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CN104039809A - 中间位和中间位结合抗体及其用途 - Google Patents

中间位和中间位结合抗体及其用途 Download PDF

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CN104039809A
CN104039809A CN201280060888.7A CN201280060888A CN104039809A CN 104039809 A CN104039809 A CN 104039809A CN 201280060888 A CN201280060888 A CN 201280060888A CN 104039809 A CN104039809 A CN 104039809A
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CN
China
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alkyl
group
antibody
interposition
meditope
Prior art date
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Pending
Application number
CN201280060888.7A
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English (en)
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J.C.威廉斯
D.A.霍恩
Y.马
H.W.常
J.M.唐纳森
C.泽
K.布奇梅克
K.N.艾弗里
J.谢
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City of Hope
Original Assignee
City of Hope
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Publication date
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Priority to CN201710448172.9A priority patent/CN107840888B/zh
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Abstract

提供了抗体和结合抗体的中间位，及含有中间位和抗体的复合物、组合物和组合，以及其生成、使用、测试和筛选方法，包括治疗性和诊断性方法和用途。

Description

中间位和中间位结合抗体及其用途
优先权要求
本申请要求2012年2月10日提交的美国临时专利申请流水号61/597,708；2011年10月10日提交的美国申请流水号13/270,207；和2011年10月10日提交的国际申请号PCT/US2011/055656的权益，其内容通过提及完整并入本文。
发明背景
单克隆抗体(单抗)在许多治疗、诊断和研究应用中使用。治疗和诊断领域包括癌症、抗病毒治疗、自身免疫性和炎性疾病、变态反应、心血管疾病、骨质疏松、和风湿病学。
蛋白质工程和其它努力已经生成了具有改善的效力和靶向(例如双特异性单抗)、改善的定位、组织穿透、和血液清除(例如单链Fab可变片段(scFvs)、双抗体、微型抗体(minibody)、和其它片段)、及改变的免疫刺激、安全性、毒性、和/或药动学/药效学特性(诸如那些含有经修饰的Fc区的抗体(例如经由突变或糖基化实现))的单抗。单抗已经再工程化为容许小分子的位点特异性缀合以实现改善的投递(例如ThioMAB)或不可逆地结合其抗原(例如无穷大亲和力单抗)。单抗还已经开发为改善生物活性肽和其它生物制剂(例如CovX-bodies)的循环和呈现。与各种药剂的缀合已经容许靶向免疫疗法和诊断方法。异多聚体scFv和与亲合素融合的scFv或单抗已经开发用于预靶向疗法并且改善肿瘤成像的检测限。
虽然单抗可以是有效的并且比小分子办法具有优点，但是现有的抗体和方法具有各种限制。这些可以包括源自脱靶相互作用的不利副作用，和/或由于抗体-药物缀合物的长循环时间等所致的附带损害。需要改善的抗体和有关的化合物(包括那些提供改善的效力、协同性、特异性和安全性的)，以及其方法和用途。提供了解决此类需要的抗体、化合物和包含肽和其它分子的组合物及相关方法。
发明概述
提供的实施方案之一是抗体、化合物和组合物(其包含与抗体一起使用的肽和其它分子)及其方法和用途和其生成方法，以及含有其的化合物、组合物、复合物、混合物、和系统，例如试剂盒。在一些方面，与可用的抗体和有关的化合物、组合物、方法和用途相比，提供的实施方案提供了改善的效力、协同性、特异性、和/或安全性。
提供了结合(即能够结合)一个或多个中间位的抗体，包括中间位使能性抗体(包括其片段)。在一些方面，抗体结合中间位，该中间位是自具有SEQID NO:1的氨基酸序列的肽衍生的环肽。
在一些方面，抗体结合中间位，该中间位是自具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的肽衍生的环肽。在一些方面，抗体结合中间位或本文中描述的任何中间位，所述中间位是具有选自下组的氨基酸序列的肽或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55中所列的序列，或具有选自下组的氨基酸序列的肽或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:1,2和15-55中所列的序列。在一些情况中，中间位是自SEQ IDNO:1或2中所列的氨基酸序列的肽衍生的环肽。
在一些方面，抗体或片段以特定的亲和力(诸如与本文中描述的一种例示性抗体，诸如西妥昔单抗、中间位使能性曲妥珠单抗、中间位使能性M5A、或其它例示的抗体相等或基本上相等的亲和力)结合中间位。在一些例子中，抗体以小于为或大约10μM、小于为或大约5μM、或小于为或大约2μM、小于为或大约1μM、小于为或大约500、400、300、200、100nM，或更小，诸如为或大约200皮摩尔或更小的解离常数，例如以此类解离常数结合一个或多个中间位，如通过特定技术，诸如表面等离振子共振(SPR)，等温滴定量热术(ITC)、荧光、荧光偏振、NMR、IR、量热术滴定；动力学排除(Kineticexclusion)；圆二色性、差别扫描量热术、或其它已知的方法，例如通过SPR测量的。
在一些方面，抗体包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区。在一些方面，所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸，第41位除甘氨酸外的残基，和/或第85位的天冬氨酸或天冬酰胺，和/或包含依照Kabat编码方式的第10位异亮氨酸或亮氨酸和第83位异亮氨酸，和/或包含依照Kabat编码方式的第9位缬氨酸或异亮氨酸和第100位除谷氨酰胺外的残基。在一些例子中，VL区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、和第85位天冬氨酸。
在一些方面，VH区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含依照Kabat编码方式的第40位丝氨酸或脯氨酸和第89位异亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、或色氨酸。在一些例子中，VH区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第40位丝氨酸和第89位异亮氨酸。
在一些例子中，VL区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第9位缬氨酸或异亮氨酸、第10位异亮氨酸或亮氨酸、第39位精氨酸、第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、第42位甘氨酸、第43位丝氨酸、第83位异亮氨酸、第85位天冬氨酸、和第100位丙氨酸；和/或VH区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第40位丝氨酸和第89位异亮氨酸。
在提供的抗体的一些方面，VL区不含依照Kabat编码方式的第40位脯氨酸、第41位甘氨酸和/或第85位苏氨酸，和/或VH区不含依照Kabat编码方式的第40位天冬酰胺或丙氨酸和/或第89位缬氨酸。
在一些方面，VL区不含依照Kabat编码方式的第10位丝氨酸、第40位脯氨酸、第41位甘氨酸、第83位苯丙氨酸，和/或第85位苏氨酸，和/或VH区不含第40位天冬酰胺或丙氨酸和/或第89位缬氨酸。
在一些方面，抗体(包括片段)进一步包含一个或多个恒定区，通常为人恒定区，诸如CL和/或CH1，例如人CL和/或CH1。
在一些方面，提供的抗体或片段具有VL区和/或VH区，所述VL区具有的氨基酸序列包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61中所列的轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3、和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:71或61的轻链的FR-L1、FR-L2、FR-L3、和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4)，和(在一些方面)至少一个与SEQ ID NO:71中所列的轻链序列的CDR不同的互补决定区(CDR)；所述VH区具有的氨基酸序列具有SEQ IDNO:72或SEQ ID NO:63中所列的重链序列的重链FR1(FR-H1)、FR-H2、FR-H3、和/或FR-H4(或与SEQ ID NO:72或63的重链的FR-H1、FR-H2、FR-H3、和/或FR-H4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-H1,FR-H2,FR-H3,和/或FR-H4)，和(在一些方面)至少一个与SEQ ID NO:72中所列的重链序列的CDR不同的CDR。
在一些方面，提供的抗体或片段具有SEQ ID NO:61中所列的轻链序列的CDR、SEQ ID NO:63中所列的重链序列的CDR。
在一些方面，VL包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，且VH包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列。
在一些方面，抗体具有VL区和/或VH区，所述VL区具有的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9中所列的轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3、和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:9的FR-L1、FR-L2、FR-L3、和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4)；所述VH区具有的氨基酸序列具有SEQ ID NO:6中所列的重链序列的重链FR1(FR-H1)、FR-H2、FR-H3、和/或FR-H4(或与SEQ ID NO:9的FR-H1,FR-H2,FR-H3,和/或FR-H4至少约或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-H1,FR-H2,FR-H3,和/或FR-H4)。在一些例子中，VL区包含至少一个与SEQ IDNO:9中所列的VL序列的CDR不同的互补决定区(CDR)；和/或VH区包含至少一个与SEQ ID NO:6中所列的VH序列的CDR不同的CDR。
在一些例子中，VL区包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些例子中，VH区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些方面，抗体或片段具有VL区和/或VH区，所述VL区具有的氨基酸序列包含SEQ ID NO:68中所列的轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3、和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:68的轻链的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3和/或FR-L4)。在一些例子中，VL区包含至少一个与SEQ ID NO:69中所列的轻链序列的CDR不同的互补决定区(CDR)；和/或VH区包含至少一个与SEQ ID NO:70中所列的重链序列的CDR不同的CDR。
在一些例子中，VL区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些方面，抗体不特异性结合由西妥昔单抗特异性结合的EGFR表位，不含西妥昔单抗的CDR，和/或不与西妥昔单抗竞争抗原结合。在其它方面，抗体是西妥昔单抗。
在一些方面，抗体或片段与一种或多种已知抗体竞争抗原结合，特异性结合相同抗原或表位，和/或含有一种或多种已知抗体的一个、多个、或所有CDR(或包含与该CDR的至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％同一性的CDR)，例如包括重链CDR1、2、和/或3和/或轻链CDR1、2、和/或3，所述已知抗体包括任何商品化抗体，诸如阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、anatumomab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、atlizumab、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、贝纳利珠单抗、贝伐珠单抗、brentuximab、卡那单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、clivatuzumab tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库利珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、伊瑞西珠单抗、厄马索单抗、fanolesomab、Fbta05、芳妥珠单抗、吉姆单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥玛珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗、ibritumomab tiuxetan、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Trbs07、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、和/或brodalumab；和/或安芦珠单抗、巴匹珠单抗、dalotuzumab、demcizumab、ganitumab、伊珠单抗、mavrilimumab、moxetumomab pasudotox、利妥木单抗、sifalimumab、他尼珠单抗、tralokinumab、tremelimumab、urelumab、由杂交瘤10B5生成的抗体(参见Edelson&Unanue,Curr OpinImmunol,2000Aug；12(4):425-31)、B6H12.2(abcam)或其它抗CD47抗体(参见Chao等,Cell,142,699–713,2010年9月3日)；和/或具有SEQ ID NO:78-124,和/或125-170中任一项所列的序列的抗体或其片段。
在一些方面，抗体或片段特异性结合选自下组的抗原：CA-125、糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体、TNF-alpha、CD52、TAG-72、癌胚抗原(CEA)、白介素-6受体(IL-6R)、IL-2、白介素-2受体a链(CD25)、CD22、B细胞活化因子、白介素-5受体(CD125)、VEGF、VEGF-A、CD30、IL-1beta、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD3、EpCAM、EGF受体(EGFR)、MUC1、人白介素-2受体、Tac、RANK配体、补体蛋白、例如C5、EpCAM、CD11a、例如人CD11a、整联蛋白、例如alpha-v beta-3整联蛋白、玻连蛋白受体alpha vbeta3整联蛋白、HER2、neu、CD3、CD15、CD20(小和/或大环)、干扰素gamma、CD33、CA-IX、TNF alpha、CTLA-4、癌胚抗原、IL-5、CD3epsilon、CAM、Alpha-4-整联蛋白、IgE、例如IgE Fc区、RSV抗原、例如呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白、TAG-72、NCA-90(粒细胞细胞抗原)、IL-6、GD2、GD3、IL-12、IL-23、IL-17、CTAA16.88、IL13、白介素-1beta、beta-淀粉状蛋白、IGF-1受体(IGF-1R)、delta样配体4(DLL4)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体的alpha亚基、肝细胞生长因子、IFN-alpha、神经生长因子、IL-13、CD326、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，又称为CD274、B7-H1)、CD47、和CD137。
在一些方面，抗体或片段具有轻链，和/或具有重链，所述轻链具有依照Kabat编码方式的P8,V9或I9,I10或L10,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168,和/或Y173，所述重链具有依照Kabat编码方式的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V111,T110,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186,和/或L187。
还提供了含有与一个或多个中间位结合的一个或多个抗体(例如中间位使能性抗体)的复合物。抗体可以是本文中描述的任何中间位使能性抗体，诸如任何前述抗体(包括其片段)。一个或多个中间位可以包括任何一个或多个本文中描述的中间位，诸如那些在此部分中描述的中间位，包括单价和多价中间位，和经标记的中间位，及中间位融合蛋白。
还提供了中间位，例如分离的中间位。提供的中间位之一是那些上文描述的。提供的中间位之一是那些包含结合中间位使能性抗体的中间位结合位点的肽的中间位，其中所述肽不是SEQ ID NO:1或2的肽或自其衍生的环肽。在其它方面，中间位是SEQ ID NO:1或2的肽，或自其衍生的环肽。
在一些方面，中间位(例如肽)以小于为或大约10μM、小于为或大约5μM、或小于为或大约2μM、小于为或大约1μM、小于为或大约500、400、300、200、100nM，或更小，诸如为或大约200皮摩尔或更小的解离常数，例如以此类解离常数结合中间位结合位点，如通过特定技术，诸如表面等离振子共振(SPR)，等温滴定量热术(ITC)、荧光、荧光偏振、NMR、IR、量热术滴定；动力学排除；圆二色性、差别扫描量热术、或其它已知的方法，例如通过SPR测量的。
在一些方面，中间位结合位点包含依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体轻链的残基40,41,83和/或85，和/或依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体重链的残基39,89,105和/或108。
