和IMO-2125(Idera)]。

正在开发若干噻唑烷(thiazolide)衍生物以治疗HCV感染，并且根据本公开内容的方法，共施用阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的拮抗剂和噻唑烷可有效治疗HCV，所述噻唑烷包括但不限于硝唑尼特(Nitazoxanide，Alinia，或者硝唑尼特或其他噻唑烷的其他持续释放制剂，Romark Laboratories)。在一个实施方案中，在这种组合治疗中也使用干扰素α和/或核苷类似物如利巴韦林和/或HCV蛋白酶抑制剂和/或HCV RNA聚合酶抑制剂和/或TLR激动剂。

在本公开内容方法的另一个实施方案中，共施用阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂和亲环蛋白(cyclophilin)抑制剂[即，NIM-811(Novartis)和DEBIO-025(Debiopharm)]和/或α-葡萄糖苷酶抑制剂[即，Celgosivir(Migenix)]和/或来自本文讨论的一种或更多种其他类型的HCV治疗剂的一种或更多种药剂被用于治疗HCV感染。

可与本公开内容的阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂组合使用的其他药剂包括：(i)靶向NS5A的药剂，包括但不限于：A-831(Arrow Therapeutics)、AZD2836(AstraZeneca)以及由XTL/Presidio或BMS正在开发的药剂(参见PCT公开WO2006/133326和WO2008/021928，其通过引用并入本文)；(ii)靶向TBC1D20和/或NS5A与TBC1D20的相互作用的药剂(参见PCT公开WO2007/018692和美国专利申请序列号11/844,993，其通过引用并入本文)；(iii)靶向NS4B的GTP酶活性的药剂(参见PCT公开WO2005/032329和美国专利申请公开2006/0199174，其通过引用并入本文)；(iv)抑制由HCV两亲性螺旋介导的膜缔合的药剂，例如见于NS5A、NS4B和NS5B中的那些(参见PCT公开WO2002/089731，同上)；(v)靶向HCV蛋白质中的PIP2或BAAPP结构域的药剂，例如见于NS4B和NS5A中的那些(参见美国临时专利申请60/057,188，同上)；(vi)靶向HCV进入、装配或释放的药剂，包括共受体的抗体；(vii)靶向HCV NS3解链酶的药剂；(viii)靶向HCV中的序列的siRNA、shRNA、逆转录RNA或其他RNA基分子；(ix)靶向微RNA122或其他介导HCV复制的微RNA的药剂；(x)靶向PD-1、PD-L1或PD-L2相互作用或途径的药剂(参见美国专利申请公开2008/0118511、2007/0065427、2007/0122378，其通过引用并入本文)；以及(xi)靶向HCV两亲性螺旋功能的药剂，例如AH2抑制剂。

在本公开内容的另一个实施方案中，将阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂与能够治疗HIV感染的一种或更多种药物组合使用以治疗被HIV和HCV同时感染的患者。在本公开内容的另一个实施方案中，将阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂与能够治疗HBV感染的一种或更多种药物组合使用以治疗被HBV和HCV同时感染的患者。在一个实施方案中，将阻止包含YXXΦ或二亮氨酸基序的至少一种病毒蛋白质与宿主蛋白质(如AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基)结合的抑制剂与PD-L1抑制剂组合使用以治疗病毒感染。

如上所述，本发明的一些实施方案包括结合至少一种另外的治疗剂来施用本文中鉴定(或通过使用本发明的筛选的一个实施方案)的抑制剂以治疗病毒感染。合适的另外的治疗剂包括但不限于：利巴韦林、核苷类似物(例如，levovirin、viramidine等)、NS3抑制剂、NS5抑制剂、干扰素和副作用管理剂(side effect management agent)。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的合适的治疗剂包括利巴韦林。利巴韦林(1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)可得自ICN Pharmaceuticals，Inc.，CostaMesa，Calif.，描述于Merck Index，化合物No.8199，第11版。其制造和配制描述于美国专利No.4,211,771中。本公开内容还考虑使用利巴韦林的衍生物(参见，例如美国专利No.6,277,830)。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的合适的治疗剂包括Levovirin。Levovirin是利巴韦林的L对映体，并且表现出增强Th1免疫应答超过Th2免疫应答的特性。Levovirin由ICN Pharmaceuticals制造。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的合适的治疗剂包括viramidine。Viramidine是利巴韦林的3-甲脒衍生物，并且用作利巴韦林的前药。其通过腺苷脱氨酶有效地转变成利巴韦林。

适于在组合治疗中使用的核苷类似物包括但不限于：利巴韦林、levovirin、viramidine、isatoribine、在美国专利No.5,559,101中公开并被美国专利No.5,559,101中的式I涵盖的L-呋喃核糖基核苷(例如，1-β-L-呋喃核糖基尿嘧啶、1-β-L-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶、1-β-L-呋喃核糖基胞嘧啶、9-β-L-呋喃核糖基腺嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基次黄嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基鸟嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基-6-硫代鸟嘌呤、2-氨基-α-L-呋喃核糖基[1′，2′：4，5]唑啉、O₂，O₂-脱水-1-α-L-呋喃核糖基尿嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基尿嘧啶、1-(2，3，5-三-O-苯甲酰-α-呋喃核糖基)-4-硫代尿嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基胞嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基-4-硫代尿嘧啶、1-α-L-呋喃核糖基-5-氟尿嘧啶、2-氨基-β-L-阿糖呋喃并[1′，2′：4，5]唑啉、O₂，O₂-脱水-β-L-阿糖呋喃基脲嘧啶、2′-脱氧-β-L-尿苷、3′5′-二-O-苯甲酰-2′脱氧-4-硫代β-L-尿苷、2′-脱氧-β-L-胞苷、2′-脱氧-β-L-4-硫代尿苷、2′-脱氧-β-L-胸苷、2′-脱氧-β-L-5-氟尿苷、2′，3′-双脱氧-β-L-尿苷、2′-脱氧-β-L-5-氟尿苷和2′-脱氧-β-L-肌苷)；在美国专利No.6,423,695中公开并被美国专利No.6,423,695中的式I涵盖的化合物；在美国专利公开No.2002/0058635中公开并被美国专利公开No.2002/0058635中的式I涵盖的化合物；在WO01/90121A2(Idenix)中公开的核苷类似物；在WO02/069903A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc.)中公开的核苷类似物；在WO02/057287A2或WO02/057425A2(二者均为Merck/Isis)中公开的核苷类似物等。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的合适的治疗剂可包括HCV NS3抑制剂。合适的HCV非结构蛋白3(NS3)抑制剂包括但不限于：在美国专利No.6,642,204、6,534,523、6,420,380、6,410,531、6,329,417、6,329,379和6,323,180(Boeh ringer-Ingelheim)中公开的三肽；在美国专利No.6，143,715(Boehringer-Ingelheim)中公开的化合物；在美国专利No.6,608,027(Boehringer-Ingelheim)中公开的大环化合物；在美国专利No.6,617,309、6,608,067和6,265,380(Vertex Pharmaceuticals)中公开的NS3抑制剂；在美国专利No.6,624,290(Schering)中公开的氮杂肽化合物；在美国专利No.5,990,276(Schering)中公开的化合物；在Pause等(2003)中公开的化合物；NS3抑制剂BILN2061(Boehringer-Ingelheim；Lamarre等(2002)和Lamarre等(2003)；NS3抑制剂VX-950(VertexPharmaceuticals；Kwong等(2003)；NS3抑制剂SCH6(Abib等(2003))；美国肝病研究协会第54届年会的大纲和摘要(AASLD，2003)；在WO99/07733、WO99/07734、WO00/09558、WO00/09543、WO00/59929或WO02/060926中公开的任何NS3蛋白酶抑制剂(例如，在WO02/060926中第224-226页的表中公开的化合物2、3、5、6、8、10、11、18、19、29、30、31、32、33、37、38、55、59、71、91、103、104、105、112、113、114、115、116、120、122、123、124、125、126和127)；在美国专利公开No.2003/019067、2003/0187018和2003/0186895中任一个专利中公开的NS3蛋白酶抑制剂等。

在一个实施方案中，用在本发明的组合治疗中的NS3抑制剂是一类特殊NS3抑制剂中的成员，例如抑制NS3丝氨酸蛋白酶活性但是对于其他丝氨酸蛋白酶(如人白细胞弹性蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶或牛胰糜蛋白酶)或者半胱氨酸蛋白酶(如人肝组织蛋白酶)不表现出显著抑制活性的NS3抑制剂。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的合适的治疗剂包括NS5B抑制剂。合适的HCV非结构蛋白5(NS5；RNA依赖型RNA聚合酶)抑制剂包括但不限于：在美国专利No.6,479,508(Boehringer-Ingelheim)中公开的化合物；在国际专利申请No.PCT/CA02/01127、PCT/CA02/01128和PCT/CA02/01129中任一个中公开的化合物，其全部由Boehringer Ingelheim在2002年7月18日提交；在美国专利No.6,440,985(ViroPharma)中公开的化合物；在WO01/47883(Japan Tobacco)中公开的化合物，例如JTK-003；在Zhong等(2003)中共公开的二核苷酸类似物；在Dhanak等(2002)中公开的苯并噻二嗪化合物；在WO02/100846A1或WO02/100851A2(二者均为Shire)中公开的NS5B抑制剂；在WO01/85172A1或WO02/098424A1(二者均为Glaxo SmithKline)中公开的NS5B抑制剂；在WO00/06529或WO02/06246A1(二者均为Merck)中公开的NS5B抑制剂；在WO03/000254(Japan Tobacco)中公开的NS5B抑制剂；在EP1256,628A2(Agouron)、JTK-002(Japan Tobacco)、JTK-109(Japan Tobacco)中公开的NS5B抑制剂等。

在一个实施方案中，用在本发明的组合治疗中的NS5抑制剂是一类特殊NS5抑制剂中的成员，例如抑制NS5RNA依赖型RNA聚合酶但是对其他RNA依赖型RNA聚合酶和DNA依赖型RNA聚合酶没有显著的抑制作用的NS5抑制剂。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是干扰素，例如干扰素-α(IFN-α)。可在本发明治疗方法中使用任何已知的IFN-α。本文使用的术语“扰素-α”是指抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答的相关多肽的家族。术语“IFN-α”包括天然的IFN-α；合成的IFN-α；衍生化的IFN-α(例如，PEG化IFN-α、糖基化IFN-α等)；以及天然的或合成的IFN-α的类似物；基本上任何具有抗病毒性质的IFN-α，如对于天然的IFN-α所描述的。

合适的α干扰素包括但不限于：天然的IFN-α(包括但不限于天然的IFN-α2a、IFN-α2b)；重组干扰素α-2b，例如可得自Schering Corporation，Kenilworth，N.J.的Intron-A干扰素；重组干扰素α-2a，例如可得自Hoffmann-La Roch，Nutley，N.J.的Roferon干扰素；重组干扰素α-2C，例如可得自Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.的Berofor α2干扰素；干扰素α-n1，其为天然α干扰素纯的共混物，例如可得自Sumitomo，Japan的Sumiferon或可得自Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain的Wellferon干扰素α-n1(INS)；以及干扰素α-n3，其为由Interferon Sciences制备并且以Alferon商品名得自Purdue Frederick Co.，Norwalk，Conn.的天然α干扰素的混合物。

术语“IFN-α”还包括复合IFN-α。复合IFN-α(也称为“CIFN”和“IFN-con”以及“复合干扰素(consensus interferon)”)包括但不限于：标记为IFN-con₁、IFN-con₂和IFN-con₃的氨基酸序列，其公开于美国专利No.4,695,623和4,897,471；以及通过确定天然的干扰素α的复合限定的复合干扰素(例如，Infergen.RTM.，InterMune，Inc.，Brisbane，CA.)。IFN-con₁是Infergen^TM alfacon-1产品中的复合干扰素剂。The Infergen^TM复合干扰素产品在本文中通过其商品名(Infergen^TM)或其通用名(干扰素alfacon-1)提及。编码IFN-con的DNA序列如前述专利中的描述或其他标准方法合成。在一个实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是CIFN。

在一个实施方案中，也可在本发明的组合治疗中使用包含IFN-α和异源多肽的融合多肽。合适的IFN-α融合多肽包括但不限于Albuferon-α^TM[人白蛋白和IFN-α的融合产物；Human Genome Sciences；参见例如Osborn等(2002)]。同样适合于在本公开内容中使用的是基因改组形式(gene-shuffled form)的IFN-α。参见例如Masci等(2003)。其他合适的干扰素包括Multiferon(Viragen)、Medusa干扰素(Flamel Technology)、Locteron(Octopus)和Omega干扰素(Intarcia/Boehringer Ingelheim)。

术语“IFN-α”还涵盖IFN-α的衍生物，其被衍生(例如，相对与天然的肽进行化学改性)以改变某些性质，例如血清半衰期。因此，术语“IFN-α”包括糖基化IFN-α；利用聚乙二醇衍生化的IFN-α(“PEG化IFN-α”，)等。PEG化IFN-α及其制备方法在例如美国专利No.5,382,657、5,981,709和5,951,974中讨论。PEG化IFN-α包括PEG与任意上述IFN-α分子的缀合物，包括但不限于：PEG与干扰素α-2a(Roferon，Hoffman La-Roche，Nutley，N.J.)、干扰素α2b(Intron，Schering-Plough，Madison，N.J.)、干扰素α-2c(Berofor A，BoehringerIngelheim，Ingelheim，Germany)和复合干扰素缀合，如通过确定天然的干扰素的共有序列定义的复合干扰素(Infergen^TM，InterMune，Inc.，Brisbane，CA)。

在一个实施方案中，可利用一种或更多种聚乙二醇部分对IFN-α多肽进行修饰，即PEG化。PEG化IFN-α多肽的PEG分子与IFN-α多肽的一个或更多个氨基酸侧链缀合。在一个实施方案中，PEG化IFN-α仅在一个氨基酸上含有PEG部分。在另一个实施方案中，PEG化IFN-α在两个或更多个氨基酸上含有PEG部分，例如，IFN-α含有附接于2、3、、4、5、6、7、8、9或10个不同的案基酸残基的PEG部分。IFN-α可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联(即，没有连接基团)。

为了确定抑制剂如PKC-412、厄洛替尼、舒尼替尼等与其他抗HCV剂的最优组合，可在多种抗HCV剂的不同组合的存在下进行HCV复制试验和/或动物研究。在另外的药剂的存在下对复制的抑制提高(高于在单一疗法中观察到的)证明组合治疗的潜在益处。

例如，HCV复制测定在PKC-412、厄洛替尼、舒尼替尼等的不同组合的存在下使用与萤光素酶报道基因连接的HCV基因。在这样的试验中，萤光素酶活性与HCV RNA基因组的复制成正比。

在一个实施方案中，可在本发明的治疗方法中使用副作用管理剂，这些包括：对疼痛管理有效的药剂；改善胃肠道不适的药剂；止痛剂、抗炎剂、抗精神病剂、抗神经过敏剂、抗焦虑剂和造血剂。此外，本发明的一些实施方案考虑使用任何化合物用于遭受疼痛或在利用主题疗法治疗的过程中的其他任何副作用的患者的姑息疗法。示例性姑息剂包括对乙酰氨基酚、布洛芬、其他NSAID、H2阻断剂和抗酸剂。在一个实施方案中，本公开内容提供了利用抑制GAK的药剂和抑制AAK1的药剂治疗的方法。在一个实施方案中，这样的共治疗提供协同作用，例如抗病毒作用。

适合于治疗的宿主

适合于利用所述抑制剂的一个实施方案或所述方法的一个实施方案治疗的宿主包括具有来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染(如HCV/HIV同时感染)、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的病毒感染的宿主。如本文使用的，术语黄病毒科病毒包括黄病毒科的任何成员，包括但不限于：登革热病毒，包括登革热病毒1、登革热病毒2、登革热病毒3、登革热病毒(参见例如GenBank登记号M23027、M19197、A34774和M14931)；黄热病毒；西尼罗河病毒；日本脑炎病毒；圣路易脑炎病毒；牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；和丙型肝炎病毒(HCV)；以及任意前述病毒的任意血清型、毒株、基因型、亚型、准种(quasispecies)或隔离种。当黄病毒科病毒是HCV时，所述HCV是若干基因型、亚型或准种中的任一种，包括例如基因型1(包括1a和1b)、2、3、4、6等以及亚型(例如，2a、2b、3a、4a、4c等)和准种。