在一些方面，中间位结合具有包含SEQ ID NO:71中所列的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:72中所列的氨基酸序列的重链的中间位使能性抗体；具有具有SEQ ID NO:9中所列的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列的重链的中间位使能性抗体；和/或具有具有SEQ IDNO:68中所列的氨基酸序列的轻链和/或具有SEQ ID NO:70中所列的氨基酸序列的重链的中间位使能性抗体。
在一些方面，肽的长度为5-16个氨基酸。
在一些方面，肽具有式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(式I)
其中：
X1＝Cys、Gly、β-丙氨酸、2,3-二氨基丙酸、β-叠氮丙氨酸、或空；
X2＝Gln或空；
X3＝Phe、Tyr、β-β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、或4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、经修饰的Phe、能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X4＝Asp或Asn；
X5＝Leu；β-β’-二苯基-Ala；Phe；苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸的非天然类似物；能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X6＝Ser或Cys；
X7＝Thr或Ser或Cys；
X8＝Arg、经修饰的Arg、或能水合的含有羰基或硼酸的残基；
X9＝Arg、Ala；
X10＝Leu、Gln、Glu、β-β’-二苯基-Ala；Phe；苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸的非天然类似物；能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X11＝Lys；且
X12＝Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸、或空，
其中：
所述经修饰的Arg具有图34中所示的式的结构，
所述经修饰的Phe是具有掺入苯基环中的一个或多个卤素的Phe，且
式I不是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或自其衍生的环肽。
在一些方面，肽是环肽，诸如其中通过二硫化物桥、硫醚桥、内酰胺连接、环加成环化的环肽。在某些方面，在肽是式I之一的情况中，经由X1和X12、X1和X11、X3和X11、X4和X11、或X2和X12之间的连接环化。在一些方面，在肽是式I之一的情况中，非天然氨基酸是β-β’-二苯基-Ala、支链烷基、或延长的芳香族。在一些方面，在肽是式I之一的情况中，所述一个或多个卤素中的每个是正、间、或对溴苯基取代基。
提供的中间位之一是具有选自下组的氨基酸的肽或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:1,2和15-55，例如1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55，例如16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55中所列的序列。
在一些实施方案中，中间位包含式(X)的化合物或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代；
其中所述化合物不是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的化合物。
在一个实施方案中，中间位含有与中间位结合位点中的半胱氨酸共价结合的半胱氨酸。此类中间位可以与任何物质、分子或化合物(其可以是治疗性分子，诸如小分子诊断分子，诸如标志物)缀合。在一些方面，“Cys中间位”将缀合物引导至Ig并且经由共价连接结合。
提供的中间位之一还是经标记的中间位，诸如那些包含中间位(诸如上文描述的那些之任一种)和治疗剂或诊断剂的。在一些方面，治疗剂或诊断剂选自下组：与金属离子结合的金属螯合剂、小分子、化学治疗剂、治疗性抗体或功能性片段、毒素、放射性同位素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、寡核苷酸、有机或无机纳米颗粒、RNAi分子、siRNA、螯合剂、硼化合物、光敏剂(photoactive agent)、染料、荧光或发光物质、酶、增强剂、放射性物质、和螯合剂。
提供的中间位之一还是多价中间位，诸如那些包含两个或更多个中间位和一个或多个接头的多价中间位，例如其中两个或更多个中间位之每个是结合中间位使能性抗体的中间位结合位点的肽。此类多价中间位可以包含本文(例如上文)描述的任何中间位。在一个方面，两个或更多个中间位包含至少三个中间位，或至少四个中间位。在一个方面，一个或多个接头包括肽、小化学支架、生物素-链霉抗生物素蛋白、有机或无机纳米颗粒、多核苷酸序列、肽核酸、有机聚合物、或免疫球蛋白Fc域。
提供的实施方案之一还是中间位使能性抗体-中间位复合物，其包括那些含有任何中间位使能性抗体和本文中描述(例如上文描述)的任何中间位的。在一些情况中，肽以小于10μM的解离常数结合中间位结合位点，如通过表面等离振子共振(SPR)，或如上文描述的另一种亲和力测量的。
还提供了使用中间位和/或抗体，诸如任何上述中间位和/或抗体的方法。例如，提供了用于纯化中间位使能性抗体或其片段或表达中间位使能性抗体或其片段的细胞的方法。在一个方面，此类方法包括在所述中间位使能性抗体或片段结合肽的条件下使含有所述中间位使能性抗体、片段、或细胞的组合物与中间位接触的步骤。在一些方面，它们进一步包括然后分离抗体或片段或细胞。在一些方面，此类方法由此纯化抗体、片段或细胞。
在一些方面，中间位与固体支持物偶联。在一些方面，通过pH的变化实现分离或纯化。
还提供了组合物，例如药物组合物，其包含中间位(包括多价和经标记的中间位)、中间位使能性抗体、和复合物和/或本文(例如上文)描述的其它化合物。在一个例子中，组合物包含复合物、中间位、和/或中间位使能性抗体和药学可接受载体。
还提供了治疗方法，诸如那些通过对受试者施用此类药物组合物，或本文(例如上文)描述的任何中间位使能性抗体、中间位、复合物、和/或其它化合物实施的方法。在一个例子中，方法包括对受试者施用如上文描述的抗体或片段。
在一个例子中，治疗方法包括对受试者施用一个或多个中间位使能性抗体或片段，例如上文描述的那些中间位使能性抗体或片段之任一。在一个例子中，所述方法包括对受试者施用如上文描述的一个或多个中间位使能性抗体或片段，和中间位，例如上文描述的那些中间位之任一，包括多价中间位和与治疗剂或诊断剂偶联的中间位。在一个方面，序贯施用中间位使能性抗体或片段和一个或多个中间位。在另一个方面，将它们同时施用。一般地，一个或多个中间位包含结合中间位使能性抗体或片段的中间位结合位点的肽。在一个方面，使中间位使能性抗体或片段与一个或多个中间位结合，使得中间位使能性抗体和一个或多个中间位的施用包括施用中间位使能性抗体和中间位的复合物。在另一个方面，在施用一个或多个中间位前施用中间位使能性抗体。
在一些方面，一个或多个中间位与治疗剂偶联，诸如选自下组的治疗剂：药物、化学治疗剂、治疗性抗体、毒素、放射性同位素、酶、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料、金属、金属合金、和纳米颗粒。
还提供了诊断方法，诸如那些通过对受试者施用此类药物组合物，或本文(例如上文)描述的任何中间位使能性抗体、中间位、复合物、和/或其它化合物，并且检测施用的组合物、抗体、中间位、复合物和/或化合物对受试者中的物质，例如对抗原的结合实施的方法。在一些方面，诊断方法包括对受试者施用一个或多个中间位使能性抗体或其片段，例如上文描述的那些中间位使能性抗体或其片段之任一。在一些方面，它进一步包括检测抗体或片段对受试者中的抗原的结合。在一些方面，序贯施用中间位使能性抗体或片段和一个或多个中间位；在其它方面，将它们同时施用。在一个例子中，使中间位使能性抗体或片段与一个或多个中间位结合，使得中间位使能性抗体和一个或多个中间位的施用包括施用中间位使能性抗体和中间位的复合物。在另一个例子中，在施用一个或多个中间位前施用中间位使能性抗体。在一些方面，一个或多个中间位是多价中间位。在一些方面，中间位与诊断剂，诸如成像剂偶联，诸如选自下组的成像剂：荧光物质、发光物质、染料、指示剂、和放射性物质。在一些情况中，成像剂是DOTA。
还提供了用于生成中间位使能性抗体或其片段的方法，例如基于模板抗体进行。在一些方面，此类方法包括在模板抗体或其片段中实现一处或多处氨基酸取代。在一个例子中，取代包括依照Kabat编码方式的VL区的第40位、第41位、或第85位取代，和/或VH区的第40位或第89位取代。
在一些方面，所述方法生成结合中间位的中间位使能性抗体或其片段，所述中间位是具有选自下组的氨基酸序列的肽或自其衍生的环肽：SEQ IDNO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55中所列的序列。
在一些方面，模板抗体或片段选自下组：阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、anatumomab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、atlizumab、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、贝纳利珠单抗、贝伐珠单抗、brentuximab、卡那单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、clivatuzumab tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库利珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、伊瑞西珠单抗、厄马索单抗、fanolesomab、Fbta05、芳妥珠单抗、吉姆单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥玛珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗、ibritumomab tiuxetan、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Trbs07、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、和brodalumab，或者是由杂交瘤10B5生成的抗体，或者是B6H12.2。
在一些方面，中间位使能性抗体以特定的亲和力，诸如以小于10、5、或2(或上文规定的其它数目)μM的解离常数结合一个或多个中间位(例如SEQ ID NO:1,2或自其衍生的环肽之一)，例如上文描述的那些中间位，如通过SPR，或上文描述的其它方法测量的。
在一些方面，一处或多处氨基酸取代之每处在选自下组的位置处：依照Kabat编码方式的轻链的位置8,9,10,38,39,40,4142,43,44,45,82,83,84,85,86,87,99,100,101,102,103,104,105,142,162,163,164,165,166,167,168和173，和/或重链的位置6,9,38,39,40,41,42,43,44,45,84,86,87,88,89,90,91,103,104,105,106,107,108,109,110,147,150,151,152,173,174,175,176,177,185,186和187。在一些方面，中间位使能性抗体含有轻链和重链，所述轻链具有依照Kabat编码方式的P8,V9或I9,I10或L10,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168和Y173，所述重链具有依照Kabat编码方式的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V111,T110,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186和L187。
还提供了包含编码中间位使能性抗体和中间位的核苷酸序列的多核苷酸，及包含该多核苷酸的载体，和包含该载体的文库。
还提供了筛选方法，诸如那些包括如下步骤的方法：从文库表达抗体或其片段，并从表达的抗体或片段中选择抗体或其片段。在一些情况中，选择基于选择抗体或其片段的结合亲和力、pH耐受性、pH依赖性、毒性、PK、或PD，和/或通过使抗体或其片段与中间位接触，并检测对一个或多个抗体或其片段的结合实现。
还提供了用于选择中间位类似物或中间位变体的方法，包括那些如下的方法，其包括：(a)组合中间位和中间位使能性抗体或其片段，由此中间位非共价结合抗体或其片段；并(b)添加候选中间位变体或类似物；并(c)测量候选中间位变体或类似物对中间位的置换，其中候选变体或类似物对中间位的置换将其鉴定为中间位变体或类似物。
还提供了用于修饰中间位和中间位使能性抗体的方法，包括用于修饰中间位的方法，其包括对具有SEQ ID NO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55中任一项中所列的序列的肽或自其衍生的环肽实现一处或多处氨基酸取代、插入、或缺失，由此改变肽对中间位使能性抗体或其片段(诸如上文描述的那些中间位使能性抗体或其片段之任一)的结合亲和力的pH依赖性。在一些方面，所述方法降低在溶酶体pH水平时所述肽对所述抗体或片段的结合亲和力。在其它方面，所述方法提高低氧环境中的结合亲和力。
还提供了用于修饰中间位使能性抗体的方法，诸如那些如下的方法，其包括：在依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体的轻链的位置8,9,10,38,39,40,4142,43,44,45,82,83,84,85,86,87,99,100,101,102,103,104,105,142,162,163,164,165,166,167,168和/或173处或重链的位置6,9,38,39,40,41,42,43,44,45,84,86,87,88,89,90,91,103,104,105,106,107,108,109,110,147,150,151,152,173,174,175,176,177,185,186和/或187处实现一处或多处修饰。在一些方面，串联提供修饰方法，以生成彼此结合的经修饰的中间位和经修饰的中间位使能性抗体，诸如通过基于经修饰的中间位中的修饰在抗体中进行修饰，或者反之亦然进行。
还提供了中间位类似物，包括那些结合上文描述的任何中间位使能性抗体，和/或与上文描述的任何中间位具有相当的结合特性的中间位类似物。
附图简述
图1显示了结合西妥昔单抗框架环的中间位肽。图1A：西妥昔单抗Fab(轻链以VL和CL表示，重链以VH和CH表示)和环状CQFDLSTRRLKC(在阴影区内描绘，并用词语“中间位”标记)(SEQ ID NO:1)的复合物指示中间位结合Fab框架的界面，其与西妥昔单抗的CDR环截然不同。图1B(顶部)显示了cQFD中间位的棍表示和(底部)cQYN中间位的棍表示。N和C端半胱氨酸是溶剂暴露的，并且展现出高的热因数(thermal factor)。
图2显示了西妥昔单抗Fab结合界面的某些实施方案。西妥昔单抗是一种人-鼠嵌合物，并且因此具有鼠Ig可变域和人Ig恒定域的混合物。图2A显示了ch14.18和人源化曲妥珠单抗(trastuzumab)的残基，其对应于西妥昔单抗中与中间位接触的那些残基。图2B显示了cQFD中间位中占据由西妥昔单抗的鼠序列编码的独特袋(前景)的Arg9的立体视图。存在有从西妥昔单抗轻链的Asp85至中间位Arg9的胍盐基团和Leu10的主链酰胺的盐桥。
图3显示了cQFD和cQYN与固定化的Fab的表面等离振子共振(SPR)迹线。将用于结晶学研究的西妥昔单抗Fab以低密度与CM5芯片偶联。显示了递增浓度的cQFD(图3A)和cQYN(图3B)中间位的迹线。将一系列迹线拟合至样品1:1朗缪尔结合模型。拟合的残差各自在下方显示。
图4显示了如先前假设的，cQFD和cQYN中间位不结合西妥昔单抗的CDR。图4A显示了两个晶体结构(西妥昔单抗Fab及其抗原EGFR域III之一)的覆盖图，其它显示了cQFD中间位和西妥昔单抗Fab，其中cQFD中间位结合西妥昔单抗Fab的中心空穴。抗原EGFR域III在离中间位结合位点相当大距离处在互补决定区结合。图4B显示了左手侧的SDS-PAGE结果和右手侧的对应大小排阻层析结果。个别组分Fab、EGFR域III、和SMT-cQFD中间位、以及所有3种的混合物的大小排阻实验指示共洗脱的异三聚体复合物的形成。非还原性SDS-PAGE凝胶显示了首先洗脱的级分，其指示从混合物观察到的新峰(最左边的峰代表“复合物”，以浅灰色加阴影)内存在所有3种组分。图4C显示了FACS分析的结果，指示cQFD中间位仅在存在西妥昔单抗(箭头)的情况下结合EGFR阳性MD-MBA-468细胞。单独的中间位或在存在M425(一种鼠EGFR抗体)情况下的中间位不结合。图4D显示了使用与西妥昔单抗scFv或Fab偶联的传感器芯片的表面等离振子共振实验的结果。该实验指示在高达100μM浓度的cQFD中间位不能实现scFv的饱和。使用偶联有西妥昔单抗Fab的传感器芯片的相同实验指示完全饱和。来自此实验的解离常数是660nM。对照SPR实验(底部小图)显示了西妥昔单抗scFv容易地结合可溶性EGFR域III片段，指示CDR环是功能性的。
图5是与细胞计数相比荧光强度的图，并且显示了经荧光标记的西妥昔单抗在存在cQFD的情况下结合MDA-MB468细胞。西妥昔单抗在没有中间位的情况中、及在存在6μM和60μM中间位以及同种型对照的情况下结合MDA-MB468细胞。如预期的，图显示了同种型IgG对照对MDA-MB468细胞上的EGFR没有结合。
图6显示了中间位和EGFR如何结合不同位点。顶部图像显示了cQFD-Fab复合物和EGFR-Fab复合物(1YY8)的立体叠加。顶部图像显示了重链的残基39-46是柔性的，并且容纳该中间位。
图7显示了Fab框架结合剂。与中间位、蛋白A、和蛋白L结合的Fab的叠加指示每种结合西妥昔单抗Fab上的独特位点。
图8显示了一个实施方案中用于增强肿瘤疗法的作用机制。在例示的实施方案中，二价抗体结合肿瘤细胞上过表达的抗原(例如ErbB受体家族)(左侧小图)，并且阻断受体信号传导，改变胞吞和受体再循环和/或引发免疫应答。在一些情况中，与西妥昔单抗组合识别EGFR的不同域的抗体诸如马妥珠单抗(matuzumab)的添加可以是更有效的，这是由于表面受体的雏菊式链接所致(右侧小图1)。多价中间位(在此具体例子中为三价)拴系/交联治疗性单抗，并且可以增强其治疗潜力(右侧)。另外，多价中间位(在本文显示为三价型式)还可以携带成像剂，其可以容许增强的治疗学及成像两者。
图9显示了scFv-中间位接头。通过经由12-20个氨基酸的接头(典型为{GGGS}3-5)将轻链可变域与重链可变域融合(或反之亦然)来创建scFv。在此例子中，柔性接头序列的部分可以用中间位序列替换。
图10显示了来自SDS-PAGE的结果，其显示了与珠偶联的cQFD中间位可以结合西妥昔单抗。将生物素化的cQFD肽添加到偶联有亲合素的珠，彻底清洗，并在PBS中平衡。然后，将西妥昔单抗添加至珠(第1道)，清洗(第2道-第4道)，然后洗脱(第5道)。上部条带是IgG重链，而底部条带是IgG轻链。
图11是空间遮蔽(steric mask)的例示实施方案的绘图。在此例示性实施方案中，中间位经由含有肿瘤关联蛋白酶位点的柔性接头与Fab轻链或重链的N端融合以在空间上堵塞抗原结合位点。
图12显示了SPR测定的单价(左侧小图)和四价(右侧小图)中间位对西妥昔单抗的结合动力学。表面等离振子共振迹线上面的小图绘出了将单价中间位通过二价IgG的草图。如右侧小图显示的，将亲合素用生物素化的中间位饱和，并通过相同的固定化西妥昔单抗IgG。多价中间位的解离速率降低至少36倍。(注意到两个实验间的时间比例尺是不同的)。
图13显示了对于含有内酰胺连接的中间位，依照一些实施方案的二聚体和三聚体中间位的合成。
图14显示了用最终二价中间位的HPLC迹线及其质谱表征经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的中间位二聚体(图13中的“14”)。
图15显示了依照一些实施方案的中间位-Fc融合蛋白的核酸序列(SEQID NO:3)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图16显示了例示性的二价中间位。将中间位与肽接头的N端直接融合，所述肽接头与IgG的Fc区直接融合。在此例子中，由于Fc在表达过程中是天然同二聚化的，来自中间位-Fc构建体的终产物是二价的。