适合于利用本发明的一些实施方案治疗的宿主包括治疗失败患者。本文使用的术语“治疗失败患者”(或“治疗失败者”)通常是指对之前对于HCV的治疗无应答的HCV感染患者(称为“无应答者”)或者对于之前的治疗初始应答但是治疗应答不持续的HCV感染患者(称为“复发者”)。之前的治疗通常可包括利用除了本公开内容的抑制剂以外的任意抗病毒剂进行的治疗。

适合于利用本公开内容的一些实施方案治疗的宿主包括已经被临床诊断为感染了HCV的个体。可通过检测其血液中的HCV RNA和/或其血清中具有抗HCV抗体来识别感染了HCV的个体。

被临床诊断为感染了HCV的个体包括未经治疗的个体(例如，之前未进行HCV治疗的个体)。

适合于利用本公开内容的一些实施方案治疗的宿主包括具有任何可检测HCV滴度的个体。所述患者可感染了任何HCV基因型(基因型1(包括1a和1b)、2、3、4、6等和亚型(例如，2a、2b、3a等))，特别是难以治疗的基因型，例如HCV基因型1以及特定的HCV亚型和准种。

同样适合于治疗的是因慢性HCV感染表现出严重的纤维化或早期肝硬化(非失代偿性，Child′s-Pugh类型A或更低)或者更晚期的肝硬化(失代偿性，Child′s-Pugh类型B或C)的HCV阳性宿主(如上所述)，以及尽管之前进行了抗病毒治疗的病毒携带者或者无法利用已知的抗病毒剂治疗的宿主。

在一个实施方案中，根据本领域中已知的METAVIR评分系统为阶段3或4的肝纤维化的HCV阳性宿主适合于利用本公开内容的方法进行治疗。在另一个实施方案中，适合于利用本公开内容的一些实施方案治疗的宿主是具有失代偿期肝硬化的患者，其临床表现包括患者具有重度肝硬化，包括等待肝移植的那些。在另一个实施方案中，适合于利用本公开内容的一些实施方案治疗的宿主包括具有轻度纤维化的患者，包括具有早期纤维化的那些(METAVIR、Ludwig和Scheuer评分系统中阶段1和2；或者在Ishak评分系统中的阶段1、2或3，其全部是本领域中已知的)。在一个实施方案中，所述方法可用于治疗肝移植后HCV，HCV诱发的肝细胞癌。在一个实施方案中，这用于预防移植物再感染。

在本公开内容的一个实施方案中，为了帮助优化选择最有可能从治疗受益的患者以及监控治疗的有效性(尤其是面对潜在的抗药性突变病毒)，使用本发明提供的合适的诊断测试可能很有益处。例如，评价在给定患者中发现的特定病毒对于预期治疗的敏感性可有助于确定候选患者和相应的合适的治疗之间的最佳匹配。

在一个实施方案中，所述方法提供了对感染本文所述病毒的患者的治疗，特别是患有癌症(如肝癌)的感染HCV的患者。

测定

本公开内容还提供了筛选抗病毒剂的体外和基于细胞的方法。在一个实施方案中，本公开内容提供了用于检测YXXΦ模体与宿主蛋白质之间的相互作用的方法。在一个实施方案中，本公开内容提供结合测定以检测抑制YXXΦ或二亮氨酸基序与AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基结合的蛋白质或药剂。例如，本公开内容提供了以下方法，在所述方法中，本文所述候选药剂与黄病毒科病毒和AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基接触。如本领域中已知的，检测黄病毒科病毒与蛋白质的结合。相对于对照在候选药剂的存在下活性降低表明确认为结合抑制剂。在另一个实施方案中，使用基于细胞的结合测定。在另一个实施方案中，使用细胞测定来筛选对病毒装配或出芽的作用。在该实施方案中，使候选药剂与黄病毒科病毒和表达AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他μ亚基的细胞接触。可通过本领域中的已知方法检测细胞效应，例如病毒出芽或装配，或者黄病毒科病毒与细胞之间的结合。在一个实施方案中，使用复制测定。美国专利申请公开201I/0052536A1概括了复制测定的一个实例，其明确地通过引用并入本文。相对于对照，在候选药剂的存在下病毒的结合、出芽或装配的降低表明确定为结合抑制剂或抗病毒剂。在一些实施方案中，使用本领域中已知的体外微流体亲和测定来检测弱的和瞬时的蛋白质相互作用。

在一个实施方案中，使用如本文描述并且本领域中已知的蛋白质片段互补测定来验证核心与AP2M1之间的相互作用。在另一个实施方案中，使用免疫共沉淀来确定蛋白质之间的相互作用。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案并给出对本公开内容原理的清楚理解。本领域技术人员应理解的是，在本发明人发现的代表性技术之后，由实施例中公开的技术在本发明的实践中运行良好，因此被认为是用于其实践的优选模式。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应理解的是，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，其依然获得相同或相似的结果，并且不脱离本发明的理念、精神和范围。更具体地，应理解，可以使用某些在化学上和生理上均相关的药剂替代本文中描述的药剂，同时可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的是，所有这些类似替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和理念内。

可对本公开内容的上述实施方案进行许多改变和修改，而基本不脱离本公开内容的精神和原理。所有的这些修改和改变旨在包含在本文的本公开内容的范围内。

实施例1：HCV核心中YXXΦ基序的鉴定

对HCV核心蛋白的一级序列的检查揭示了蛋白质的第二结构域(D2)内的保守YIP(V/L)基序(图1A，D)。该基序符合由AP2M1识别的YXXΦ分选信号共有序列(Ohno，J CellSci119：3719-3721，2006；Nakatsu等，Cell Struct Funct28：419-429，2003；Owen等，AnnRev Cell Devel Biol20：153-191，2004)。

核心结合AP2M1

利用网格蛋白衔接子和内吞组分的分选信号的相互作用通常较弱(结合Kd在μM范围)、瞬时(Nakatsu等，Cell Struct Funct28：419-429，2003；Aguilar等，JBiol Chem276：13145-13152，2001)并且包括膜蛋白，因此难以通过标准技术研究(Cusick等，Hum MolGenet2005；Bailer Curr Opin Microbiol12：453-459，2009)。为了检测HCV核心是否结合AP2M1，使用克服了这些挑战的蛋白质组学平台。体外微流体亲和测定以分子间相互作用的机械捕获(MITOMI)为基础，其消除了当前平台面临的解离率(off-rate)问题，从而允许以纳升蛋白质消耗研究弱的且瞬时的相互作用(Maerkl等，Science315：233-237，2007；Einav等，Nat Biotech26：1019-1027，2008；Gerber等，Nat Meth6：71-74，2009)。使用能够高保真度分析蛋白质-蛋白质相互作用(P-PI)的微流体形式(Gerber等，Nat Meth6：71-74，2009)。基本如描述(Maerkl等，Science315：233-237，2007；Einav等，Nat Biotech26：1019-1027，2008；Gerber等，Nat Meth6：71-74，2009)进行在微粒体膜的存在下的体外蛋白质表达以及利用MITOMI的结合实验(图9)。这些测定检测AP2M1与核心的结合。结合的程度与核心浓度的提高相关(图1F)。AP2M1与对照HCV蛋白质NS3的背景结合低4-20倍，并且不随着蛋白质浓度的提高而显著提高。

为了确定在细胞中是否发生核心-AP2M1相互作用，使用基于Gaussia princeps萤光素酶报道子的可逆重构的蛋白质片段互补测定(protein-fragment complementationassay，PCA)(图2A)。当前形式对于改善的信号是最佳的，因此提供了用于测量挑战性P-PI的高灵敏度方法(Cassonnet等，Nat Meth8：990-992，2011)。在利用编码与猎物和诱饵蛋白质融合的两个报道基因片段(GLuc1-AP2M1和GLuc2-核心)的质粒共转染的Huh-7.5细胞中检测到显著的萤光素酶信号。在利用GLuc1-AP2M1或GLuc2-核心构建体和空白互补(reciprocal)载体(两个空白GLuc载体或者与三个无关蛋白质(SPIRE、RAC1和ARPC)融合的GLuc1)共转染的细胞中检测结合的背景水平。AP2M1与核心的表观亲和力比运铁蛋白受体(TFR)高，其为被AP2M1识别的具有YXXΦ信号的宿主货物蛋白(Gminard等，Traffic5，181-193，2004)(图2B)。结合不是基因型特异性的，因为来自于2a(Lindenbach等，Science309：623-626，2005)或1b(Lohmann等，Science285：110-113，1999)基因型的核心蛋白被证明具有比得上AP2M1结合的水平。此外，在与两种亚型的AP2M1(a/b)结合的核心之间没有显著差异(图2B)。在Huh-7.5(人肝肿瘤来源的)细胞(代表最相关的细胞模式(图2B))和293T细胞(数据未示出)中证明了相当的结果。结合表现出特异性，因为游离核心或AP2M1的浓度升高，但是没有核输出信号相互作用蛋白质(nuclear export signal-interactingprotein，NESI)，对照蛋白质参与介导丁型肝炎病毒装配(Wang等，J Virol79：8113-8120，2005)，核心-AP2M1结合逐渐降低(图2C)。

为了确定在真实HCV感染的情况下核心是否与AP2M1结合，在利用细胞培养物生长HCV(J6/JFH)感染的Huh-7.5细胞制备的膜级分中进行免疫共沉淀测定(Lindenbach等，Science309：623-626，2005)。当向膜裂解物中添加抗AP2M1抗体而非IgG对照时，AP2M1使核心拉下。通过花萼海绵诱癌素A[AP2M1脱磷酸作用的抑制剂，其将AP2M1“锁定”在其YXXΦ结合活性构象(Ricotta等，J Biol Chem283：5510-5517，2008)]，结合显著提高(图2D)。类似地证明了在相反条件下的结合(图2D)。在利用J6/JFH HCV RNA电穿孔后72小时，还研究了核心和AP2M1在Huh-7.5细胞中的共定位。定量共聚焦免疫荧光(IF)分析揭示了核心和AP2M1在这些细胞中的广泛的共定位(67±6％共定位的AP2M1被核心斑点着色)(图2E)。

AP2M1结合和HCV装配中核心的YXX基序

使用一系列点突变(图1D)，测试AP2M1结合是否由核心的YXXΦ基序介导。通过PCA测量，Y136A核心突变使AP2M1结合比野生型(WT)核心下降～10倍，而V(Φ)139A突变造成较少的结合抑制(图3A)。为了研究核心的YXXΦ基序在HCV感染中的作用，将这些突变引入到J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV基因组中，这是一种含有海肾萤光素酶(Renilla luciferase)报道基因的病毒，其在Huh-7.5细胞中复制并产生高病毒滴度(Murray等，J Virol81：10220-10231，2007)。利用由每一种构建体产生的体外转录RNA对细胞进行电穿孔。如通过萤光素酶报道基因相关测定(图3B)和qRT-PCR(图11和12)测量的，这些病毒突变体的HCV RNA复制与WT病毒的相当。相比之下，聚合酶缺陷的突变体J6/JFH(p7-Rluc2A)-GNN不复制。在利用来自于用具有Y136A核心突变的病毒基因组电穿孔的细胞的上清液接种的未经处理的细胞中，萤光素酶测定测量了不可检测水平的细胞外感染性。与WT病毒相比，V139A突变使感染性下降～1.5log(图3C)。在利用来自于裂解的电穿孔细胞的澄清上清液感染的未经处理的细胞中测量的细胞内感染性反映了降低的细胞外感染性(图3D)，表明核心的YXXΦ基序介导病毒体装配而不是释放。通过装配(ΔE1-E2)或复制(GNN)缺陷对照，基本上未在细胞外或细胞内产生感染性病毒。通过有限稀释测定测量的WT病毒的感染性滴度比得上之前利用该报告系统报告的那些(Kopp等，J Virol 84：1666-1673，2010)。与上述萤光素酶测定一致，尽管V139A核心突变价使细胞外和细胞内感染性滴度比WT病毒降低了～1-1.5log，但是具有Y136A核心突变或E1-E2缺失的病毒测量到了不可检测水平的感染性滴度(图3E)。核心突变对感染性的作用与其对AP2M1结合性的作用相关。为了排除核心的突变通过造成颗粒解装配或产生缺陷的核心蛋白和含有RNA的颗粒来影响感染性的可能性，检测非感染性颗粒的产生。分别通过qRT-PCR和ELISA测定，在具有复制基因组的细胞的上清液测量到了可检测水平的HCV RNA和核心蛋白的释放(Murray等，J Virol81：10220-10231，2007；Kopp JVirol84：1666-1673，2010)(图3F，3G)。然而，由Y136A和V139A核心突变体释放的水平未显著高于由装配缺陷的ΔE1-E2突变体释放的那些，表明未产生非感染性颗粒。核心的表达不受突变的影响，因为western分析(图3H)和荧光显微镜(数据未示出)证明蛋白质表达处于WT水平。通过两周以后，在利用具有Y136A和V139A核心突变的HCV感染的Huh-7.5细胞中，通过萤光素酶测定检测到了感染性表现型的逆转。通过测序分析，该逆转与出现一级位点回复体(revertant)相符。这些结果提供了需要保持功能性YXXΦ基序以支持HCV复制的额外的证据。总之，这些数据表明病毒的体外装配需要核心中的AP2M1结合基序。

核心的YXXΦ基序与其他YXXΦ分选信号在功能上是可互换的

为了确定核心的YXXΦ基序是否与其他同类信号在功能上可互换，引入V139L突变，因此引入使基因型2a核心的序列与基因型1b的“交换”。类似地，使用YTPL和YRRL序列来代替核心的YXXΦ序列(图1D)，已知YTPL和YRRL序列分别介导HLA-DM(Ohno等，J BiollChem273：25915-25921，1998)和血小板生成素受体(Hitchcock等，Blood112：2222-2231，2008)与AP2M1的结合。具有这些序列的核心与AP2M1的结合比得上或大于WT核心，如通过PCA确定的(图3A)。这些突变对于HCV RNA复制没有影响(图3B)。与其生物化学表现型相关，V139L和YTPL核心突变体的细胞内和细胞外感染性比得上WT病毒(图3C，3D)。这种在功能上可相互交换支持核心的YXXΦ基序通过与宿主蛋白质的相互作用发挥其功能。尽管其与AP2M1有效结合(图3A)并且通过western分析稳定(图3H)，但是YRRL突变体不产生可检测水平的感染性病毒(图3C，3D)。有趣的是，该突变体以比得上WT核心的水平释放HCV RNA和核心蛋白到进电穿孔细胞的上清液中，很可能反映了产生了非感染性颗粒(图3F，3G)。因此，YRRL突变体可影响感染性病毒的产生(其不依赖于其与AP2M1的结合)中核心的其他功能。

HCV装配中的AP2M1

确定AP2M1与HCV生命周期的功能相关性。建立具有靶向AP2M1基因中的不同区域或非靶向(NT)序列的具有短发夹RNA(shRNA)慢病毒构建体的稳定Huh-7.5克隆。获得对AP2M1水平的有效抑制(图4A，4B)，而无明显的细胞抑制或细胞毒作用。在利用J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA电穿孔之后，在这些克隆中研究AP2M1消耗对于感染性病毒的产生的影响。如在这些稳定的克隆中通过萤光素酶测定(图4C)以及电穿孔后72小时的qRT-PCR(数据未示出)测量的，AP2M1敲除对于HCV RNA复制没有影响。使用在电穿孔后72小时收集的上清液接种未经处理的Huh-7.5细胞，然后在接种后72小时进行萤光素酶测定。如图4D中所示，与NT对照相比，AP2M1消耗使细胞外感染力降低＞2log。在利用来自裂解的电穿孔细胞的澄清上清液感染的未经处理的细胞中测量的细胞内感染力反映了降低的细胞外感染力(图4E)以及与AP2M1消耗程度的相关性。通过有限稀释试验测量的细胞内或细胞外感染性滴度证明了一致的结果(图4F)。如分别在通过qRT-PCR和ELISA测定(图4G，4H)在细胞的上清液中测量的释放的HCV RNA和核心的水平所表明的，AP2M1消耗不提高非感染性颗粒的产生。在通过siRNA瞬时消耗AP2M1和利用J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA电穿孔或利用培养物生长J6/JFH病毒(滴度，1.2x10⁵TCID₅₀/ml)感染的Huh-7.5细胞中证明了对感染性病毒的产生的类似的作用(Lindenbach et al.，Science309：623-626，2005)。沉默内源AP2M1对感染性病毒的产生的作用被异位表达在被shRNA靶向的位点内具有摇摆突变的shRNA抗WT AP2M1所挽救，极大排除了脱靶效应的可能性，导致所观察的表现型(图4I)。因此，稳定并且瞬时的RNAi方式二者表明AP2M1对于有效的HCV装配很重要。