图17显示了监测单价和二价中间位对经西妥昔单抗预处理的EGFR表达细胞的结合的一系列例示性FACS分析的结果。将过表达EGFR的MDA-MB-468细胞用10nM西妥昔单抗预处理30分钟，漂洗，然后用4种浓度的中间位-Fc构建体或单体中间位处理。底部迹线为阴性对照(无抗体)。接着的4条迹线显示了单体中间位以浓度依赖性方式结合用西妥昔单抗预处理的细胞。顶部4条迹线也显示了二价中间位Fc以浓度依赖性方式，但是以更高的亲和力(即更向右移位)结合用西妥昔单抗预处理的细胞。这是预测到的并且与多价相互作用一致。
图18是可选中间位-Fc接头(螺旋卷曲)的描绘，其可以依照某些实施方案使用。
图19：通过NMR筛选片段。在添加西妥昔单抗之前(顶部迹线)和之后(底部迹线)的片段集合的代表性NMR谱。使用此方法，已经鉴定出先导化合物(例如那些在本文中显示的)，并且使用衍射研究来测定结合位点。
图20显示了使用定向随机文库(directed random library)来改变和/或增强单抗对中间位位点处结合的化合物或中间位的结合亲和力(或改变另一种特性)的例示性步骤。具体地，可以使用FAC分选(其中中间位和抗原用不同的生色团标记)选择基因文库，其中作为中间位结合位点衬里的单抗残基的密码子用NNK(其中N是任意核苷酸，而K是胸腺嘧啶或鸟苷)替换。在另一个实施方案中，用NNN取代密码子，其中N是任何核苷酸。GPI接头可以确保选出的单抗保持与用编码该基因序列的载体转染的细胞结合。对编码来自所选细胞的轻链和重链的基因测序会鉴定出高亲和力单抗。可以重复该方法来选择较高亲和力的中间位或中间位类似物。
图21显示了西妥昔单抗和曲妥单抗的序列差异的表面图像。顶部小图中的黑灰色区标示西妥昔单抗和完全人源化曲妥珠单抗框架之间的氨基酸差异。方框内部的某些残基已经突变到曲妥珠单抗框架上。已经鉴定出曲妥珠单抗的CDR环(黑色区；底部小图)，并嫁接到西妥昔单抗框架上。
图22显示了中间位使能性曲妥珠单抗结合中间位-Fc融合蛋白。在曲妥珠单抗(一种结合肿瘤抗原HER2的人源化单抗)上创建中间位结合位点。顶部小图中的FACS分析显示了中间位使能性曲妥珠单抗结合过表达HER2的SKBR3细胞(顶部两条迹线)。在底部图中，中间位-Fc结合中间位使能性曲妥珠单抗(顶部两条迹线，向右移位的峰)，但是不结合野生型曲妥珠单抗(从底部起第二个)或阴性对照(底部迹线)。
图23A显示了中间位使能性曲妥珠单抗重链序列的核酸(SEQ ID NO:5)序列。信号肽序列加以灰色阴影。图23B显示了与野生型(SEQ ID NO:7)相比，中间位使能性曲妥珠单抗重链序列的氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。差异以灰色突出显示。在图23B中显示的氨基酸后，显示的重链的人序列中没有剩余的差异。图23C显示了中间位使能性曲妥珠单抗轻链序列的核酸(SEQ IDNO:8)序列。信号肽序列加以灰色阴影。图23D显示了与野生型(SEQ ID NO:10)相比，中间位使能性曲妥珠单抗轻链序列的氨基酸(SEQ ID NO:9)序列。差异以灰色突出显示。
图24显示了含有西妥昔单抗样框架上嫁接的HER2结合CDR环的抗体结合HER2和中间位-Fc。在图24A中，FACS分析显示嫁接有HER2-CDR的中间位使能性单抗结合过表达HER2的SKBR3细胞(不同浓度的顶部3条迹线)。图24B显示了虽然中间位-Fc结合嫁接有HER2-CDR的中间位使能性单抗(顶部3条迹线：以浓度依赖性方式向右移位的峰)，但是它不结合野生型曲妥珠单抗(从底部起第二条)或阴性对照(底部迹线)。
图25A显示了具有分泌序列和工程化限制性位点(加下划线)的曲妥珠单抗重链的核酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。图25B显示了具有分泌序列和工程化限制性位点(加下划线)的曲妥珠单抗轻链的核酸(SEQ ID NO:13)和氨基酸(SEQ ID NO:14)序列。有阴影区标示例示性的残基，其在一些方面中可以改变为增强或改变中间位的特异性，或者可以参与与经修饰的表位的结合相互作用。
图26显示了IgG和IgE Fab域的序列和结构比对的例子，有阴影区标示与中间位结合位点附近的残基对应的某些残基。
图27是显示表面等离振子共振(SPR)研究的图。从pH＝4.0至pH＝8.0测定不同中间位对西妥昔单抗[cQFD(中间位1,SEQ ID NO:1)、cQYN(中间位2,SEQ ID NO:2)和cQYD(中间位16,SEQ ID NO:16)]的结合亲和力。
图28显示了比较二价中间位-Fc的效力与单体中间位抑制MDA-MB-468细胞生长的效力的MTT测定法结果。图28A显示了中间位-Fc，而非单体中间位在与西妥昔单抗组合时抑制细胞生长的研究的结果。图28B显示了与M425和西妥昔单抗的组合类似，中间位-Fc增强西妥昔单抗的细胞杀死能力。
图29显示了中间位对西妥昔单抗中间位结合位点(“西妥昔单抗结合”，如图中显示的)，而不对完全人源化框架(“曲妥珠单抗无结合”，如图中显示)或另一种鼠-嵌合物框架(“利妥昔单抗无结合”，如图中显示)的结合。将cQFD中间位(中间位1,SEQ ID NO:1)与CM5芯片缀合以进行表面等离振子共振研究，并且在浓度0.01、0.05、0.1、0.5和1μM测试西妥昔单抗(中间位结合Fab)、曲妥珠单抗(完全人源化框架)、和利妥昔单抗(鼠-人嵌合框架)。仅西妥昔单抗结合缀合有中间位的芯片。
图30显示了对中间位获得的生物物理数据。图30A显示了使用西妥昔单抗Fab芯片得到的未修饰的中间位cQFD(SEQ ID NO:1)和QYN中间位(SEQID NO:2)的SPR传感图。图30B显示了中间位(SEQ ID NO:1)和西妥昔单抗Fab的代表性结合等温线(顶部)和积分(底部)。图30C显示了这两个中间位的重叠。卵形1标示Phe/Tyr位置。箭头标示主链的移动，其导致有利的氢键网络，并且可以造成焓的有利变化。疏水性基团F/Y3L5和L10几乎相同定位，但是cQYN中间位中Y5的羟基基团阻止R8与Q105主链相互作用，如在cQFD中间位中观察到的(“空间碰撞”)。此重排还导致β-转角的主链残基的伴随变化(“主链旋转”)。图30D显示了通过不同中间位变体的ITC测定的个别热力学参数。Phe3Tyr变体(中间位2,SEQ ID NO:2)显示了ΔH的显著变化(尽管亲和力较低)。基于结构，SEQ ID NO:1的中间位中的Gln2用D-立体异构体替换。此中间位(SEQ ID NO:15)的ITC分析揭示了熵的显著升高和焓的损失。
图31显示了依照一些实施方案的中间位的化学结构。圆圈标示可以修饰为例如改善Fab的中间位亲和力的位置。框标示环化策略。“点击”化学和烯烃复分解(顶部和底部远右侧框)分别是用于环化中间位的其它路径。
图32显示了内酰胺(2,SEQ ID NO:32)和经荧光素标记的内酰胺(3)的合成。
图33显示了依照一些实施方案的优化位点。卵形标示单抗Fab区中可以用来优化中间位亲和力的空穴。
图34显示了经修饰的Arg8残基，其可以用于优化中间位结合参数，并且可以依照本文中描述的实施方案使用(R＝烷基、取代的烷基、芳香族或NHR”’，其中R”’＝烷基、取代的烷基、或芳香族)。
图35显示了中间位的.Phe3附近的亲水性界面。苯基环中掺入的卤素可以与西妥昔单抗Tyr87或Tyr91的羟基基团及与主链羰基形成强非共价键。
图36显示了中间位和西妥昔单抗主链之间的共价相互作用。能水合的侧链可以在Arg8(左侧)或Leu10(右侧)处掺入以与Fab的Ser或Tyr的羟基基团形成共价键。
图37显示了未标记的肽对西妥昔单抗和经荧光素标记的肽之间的相互作用的剂量依赖性抑制的荧光偏振测定法。测定法鉴定小分子化合物，其可以与中间位竞争单抗结合，因此可以开发为与中间位以类似的方式发挥功能。作为对照，证明了未标记的中间位可以置换经荧光标记的中间位。三个时间点的置换平衡指示测定法是强力的且适合于高通量筛选。
图38显示了从荧光偏振筛选鉴定的5种先导化合物。
图39显示了与SEQ ID NO:22(A),SEQ ID NO:16(B),SEQ ID NO:17(C),SEQ ID NO:18(D),SEQ ID NO:15(E),SEQ ID NO:23(F),SEQ ID NO:24(G),SEQ ID NO:25(H),SEQ ID NO:32(I),SEQ ID NO:33(J),SEQ ID NO:34(K),SEQ ID NO:35(L),SEQ ID NO:36(M),SEQ ID NO:37(N),SEQ ID NO:38(O),SEQ ID NO:39(P),SEQ ID NO:40(Q)和SEQ ID NO:41(R),SEQ ID NO:42(S),SEQ ID NO:43(T),SEQ ID NO:44(U),SEQ ID NO:46(V)SEQ ID NO:49(W),SEQ ID NO:51(X),SEQ ID NO:52(Y),SEQ ID NO:53(Z),SEQ IDNO:54(AA)和SEQ ID NO:55(BB)对应的18种经修饰的中间位的棒结构。表3和4中显示了这些结构的序列。
图40是一张表，其显示了图39中显示的结构和表3和4中的其它中间位的X-射线衍射数据。
图41显示了中间位变体的代表性表面等离振子共振研究。基于cQFD中间位中Phe3His突变的结构信息，在第3位具有β,β’-二苯丙氨酸的合成变体中间位(顶部迹线)。通过表面等离振子共振观察到约4倍的对西妥昔单抗的结合亲和力显著改善。使用氨基己酸替换初始中间位的二硫化物桥(底部迹线)。虽然结合亲和力降低，这些数据指示可以对中间位进行修饰以解决动物和人研究中药动学、药效学和毒性的潜在问题。注意到，此组合可以与中间位内其它位置处的非天然氨基酸组合。
图42显示了可以用于例如改善中间位亲和力的结构信息。顶部小图显示了中间位结合的西妥昔单抗的晶体结构，显示了西妥昔单抗的Fab空穴内结合的Phe3。用组氨酸对此位置的取代及随后的结构分析指示侧链(咪唑)呈现新的构象(中间小图)。基于此观察结果，在第3位取代β,β’-二苯丙氨酸，其可以放置初始位置处的一个苯基侧链和咪唑环处的一个苯基侧链。晶体结构指示此取代模拟这两个侧链构象。表面等离振子共振研究显示了此替代物以较高的亲和力结合(图41，顶部小图)。
图43显示了研究结果，其表明本文中提供的中间位使能性曲妥珠单抗与野生型曲妥珠单抗具有相似的对抗原的结合亲和力，如实施例4中描述的。
图44显示了实施例4中描述的研究的结果，其证明了用中间位使能性曲妥珠单抗(TM)预结合的HER2表达细胞，而非那些用野生型曲妥珠单抗(WTT)预结合的细胞结合cQFD(SEQ ID NO:1)中间位-蛋白L融合(MPL)。没有预结合的抗体(仅MPL(WT))的对照细胞也不结合MPL。
图45显示了实施例4中描述的研究结果，其证明了用中间位使能性曲妥珠单抗(TM)预结合的HER2表达细胞(SKBR3)，而非那些用野生型曲妥珠单抗(WT T)预结合的细胞结合cQFD(SEQ ID NO:1)中间位-蛋白L融合，其中蛋白L中1个赖氨酸外全部突变为精氨酸和天冬酰胺(MPL-5K)。没有用任何抗体(仅MPL(WT))预结合的对照细胞也不结合MPL-5K。
图46显示了实施例4中描述的研究结果，其证明了中间位以类似的程度结合中间位使能性曲妥珠单抗，无论抗体在与中间位一起温育前与表达抗原的细胞预结合(左侧小图)还是将中间位-蛋白L和抗体预混合然后与表达抗原的细胞一起温育(右侧小图)。TM＝中间位使能性曲妥珠单抗。图注中显示了相对于无处理对照的MPL阳性细胞百分比。
图47A显示了嫁接有CDR的中间位使能性曲妥珠单抗(具有嫁接到西妥昔单抗样框架上的曲妥珠单抗样CDR)的轻链核酸(SEQ ID NO:61)和轻链氨基酸(SEQ ID NO:61)序列，信号序列和其它残基有阴影。图47B显示了此抗体的重链核酸(SEQ ID NO:62)和重链氨基酸(SEQ ID NO:63)。
图48显示了与西妥昔单抗Fab片段结合的中间位54(参见表4)的结构(背部视图)，第5位β,β’-二苯丙氨酸中间位(SEQ ID NO:18,中间位18)和cQFD(中间位1,SEQ ID NO:1)的结构重叠。
图49显示了研究的结果，其中将经Alexa488标记的中间位-Fc融合蛋白(600nM,180nM或60nM)与用西妥昔单抗或M425(小鼠抗EGFR抗体)预标记的MDA-MB-468细胞一起温育30分钟，并且通过FACS分析分析抗体结合和中间位结合。
图50(顶部小图)显示了与西妥昔单抗结合的中间位18(SEQ ID NO:18，表3中所示，在第5位具有β,β’-二苯丙氨酸)(暗灰色棒)、与中间位使能性曲妥珠单抗结合的相同中间位(18)(白色棒)、和野生型曲妥珠单抗(略图)的结构的棒表示(重叠)。底部小图显示了比较野生型和中间位使能性曲妥珠单抗的带状草图。
图51在上左小图中显示了曲妥珠单抗和曲妥珠单抗memab(在此图中，曲妥珠单抗memab标记为“中间位使能性Memab”)的结构的重叠，在中间位使能性抗体中中间位结合中涉及的某些残基以棒显示。上右小图显示中间位使能性曲妥珠单抗(memab)和西妥昔单抗的结构重叠，标记相同残基。底部小图显示了重叠的所有三种这些结构的“草图/带状图”。
图52显示了中间位(第3位β,β’二苯基)、蛋白L(左侧)、蛋白A(右侧)和Fab(灰色草图)的结构。蛋白L和中间位中在本文中描述的MPL中突变的赖氨酸以黑色显示。
图53显示了中间位-蛋白L融合(MPL)的表面等离振子共振(SPR)数据：顶部小图显示了以多至10nM的浓度对中间位使能性曲妥珠单抗添加的MPL的迹线。拟合数据指示165pM的结合亲和力。底部小图显示了以相同浓度对中间位使能性曲妥珠单抗添加的蛋白L(唯一)的迹线，显示了在此浓度时没有结合。
图54显示了GPI连接的中间位使能性曲妥珠单抗结合中间位-蛋白L(MPL)融合蛋白。使用1x10^6个细胞/样品。通过温和移液将细胞从板取出，并将其用PBS中的0.1％BSA(w/v)清洗一次。将经AF647标记的MPL在清洗缓冲液中稀释至10nM，并于RT与细胞一起温育30分钟。将细胞清洗两次，然后通过FACS分析。
图55A显示了人IgG2,IgG4,IgG3和IgG1的CH1域(SEQ ID NO:64-67)之间的序列比较。图55B显示了定位到西妥昔单抗和中间位1(SEQ ID NO:1,cQFD)的共晶体结构上的这些序列之间的差异。
图56显示了与野生型M5A轻链序列(SEQ ID NO:69)相比中间位使能性(“medi”)抗CEA抗体(中间位使能性M5A)(SEQ ID NO:68)轻链的氨基酸序列。有阴影的残基表示8处点突变，其在M5A抗体的轻链中引入，容许其结合中间位(为了参照，重链M5A序列在SEQ ID NO:70中列出)。
图57显示了FACS分析的结果，证明了中间位使能性M5A抗体(M5A8M)对LS174T细胞上M5A抗原(CEA)的结合。
图58显示了与M5A8M中间位使能性抗体结合的5-二苯基中间位的表面等离振子共振(SPR)数据。
图59显示了用HPLC迹线及其质谱图表征中间位54。
图60显示了自120:1(DOTA-NHS:MPL)的起始物质比率形成的DOTA-NHS-MPL缀合物的质谱图。
图61A显示了与Alexa555-西妥昔单抗一起预温育，然后与Alexa488-中间位-Fc一起温育的MDA-MB-468细胞。使用DAPI作为复染剂。用OlympusAX70自动立式显微镜(Automatic Upright Microscope)拍摄图像。白色箭头标示阳性中间位-Fc染色。图61B显示中间位-Fc-阳性细胞的量化。柱形图显示中间位-Fc-阳性细胞占从两个视野计算的来自经西妥昔单抗预处理或未处理的样品的总细胞的百分比。
发明详述
A.定义
如本文中使用的，“抗体”指与抗原或表位特异性结合或者与其有免疫学反应性的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体两者，及功能性抗体片段，包括但不限于片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链可变片段(scFv)和单域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体(nanobody))片段。术语“抗体”包括免疫球蛋白的遗传工程化或其它方式修饰的形式，诸如内体(intrabody)、肽体(peptibody)、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体、中间位使能性抗体和异缀合物抗体(例如双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、串联双-scFv、串联三-scFv)。除非另有陈述，术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。
术语“互补性决定区”和“CDR”在本领域中是已知的，指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的非连续氨基酸序列。一般地，存在有每个重链可变区中的3个CDR(CDR-H1,CDR-H2,CDR-H3)和每个轻链可变区中的3个CDR(CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3)。“框架区”和“FR”是本领域中已知的，指重链和轻链的可变区的非CDR部分。一般地，存在有每个重链可变区中的4个FR(FR-H1,FR-H2,FR-H3和FR-H4)，和每个轻链可变区中的4个FR(FR-L1,FR-L2,FR-L3和FR-L4)。
可以使用许多公知方案之任一种，包括那些由Kabat等(1991),“Sequencesof Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等,(1997)JMB273,927-948(“Chothia”编号方案),MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis andbinding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(Contact”编号方案),Lefranc MP等,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,”Dev CompImmunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”编号方案),及Honegger A andPlückthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool,”J Mol Biol,2001Jun8；309(3):657-70,(AHo编号方案)描述的方案，容易地确定给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界。
给定CDR或FR的边界可以随用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案两者的编号方式基于最常见的抗体区序列长度，插入以插入字母提供，例如，“30a”，且缺失存在于一些抗体中。两种方案在不同位置处放置某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)，导致差异的编号方式。Contact方案基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面类似于Chothia编号方案。
下文表1列出了CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3和CDR-H1,CDR-H2,CDR-H3的位置，如分别通过Kabat,Chothia和Contact方案鉴定的。对于CDR-H1，使用列出的Kabat和Chothia编号方案两者给出残基编号方式。注意到，由于Kabat编码方案在H35A和H35B处放置插入，在使用Kabat编码约定编号时Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，这取决于环的长度。
表1。
1-Kabat等(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等,(1997)JMB273,927-948