破坏核心-AP2M1的结合消除了向LD招募AP2M1，改变了核心的亚细胞定位和核心与E2的共定位

为了测试HCV装配的缺陷是由于YXXΦ核心突变以及与AP2M1和/或核心的亚细胞定位的改变有关的AP2M1沉默所造成的假设，进行定量共聚焦免疫荧光(IF)测定。使用测定ImageJ(JACoP)软件和Manders′ Colocalization Coefficients(MCC)分析10至15个随机选择的细胞各自的每一种核心或AP2M1在不同细胞内隔室的每一种定位程度。选择后者，因为其严格测量不依赖于共出现(co-occurrence)的信号比值(Dunn等，Am J Physiol-CellPhysiol300：C723-C742，2011)。内源AP2M1最低程度地与LD标记物Bodipy在未经处理的Huh-7.5细胞中共定位，8.2％的LD对于AP2M1着色阳性(图5A，5E)。相比之下，利用J6/JFH病毒感染看来显著提高AP2M1向LD的定位，40±8％的LD是AP2M1阳性(图5B，5E)(p值＝0.0006)。类似地，如之前所述(Kopp等，J.Virol.84：1666-1673，2010；Boulant等，Journalof General Virology88：2204-2213，2007；Coller 等，PLoS pathogens8：e1002466-e1002466，2012)，核心部分地定位于LD(37±14％的核心阳性LD)(图5C，5E)。此外，核心和AP2M1的局部共定位发生在LD局部(图5D，5F)。

为了测试核心是否参与介导在HIV感染的细胞中测量的AP2M1向LD上定位的提高，通过转染Huh-7.5细胞单独过表达AP2M1-mCherry或者与WT核心或Y136A核心突变体组合过表达AP2M1-mCherry。利用HCS LipidTOX(Invitrogen)标记LD。与未经处理的细胞类似，在单独过表达AP2M1的Huh-7.5细胞中，AP2M1在LD的定位最少(8±2％LD为AP2M1阳性)(图5G，5J)。相比之下，如在感染的细胞中，当与WT核心共表达时，AP2M1表现为在LD显著积累，51.8±20％的LD是AP2M1阳性(p值＝4.8x10^-5)。(图5H，5J)。但是，当共表达AP2M1和具有Y136A突变的核心，未证明这样的共定位提高(具有10％AP2M1阳性LD)(p值＝0.001)时(图5I，5J)，表明核心的YXXΦ基序可介导向LD招募AP2M1。

测试在利用J6/JFH HCV RNA电穿孔的细胞中破坏核心-AP2M1相互作用对核心在LD、ER和TGN的定位及其与E2薄膜蛋白的共定位的影响。如前所示，核心在所有这些细胞内隔室定位(Kopp等，J.Virol.84，1666-l673，2010；Boulant等，Journal of GeneralVirology88，2204-2213，2007)(共定位百分比范围为30％至45％)。有趣的是，具有Y136A突变的核心向LD的定位显著高于WT核心(分别为78±13％对32±16％，p值＝2.7×10^-6)(图5K)。类似地，核心与LD标记的共定位百分比由NT细胞中的25±10％急剧提高到沉默AP2M1后的87±6.6％(p值＝1.55×10^-8)(图5L)。尽管Y136A核心突变或AP2M1消耗均对核心与ER标记物钙网蛋白的共定位没有明显影响(图14)，但是二者都与核心与TGN标记TGN46(图5M，5N)和E2包膜蛋白(图5O，5P)的共定位的显著降低有关。

总之，这些结果表明核心与AP2M1的相互作用有助于向LD招募AP2M1，并且在破坏核心-AP2M1相互作用之后观察到的HCV装配缺陷和核心向LD上积累、核心与E2的共定位降低以及与向TGN的运输有关的损伤的核心。

AAK1和GAK调节核心-AP2M1结合并且参与HCV装配

通过丝氨酸/苏氨酸激酶AAK1和GAK使AP2M1中的T156磷酸化(Ricotta等，Journalof Cell Biology156，791-795，2002；Korolchuk等，Traffic3，428-439，2002；Zhang等，Traffic6，1103-1113，2005)刺激AP2M1与货物蛋白酪氨酸信号的结合，并且因PP2A的脱磷酸而短暂(Ricotta等，Journal of Biological Chemistry283，5510-5517，2008)(图6A)。实际上，花萼海绵诱癌素A(PP2A抑制剂)放大核心与AP2M1的结合(图2D)而T156A AP2M1突变对其有损害(图6B)。为了研究过表达具有T156A突变AP2M1的对感染性HCV的产生的影响，利用编码WT或AP2M1T156A突变体的质粒感染Huh-7.5细胞，转染后48小时如上所述利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV RNA对细胞进行电穿孔并进行HCV RNA复制和感染性分析。T156AAP2M1突变体的过表达对于细胞生存力没有影响并且对于HCV RNA复制是非必要的，但是与WT AP2M1相比还是显著降低细胞外感染性和细胞内感染性(图6C-E)，与对于HCV装配的显性阴性作用相一致。

为了研究AAK1和GAK参与调节AP2M1与核心的相互作用的假设，在通过siRNA消耗AAK1或GAK的Huh-7.5细胞中进行结合实验(图6F，6G)。如通过PCA测量的，相对于NT，AAK1或GAK的消耗显著降低了核心-AP2M1的结合(图6H)，没有显著的细胞毒性(数据未示出)。然后利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV RNA对消耗了AAK1和GAK的细胞进行电穿孔。尽管AAK1或GAK的消耗没有细胞毒性并且对于HCVRNA的复制不是必要的，但是其显著降低细胞内和细胞外感染性(图6I-K)。AAK1和GAK对于HCV装配的作用不是由于其直接与核心结合(图6L)。这些结果提供了证据AAK1和GAK参与调节核心-AP2M1结合并且介导HCV装配。另外，其验证了AP2M1通过占主导地位的干扰的方式对于有效的HCV装配的重要性，因此支持RNAi数据。

AAK1和GAK的药理学抑制剂破坏核心-AP2M1结合和HCV装配

激酶抑制剂的热图分析和亲和力测定(Karaman等，Nat Biotech26，127-132，2008)揭示化合物(例如舒尼替尼和PKC-412)以高亲和力(nM范围)结合AAK1并且厄洛替尼结合GAK(Karaman等，Nat Biotech26，127-132，2008)(图7A，7B)。如通过PCA确定的(图7C)，这些化合物以剂量依赖的方式抑制核心-AP2M1结合，半数最大有效浓度(IC50)为～0.04-0-2μM。当用于处理利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV基因组电穿孔的Huh-7.5细胞时，这些化合物在72小时对于细胞外感染性(图7D)和细胞内感染性(图7E)具有强烈的剂量依赖作用(半数最大有效浓度(EC50)为0.15-1.8μM)(图7B)。对于HCV RNA复制没有作用，并且没有明显的细胞毒性(图7F，7G)。实际上，通过western分析，AP2M1结合和感染性的抑制作用与相关细胞中磷酸-AP2M1水平的降低有关(图7H)。最后，这些化合物显著抑制被阻止培养物生长HCV(滴度：6.3×10⁵TCID₅₀/ml)感染的Huh-7.5细胞中病毒的感染(图7I，7B)。这些结果提供了药理学证据，AAK1和GAK参与调节核心-AP2M1相互作用以及P2M1在HCV装配中的作用。此外，其提供了靶向装配的候选化合物。

实施例2

AAK1和GAK消耗或者药理学抑制消除HIV-1复制。

有大量证据支持AP1M1和AP2M1与HIV Gag和Env(gp41)的相互作用介导装配/释放途径中的多个关键步骤(Batonick等，Virology342：190-200，2005；Camus等，Molec BiolCell18：3193-3203，2007；Berlioz-Torrent等，J Virol73：1350-1361，1999；Byland等，Molec Biol Cell18：414-425，2007；Wyss等，J Virol75：2982-2992，2001；Ohno等，Virology 238：305-315，1997；Boge等，J Biol Chem273：15773-15778，1998；Egan等，JVirol70：6547-6556，1996；Rowell等，J Immunol155：473-488，1995；Lodge等，EMBO J l6：695-705，1997；Deschambeault等，J Virol73：5010-5017，1999)。最重要的是，Env中的酪氨酸基序介导细胞至细胞的传播(Gminard等，Traffic5，181-193，2004；Lindenbach等，Science309，623-626，2005)，该机理被认为解释了不论ART地不间断的HJV复制(Sigal等，Nature477，95-98，2011)，很可能通过被分类在基底膜的AP1M1。但是，尚未研究AAK1和GAK在HIV感染中的作用，并且这些机理还未作为药理学靶标。