因此，除非另有规定，给定抗体或其区域(诸如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或个别规定CDR(例如“CDR-H1,CDR-H2”)应当理解为涵盖(或特定)互补决定区，如由任何已知方案定义的。同样地，除非另有规定，给定抗体或其区域(诸如其可变区)的“FR”或“框架区”或个别规定的FR(例如“FR-H1,FR-H2)应当理解为涵盖(或特定)框架区，如由任何已知方案定义的。在一些情况中，规定用于鉴定一种特定的CDR,FR或者多种FR或CDR的方案，诸如如由Kabat,Chothia或Contact法规定的CDR。在其它情况中，给出CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“中间位使能性”抗体和“meMAb”指能够经由中间位结合位点结合中间位的抗体或其功能性片段。中间位使能性抗体的例子包括但不限于西妥昔单抗和本文描述的其它抗体。“中间位结合位点”是中间位使能性抗体中含有与结合的中间位相互作用的氨基酸残基的区域，所述残基包括重链和轻链的框架区(FR)残基。通过参照抗体的Fab片段或Fab部分，中间位结合位点位于Fab片段或部分的中心空穴内。
“中心空穴”就Fab的三维结构而言指重链和轻链可变和恒定区的一部分做衬里的Fab内部空穴。因此，中心空穴以VH,VL,CH1和CL区的残基做衬里，并且不包含抗原结合位点。
在一些实施方案中，中间位结合位点包含依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体的轻链的残基40,41,83和85，和/或依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体的重链的残基39,89,105和108。
在一些实施方案中，中间位结合位点位于由依照Kabat编码方式的抗体的轻链的残基8,9,10,38,39,40,4142,43,44,45,82,83,84,85,86,87,99,100,101,102,103,104,105,142,162,163,164,165,166,167,168和173和重链的残基6,9,38,39,40,41,42,43,44,45,84,86,87,88,89,90,91,103,104,105,106,107,108,111,110,147,150,151,152,173,174,175,176,177,185,186和187形成的空穴内。
就中间位使能性抗体的Fab部分而言，中间位结合位点包括中心空穴内的残基。中间位结合位点通常进一步包含恒定区残基。
如本文中使用的，术语“中间位”指结合中间位使能性抗体的中间位结合位点的一种或多种肽，所述抗体具有依照Kabat编码方式的其轻链的第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、和第85位天冬氨酸，或者含有中间位结合位点，该中间位结合位点含有与西妥昔单抗、中间位使能性曲妥珠单抗或中间位使能性M5A(本文中公开)的中间位结合位点内的那些残基对应的残基。例示性中间位包括但不限于cQFD和cQYN肽及其变体(“中间位变体”或“变体中间位”)及多价且经标记的中间位。其它分子也可以以与中间位的那些特征相似的功能性特征结合中间位使能性抗体的中间位结合位点。此类分子，即中间位类似物可以包括但不限于能够与中间位结合相同中间位结合位点的小分子、适体、核酸分子、肽体和任何其它物质。
如本文中使用的，“治疗剂”是可用于治疗疾病或状况的原子、分子或化合物。
“治疗有效量”、“治疗有效浓度”或“治疗有效剂量”是在受试者中产生期望的治疗效果，如预防或治疗目标状况、减轻与该状况有关的症状、产生期望的生理学效果、或允许导致疾病或状况治疗的状况成像或诊断的化合物量。精确的治疗有效量是就给定受试者中的治疗效力而言会产生最有效结果的组合物量。此量会随多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗性化合物的特征(包括活性、药动学、药效学和生物利用度)、受试者的生理学状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的响应性、和药物类型)、配制物中一种或多种药学可接受载体的性质、和施用路径。临床和药理学领域的技术人员会能够经由常规实验，即通过监测受试者对化合物施用的响应并相应地调节剂量来确定治疗有效量。关于更多指导，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Univ.ofSciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2005。
“药学可接受载体”指牵涉将感兴趣的化合物从一种组织、器官或身体部位携带或运输到另一种组织、器官或身体部位的药学可接受材料、组合物或媒介物。例如，所述载体可以是液体或固体充填剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、或包囊材料、或其某种组合。载体的每种组分必须是“药学可接受的”，这在于它必须与配制物的其它成分相容。它还必须适合于与其可能遇到的任何组织、器官、或身体部位接触，这意味着它必须没有携带毒性、刺激、变应性应答、免疫原性或任何其它超出其治疗益处的并发症的风险。
“施用路径”可以指本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠、鼻、眼、口、胃肠外、直肠、经皮、或阴道。“经皮”施用可以使用表面乳膏或软膏剂，或依靠经皮贴片来实现。“胃肠外”指一般与注射有关的施用路径，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心脏内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。
在本文中在多种药剂、治疗剂或治疗的背景中使用时，“组合”或“与…组合”意味着在受试者中治疗同一疾病或状况的过程中以任意次序使用两种或更多种药剂、药物、治疗方案、治疗形态或其组合(例如与中间位或多价拴系剂组合的抗体)。这包括同时施用(或“共施用”)、在施用第二药剂之前或之后施用第一药剂、以及以相隔长达几天的时间间隔次序。这类组合治疗还可以包括任何一种或多种药剂、药物、治疗方案或治疗形态的超过单次施用。此外，可以通过相同或不同施用路径来施用两种或更多种药剂、药物、治疗方案、治疗形态或其组合。
“治疗性抗体”可以指用于治疗癌症、自身免疫性疾病、移植物排斥、心血管疾病或其它疾病或状况(如本文中描述的那些疾病或状况)的任何抗体或其功能性片段。可以依照本文中描述的实施方案使用的治疗性抗体的例子包括但不限于鼠抗体、鼠源化或人源化嵌合抗体或人抗体，包括但不限于Erbitux(西妥昔单抗)、ReoPro(阿昔单抗)、Simulect(巴利昔单抗)、Remicade(英夫利昔单抗)；Orthoclone OKT3(莫罗单抗-CD3)；Rituxan(利妥昔单抗)、Bexxar(托西莫单抗)、Humira(阿达木单抗)、Campath(阿仑单抗)、Simulect(巴利昔单抗)、Avastin(贝伐珠单抗)、Cimzia(赛妥珠单抗pegol)、Zenapax(达克珠单抗)、Soliris(依库利珠单抗)、Raptiva(依法利珠单抗)、Mylotarg(吉姆单抗)、Zevalin(ibritumomab tiuxetan)、Tysabri(那他珠单抗)、Xolair(奥玛珠单抗)、Synagis(帕利珠单抗)、Vectibix(帕木单抗)、Lucentis(兰尼单抗)、和Herceptin(曲妥珠单抗)。
“治疗”或“处理”状况可以指预防状况、延缓状况的发作或形成速率、降低形成状况的风险、预防或延迟与状况有关的症状的进展、减少或终止与状况有关的症状、对状况产生完全或部分消退、或其某种组合。
如本文中使用的，术语“包括”、“含有”、和“包含”以其开放的，非限制性意义使用。
如本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确叙述。
为了提供更简明的描述，本文中给出的一些定量表示用术语“约”限定。应当理解，不管术语“约”明确使用与否，本文中给定的每个量意图指实际给定数值，并且还意图指基于本领域普通技术人员会合理推断的此类给定数值的近似值，包括由于此类给定数值的实验和/或测量条件所致的等值和近似值。
如本文中使用的，“烷基”指具有1至12个碳原子的饱和的、直链的或支链的烃基。代表性烷基基团包括但不限于甲基、乙基、n-丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、n-戊基、异戊基、新戊基、n-己基等，和较长的烷基基团，诸如庚基、辛基，等等。术语“Cx-y烷基”在x和y是整数的情况中指具有x-y碳原子的烷基。
如本文中使用的，“烯基”指其中具有一个或多个双键并且具有2至12个碳原子的直链或支链烃基。例示性烯基基团包括但不限于乙基烯基(ethylenyl)、乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基，等等。术语“Cx-y烯基”在x和y是整数的情况中指具有x-y碳原子的烯基。
术语“烷基烯基”或“亚烷基”指二价烷基基团。术语“亚烯基”或“亚烯基”指二价烯基基团。
如本文中使用的，“炔基”指其中具有一个或多个三键并且具有2至10个碳原子的直链或支链烃基。例示性的炔基基团包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基、4-丁基-2-己炔基，等等。
“芳香基”意指单、二、或三环芳香族基团，其中基团的所有环是芳香族的。对于二环或三环系统，单独的芳香族环彼此融合。例示性的芳香基基团包括但不限于苯基、萘和蒽。
术语“硼酸酯”指取代基–B(OR)2，其中每个R基团独立是C1-4烷基，或者一起采用的两个R基团形成C2-6亚烷基。
术语“缩醛”指–CH(OR)2基团，其中每个R基团独立是C1-4烷基，或者一起采用的两个R基团形成C2-6亚烷基。例示性的缩醛基团包括二甲基缩醛或二乙基缩醛，或环缩醛。术语“缩酮”指–C(OR)2-基团，其中每个R基团独立是C1-4烷基，或一起采用的两个R基团形成C2-6亚烷基。例示性的缩酮包括二甲基缩酮或二乙基缩酮，或环缩酮。
术语“卤代”代表氯代、氟代、溴代、或碘代。在一些实施方案中，卤代是氯代、氟代、或溴代。如本文中使用的，术语“卤素”指氯、氟、溴、或碘。
术语“原酸酯”指–C(OR)3基团，其中每个R基团独立是C1-4烷基，一起采用的两个R基团形成C2-6亚烷基。
术语“氧代”意指＝O基团，并且可以附接于碳原子或硫原子。
术语“磷酸酯”指–P(O)(OR)2基团，其中每个R基团独立是C1-4烷基，或者一起采用的两个R基团形成C2-6亚烷基。
如本文中使用的，术语“环烷基”指具有3至15个环碳原子的饱和的或部分饱和的，单环的，融合多环的，桥接多环的，或螺旋多环的碳环。环烷基基团的非限制性种类是具有3至6个碳原子的饱和的或部分饱和的，单环的碳环。环烷基基团的例示性例子包括但不限于以下模块：
如本文中使用的，术语“5元杂芳香基”指具有选自下组的5环原子的单环、芳香族杂环：碳、氧、氮、和硫。5元杂芳香基基团的例子包括但不限于咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异口恶唑基、噻唑基、口恶唑基、异噻唑基、吡咯基、和噻二唑基。5元杂芳香基的具体例子包括那些可以通过1,3-环加成反应诸如叠氮化物和炔丙基基团之间的Huisgen反应形成的。
如本文中使用的，术语“取代的”意指规定基团或模块携带一个或多个合适的取代基。如本文中使用的，术语“未取代的”意指规定的基团不携带取代基。如本文中使用的，术语“任选取代的”意指规定的基团是未取代的或者被规定数目的取代基取代。在术语“取代的”用于描述结构系统的情况中，取代意指在系统上的任何价容许位置处发生。
如本文中使用的，表述“一个或多个取代基”意指可以在系统上的任何价容许位置处发生的1至最大可能数目的取代。在某个实施方案中，“一个或多个取代基”意味着1,2,3,4或5个取代基。在另一个实施方案中，一个或多个取代基意味着1,2或3个取代基。
本文中用不饱和价表示的任何原子假设具有足够数目的氢原子来满足原子的价。
在任何变量，诸如烷基、R3、或R5在本文中提供的任何式或描述中在超过一个位置中出现时，每次出现的所述变量的定义在每隔一次出现时不依赖于其定义。
如本文中使用的，许多范围意图包括连续的整数。例如，以“从0至4”或“0-4”表示的范围包括0,1,2,3和4。
在显示多功能性模块时，对核心的附接点以线或连字符指示。例如，-OH指其中氧原子是羟基基团与分子的剩余部分的附接点的模块。
本文中给出的任何式意图代表具有以结构式描绘的结构的化合物及某些变型或形式。例如，本文中给出的任何式的化合物可以具有不对称或手性中心，因此以不同立体异构形式存在。认为通式化合物的所有立体异构体(包括光学异构体、对映体、和非对映体)及其混合物落入式的范围内。此外，某些结构可以以几何异构体(即顺式和反式异构体)，以互变异构体，或者以阻转异构体存在。所有此类异构形式及其混合物作为本发明的一部分涵盖在本文中。因此，本文中给出的任何式意图代表外消旋物、一种或多种对映体形式、一种或多种非对映体形式、一种或多种互变异构或非互变异构形式，及其混合物。
非对映体混合物可以通过本领域技术人员公知的方法，诸如例如通过层析和/或分步结晶基于其物理化学差异分成其单独的非对映体。对映体可以如下分开，即通过与合适的光学活性化合物(例如手性助剂诸如手性醇或Mosher酸性氯化物，或非对映体盐混合物的形成)的反应将对映体混合物转化成非对映体混合物，分开非对映体，并将个别非对映体转化(例如水解或脱盐)成相应的纯的对映体。对映体也可以通过使用手性HPLC柱分离。本发明的化合物的手性中心可以称为“R”或“S”，如由IUPAC1974推荐定义的，或以与肽文献一致的“D”或“L”名称命名。
如本文中使用的，用下标绘出的结构部分周围的框标示框内出现的结构片段依照下标重复。例如，子结构：
其中x是0、1、或2，指片段是结构中缺乏的，或者是–片段-，或者是–片段-片段-。例如，在式(X)内，以下子结构：
其中p是0或1，意味着框内的–X-NH-基团是结构中缺乏的(p是0)，或者存在一次(p是1)。
本发明的化合物可以形成药学可接受盐，其也在本发明的范围内。“药学可接受盐”指本文中描述的化合物的游离酸或碱的盐，其是无毒的，是生理学可容许的，与其配制的药物组合物相容的，并且在其它方面适合于配制和/或对受试者施用。提及本文中的化合物理解为包括提及所述化合物的药学可接受盐，除非另有指示。
化合物盐包括与无机和/或有机酸形成的酸式盐，及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。另外，在给定的化合物含有碱性模块(诸如但不限于吡啶或咪唑)和酸性模块(诸如但不限于羧酸)两者的情况中，本领域技术人员会认可化合物可以以两性离子(“内盐”)存在；此类盐包括在如本文中使用的术语“盐”内。可以制备本发明的化合物的盐，例如，通过在介质(诸如盐沉淀的介质)中或水性介质中使化合物与一定量的合适的酸或碱(诸如等量)起反应，接着冻干进行。
例示性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐(isonicotinate)、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐(tannate)、泛酸盐(pantothenate)、酒石酸氢盐(bitartrate)、抗坏血酸盐(ascorbate)、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucuronate)、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(“mesylate”)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonate)、和扑酸盐(pamoate)(即1,1’-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。药学可接受盐可以涉及包括另一个分子诸如醋酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子(counterion)。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机模块。此外，药学可接受盐在其结构中可以具有超过一个带电荷的原子。多个带电荷的原子是药学可接受盐的部分的例子可以具有多个抗衡离子。因此，药学可接受盐可以具有一个或多个带电荷的源自和/或一个或多个抗衡离子。
例示性的酸加成盐包括乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、延胡索酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(naphthalenesulfonate)、硝酸盐、草酸盐、磷酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐(tartarate)、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(又称为甲苯磺酸盐)，等等。
例示性的碱式盐包括铵盐、碱金属盐，诸如钠、锂、和钾盐、碱土金属盐，诸如钙和镁盐、与有机碱(例如，有机胺)诸如二环己胺、叔丁基胺的盐，和与氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸等的盐。含有氮的碱性基团可以用诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、和丁基氯、溴和碘)、二烷基硫酸盐(例如二甲基、二乙基、和二丁基硫酸盐)、长链卤化物(例如癸基、月桂酰、和硬脂酰氯、溴和碘)、芳烷基卤化物(例如苄基和苯乙基溴)等试剂季化。
另外，一般认为适合于从药用化合物形成药学有用的盐的酸和碱例如由P.Stahl等,Camille G.(编)Handbook of Pharmaceutical Salts.Properties,Selection and Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge等,Journal ofPharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.Gould,International J.ofPharmaceutics(1986)33201-217；Anderson等,The Practice of MedicinalChemistry(1996),Academic Press,New York；及于The Orange Book(Food&Drug Administration,MD,可获自FDA)讨论。这些公开内容通过对其的提及并入本文。
另外，本文中描述的任何化合物意图还指此类化合物的任何未溶解形式、或水合物、溶剂合物、或多晶形及其混合物，即使此类形式没有明确列出。“溶剂合物”意指本发明的化合物与一种或一种溶剂分子的物理结合。此物理结合牵涉不同程度的离子和共价键合，包括氢键键合。在某些情况中，溶剂合物会能够分离，例如在一种或多种溶剂分子掺入晶体固体的晶格时。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离溶剂合物两者。合适的溶剂合物包括那些与药学可接受溶剂诸如水、乙醇等形成的。在一些实施方案中，溶剂是水，且溶剂合物是水合物。
本文中给予的任何式也意图代表化合物的未标记的形式及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有以本文中给予的式描述的结构，只是一个或多个原子用具有选定的原子量或质量数的原子替换。可以掺入本发明的化合物中的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯、和碘，诸如2H,3H,11C,13C,14C,15N,18O,17O,31P,32P,35S,18F,36Cl和125I各自的同位素。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(例如用14C)、反应动力学研究(用例如2H或3H)、检测或成像技术[诸如正电子成象术(PET)或单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography,SPECT)]，包括药物或底物组织分布测定法，或者在患者的放射性治疗中。特别地，经18F或11C标记的化合物可以特别适合于PET或SPECT研究。此外，用较重同位素诸如氘(即2H)的取代可以提供源自较大代谢稳定性的某些治疗优点，例如延长的体内半衰期或降低的剂量需要。本发明的同位素标记的化合物及其前药一般可以通过实施方案或例子中公开的程序和下文描述的制备来制备，其通过用容易可用的同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂进行。
B.抗体和抗体结合物质
本文中提供了抗体，包括单克隆抗体(单抗)及其片段，例如功能性片段，和包含结合抗体的肽(诸如中间位和中间位类似物)的化合物和组合物。物质(例如中间位)一般结合抗体和片段中与互补决定区(CDR)不同(例如分开)的区域/结合位点，通常结合抗体和片段的框架区(FR)和/或恒定区内的残基。还提供了含有抗体和物质(例如中间位)的复合物、化合物、和组合物，及其方法和用途，包括抗体和物质的治疗、诊断、研究、和其它用途，以及其生成方法。
在某些方面，提供的实施方案基于本文中描述的发现，即某些肽C-QFDLSTRRLK-C(cQFD；SEQ ID NO:1)和C-QYNLSSRALK-C(cQYN；SEQ ID NO:2)非共价结合鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗，其通过与互补决定区(CDR)外部的残基(包括框架和恒定区中的残基)相互作用进行。也如本文中描述的，结合这些肽的能力基于对西妥昔单抗特异性的某些方面，并且在本文中的研究中，没有观察到结合，例如，对完全人抗体、鼠抗体、或其它嵌合抗体的结合。如本文中表明的，这些中间位能够与其抗原同时结合嵌合抗体。参见图4。如本文中表明的，西妥昔单抗上这些中间位的结合位点也与其它框架结合抗原诸如超抗原葡萄球菌蛋白A(SpA)和大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白L(PpL)的结合位点不同(图7)。在某些方面，提供的实施方案基于此发现，例如，通过修饰其它单抗以容许其对这些和其它中间位的结合(即“中间位使能性”)，并生成变体中间位和/或改变的中间位使能性抗体，例如，那些具有改变的特性(包括改善的结合亲和力、毒性、PK/PD、和/或pH依赖性)的。
C.中间位使能性抗体和复合物
提供了中间位使能性抗体，其能够经由中间位结合位点结合一个或多个中间位。在一些情况中，中间位使能性抗体结合SEQ ID NO:1或2(中间位1或2)的环肽和/或其一种或多种变体，诸如中间位1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54或55(基于具有SEQ ID NOs:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54或55中所列序列的肽的中间位)，或者在一些情况中，中间位1、2、或15-55中任一项。提供的中间位使能性抗体之一是那些以与西妥昔单抗的亲和力相似的亲和力结合一个或多个中间位的抗体。例如，在某些方面，抗体以小于为或大约10μM，小于为或大约5μM，或小于为或大约2μM，小于为或大约1μM，小于为或大约500,400,300,200,100nM或更小，诸如为或大约200皮摩尔或更小的解离常数结合中间位。在一些情况中，解离常数(诸如本文中列出的那些解离常数中任一项)是使用特定技术，诸如表面等离振子共振(SPR)，等温滴定量热术(ITC)、荧光、荧光偏振、NMR、IR、量热术滴定；动力学排除(Kinetic exclusion)、圆二色性、差别扫描量热术、或其它已知的方法测量的。例如，在一些情况中，类似物或中间位展现出小于为或大约10μM，小于为或大约5μM，或小于为或大约2μM，小于为或大约1μM，小于为或大约500,400,300,200,100nm或更小的结合常数，如通过SPR测量的或者通过ITC测量的或者通过这些中的任何方法测量的。
在一些例子中，中间位结合位点是单克隆抗体西妥昔单抗(一种用于治疗EGFR表达性转移性结肠直肠癌和头和颈癌的人-鼠嵌合抗体)的结构特征。因此，在一些情况中，中间位结合位点含有与西妥昔单抗的中间位结合位点内的那些残基对应的残基。在本文中报告的研究中，x-射线结晶学分析已经揭示了SEQ ID NO:1的肽以约700nM的结合常数结合西妥昔单抗Fab片段的中心空穴内以重链和轻链的多个残基(参见图1和4A)限定的中间位结合位点(参见图30A-30B)。
西妥昔单抗的中间位结合位点与cQFD(SEQ ID NO:1，中间位1)和cQYN(SEQ ID NO:2，中间位2)中间位之间的几种相互作用基于西妥昔单抗的特定结构特征，特别是在Fab片段的中心空穴的框架和恒定区内。西妥昔单抗中构成中间位结合位点的区域是独特的，并且表现为是此抗体的嵌合性质的结果。具体地，Fab可变区(Fv)是鼠的，而Fab恒定区(CH1和CL)是人的。此Fab的工程化改造产生不存在于鼠和人嵌合抗体的序列比对中的残基组合。例如，本文中的数据显示了中间位不结合完全人IgG框架(例如曲妥珠单抗)，其它嵌合抗体，诸如利妥昔单抗(图29)，或小鼠抗体，这确认了西妥昔单抗中间位结合位点是高度特异性的。在这些结果外，将曲妥珠单抗(1N8Z；Cho等,Nature,“Structure of the extracellular region of HER2alone and incomplex with the Herceptin Fab,”2003Feb13；421(6924):756-60)和利妥昔单抗(2OSL；Du等,J Biol Chem,2007May18；282(20):15073-80.Epub2007Mar29)Fab的分子结构重叠到中间位结合的西妥昔单抗Fab结构上进一步突出显示了框架的独特性。将多个人和鼠Fab重叠到西妥昔单抗-环肽(中间位1)结构上指示此肽与鼠-人嵌合Fab之间的关键相互作用是本研究中比较的仅人的和仅鼠的IgG结构中缺乏的。cQFD环肽(中间位1)内的关键残基的点突变降低其对西妥昔单抗Fab的结合亲和力，进一步确认了高特异性和结构模型。因此，相互作用表现为对此特定鼠-人嵌合Fab的中心空穴和选择的中间位是特异性的。
在某些实施方案中，利用中间位和西妥昔单抗结合位点之间的独特相互作用来生成其它中间位使能性抗体。中间位使能性抗体可用于例如改善抗体和细胞纯化方法，改善单抗的治疗功效，增强成像或治疗剂的靶向投递，包括在预靶向投递和成像中，以及改善基于单抗的成像方法，和在一些方面中广泛适用于任何单克隆抗体。
在一些实施方案中，中间位使能性抗体如下生成，即修饰与西妥昔单抗不同的抗体(有时称为模板抗体)，诸如具有与西妥昔单抗的那些CDR不同的一个或多个CDR的抗体，以赋予结合一个或多个提供的中间位，诸如SEQ IDNO:1或2的中间位或其变体的能力。模板抗体可以是人的或人源化的抗体或小鼠抗体。在一个方面，修饰包括取代Fab片段的中心空穴内，通常重链和轻链可变区和/或恒定区的框架区(FR)内的残基以使模板抗体成为中间位使能性。例如，在模板抗体是人的或人源化的抗体的情况中，修饰一般包括重链和轻链可变区FR内的残基处的取代。在一些实施方案中，此类残基用存在于西妥昔单抗中的相应残基，或相当的氨基酸替换。如此，在某些实施方案中，人的或人源化的抗体的FR内的残基用相应的鼠残基替换；在某些实施方案中，它们用其它残基，诸如那些具有用于与中间位相互作用的相似官能团或模型的残基替换。通常，用相应的鼠(或其它)残基替换的残基存在于中心Fab空穴内，因此不被暴露于免疫系统。因而，在一些实施方案中，在对人受试者投递的背景中，在人的或人源化的抗体中引入这些氨基酸取代不提高或基本上不提高经修饰的模板抗体的抗原性。另外，抗原性预测算法可以进一步用于指示具有点突变的人序列不应是抗原性的。
在一些实施方案中，替换的一个或多个残基选自依照Kabat编码方式的轻链框架残基10,39-43,83,85,100和104(参见Kabat E.A.,等(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242，通过提及将其完整并入本文)，和/或依照Kabat编码方式的重链框架残基号40、89和105(参见图2)。一般地，除非另有规定，抗体的重链或轻链中的氨基酸位置指Kabat编码方式。本公开内容内还涵盖其它抗体中与本文中描述的西妥昔单抗残基(诸如西妥昔单抗中间位结合位点内的那些残基)对应的残基。在一些实施方案中，模板抗体中与轻链残基9,10,39,40,41,42,43,83,85,100和/或104,和/或重链残基40,89和/或105对应的残基例如用存在于那些在西妥昔单抗内的位置处的氨基酸替换。
在一个实施方案中，替换的一个或多个残基是轻链框架残基，包括但不限于依照Kabat编码方式的40,41,83和85。在一个实施方案中，用苏氨酸替换轻链残基40；用天冬酰胺替换轻链残基41，用异亮氨酸或缬氨酸替换轻链残基83，和/或用天冬氨酸替换轻链残基85。在一个具体的例子中，用Thr(P40T)或Ser(P40S)替换轻链框架Pro40，用Asn(G41N)替换轻链框架Gly41，用Ile(F83I)或Val(F83V)替换轻链框架残基Phe83，并用Asp(T85D)或Asn(T85N)替换轻链框架残基Thr85。
因此，提供的中间位使能性抗体之一是具有与在西妥昔单抗或其它中间位使能性抗体，诸如本文中描述的那些抗体，包括中间位使能性曲妥珠单抗和中间位使能性M5A的中间位结合位点内的位置对应的残基处的一处或多处修饰，通常为氨基酸取代的抗体。抗体之一是那些具有的VL区具有依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸、第41位除甘氨酸外的残基、和第85位天冬氨酸或天冬酰胺的抗体，例如，具有的VL区具有第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、和第85位天冬氨酸的抗体。在一些实施方案中，抗体具有依照Kabat编码方式具有第40位丝氨酸和第89位异亮氨酸的VH区和/或具有第40位丝氨酸或脯氨酸和第89位异亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、或色氨酸的VH区。在一些实施方案中，VL区具有第10位异亮氨酸或亮氨酸和/或第83位异亮氨酸。在一些实施方案中，VL区具有第9位缬氨酸或异亮氨酸和/或第100位除谷氨酰胺外的残基。
在一些例子中，依照Kabat编码方式，VL区具有第9位缬氨酸或异亮氨酸、第10位异亮氨酸或亮氨酸、第39位精氨酸、第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、第42位甘氨酸、第43位丝氨酸、第83位异亮氨酸、第85位天冬氨酸、和第100位丙氨酸；且VH区具有第40位丝氨酸和第89位异亮氨酸。
在一些例子中，VL区不含依照Kabat编码方式的第40位脯氨酸、第41位甘氨酸、或第85位苏氨酸，和/或VH区不含依照Kabat编码方式的第40位天冬酰胺或丙氨酸或第89位缬氨酸。在一些例子中，VL区不含依照Kabat编码方式的第10位丝氨酸、第40位脯氨酸、第41位甘氨酸、第83位苯丙氨酸、或第85位苏氨酸，和/或VH区不含依照Kabat编码方式的第40位天冬酰胺或丙氨酸或第89位缬氨酸。
在一些方面，抗体具有轻链和/或重链，所述轻链具有依照Kabat编码方式的P8,V9或I9,I10或L10,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168和Y173，所述重链具有依照Kabat编码方式的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V109,T110,V111,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186,和L187。
在其它实施方案中，经由CDR嫁接生成中间位使能性抗体，其通常通过修饰中间位使能性抗体，诸如本文中描述的任何中间位使能性抗体的重链和/或轻链的一个或多个互补决定区(CDR)(例如CDR1-3中的一个或多个)，以将它们用其它CDR，诸如现有或新抗体的CDR替换。CDR嫁接是用于生成人源化单克隆抗体的标准实践，例如通过将非人物种(诸如小鼠)中生成的抗体的CDR嫁接到人抗体框架上进行。参见美国专利No.5,558,864和8,133,982；Kettleborough等,“Humanization of a mouse monoclonal antibody byCDR-grafting:the importance of framework residues on loop conformation,”Protein Eng.,4:773-783(1991)。因此，在某些实施方案中，通过嫁接先存或新生成的感兴趣抗体的CDR改变中间位使能性抗体的抗原特异性。提供的中间位使能性抗体之一还是此类嫁接有CDR的中间位使能性抗体。
在一些实施方案中，生成中间位使能性抗体，其使用本文中公开的抗体之一(例如西妥昔单抗、中间位使能性曲妥珠单抗、或中间位使能性M5A(抗CEA)抗体)作为模板序列，并且实施改变其(例如改变其抗原结合特征)的一种或多种已知抗体工程化方法，生成具有独特特征的中间位使能性抗体进行。通常用于改变抗原结合和其它特性的已知抗体工程化方法包括各种体外随机化、亲和力成熟、和选择方法，包括易错PCR、掺入PCR(spiked PCR)、定点诱变、噬菌体展示和其它选择方法。还提供了用于实施此类方法的构建体、文库、和表达系统，其包含GPI关联表达系统。
如此，在某些实施方案中，提供的中间位使能性抗体具有轻链和/或重链可变区，其具有中间位使能性抗体，诸如西妥昔单抗、中间位使能性曲妥珠单抗、或中间位使能性M5A的一个或多个框架区(FR)(或与此类抗体的FR具有至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％同一性的FR)。在一些方面，此类抗体具有与所述中间位使能性抗体的CDR不同的一个或多个CDR。
例如，在一些实施方案中，VL区具有包含SEQ ID NO:71中所列轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:71的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4)和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:71中所列的轻链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列；和/或VH区具有具有SEQ ID NO:72中所列重链序列的重链FR1(FR-H1),FR-H2,FR-H3和/或FR-H4(或与SEQ ID NO:72的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4和在一些方面至少一个与SEQID NO:72中所列的重链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VL区具有包含SEQ ID NO:9中所列轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:9的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4)和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:9中所列的轻链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列；和/或VH区具有具有SEQ ID NO:6中所列重链序列的重链FR1(FR-H1),FR-H2,FR-H3和/或FR-H4(或与SEQ ID NO:6的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:6中所列的重链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VL区具有包含SEQ ID NO:68中所列轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:68的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4)和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:68中所列的轻链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列；和/或VH区具有具有SEQ ID NO:70中所列重链序列的重链FR1(FR-H1),FR-H2,FR-H3和/或FR-H4(或与SEQ ID NO:70的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:70中所列的重链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VL区具有包含SEQ ID NO:61中所列轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3和/或FR-L4(或与SEQ ID NO:61的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-L1,FR-L2,FR-L3,和/或FR-L4)和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:61中所列的轻链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列；和/或VH区具有具有SEQ ID NO:63中所列重链序列的重链FR1(FR-H1),FR-H2,FR-H3和/或FR-H4(或与SEQ ID NO:63的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4至少为或大约75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98或99％相同的FR-H1,FR-H2,FR-H3和/或FR-H4和在一些方面至少一个与SEQ ID NO:63中所列的重链序列的CDR不同的CDR的氨基酸序列。
在一些实施方案中，中间位使能性抗体具有一个或多个与SEQ ID NO:6,7,9,10,12,14,61,63,68,69,70,71,和/或72中所列的CDR不同的CDR。
在一些实施方案中，中间位是与西妥昔单抗不同的抗体，不特异性结合EGFR，结合与EGFR不同的抗原，和/或不特异性结合EGFR上被西妥昔单抗特异性结合的表位。
在一些例子中，基于选自下组的模板抗体生成中间位使能性抗体：阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、anatumomab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、atlizumab、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、贝纳利珠单抗、贝伐珠单抗、brentuximab、卡那单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、clivatuzumab tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库利珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、伊瑞西珠单抗、厄马索单抗、fanolesomab、Fbta05、芳妥珠单抗、吉姆单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥玛珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗、ibritumomab tiuxetan、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Trbs07、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、brodalumab、安芦珠单抗、巴匹珠单抗、dalotuzumab、demcizumab、ganitumab、伊珠单抗、mavrilimumab、moxetumomab pasudotox、利妥木单抗、sifalimumab、他尼珠单抗、tralokinumab、tremelimumab、由杂交瘤10B5生成的抗体、B6H12.2、和urelumab、其片段、具有其CDR和/或抗原结合区的抗体、和/或与此类抗体竞争结合的抗体；和/或具有SEQ ID NO:78-124和/或125-170中任一项所列序列的抗体，其片段、具有其CDR和/或抗原结合区的抗体、和/或与此类抗体竞争结合的抗体。
表2列出某些抗体的登记号(参见www.cas.org/expertise/cascontent/registry/regsys.html)。
表2.