为了测试AAK1和GAK对于HIV感染很重要的假设，使用HeLa来源的TZM-b1细胞，其表达CD4、CCR5和CXCR4、以及响应于HIV转录的β-半乳糖苷酶和萤火虫萤光素酶报道基因(Wei等，Antimicrobial agents and chemotherapy46：1896-1905，2002)。利用靶向AAK1、GAK或NT序列的siRNA转染细胞，然后如描述的(Zhou等，Cell Host & Microbe4：495-504，2008)利用感染性HIV-1NL4-3克隆(Adachi等，J Virol59：284-291，1986)感染。在感染后96小时测量萤光素酶活性。AAK1和GAK消耗显著地抑制HIV复制(图10)。为了测试AAK1和GAK对于HIV的药理学抑制剂作用，将HIV-1感染的HeLa来源的TZM-b1细胞每日用系列稀释的舒尼替尼、厄洛替尼或PKC-412处理4天，然后进行萤光素酶测定。观察到了显著的剂量响应抗病毒作用，对生存力没有作用(图10)。厄洛替尼的EC₅₀是1.4±0.3(P值0.0058)，舒尼替尼的是0.8±0.4(P值0.1)，PKC-412的是8.5±4(P值0.1)。由于这些研究在感染后进行96小时，其评估了从进入到释放和传播的全部阶段(Zhou等，Cell Host & Microbe4：495-504，2008)，因此，表明AAK1和GAK对于整个HIV复制很重要。

方法

质粒。从人cDNA的ORFeome文库克隆(Rual等，Genome research 14，2128-2135，2004)(Open biosystems)中挑选编码AP2M1、GAK、AAK1、TFR、SPIRE、RAC1、ARPC和NESI的ORF并且使用网关技术(Invitrogen)重组到pcDNA-Dest40(用于C末端V5-his标记)、pGLuc(用于Gaussia Princeps萤光素酶片段(Gluc)标记)(Cassonnet等，Nat Methods8，990-992，2011)和/或pCherry(用于mCherry荧光蛋白质标记)载体中。从所述载体中扩增编码T7标记的全长核心和NS3的ORF(Blight等，Science290，1972-1974，2000)并与pcDNA3.1(Invitrogen)连接。pFL-J6/JFH(p7-Rluc2A)(Murray等，J Virol81，10220-10231，2007)由C.M.Rice博士(Tscherne等，J Virol80，1734-1741，2006)惠赠。通过定点诱变(使用QuikChange试剂盒(Stratagene))向这些质粒中引入YXXΦ核心突变和AP2M1突变。

抗体和化合物。见表1和表2

RNA i和基因沉默的挽救。使用silM PORTER(Upstate，Millipore)将40-100nM的单独或汇集的siRNA(图8)转染到细胞中，48小时之后进行HCV RNA电穿孔。使用具有靶向AP2M1RNA中的不同位点的RNA(shRNA)的5个单独MISSION慢病毒转导颗粒(Sigma)和对照shRNA根据制造商的方案转导Huh-7.5细胞。本研究中使用的RNAi试剂总结在表3中。在利用HCV基因组电穿孔之前48小时，通过利用表达shRNA抗AP2M1的慢病毒亚科病毒转染稳定消耗AP2M1的Huh-7.5细胞来进行AP2M1挽救。

微流体亲和测定。基本如(Maerkl等，Science315，233-237，2007)的描述进行装置制造和设计。通过哺乳动物体外转录/翻译混合物(TNT)(Promega)(在微粒体膜的存在下)在芯片外表达V5-his标记的人蛋白质和T7标记的病毒蛋白质。将装置进行表面图案化，导致每个单元小室内覆盖有生物素化抗-his抗体的圆形区域(Einav等，NatureBiotechnology26，1019-1027，2008；Gerber等，Nature methods6，71-74，2009)。如(Gerber等，Nature methods6，71-74，2009)所述进行蛋白质-蛋白质结合实验。简单地说，将人诱饵蛋白质装载到元件中并与表面抗-his抗体结合。将病毒和人蛋白质在芯片中孵育并分别用抗-T7-Cy3和抗-V5-FITC抗体标记。通过MITOMI机械地捕获相互作用(Maerkl等，Science315，233-237，2007；Einav等，Nature Biotechnology26，1019-1027，2008；Gerber等，Nature methods6，71-74，2009)。在简单清洗以除去未捕获的未结合物质后，通过阵列扫描(Tecan)检测捕获的蛋白质复合物。通过测量Cy3的中值信号与FITC的中止信号的比值，计算每一数据点结合的病毒猎物和表达的人诱饵蛋白质的比值。通过对于T7标记蛋白质的标准曲线的定量western分析，检测溶解物中的蛋白质浓度。实验进行至少三次，每次＞20个重复。见图10的详细方案。

细胞培养物。将Huh-7.5细胞和293T细胞保持在补充有1％L-谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素、1％链霉素(Gibco)、1×非必需氨基酸(Gibco)和10％胎牛血清(OmegaScientific)的Dulbecco改进型最低极限培养基(Gibco)中。在利用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA处理1周后每周使细胞系传代三次并以1：4的稀释度接种。

蛋白质-片段互补测定。基本上如(Cassonnet等，Nat Methods.8，990-992，2011)所述进行结合测定。将编码猎物(A)和诱饵(B)蛋白质的质粒的组合(各自与GaussiaPrinceps萤光素酶蛋白质的片段(Gluc1和Gluc2)或对照载体融合)共转染到一式三份地平板接种在96孔平板的293T或Huh-7.5细胞中。转染后24小时，使细胞裂解并使用海肾萤光素酶测定系统(Promega)检测标准萤光素酶报道基因。结果表示为发光或发光比值。后者表示在利用Gluc1-A和Gluc2-B转染的细胞中检测的平均发光信号除以在利用Gluc1-A和空白Gluc2载体转染的对照孔或利用Gluc2-B和空白Gluc1载体转染的那些中测量的发光平均值。如上进行竞争性测定以及被设计成确定化合物或siRNA的抑制作用的研究，只是分别在过量游离蛋白质、抑制剂或siRNA的存在下测量结合性。试验一式三份地进行至少三次。

免疫共沉淀。如(Einav等，J Virol78，11288-11295，2004)先前所述，由感染有HCV(J6/JFH)(Lindenbach，等，Science309，623-626，2005)的～20x10⁶Huh-7.5细胞制备膜。简单地说，通过胰蛋白酶收集细胞，利用PBS清洗一次并重悬在HME缓冲液(20mM HEPES[pH7.4]，1mM EDTA，2mM MgCl2)中，所述缓冲液增补有1mM的终浓度的苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)。通过在无水冰乙醇中的两个冻融循环裂解细胞，然后使其通过27.5号针10次。通过在250×g离心10分钟除去核，并且将去核的上清液在100,000×g超速离心30分钟，获得膜制剂。所有步骤在4℃进行。将全部膜蛋白质在1ml TDB缓冲液(2.5％Triton X-100，25mM三乙醇胺-Cl[pH8.6]，20mM NaCl，5mM EDTA，0.2％NaN3)( Einav等，JVirol78，11288-11295，2004)中稀释，并与100nM花萼海绵诱癌素A或DMSO在37℃孵育30分钟。由于相互作用弱的和瞬时的性质，添加25mM二硫代双-琥珀酰亚胺基-丙酸(DSP)交联剂(Pierce)以允许已结合的相互作用的蛋白质共价结合。将样品在冰上孵育2小时。添加1MTris以终止DSP活性。然后通过在1000×g离心10分钟，接着在100,000×g将上清液超速离心30分钟来使裂解物澄清。将膜沉淀重悬在100l HME缓冲液(20mM NaHEpes(PH7.4)，1mMEDTA(Ph8)，2mM MgCl2)中，添加TDB缓冲液至1ml的最终体积。将样品与抗-AP2M1抗体、抗-核心抗体或IgG对照以及蛋白质G磁珠(Millipore)一起孵育过夜。通过western印迹测定免疫沉淀物。将实验一式两份地进行两次。