在其它例子中，模板抗体选自：阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、anatumomab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、atlizumab、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、贝纳利珠单抗、贝伐珠单抗、brentuximab、卡那单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、clivatuzumab tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库利珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、伊瑞西珠单抗、厄马索单抗、fanolesomab、Fbta05、芳妥珠单抗、吉姆单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥玛珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗、ibritumomab tiuxetan、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Trbs07、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、由杂交瘤10B5生成的抗体和brodalumab或tiuzetan。在一些此类例子中，一个或多个CDR是存在于这些模板抗体中的CDR，和/或抗体与此类抗体特异性结合相同抗原或表位，和/或与此类抗体竞争对其抗原的结合。
因此，在一些情况中，中间位使能性抗体(包括其片段)特异性结合选自下组的抗原：CA-125、糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体、TNF-alpha、CD52、TAG-72、癌胚抗原(CEA)、白介素-6受体(IL-6R)、IL-2、白介素-2受体a链(CD25)、CD22、B细胞活化因子、白介素-5受体(CD125)、VEGF、VEGF-A、CD30、IL-1beta、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD3、EpCAM、EGF受体(EGFR)、MUC1、人白介素-2受体、Tac、RANK配体、补体蛋白、例如C5、EpCAM、CD11a、例如人CD11a、整联蛋白、例如alpha-v beta-3整联蛋白、玻连蛋白受体alpha v beta3整联蛋白、HER2、neu、CD3、CD15、CD20(小和/或大环)、干扰素gamma、CD33、CA-IX、TNF alpha、、CTLA-4、癌胚抗原、IL-5、CD3epsilon、CAM、Alpha-4-整联蛋白、IgE、例如IgE Fc区、RSV抗原、例如呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白、TAG-72、NCA-90(粒细胞细胞抗原)、IL-6、GD2、GD3、IL-12、IL-23、IL-17、CTAA16.88、IL13、白介素-1beta、beta-淀粉状蛋白、IGF-1受体(IGF-1R)、delta样配体4(DLL4)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体的alpha亚基、肝细胞生长因子、IFN-alpha、神经生长因子、IL-13、PD-L1、CD326、CD47、和CD137。在一些例子中，中间位使能性抗原结合鉴定为感兴趣的疾病或状况(诸如癌症或其它疾病)中的靶物的另一种抗原。
中间位使能性抗体一般进一步包含恒定区，通常为重链和轻链恒定区，其一般是人或部分人恒定区。在一些方面，重链恒定区包括CH1或其部分。在一些方面，轻链恒定区包含CL或其部分。在一些实施方案中，恒定区的部分足以使抗体能够结合中间位，例如以需要的结合亲和力。在一些方面，恒定区是西妥昔单抗或曲妥珠单抗的恒定区。因此，在一些方面，重链恒定区是一个或多个人IgG1恒定区；在一些方面，轻链恒定区是kappa恒定链区。在其它例子中，恒定区可以包括其它同种型的那些恒定区，包括人(或其它生物体，例如鼠或鸡)IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgEs,IgA1,IgA2,IgD或IgM，并且可以包含kappa或lambda恒定区。因此，提供的中间位使能性抗体之一那些通过在其它IgG，诸如人、鼠、或鸡、或其它免疫球蛋白中的残基突变生成的。换言之，本文中提供的中间位使能方法可以用于任何抗体，包括IgA,IgE,IgD和IgM及生成抗体的任何生物体，包括但不限于鸡、鼠、大鼠、牛、兔、灵长类、和山羊。
例如，图55A中比较人IgG1,IgG2,IgG3和IgG4的第一恒定区(CH1)的序列。图55B显示了与IgG1CH1相比，定位到西妥昔单抗和cQFD中间位(中间位1,SEQ ID NO:1)的共晶体结构上的IgG2-4CH1的序列差异。如图中显示的，这些同种型间不同的残基不在西妥昔单抗的中间位结合区内，这确认中间位使能技术可适用于与西妥昔单抗的IgG1不同的同种型。作为另一个例子，IgG1和IgE Fab域的序列和结构比对指示IgE上在中间位结合位点附近的残基(图26)。
可以使用提供的用于单克隆抗体内Fab空穴的中间位位点嫁接的方法来创建中间位结合的独特手段，并且与先前公开且用于新生成的抗体的技术一起使用。在某些实施方案中，可以在先存的和所有未来的单克隆抗体上创建中间位结合位点。
如下文在F小节中描述的，还提供了用于修饰中间位使能性抗体，例如，以改变中间位使能性抗体的各个特性，包括与中间位相互作用的方面，包括亲和力、亲合力、pH依赖性，及其它方面，包括抗体的药动学(PK)和药效学(PD)的方法。因此，提供的中间位使能性抗体之一也是依照那些方法，例如通过产生药效团结合模型生成的那些经修饰的抗体，包括具有下文F小节中描述的任何一处或多处修饰的抗体。
用作模板抗体以生成中间位使能性抗体的抗体之一也是经修饰的抗体及其部分，诸如CovX-BodyTM。因此，提供的中间位使能性抗体之一是CovX-body，其修饰为容许其对一个或多个提供的中间位的结合，例如以如本文描述的亲和力。
还提供了含有与中间位使能性抗体(诸如本文中描述的任何抗体)结合的一个或多个中间位的复合物。
还提供了编码中间位使能性抗体的核酸，诸如cDNA和RNA分子，和含有该核酸的载体和文库，及其使用方法，包括选择和表达方法和使用此类构建体生成转基因动物的方法。
D.中间位
还提供了结合中间位使能性抗体的中间位，包括变体、经修饰的、和多价的中间位，及含有该中间位的复合物和组合物，及其方法和用途。在某些实施方案中，中间位包括中间位1和2(cQFD(SEQ ID NO:1)和cQYN(SEQ IDNO:2))，其最初鉴定为结合西妥昔单抗CDR区的候选肽，如由Riemer,等(2004)；J Immunol173,394-401；Riemer,等(2005)；J Natl Cancer Inst97,1663-1670描述的。如本文中表明的，cQFD和cQYN中间位结合西妥昔单抗内与西妥昔单抗CDR不同的位点，因此不可能是用作疫苗的特定西妥昔单抗样抗体免疫原的候选物。
还提供了编码中间位(包括中间位变体和多价中间位)的核酸及含有该核酸的载体、细胞、文库和其它系统。
I.变体中间位
提供的中间位之一是与中间位1或2(SEQ ID NO:1或2的中间位)相比具有一处或多处修饰，例如结构修饰的中间位变体(又称作变体中间位)，及其生成方法。在一些实施方案中，cQFD和cQYN中间位在中间位变体设计中用作起始点。在一些方面，中间位变体设计为例如与未修饰的中间位cQFD和cQYN相比，具有改变的特性，诸如升高或改变的亲和力、改变的pH依赖性、或在不同生理学条件下对一种或多种提供的中间位使能性抗体(包括西妥昔单抗和本文中描述的其它抗体)的不同亲和力。使用多种化学和生物物理方法设计并生成中间位变体。
中间位变体包括但不限于对中间位，例如cQFD和cQYN及本文中描述的其它中间位掺入修饰的变体。合适的修饰包括但不限于本领域已知的任何肽修饰，诸如但不限于对肽环化方式和/或位置的修饰，对环肽的一个或多个氨基酸组分的修饰，或者从环肽添加或删除一个或多个氨基酸。在一个具体的例子中，cQFD可以以下列一处或多处修饰改变：Arg8修饰、Phe3修饰、Leu5修饰、Leu10修饰、对肽环化模式的改变和/或在一个或多个位置处掺入能水合的羰基官能性，和一处或多处氨基酸删除或添加。在cQYN的情况中，合适的修饰可以包括下列一处或多处：Arg8修饰、Leu5修饰、Leu10修饰、对肽环化模式的改变和/或在一个或多个位置处掺入能水合的羰基官能性，和一处或多处氨基酸删除或添加。可以将中间位内的某些氨基酸位置删除或者用不同的天然氨基酸或非天然氨基酸替换，或者中间位可以与片段化学缀合。本文中显示了其中SEQ ID NO:1的Arg9已经突变为瓜氨酸的中间位结合西妥昔单抗。另外，可以延长氨基酸羧基端，额外的氨基酸超出中间位变体的环部分(即在环部分外)以与Fab产生额外的接触。例如，已经对cQFD中间位的C端添加蛋白L，并且初步数据显示了这以高得多的亲和力结合。此类修饰在实施例6和7中进一步讨论。
在一些实施方案中，中间位包括表3和4中列出的那些中间位，及具有额外的氨基酸的此类中间位，诸如那些长度长达16个氨基酸的。例如，在一些方面，中间位是中间位1，2，或15-55之一，其进一步包含第一残基(即第0位)前的丝氨酸。表3中所列的中间位采用二硫化物连接来连接C和N端(只是中间位31含有额外的尾部，这意味着二硫化物连接不在两个末端残基之间)；对于表4中的肽，使用内酰胺桥，即与二硫化物不同的连接(诸如[3+2]环加成)，或不使用连接(例如无环或线性变体)。可以依照本文中描述的实施方案使用的别的中间位包括如本文的肽限定的任何中间位，其结合西妥昔单抗或任何其它治疗性抗体的抗体框架结合界面(即Fab轻链和重链之间)。例如，在环肽cQFD和cQYN外，一些实施方案包括cQFD和cQYN的一个或多个变体。
表3：
表4
中间位变体通常具有长度为5-16个氨基酸，例如5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或16个氨基酸，诸如长度为8-13个氨基酸，例如长度为9-12个氨基酸的氨基酸序列长度。另外，中间位可以另一种分子(诸如另一种肽，包括接头或药剂)缀合或联合(例如作为融合蛋白或肽的一部分)。如此，在此情况中，含有中间位的化合物可以含有超出此段中描述的长度的额外氨基酸残基，其中中间位部分含有5-16个氨基酸，并且复合物或化合物含有额外的氨基酸。本文中描述了例子，例如上述SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，变体中间位是环肽。在其它实施方案中，它们是线性或环肽。
中间位可以包括肽或源自此类肽的环肽，例如，其中肽具有下式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(式I)，
例如，其中：
X1＝Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮丙氨酸、或空；
X2＝Gln或空；
X3＝Phe、Tyr、β-β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、或4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、经修饰的Phe、能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X4＝Asp或Asn；
X5＝Leu；β-β’-二苯基-Ala；Phe；苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸的非天然类似物；能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X6＝Ser；
X7＝Thr或Ser；
X8＝Arg、经修饰的Arg、或能水合的含有羰基或硼酸的残基；
X9＝Arg、Ala；
X10＝Leu、Gln、Glu、β-β’-二苯基-Ala；Phe；苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸的非天然类似物；能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X11＝Lys；且
X12＝Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸、或空。
在一些方面，经修饰的Arg具有图34中显示的式的结构。在一些方面，经修饰的Phe是具有掺入苯环中的一个或多个卤素的Phe。在一些方面，式I不是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，中间位是具有式(X)的结构的肽或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代；
其中所述化合物不是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的化合物。
在一些情况中，此类中间位不是SEQ ID NO:1或2，或不是源自此类序列的环肽，和/或不是中间位1或2。
在式(X)的中间位的一些实施方案中，m是0,1或2。在其它实施方案中，R3是H或苯基，且R3’是苯基、2-溴苯基、3-溴苯基、或4-溴苯基。在其它实施方案中，R5是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、或叔丁基，其各自任选用氧代、-B(OH)2、-CO2H、或–CONH2基团，或者用一个或两个苯基基团取代，所述苯基基团各自任选用溴或氯取代基取代。在其它实施方案中，R8是-OH、-NH2、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re。仍在其它实施方案中，Rc是H或甲基，Rd是H或C1-4烷基，且Re是C1-4烷基，或–NH(C1-4烷基)。在其它实施方案中，R9是甲基或乙基，其任选用-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2取代。仍在其它实施方案中，R10是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、或叔丁基，其各自任选用氧代、-B(OH)2、-CO2H、或–CONH2基团取代。仍在其它实施方案中，–X-NH-是–Cys-Cys-,-Gly-Gly-,-C(O)(CH2)6-NH-,-β-Ala-β-Ala-,-C(O)CH(NH2)CH2CH＝CHCH2CH(CO2H)-NH-,-C(O)CH(NH2)CH2NHC(O)CH2CH(CO2H)-NH-,-β-Ala-C(O)CH2CH(CO2H)-NH-或–C(O)CH(NH2)CH2-三嗪基-CH2-CH(CO2H)-NH-。
修饰
基于结构和热力学数据，本文中描述的中间位1和2内的多个位置已经鉴定为修饰的靶位点(例如用不同天然或非天然氨基酸)以增强总体结合亲和力和/或改变如本文中描述的另一种特性。此类修饰包括但不限于cQFD或cQYN的修饰以生成头尾环状内酰胺肽、Arg8的修饰、第3位(例如cQFD或其变体的Phe3)的修饰、Leu5的修饰、Leu10的修饰、和/或能水合的羰基官能性的掺入(参见图31)。如本文中表明的，cQFD的初始中间位中Phe3、Leu5和Arg8中每个至丙氨酸的突变将所得化合物对中间位使能性抗体结合界面的亲和力降低10–140倍。在一些方面，变体中间位包括那些在SEQ ID NO:1或2的中间位或表3或4中列出的其它中间位的位置1,3,5,8,10和12中的一个或多个处的修饰的。
第8位
在一些实施方案中，中间位变体含有与中间位1或2的第8位(Arg8)对应的位置中的修饰。在未修饰的中间位(cQFD；SEQ ID NO:1)中，Arg8是延长的，与中间位使能性抗体重链的Q105的重链羰基形成氢键。此残基周围的紧接区域是疏水但溶剂暴露的(图33A)。在一些方面，中间位在此位置处含有经修饰的残基(例如经修饰的Arg8)。在一些例子中，经修饰的残基维持可用于中间位使能性抗体H键合的Arg8残基的亚胺(iminium)官能性，并且引入取代的或未取代的疏水性臂以填充空穴。此类修饰由于熵增加而导致结合的显著增加，如通过配体停靠计算支持的。此类修饰可以通过使用N-烷基胍盐基团，或烷基-脒官能性引入。在任一种情况中，末端N原子的取代基团可以是烷基或芳香基，其中烷基或芳香基基团的每个位置可以任选用包括末端位置在内的基团内的其它官能性取代。在一个例子中，用经修饰的精氨酸(经修饰的Arg8)(其具有如图34中所示的结构)取代中间位，例如SEQ ID NO:1或2且在NH2上具有丁基基团(在图34中显示为NHR)的中间位的Arg8。在一些方面，变体中间位含有第8位的正丁基-精氨酸或丁基脒修饰。
第3位
在一些实施方案中，中间位变体含有与第3位对应的位置(诸如中间位1的Phe3)中的修饰。如本文中关于结构数据显示的，与cQFD(SEQ ID NO:1)相比，中间位变体Phe3Tyr cQYN(SEQ ID NO:2)的羟基基团在Arg8侧链的延长构象中具有变化(参见图30C和35)。本文中的数据提示了有利氢键网络的形成，其中水与Fab结合。焓驱动的优化在药物设计的许多小分子办法中已经成功是成功的，并且在提供的中间位中有熵工程化增加的机会。在一些实施方案中，导致中间位设计中的焓和/或熵增加的方法用于生成变体中间位，例如以优化结合。
例如，在与中间位使能性抗体结合时，Phe3的疏水性苯环周围有中间位使能性抗体Fab的相当极性的一批侧链残基(图35)。在一些实施方案中，在此残基的苯环上引入一个或多个卤素，以容许与极性侧链残基的卤素键合相互作用。卤素键是相对较强的非共价键，其与氢键相似，但是牵涉卤素诸如溴或氯(或其它卤素)与氧原子的相互作用。在一些方面，此位置处的残基修饰为并入卤素取代基。在一些方面，用2-溴-、3-溴-、或4-溴苯丙氨酸替换Phe3，以替换适合于卤素与中间位使能性抗体的键合的位置中的溴原子，例如分别在中间位使能性抗体的位置Tyr87(轻链)、Gln38、和/或Tyr91(重链)处。此类苯丙氨酸衍生物是商品化的，并且在一些方面通过固相肽合成(SPPS)并入环肽中间位变体中。例示性变体中间位包括那些在与中间位1的Phe3对应的位置中的2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸或4-溴-L-苯丙氨酸的。
在另一个例子中，中间位在此位置处掺入别的苯基基团，例如，通过用β,β’-二苯丙氨酸替换Phe3进行。
第5位和第10位(例如中间位1或2的Leu5，Leu10)
在一些实施方案中，中间位变体含有与中间位1或2的第5位或第10位(Leu5或Leu10)对应的位置中的修饰。如本文中显示的，中间位1的Leu5和Leu10的侧链与中间位使能性Fab西妥昔单抗进行疏水性接触(参见图36，右侧小图；Leu10)。在某些实施方案中，改变中间位的一种或多种特性(例如亲和力)，其通过在这些位置之一或两处掺入不同天然氨基酸，或者非天然氨基酸，例如由此改变可以延长的表面积的量进行。在一个实施方案中，在一个或两个位置处经由SPPS系统性引入天然氨基酸(Phe/Tyr/Trp)和非天然类似物(例如β,β’-二苯基-L-丙氨酸或掺入包括支链烷基、延长的芳香族诸如萘基，或其它疏水性基团的侧链的氨基酸)。
“能水合的”官能性
在某些实施方案中，通过与掺入能水合的官能性的中间位形成共价键，经由选择性包载利用中间位使能性抗体中间位结合位点周围的一个或多个携带羟基的Fab侧链。因此，在一些实施方案中，中间位含有一个或多个具有能水合取代基的残基，例如以产生与中间位使能性抗体或其它物质的高度选择性但不可逆的相互作用。例如，中间位1的Arg8在依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体的轻链Ser43()和重链Tyr91()附近延长(图36，左侧小图)。在中间位的Arg8或Leu10的末端掺入能水合的官能性会容许丝氨酸或酪氨酸半缩醛的选择性形成。此类共价加合物基本上会提供不可逆的结合。另外，也可以将含有硼酸的残基以能水合的基团整合入中间位中。硼酸在bortezamib()(其用于治疗多发性骨髓瘤)的结构活性中发挥重要作用。能水合残基的其它代表性例子也在图34中显示，其中R＝-CH2CHO或–CH2B(OH)2。在一些例子中，使用SPPS通过掺入含有此类基团的残基制备此类变体。