病毒RNA的体外转录以及转染。如(Lindenbach等，Science309，623-626，2005；Murray等，J Virol81，10220-10231，2007)先前的描述产生HCV RNA并递送到Huh-7.5细胞中。简单地说，使用T7MEGAscript试剂盒根据制造商的方案(Ambion)由XbaI线性化J6/JFH(p7-Rluc2A)模板合成RNA。将反应混合物在37℃孵育3小时，然后在37℃用DNA酶处理15分钟。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)纯化病毒RNA。通过260nm吸光度量化RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检验其质量。将亚汇合的(Subconfluent)Huh-7.5细胞用胰蛋白酶消化，并通过在700g离心5分钟来收集。然后将细胞在冰冷的无RNA酶PBS(BioWhittaker)中清洗3次并以1.5×10⁷细胞/ml重悬在PBS中。将5μg体外转录的野生型或6/JFH(p7-Rluc2A)突变体RNA与400μl经清洗的Huh-7.5细胞在2mm间歇小池(gap cuvette)(BTX)中混合并立即用BTX-830电穿孔仪脉冲(0.82kV，5个99μs脉冲)。在25℃恢复15分钟后，将细胞在30ml预热的生长培养基中稀释并在96、24、6-孔和P100组织培养板中平板接种。

通过萤光素酶检验的HCV RNA复制。如(Murray等，J Virol81，10220-10231，2007)所述在电穿孔后6-9小时和72小时测量HCV RNA复制。将一式四份地平板接种在96孔平板中的电穿孔细胞用PBS清洗两次并用30μl海肾裂解缓冲液(Promega)裂解。在室温摇动15分钟后，使用海肾萤光素酶底物(Promega)和Tecan光度计(Tecan)根据制造商的方案量化萤光素酶活性。

HIV复制试验。在这些实验中使用HeLa来源的TZM-b1细胞(其表达CD4、CCR5和CXCR4)和响应HIV转录的β-半乳糖苷酶和萤火虫萤光素酶报道基因(Wei等，Antimicrobialagents and chemotherapy46，1896-1905，2002)。如所描述的(Zhou等，Cell Host &Microbe4，495-504，2008)，利用靶向AAK1、GAK或NT序列的siRNA转染细胞，然后利用感染性HIV-I NL4-3克隆(Adachi等，J Virol59，284-291，1986)感染。在感染后第96小时测量萤光素酶活性。为了测试AAK1和GAK对于HIV的药理学抑制剂作用，将HIV-1感染的HeLa来源的TZM-b1细胞每日利用系列稀释的舒尼替尼、厄洛替尼或PKC-412处理4天，然后进行萤光素酶测定。

细胞外感染性。在电穿孔后第72小时收集利用J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA电穿孔并平板接种在P100皿中的Huh-7.5细胞的培养物上清液、澄清化(利用0.22μm孔径过滤器)并用于一式三份地感染未经处理的Huh-7.5细胞72小时，之后在海肾裂解缓冲液(Promega)中裂解。如上所述量化20μl细胞裂解物中的萤光素酶活性。为了确定厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412对于感染性病毒的产生的作用，在抑制剂存在下利用每日更换的培养基培养电穿孔细胞72小时，之后收集上清液或细胞裂解物。结果表示为每10cm组织培养皿的log10RLU值。实验重复三次，每次一式四份。

细胞内感染性测定。如Murray等(J Virol81，10220-10231，2007)所述，将利用J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA电穿孔后72小时的细胞用胰蛋白酶消化，通过离心收集，重悬在500μl培养基中，通过冻融循环裂解，并在3,650×g沉淀2次。使用在完全培养基中稀释的澄清上清液一式三份地接种未经处理的Huh-7.5细胞，然后裂解并在第72小时进行萤光素酶测定。结果表示为每10cm组织培养皿的log10RLU值。实验重复三次，每次一式四份。

病毒滴度。通过基于对核心的免疫组织化学着色的有限稀释测定来确定细胞外和细胞内滴度。如(Lindenbach等，Science309，623-626，2005)所述计算50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)。结果表示为TCID₅₀/ml。将利用AE1-E2突变体测量的最小滴度用于背景减除。

核心ELISA。根据制造商的指示通过对于重组核心抗原的标准曲线的ELISA(CellBiolabs)，测量在电穿孔后72小时收集的澄清细胞培养物上清液中释放的核心蛋白的浓度。

生存力测定。在利用抑制性化合物处理或利用siRNA沉默后24、48和72小时，如(Einav等，Nature Biotechnology26，1019-1027，2008)所述将细胞在10％阿尔玛蓝试剂(TREK Diagnostic Systems)的存在下在37℃孵育2至4小时。然后使用FLEXstation II384(Molecular Devices，Inc.)扫描平板并检测荧光性。

感染性研究。利用细胞培养物生长HCV J6/JFH(滴度：1.2×10⁵TCID₅₀/ml)感染接种在96孔平板中的6×10³个Huh-7.5细胞。通过焦点形成测定(Lindenbach等，Science309，623-626，2005)测量用来自于感染后72小时的感染细胞的上清液或澄清细胞裂解物感染的未经处理的Huh-7.5细胞中的细胞外和细胞内感染性。

为了确定厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412的抗病毒作用，利用细胞培养生长的HCV(J6/JFH(p7-Rluc2A))(滴度：6.3×10⁵TCID₅₀/ml)以0.1M0I(感染复数)一式三份地感染接种在96孔平板中的6×10³个Huh-7.5细胞。在感染后6小时以及以后的每一天，清洗细胞并用含有系列稀释的抑制化合物的培养基替换培养基。在第72小时，对样品进行生存力测定，然后进行标准萤光素酶测定(Promega)。

回复体测定。繁殖利用具Y136A或V139A突变的J6/JFH(p7-Rluc2A)电穿孔的Huh-7.5细胞。每隔几天收集培养物上清液并用于接种未经处理的Huh-7.5细胞，以在接种后72小时通过萤光素酶测定确定细胞外感染性。使用TRIzol试剂(Invitrogen)由被证明感染性表现型逆转(对于Y136A克隆为电穿孔后第8天，对于V139A突变体克隆为第14天)的克隆中提取总细胞RNA。使用Superscript One-Step逆转录PCR(RT-PCR)试剂盒(Invitrogen)进行逆转录反应和PCR扩增。扩增具有核心编码序列的～1-kb片段。通过Ultra Clean15DNA纯化试剂盒(MoBio)从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，并在ABI Prism377DNA测序仪(Sequetech)上进行自动测试。使用正向和逆向寡聚物(oligo)通过两个独立的序列验证一级位点回复的存在。

RNA提取和qRT-PCR。分别使用TRIzol(Invitrogen(MoBio)或QiaAmp UltraSens试剂盒(Qiagen)从细胞或1ml细胞培养物上清液分离总RNA。使用0.5μg或4μlRNA和High-Capacity RNA-to-cDNA(Applied Biosystems)一式三份地装配qRT-PCR混合物。表4列出了TaqMan试剂。使用StepOnePlus Real-Time-PCR系统(Applied Biosystems)进行扩增和分析。使用S18作为对照。

Western印迹。使用初级抗体然后HRP缀合的二级抗体对细胞裂解物进行western分析。使用NIH Image对带强度进行量化。

定量免疫荧光共聚焦显微镜。利用J6/JFH HCV RNA对Huh-7.5细胞进行电穿孔或利用培养物生长的J6/JFH病毒进行感染，接种在盖玻片上，并在37℃孵育72小时。用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞，用PBS清洗，用PBS中的0.1％Triton X-100透化5分钟，并在含有1％BSA的PBS中封闭1小时。将固定细胞利用核心蛋白AP2M1、TGN46、钙网蛋白(calreticulin)或E2的初级抗体在室温孵育1小时(见表1)。二级抗体(山羊抗-兔AlexaFluor488，山羊抗-小鼠Alexa Fluor594，鸡抗-山羊IgG Alexa Fluor647和山羊抗-人Alexa Fluor647)(Invitrogen)在室温孵育1小时。如(Kopp等，J Virol84，1666-1673，2010)所述利用Bodipy-488/503(Invitrogen)进行LD染色。然后将盖玻片在PBS中清洗三次，并利用ProLong Gold抗褪色试剂(Invitrogen)固定。或者，利用表达AP2M1-YFP和/或Core-mCherry的质粒共转染Huh-7.5细胞。利用HCS LipidTOX(Invitrogen)对LD染色。使用Zeiss LSM510共聚焦显微镜分析全部玻片。使用ImageJ(JACoP)共定位软件和Manders共定位系数(Manders’Colocalization Coefficient，MCC)量化由每一种样品随机选择的10至15个细胞中的共定位。使用auto_threshold(插件，ImageJ)确定阈值。仅红色和绿色强度值二者都高于其各自阈值的像素被认为是具有共定位探针的像素。然后作为总荧光在“共定位”像素中发生的目标区域中的分数计算MCC(更高的值代表更多共定位)。示出了表示为平均共定位百分比的M2系数值。