此类能水合的策略可以应用于工程化改造抗体Fab-中间位结合位点内的新氨基酸残基，并且在中间位的不同位置内引入需要的互补“能水和的”官能性。可以如下应用类似的策略，即将半胱氨酸残基引入Fab区中，并且使用此官能性以在中间位内含有的“能水合的”官能性，诸如亲电羰基基团或其衍生物上的亲核攻击或者在Fab区和含有必需的硫醇或硫醇等同官能性的中间位之间产生选择性二硫键(-S-S-)。此想法的其它实施方案会包括引入中间位中含有的Michael接受体，诸如α,β-不饱和羰基官能性。公知的是这些官能性与硫醇选择性起反应以形成稳定的共价碳-硫键。
可选的环化策略和二硫化物桥的替换
在某些实施方案中，变体中间位包括二硫化物桥，如在cQFD和cQYN中。二硫化物桥可以通过两个半胱氨酸残基的侧链的反应形成。在某些实施方案中，将中间位(例如中间位1或2)中的二硫化物桥用可选连接替换或消除。因此，变体中间位之一是那些具有可选连接或缺乏初始中间位的二硫化物桥的。
在一些方面，在氨基酸链内的一个或多个非天然氨基酸之间产生连接。可以与非天然氨基酸进行连接的例子包括连接，包括(i)通过包含醛或酮的残基与包含氨基基团的残基的反应产生的稳定的基于腙或肟的连接，其中胺氮用-NH2或烷氧基基团取代(例如对乙酰基苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、或对-(3-氧丁酰基)-L-苯丙氨酸残基与对-(2-氨基-3-羟基乙基)-苯丙氨酸残基的反应)，(ii)硫醇反应性，其通过掺入苯基硒基(selenidyl)丙氨酸实现，(iii)含有二苯甲酮的UV交联剂，其通过掺入对苯甲酰-L-苯丙氨酸实现，(iv)胺反应性，其通过掺入对异丙基硫代羰基-苯丙氨酸或对乙基硫代羰基-苯丙氨酸来实现，(v)杂环连接，诸如三嗪、噻唑、噻唑烷、或口恶唑连接，其经由Huisgen环加成通过含有叠氮基基团的残基与含有炔基团的残基的反应产生(例如对炔丙基氧苯丙氨酸残基与对叠氮基苯丙氨酸(p-azidophenylalanine)残基的反应)；(v)酰胺键，其通过一个残基中的酸性基团与另一个残基中的胺基团的反应产生；(vi)酯键，其通过一个残基中的酸性基团与另一个残基(诸如丝氨酸)中的醇的反应产生；(vii)双键，其通过两个各含有末端烯烃的残基的反应，例如通过烯烃复分解(例如两个烯丙基甘氨酸残基或两个N-烯丙基取代氨基酸的反应)产生，或(viii)通过本领域中已知的任何其它合适的残基对的反应进行。关于综述，参见例如Davies,J.S.,“The Cyclization of Peptides andDepsipeptides,”J.Peptide Sci.2003,9,471-501。在一个实施方案中，中间位可以将反应基团引导至掺入Fab中的非天然氨基酸，诸如对乙酰基苯丙氨酸。
可以使用用于中间位环化的多种方法，例如以解决体内稳定性及使化学选择性控制能够用于随后的缀合化学。在一些实施方案中，环化策略是内酰胺环化策略，包括头与尾(头-尾)内酰胺环化(环肽的末端残基之间)和/或其它残基之间的内酰胺连接。内酰胺形成也可以通过如下实现，即将残基诸如甘氨酸、β-Ala、7-氨基庚酸等掺入无环中间位环化前体中以产生不同内酰胺环大小和连接性模式。也可以使用其它环化策略诸如“点击”化学和烯烃复分解(参见图31，右侧框)。肽和肽模拟物环化的此类方法是本领域中公知的。
在一些实施方案中，含有内酰胺连接的中间位在体内更稳定，例如与具有其它连接的中间位相比具有在体内更稳定的连接。
在一些实施方案中，将环肽的末端残基起反应以形成环状中间位，例如环状中间位变体。在其它实施方案中，其它位置适合于环化，包括在残基3与11和4与11之间。因此，在一些方面，中间位含有在例如12个氨基酸的肽的除了N端和C端残基外的残基，诸如残基3和11和/或4和11之间形成的连接。
在一些实施方案中，中间位(例如变体中间位)含有反应性胺官能性(例如Lys11)，其可以用于随后中间位变体，例如与支架或接头或者与如本文中描述的药剂，诸如诊断剂(例如成像剂)或治疗剂缀合。例如，图13显示了中间位变体与荧光素的缀合以进行FACS分析的程序；此策略可以应用于其它成像和其它药剂，包括用于体内PET成像的DOTA。
在一些实施方案中，可以将硫醇官能性在中间位上的任何合适的位置中引入，并且可以使用许多含有成像剂、其它蛋白质和肽、金属螯合物、siRNA、纳米颗粒、和细胞毒性药物的内部试剂选择性修饰。
中间位的表征
在一些实施方案中，例如通过ITC、SPR和/或衍射和/或其它方法，诸如本文在实施例中描述的那些方法表征中间位，诸如变体中间位。在一个例子中，以重复方式实施中间位的合成及其表征，例如从而随后将具有最想要的特性，例如对一种或多种中间位使能性抗体的最高亲和力或其它想要的特性，诸如pH依赖性的中间位变体修饰为改善期望的特性。
在一个例子中，为了表征中间位与中间位使能性抗体的结合，将中间位纯化至>95％同质性，并且通过质谱术进行结构表征。将肽在水中透析，通过UV-Vis测量其浓度，并且用元素分析校正，并稀释(大于100倍)到合适的缓冲液中。通过ITC、SPR、X-射线衍射、或其组合严格表征对中间位使能性抗体的结合。可以在TA仪nanoITC上实施ITC测量，每次测量仅用1–2mg肽。在一个例子中，对于SPR测量，将低密度和高密度芯片与中间位使能性抗体，例如Fab或空IgG缀合。在一些情况中，首先使用抗原，诸如在西妥昔单抗的情况中EGFR的整个胞外域的可溶性片段(残基1–621)表征芯片。在本文中报告的研究中，与完全完整的西妥昔单抗IgG相比，cQFD中间位以类似的焓和熵结合西妥昔单抗Fab片段，例如如通过SPR和ITC测量的。因而，可以使用西妥昔单抗或其它中间位使能性抗体的完整IgG或Fab片段实施结合测量。在一个例子中，对于衍射，西妥昔单抗Fab片段和SEQ ID NO:1的中间位的共结晶条件是完善建立的，并且衍射质量晶体通常在1至3天，通常1天中获得。用自用资源(Rigaku007-HF和R-Axis IV++)在8至12小时中及在Stanford同步辐射光源(其容许快速表征中间位变体与中间位使能性抗体的相互作用)在10分钟中收集完整的数据集。
在一些方面，例如，ITC、SPR和X-射线衍射数据共同提供原子详情以引导随后的化学修饰，最终改善中间位的亲和力和/或对中间位产生其它变化。基于ΔG＝-RT ln Ka的计算显示了中间位对西妥昔单抗的微摩尔和纳摩尔亲和力之间的差异源自在300K时约4kCal/mol(其相当于强氢键)的自由能变化。如此，从蛋白质结合袋丧失有序水分子或者氨基酸残基链的再定向可以足以改变结合达几个数量级。
在一些例子中，使用其它方法来改变中间位的特性，例如改善中间位-Fab相互作用的亲和力。在一个例子中，结构数据(诸如上文描述的研究中获得的那些结构数据)可以用于替换Fab中的残基，其通过诱变进行，例如以添加额外的氢键，用氨基酸取代非天然氨基酸或者改变疏水性界面，例如，以可以更好互补中间位结合的方式。在一些例子中，使用荧光偏振测定法鉴定中间位变体，其可以置换给定的中间位，诸如SEQ ID NO:1。在其它例子中，使用相同技术鉴定可以置换中间位的小分子，然后使用这些小分子作为模板进一步改善中间位的结合亲和力。
在一些例子中，基于pH依赖性设计中间位变体，例如以在不同pH条件具有不同亲和力。如此，在某些实施方案中，在pH方面改编meMAb-中间位相互作用。本文中描述了此类中间位的例子。在一些方面，中间位变体的结合亲和力以缓冲液pH的函数测量。例如，变体中间位包括对一个或多个中间位使能性抗体或片段具有结合亲和力的中间位，所述结合亲和力在溶酶体pH水平降低或在低氧环境中升高。例如，提供了变体中间位，其在中性pH(例如pH7-8，例如pH7.3-7.5)展现出较高的对中间位使能性抗体的结合亲和力，而且在更酸性的pH，诸如为或大约4-6.5的pH，例如at an内体pH(例如为或大约5-为或大约6.5)或溶酶体pH(例如为或大约4.5-为或大约5)展现出相对较低的对抗体的结合亲和力。参见图27，其显示了几个例子。在另一个例子中，例如，与在其它生理学条件(诸如在血液中)下观察到的亲和力相比，中间位在低氧环境，诸如肿瘤环境中对抗体具有升高的结合亲和力。在一些实施方案中，提供了中间位变体或中间位“类似物”的修饰，用于低pH(例如在药物投递的溶酶体中)的特异性释放；和中间位的修饰，从而它们在低氧环境(例如肿瘤基质pH经常低于正常组织)中以较高的亲和力结合。还提供了用于生成此类中间位变体的方法。
依照一些实施方案，可以利用或优化中间位结合位点以增强中间位使能性抗体及其功能性片段的结合、纯化、和/或使用中间位使能性抗体及其功能性片段的成像或其它方法。在一个不同的实施方案中，中间位可以含有一个或多个半胱氨酸残基，其结合在Fab中在中间位结合位点(例如ThioMAb)的一个或多个工程化半胱氨酸。由此，中间位与任何诊断和/或治疗性物质、分子或化合物缀合。例如，物质可以是小分子诊断分子，诸如标志物。“Cys中间位”将缀合物引导至抗体，并且经由共价连接结合。或者，中间位可以与Fab与掺入中间位结合位点中的一个或多个非天然氨基酸缀合。
II.多价中间位
提供的中间位之一也是多价中间位。在某些方面，中间位与接头或支架的缀合(例如以形成多价拴系实体)显著改善对与抗原(例如肿瘤关联抗原)结合的中间位使能性单抗的总体亲和力和靶向。
全长单克隆抗体(单抗)和F(Ab)’2片段包括两个Fab域(在全长单抗的情况中与嵌合Fc偶联的)。此类二价抗体(例如IgG)优先结合以高密度表达抗原的细胞。识别相同抗原上的独特表位的单克隆抗体(单抗)的组合可以产生协同效应，包括增强各种抗体效应器功能(例如ADCC、补体依赖性裂解、信号传导抑制)、增强细胞死亡、及在癌症靶向抗体的情况中增强肿瘤生长抑制。参见例如Dechant M等,“Complement-dependent tumor cell lysis triggered bycombinations of epidermal growth factor receptor antibodies,”Cancer Res,2008Jul1；68(13):4998-5003；Scheuer W等,“Strongly enhanced antitumor activity oftrastuzumab and pertuzumab combination treatment on HER2-positive humanxenograft tumor models,”Cancer Res,2009Dec15；69(24):9330-6；CardarelliPM等,“Binding to CD20by anti-B1antibody或F(ab')(2)is sufficient forinduction of apoptosis in B-cell lines,”Cancer Immunol Immunother,2002Mar；51(1):15-24.Epub2001Dec18。虽然此增强的细胞死亡的精确机制仍然有争论，研究指示这两种单抗都应当是多价的(例如完整抗体或F(ab)’2)以实现增强的效果，这提示了第二种二价抗体(其结合相同抗原上的独特表位)可以簇集细胞表面抗原，并且更有效起作用，例如更有效杀死肿瘤细胞。参见图8和16。
在本文中的一些实施方案中，使用多价中间位重演此类簇集。在一些方面，多价中间位代替二抗使用，在一些方面以与中间位使能性抗体组合实现协同。在一些方面，与使用识别不同表位的第二种抗体相比，多价中间位提供优点。例如，多价中间位的生成可以是更有效的，且在与第二种抗体相比时是划算的。例如，虽然许多临床前/临床试验在调查两种单克隆抗体的共施用，生产和销售此类治疗剂的成本有可能是令人望而却步的。在一些方面，多价中间位也相当容易靶向至疾病部位，诸如肿瘤。鉴于中间位结合位点的性质(在中间位结合位点内，与抗体CDR分开)，和本文中提供的广泛适用的用于使选择的任何抗体中间位使能化的方法，多价中间位也具有容易适用于一大批治疗性抗体的优点，而不需要降低具有治疗可接受特征的第二种抗体或表位。如此，在一些方面，多价中间位的使用避免鉴定具有可接受特征的第二种单抗的需要，及其开发的相关且大量成本。
经常经由多价实现特异性和亲和力。对于具有接头的二价配体，这可以表示为ΔG总计＝ΔG1+ΔG2–ΔG接头。换言之，K总计＝K1*K2/K接头。在接头对自由能没有做出贡献(K接头约1)的情况中，二价配体对二价靶物的表观亲和力是单体结合常数的乘积。如此，亲和力的显著增加一般可以经由多价实现(例如对于具有KD＝1μM的中间位，“理论”二价中间位的亲和力是1pM)。虽然此类大幅增加一般很少看到(主要是由于二价/三价/多价受体的几何学)，但是观察到协同。细胞表面表达的抗原的几何学可以对多价中间位的接头放置严格约束，但是也可以确保特异性，其在一些背景(诸如用于靶向投递)中可以是重要的目的，例如通过使脱靶效应的风险最小化实现。
在一个例子中，多价中间位含有抗体的Fc区或其部分，诸如基本上整个Fc区。使用Fc区“二聚化”配体是建立的，并且例如由Jazayeri JA&Carroll GJ.,“Fc-based cytokines:prospects for engineering superior therapeutics,”BioDrugs,22(1):11-26(2008)描述。在一些例子中，为了生成二价中间位，经由接头，通常肽接头，例如柔性肽接头将中间位与Fc区(例如与IgG的Fc区的N端)融合。在一个例子中，选择接头的长度以大致匹配IgG的Fab间的距离，诸如长度为17个氨基酸的。在一些方面，接头含有甘氨酸、丝氨酸、和/或其组合。例示性的“中间位-Fc”融合显示于图15(分别为SEQ ID NO:3和4)。还可见图16。
在一些实施方案中，将接头的组成和/或Fc和中间位之间的距离系统性改变，例如以优化亲和力和特异性。在一个实施方案中，可以在接头内的任何位置处取代每个天然的或非天然的残基以进行优化。在一些方面，接头的长度为为或大约2-100个残基，例如长度为或大约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,125,150,175或200个残基(氨基酸)或更多。在一个例子中，将此类接头使用目前和未来的DNA合成仪生成，并且插入中间位和Fc区之间。也可以将接头“僵化”以限制旋转的半径及增强Fc-中间位的亲和力和特异性。例如，可以将螺旋卷曲域置于中间位和Fc之间(图18)。在其它例子中，用惰性蛋白质域(例如免疫球蛋白折叠)取代接头。可以将多个免疫球蛋白折叠置于中间位和Fc域之间。在某些实施方案中，接头的组成是人起源的以减轻潜在的抗原性。
在一些例子中，将提供的中间位与支架拴系以创建多价中间位，例如实现增强的选择性和结合亲和力。在一些实施方案中，多价中间位支架用于支撑或“雏菊链化”与肿瘤关联抗原结合的中间位使能性单抗以增强配体拮抗，改变受体胞吞，和/或经由ADCC/CDC改善免疫应答(参见图8)。如此，在一些实施方案中，使用中间位拴系两个或更多个抗体或其功能性片段。此类中间位可以是多价拴系剂的一部分，例如，以增强癌症或肿瘤疗法和成像。多价拴系剂可以包含经由接头(诸如经由长接头和生物素到链霉抗生素蛋白)偶联的两个或更多个中间位，以创建多价中间位拴系实体。
在一个实施方案中，多价中间位拴系实体是四价中间位拴系剂。在一个方面，与单价肽相比，通过表面等离振子共振显示四聚体拴系实体具有增强的对抗体的结合，其与多价相互作用一致。在一个例子中，与使用单独的抗体或单独的单价中间位相比，此类多价中间位(例如四价中间位)的使用产生增强的中间位使能性抗体对抗原的结合亲和力(例如在西妥昔单抗的情况中，对EGFR阳性细胞的结合亲和力)。可以使用公知的方法，例如通过FACS分析测定此类结合亲和力。参见图12。
在一些实施方案中，为了解决受体对接头的约束，将未修饰的或经修饰的(例如变体，例如经优化的)中间位(诸如实施例6中描述的那样获得的那些中间位)与多价支架偶联，诸如通过优化接头进行。在一些方面，多价中间位能够“锁上”相邻的抗体，例如IgG，以形成“雏菊链”样阵列(参见图8)，其可以例如在靶向肿瘤抗原的抗体中使用(考虑到肿瘤细胞的高抗原密度)。虽然二价中间位和抗体的分子内结合是可能的，抗体(例如IgG)的C2对称可以对实现此类相互作用的接头放置严重的几何约束。如此，在一些方面，中间位基于三价或更高价的支架，这确保超过一个抗体会是“雏菊链化的”。通过纳入第三个中间位臂，三价中间位与抗原结合的抗体的最初相遇的半衰期可以延长。这继而可以提高如下的可能性，即额外的臂会结合邻近的抗原结合的抗体，如此使总体复合物稳定化。在其它实施方案中，可以构建多功能性中间位以同时结合memab和其它靶物，诸如其它B和T细胞表面蛋白，诸如T细胞受体和共刺激分子。在一些实施方案中，对不同中间位具有特异性的多个中间位使能性抗体(例如，包括一个或多个经修饰的中间位使能性抗体)在此类多价实施方案中与此类不同中间位一起使用。
各种接头和支架是本领域中已知的，并且可以与这些实施方案结合使用。一种例示性的支架合成方案显示于图13，并且在本文中的实施例中讨论。在一些方面，图13中显示的模板4和5的使用分别容许二和三价中间位两者的形成。在一些实施方案中，使用不同长度聚乙二醇(PEG)和/或其它接头，例如以改善或改变结合或其它特性。在一些方面，PEG长度是为或大约10A-为或大约1000A。合成方法也适合于DOTA掺入，用于放射性核素成像。例如，已经在经FITC标记的二价中间位(即化合物13)的合成中掺入PEG双官能性臂(图13)。IgG内CDR区之间的距离是约可以将PEG接头的长度系统性改变以确保此方法是最佳的。商品化PEG的末端至末端距离延伸至(Pierce)，其会超过IgG距离。
在其它实施方案中，使用其它支架和/或接头，例如以生成高亲和力多价中间位和/或创建协同性。例如，DNA可以作为中间位的支架使用以创建更具刚性的支架。例如，生物学和化学起源的不同支架也可以用于实现多价。这包括但不限于构建二价或三价支架，其使用链霉抗生物素蛋白或(参见欧洲申请，公开文本No.:EP2065402A1)链霉抗生物素蛋白作为四价支架、独特支架(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283)、Origami DNA(参见Gu等,Nature Nanotechnology4,245-248(2009))等进行。也可以使用分子创建化学支架，所述分子包括但不限于DNA(单链，双链体，霍利迪连结体(Holliday junctions)，适体等)、RNA(单链，发夹，茎环，适体等)、PNA(肽核酸)、实现刚性的DNA/PNA双链体和三链体、有机和或无机纳米颗粒(直接偶联或经由有机聚合物诸如PEG偶联)，可以自身和/或DNA或PNA形成双链体的有机聚合物。
多价中间位的表征
可以通过许多已知方法之任一种，包括SPR和ITC表征多价中间位与中间位使能性抗体的结合特性，例如以确保与多价支架的缀合不影响中间位-Ig相互作用。在一些情况中，此类测量在其测定多价和协同效应的能力上可以是受限的，考虑到这些方法一般不涉及细胞表面上(诸如肿瘤细胞表面上)存在的抗原。如此，在一些方面，FACS分析和/或细胞存活力测定法用于直接在表达由中间位使能性抗体识别的抗原的细胞(例如在西妥昔单抗的背景中过表达EGFR的细胞)上量化多价中间位的效应。实施例7中描述了例示性的方案。一般地，在使抗体结合细胞上表达的抗原的条件下将表达(例如过表达)由中间位使能性抗体识别的抗原的细胞系与中间位使能性抗体一起温育。在一些情况中，使用不同浓度的抗体。同时或随后，将细胞与多价中间位一起温育，在一些情况中为不同浓度。实施合适的温育时间和清洗。可以分别使用第二种抗体和单价中间位作为阳性和阴性对照。可以将抗体和中间位用通过流式细胞术或显微术可检测的试剂(其是公知的)标记。在一些例子中，与单价中间位相比在存在多价中间位的情况中转变(在FACS的情况中)或升高的信号指示协同或添加效应。在另一个例子中，为了进一步确认多价中间位的添加效应，在竞争测定法中使用非标记的、单价中间位，以测定它是否可以与经标记的多价中间位竞争抗原结合的中间位使能性抗体。