统计分析。如(Einav等，Nature Biotechnology26，1019-1027，2008)所述，通过将数据拟合于三参数逻辑曲线(logistic curve)来测量IC50和ECS0。使用单尾不成对t检验计算P值。

实施例3

厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412对AP2M1磷酸化的作用

为了确定抑制化合物对AP2M1磷酸化的作用，每日用不同浓度的化合物或DMSO处理具有J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA的Huh-7.5细胞。由于磷酸酶PP2A的活性，AP2M1磷酸化是暂时的(Ricotta等，JBiol Chem283：5510-5517，2008)，为了允许获得磷酸化AP2M1状态，在利用100nM PP2A抑制剂、花萼海绵诱癌素A(Cal-A)或DMSO对照孵育细胞30分钟之后，在第72小时制备裂解物。然后对样品进行SDS-PAGE并利用靶向磷酸化AP2M1形式或激动蛋白的抗体进行印迹。实际上，与DMSO对照相比，在利用舒尼替尼、厄洛替尼和PKC-412处理的细胞制备的裂解物中，测量到磷酸化AP2M1与肌动蛋白的比值显著更低(图6H)。磷酸化AP2M1和肌动蛋白的比值随着舒尼替尼、厄洛替尼浓度的提高以剂量依赖的形式逐渐价低。这些结果表明在具有感染性HCV的Huh-7.5细胞中，AAK1或GAK被这些化合物强效抑制。

所述化合物对HCV RNA复制、细胞内感染性、细胞外感染性和HCV复制的作用

为了确定厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412对感染性病毒的产生的作用，利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV基因组对Huh-7.5细胞进行电穿孔(Murray等，J Virol81：10220-10231，2007)，在6孔平板上平板接种，每日用系列稀释的化合物或DMSO进行处理。在电穿孔72小时，通过基于阿尔玛蓝试验测量细胞生存力，然后通过萤光素酶测定确定HCV RNA复制。在第72小时从平行样品中收集细胞培养物上清液和裂解物并用于孵育未经处理的Huh-7.5细胞，以分别确定细胞外和细胞内感染性。在孵育后72小时在这些细胞中进行萤光素酶测定。

为了确定这些化合物对HCV复制的作用，利用滴度为6.3×10³TCID₅₀/ml的细胞培养物生长HCV(J6/JFH(p7-Rluc2A)以0.1的MOI(感染复数)一式三份地感染接种在96孔平板中的6×10³Huh-7.5细胞。在电穿孔后6小时，清洗细胞并将培养基替换成系列稀释的抑制化合物。每日处理细胞72天，然后进行生存力测定，随后进行标准萤光素酶测定。

或者，利用细胞培养物生长HCV J6/JFH(滴度：1.2×10⁵TCID₅₀/ml)以0.1的MOI(感染复数)一式三份地感染接种在96孔平板中的6×10³Huh-7.5细胞，并且进行焦点形成测定，如(Lindenbach等，Science309：623-626，2005)所述。在利用化合物每日处理72小时后，利用4％甲醛固定细胞并利用皂苷进行通透化。利用第一抗核心单克隆抗体和第二抗小鼠Alexa594缀合抗体检测HCV核心蛋白。在倒置显微镜下对焦点计数。

将实验重复两次，每次进行4个重复。利用在相应浓度的DMSO的存在下生长的样品对信号进行归一化。通过使用式Y＝a+(b-a)/(1+10^(X-c))(a、b和c分别表示最小结合、最大结合和logEC50)将数据拟合于三参数对数曲线来测量ECS0(BioDataFit，ChangBioscience，Inc)。

表1.本研究中使用的抗体

抗体	来源
		生物素化抗五-his	Qiagen
FITC缀合的抗his	InVitrogen
		藻红蛋白缀合的抗-T7标签	Abcam
兔抗AAK1	Abcam
		兔抗AP2M1	Santa Cruz Biotechnology
山羊抗AP2M1	Santa Cruz Biotechnology
		兔抗磷酸-AP2M1(T156)	Cell signaling
兔抗-TGN46	Abcam
		兔抗钙网蛋白	Enzo Life Sciences
小鼠抗GAK	MBL international corporation
		小鼠抗核心	Austral Biological
人抗E2(CBH5)	Dr.SteVen K Foung
		小鼠抗肌动蛋白	Sigma
HPR缀合的抗小鼠IgG	Cell signaling
		HPR缀合的抗兔IgG	Cell signaling

表2.本研究中使用的化合物

化合物	来源
		PKC-412	Sigma
苹果酸舒尼替尼	Sigma
		厄洛替尼	LC Laboratories
花萼海绵诱癌素A	Cell signaling

表3.本研究中使用的RNAi

表4.本研究中使用的taqman探针和引物

该表中所列全部试剂都购自Applied Biosystems，Inc(ABI)。

Claims

1.有效量的舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐在制备用于在有此需要的患者中治疗HCV和HIV的药物中的用途。

2.权利要求1所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐抑制HCV和HIV病毒与宿主网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物μ亚基结合，所述网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物包含网格蛋白AP1、AP2、AP3和AP4复合物μ亚基。

3.权利要求2所述的用途，其中所述μ亚基选自AP2M1、AP1M1、AP3M1和AP4M1。

4.权利要求1所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐抑制AAK1或GAK。

5.权利要求1所述的用途，其还包括向所述患者施用厄洛替尼、PKC-412或其可药用盐或者其组合。

6.有效量的舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐在制备用于在有此需要的患者中抑制HIV、HIV和HCV、或其他网格蛋白AP结合病毒的感染的药物中的用途。

7.权利要求6所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐抑制来自所述病毒的包含YXXΦ或二亮氨酸基序的蛋白与宿主网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物μ亚基结合，并且其中所述μ亚基选自网格蛋白AP1、AP2、AP3和AP4复合物μ亚基。

8.权利要求7所述的用途，其中所述μ亚基选自AP2M1、AP1M1、AP3M1和AP4M1。

9.权利要求6所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐抑制AAK1或GAK。

10.权利要求6所述的用途，其中所述用途还包括向所述患者施用有效量的厄洛替尼、PKC-412或其可药用盐或者其组合。

11.筛选抗病毒剂的方法，其包括：

使包含YXXΦ或二亮氨酸基序的黄病毒科病毒与候选药剂和宿主网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物μ亚基接触，并且确定所述候选药剂对所述黄病毒科病毒与所述网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物μ亚基结合的影响。

12.筛选抗病毒剂的方法，其包括：

使包含YXXΦ或二亮氨酸基序的黄病毒科病毒与候选药剂和表达宿主网格蛋白衔接蛋白(AP)复合物μ亚基的细胞接触，并且确定所述候选药剂对病毒装配或出芽的影响。

13.权利要求11所述的方法，其中所述候选药剂抑制AAK1或GAK的活性。

14.舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐在制备用于抑制宿主细胞中除HCV以外的包含YXXΦ或二亮氨酸基序之黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的包含YXXΦ或二亮氨酸基序之病毒或除HCV以外的包含YXXΦ或二亮氨酸基序之病毒的装配或出芽的药物中的用途，其包括使所述宿主细胞与舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐接触，从而抑制所述装配或出芽。

15.权利要求14所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐阻断病毒结构蛋白与宿主蛋白质的结合。

16.权利要求14所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐与病毒蛋白竞争与宿主蛋白质结合。

17.权利要求14所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐与宿主蛋白质竞争与病毒蛋白结合。

18.权利要求6所述的用途，其中舒尼替尼或舒尼替尼的可药用盐在患者中抑制除HCV以外的黄病毒科病毒的感染。

19.权利要求18所述的用途，其中除HCV以外的黄病毒科病毒包括登革热病毒。