在其它例子中，使用细胞存活力测定法测定多价中间位增强中间位使能性抗体的细胞杀伤效果的能力。例如，可以将表达感兴趣抗原的细胞与不同浓度的中间位使能性抗体和/或多价中间位一起温育。单价中间位和第二种抗体再次可用作对照。在一些例子中，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)用于量化活细胞的数目或百分比。用于测量细胞存活力、增殖和/或死亡的其它方法是本领域中已知的，并且可以使用。
在另一个例子中，对于在此类测定法中证明活性的多价中间位，实施Western印迹分析或其它生物化学或信号传导方法以调查对与特定抗原，诸如细胞表面受体(例如在西妥昔单抗的情况中，以追踪作为EGFR信号传导途径的一部分的EGFR,AKT,MAP的磷酸化状态)有关的信号传导的抑制。可以比较来自此类研究的数据与来自仅用中间位使能性抗体(即没有中间位)、用单价中间位、和/或用酪氨酸激酶或其它已知的抑制剂(AG1478等)处理的细胞的数据。在一些例子中，观察到作为多价中间位浓度函数的细胞死亡增加，这证明了多价中间位的协同细胞杀伤效果。
III.融合蛋白
还提供了含有一个或多个中间位的融合蛋白。如本文中通过与cQFD中间位(中间位1)结合的中间位使能性Fab片段上的衍射表明的，显示了所述抗体结合的中间位的N端和C端与结合的蛋白L(即一种结合人蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的细菌蛋白)的位置并列。在一些实施方案中，提供了中间位-蛋白L融合蛋白(MPL)。在一些方面，与单独的中间位和/或单独的蛋白质相比，蛋白L-中间位融合物以更大的亲和力展现出对中间位使能性抗体的结合，例如经由能量相加性。与单独的蛋白L和蛋白L、蛋白A、和/或类似的抗体结合蛋白的其它多价缀合物相比，MPL也可以是有利的，因为它们提供对中间位使能性抗体的特异性，并且在治疗性施用时不会靶向内源免疫球蛋白分子。
蛋白L最初从细菌大消化链球菌分离，其是一种结合人和其它抗体的kappa轻链的蛋白质。例示性的中间位-蛋白L(MPL)融合蛋白包括那些其中提供的中间位与蛋白L(其可以是野生型蛋白L或其变体，诸如本领域中已知的几种变体之一，或者修改为改善一种或多种特性，诸如降低抗原性的变体)缀合的。用于修饰类似的蛋白质，诸如以降低抗原性或免疫原性，或者改善“免疫耐受性”的方法是本领域中已知的，并且由例如Ahlgren等,J Nucl Med,2010；51:1131-1138；Feldwisch J等,J Mol Biol,2010Apr30；398(2):232-47.Epub2010Mar10描述。例如，氨基酸取代可以例如以重复的过程，随机或者基于结构建模，接着分析期望的特性，例如抗原性进行。在另一个例子中，引入突变以改善特异性。在其它实施方案中，将中间位与其它抗体结合物质，诸如其它抗体结合蛋白，例如蛋白A或蛋白G融合。
MPL一般包含接头，其连接中间位部分与蛋白L部分。接头通常包含至少2，更通常至少3，例如3,4,5,6,7,8,9或10个氨基酸残基(例如4个甘氨酸)。在一些方面，此类残基连接中间位的C端和蛋白L的N端。在一个例子中，中间位-蛋白L融合蛋白具有SEQ ID NO:58(S C Q F D L S T R R L K C G G GG S E V T I K V N L I F A D G K I Q T A E F K G T F E E A T A E A Y R Y A AL L A K V N G E Y T A D L E D G G N H M N I K F A G)中列出的序列。
在一些实施方案中，MPL与中间位使能性抗体结合使用，在本文中描述的方法和用途(包括那些涉及缀合中间位与药剂，诸如治疗剂或诊断剂，诸如细胞毒素、放射性核素、DOTA、蛋白质或其它生物学分子的)中，例如以靶向疾病和/或对疾病部位成像。在一些方面，为了便于此类缀合，将蛋白L融合物中的一个或多个赖氨酸突变为例如精氨酸或天冬酰胺，以生成可以与其它分子特异性缀合的蛋白L融合蛋白，例如通过留下N端胺和可用于缀合的epsilon胺进行，后一种是溶剂暴露的且更具反应性。例示性的融合蛋白具有SEQ ID NO:59(S C Q F D L S T R R L R C G G G G S E V T I R V N L I FA D G N I Q T A E F R G T F E E A T A E A Y R Y A A L L A R V N G E Y T AD L E D G G N H M N I K F A G)中所列的序列，其中除去除了1个外的所有赖氨酸。
例示性中间位-蛋白L融合蛋白的编码序列在SEQ ID NO:56中列出。例示性中间位-蛋白L融合蛋白的序列在SEQ ID NO:57(His6-Smt3-中间位-蛋白L)和SEQ ID NO:58(含有两个半胱氨酸，以粗体文本列出，其在一些方面用于环化MPL，例如通过过氧化物或用空气过夜：SCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG(SEQ ID NO:58)中列出。
在一些实施方案中，与单独的中间位相比，中间位-蛋白L(MPL)构建体对中间位使能性抗体展现出改善的结合亲和力。例如，与单独的相应中间位和/或单独的蛋白L相比，改善可以是对中间位使能性抗体的亲和力(例如解离常数)的至少或为或大约10,000,9000,8000,7000,6000,5000,4000,3000,2000,1000,900,800,700,600,500,400,300,200,100,90,80,70,60,50,40,30,20或10倍改善。在一个例子中，单独的蛋白L和中间位与中间位使能性抗体之间的相互作用的结合常数分别是约0.5μM和1μM，而MPL对抗体的结合常数是约165pM。
IV.中间位-药剂缀合物
在某些实施方案中，中间位，包括一个或多个中间位、中间位变体、多价中间位、中间位-蛋白L融合物(MPL)、多价拴系剂或多价中间位变体拴系剂与一种或多种治疗剂或诊断剂(例如成像剂、治疗有效剂或治疗有效量的化合物)或两者缀合。提供了含有中间位和一种或多种药剂的此类复合物。
在一些方面，中间位或其变体对一种或多种与治疗或诊断(例如成像)剂或化合物缀合的中间位使能性抗体的结合用于治疗、预防、诊断或监测疾病或状况。在一个方面，中间位(诸如多价中间位)与药剂的此类缀合在与中间位使能性单克隆抗体结合使用时提供高度通用的平台技术，其会显著改善基于单抗的治疗学和成像方法来治疗和检测疾病(参见图8)。
诊断剂和治疗剂包括相关领域中公知的任何此类药剂。成像剂之一是荧光和发光物质，包括但不限于多种有机或无机小分子，其通常称为“染料”、“标记物”、或“指示剂”。例子包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料、和花青素苷染料。可以依照公开的实施方案用作成像剂的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-内酰胺酶。此类酶可以与色原体、荧光化合物或发光化合物组合使用以产生可检测信号。
可以依照公开的实施方案用作成像剂的放射性物质包括但不限于18F,32P,33P,45Ti,47Sc,52Fe,59Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,77As,86Y,90Y.89Sr,89Zr,94Tc,94Tc,99mTc,99Mo,105Pd,105Rh,111Ag,111In,123I,124I,125I,131I,142Pr,143Pr,149Pm,153Sm,154-1581Gd,161Tb,166Dy,166Ho,169Er,175Lu,177Lu,186Re,188Re,189Re,194Ir,198Au,199Au,211At,211Pb,212Bi,212Pb,213Bi,223Ra和225Ac。可以依照公开的实施方案用作其它成像剂的顺磁性离子包括但不限于过渡和镧系元素金属(例如具有原子数目21-29,42,43,44或57-71的金属)的离子。这些金属包括Cr,V,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,La,Ce,Pr,Nd,Pm,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Yb和Lu的离子。
在成像剂是放射性金属或顺磁性离子时，可以将药剂与另一种长尾试剂起反应，所述长尾试剂具有较长的尾部，该尾部具有附接于较长尾部的一个或多个螯合基团用于结合这些离子。较长的尾部可以是聚合物，诸如多赖氨酸、多糖、或其它衍生化的或可衍生化的链，其具有为了结合而可以添加金属或离子的侧基(pendant group)。可以依照公开内容使用的螯合基团的例子包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、NETA、TETA、卟啉、多胺、冠醚、二硫代缩氨基脲(bis-thiosemicarbazone)、多肟(polyoxime)等基团。通常通过基团将螯合物与PSMA抗体或功能性抗体片段连接，所述基团使与分子的键能够在免疫反应性损失最小和最小聚集和/或内部交联的情况下形成。在与本文中描述的抗体和载体一起使用时，相同的螯合物在与非放射性金属(诸如锰、铁和钆)复合时可用于MRI。大环螯合物诸如NOTA、DOTA、和TETA分别与多种金属和放射性金属，包括但不限于镓、钇和铜的放射性核素一起使用。可以使用其它环型螯合物诸如大环聚醚(其对于稳定的结合核素是感兴趣的，诸如用于RAIT的223Ra)。在某些实施方案中，可以使用螯合模块将PET成像剂，诸如Al-18F复合物附接至靶向分子，用于PET分析。
例示性的治疗剂包括但不限于药物、化学治疗剂、治疗性抗体和抗体片段、毒素、放射性同位素、酶(例如将前药在肿瘤部位切割成细胞毒剂的酶)、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、RNAi分子(例如siRNA或shRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂和染料。治疗剂还可以包括与螯合剂结合的金属、金属合金、金属间或核心-壳纳米颗粒，其充当辐射敏化剂以使靶定细胞与健康细胞相比对放射疗法更敏感。此外，治疗剂可以包括用于MRI造影剂的顺磁性纳米颗粒(例如磁铁矿或Fe3O4)，并且可以与其它类型的疗法(例如光力学和高温疗法和成像(例如荧光成像(Au和CdSe))一起使用。
化疗剂经常本质上是细胞毒性或细胞抑制的，并且可以包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓朴异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂激素疗法、靶向治疗剂和免疫治疗剂。在一些实施方案中，可以依照公开的实施方案用作治疗剂的化疗剂包括但不限于13-顺-视黄酸(Retinoic Acid)、2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)、5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)、6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine)、放线菌素D、阿霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗、阿利维A酸(alitretinoin)、全反式视黄酸(all-transretinoic acid)、α干扰素、六甲蜜胺(altretamine)、甲氨蝶呤(amethopterin)、氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、安吖啶(amsacrine)、氨基喜树碱(amino camptothecin)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、门冬酰胺酶(asparaginase)、氮杂胞苷(azacytidine)、卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、依那西普(etanercept)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、硼替佐米(bortezomib)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、甲酰四氢叶酸钙(calcium leucovorin)、嗜橙菌因子(citrovorum factor)、卡培他滨(capecitabine)、卡奈替尼(canertinib)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、可的松(cortisone)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿法达贝泊汀(darbepoetinalfa)、达沙替尼(dasatinib)、道诺霉素(daunomycin)、地西他滨(decitabine)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠(dexasone)、右雷佐生(dexrazoxane)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、氨烯咪胺(decarbazine)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、恩尿嘧啶(eniluracil)、表柔比星(epirubicin)、阿法依伯汀(epoetin alfa)、厄洛替尼(erlotinib)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、非格司亭(filgrastim)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟维司群(fulvestrant)、flavopiridol、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉姆单抗奥佐米星(ozogamicin)、戈舍瑞林(goserelin)、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、氢化可的松(hydrocortisone)羟基脲(hydroxyurea)、替伊莫单抗、干扰素α、白介素-2、白介素-11、异维A酸(isotretinoin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊达比星(idarubicin)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenalidomide)、来曲唑(letrozole)、亚叶酸钙(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、脂质体Ara-C、洛莫司汀(lomustine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奈拉滨(nelarabine)、尼鲁米特(nilutamide)、奥曲肽(octreotide)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、帕西他赛(paclitaxel)、氨羟二磷酸二钠(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、帕木单抗、PEG干扰素、培门冬酶(pegaspargase)、PEG非格司亭(pegfilgrastim)、PEG-L-门冬酰胺酶、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷洛昔芬(raloxifene)、利妥昔单抗、罗米司亭(romiplostim)、雷替曲塞(ralitrexed，raltitrexed)、sapacitabine、沙格司亭(sargramostim)、沙铂(satraplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替加氟(tegafur)、替加氟-尿嘧啶、替西罗莫司(temsirolimus)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷(teniposide)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、托泊替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维A酸(tretinoin)、三甲曲沙(trimitrexate,trimetrexate)、alrubicin、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞滨(vinorelbine)、伏立诺他(vorinostat)、或唑来膦酸(zoledronic acid)。
可以依照本公开内容的实施方案用作治疗剂的治疗性抗体和其功能性片段包括但不限于阿仑单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、依决洛单抗(edrecolomab)、吉姆单抗、ibritumomab tiuxetan、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗以及其它与本文中列出的具体疾病有关的抗体。
可以依照本公开内容的实施方案用作治疗剂的毒素包括但不限于蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、和假单胞菌内毒素。
可以依照本公开内容的实施方案用作治疗剂的放射性同位素包括但不限于，32P,89Sr,90Y,99mTc,99Mo,131I,153Sm,177Lu,186Re,213Bi,223Ra和225Ac。
E.使用方法和组合物
还提供了中间位、中间位使能性抗体、和含有其的复合物的方法和用途，包括治疗和诊断用途，及其它用途，包括抗体纯化。还提供了含有中间位(包括变体和多价中间位及中间位融合蛋白)的药物组合物，用于此类诊断和治疗方法。
I.治疗和诊断用途及药物组合物
在一个实施方案中，使用中间位、中间位变体、多价中间位、MPL、多价中间位拴系剂和多价中间位变体拴系剂等的特异性和结合投递治疗剂、诊断剂(例如成像剂)或其组合，用于治疗、诊断(例如成像)疾病或状况，通常在与一种或多种中间位使能性单克隆抗体组合(同时或分开)施用时。
在一个例子中，中间位(例如多价中间位)用于预靶向疗法或者预靶向成像，如下文进一步描述的，其通过在施用中间位、中间位变体、多价中间位拴系剂或多价中间位变体拴系剂前施用中间位使能性单克隆抗体进行。此外，多价中间位的使用可以增强选择性，并且改善肿瘤检测，如已经对工程化scFv或化学缀合的单抗证明的，但是避免这些非人构建体中固有的潜在免疫原性。
如此，本文中描述的平台技术对单抗投递领域具有广泛的影响，并且提供了可用于治疗和诊断各种疾病和状况，包括癌症，诸如指示使用抗体的癌症的方法。例如，针对EGFR阳性癌症，包括结肠直肠和鳞状细胞癌头和颈癌的中间位使能性抗性会受益于西妥昔单抗和中间位的使用。另外，修饰其它治疗性抗体以生成此类抗体的中间位使能性型式容许平台技术用于治疗和诊断几种其它癌症、疾病和其它状况的方法。
例如与结合或缀合抗体的其它手段相比，在此类方法中使用中间位是有利的，例如，为了特异性。例如，PpL(蛋白L)和SpA(蛋白A)不是鼠特异性的或嵌合抗体特异性的。PpL结合约66％鼠的和约50％人的IgG Kappa轻链，而SpA结合12％鼠的和50％人的可变重链(Graille等,2002)。比较而言，如本文中证明的，中间位与中间位使能性抗体的相互作用是高度特异性的，其可以避免不利效应，包括脱靶效应，例如避免治疗性化合物结合对于受试者而言内源的免疫球蛋白。
在一些实施方案中，与中间位使能性抗体组合使用的中间位、抗体-中间位复合物、与中间位使能性抗体组合施用的多价拴系剂、或其组合可以与一种或多种成像剂缀合。在一个方面，成像剂可以包括但不限于荧光、发光、磁性蛋白质、或放射性核素蛋白质、肽或其衍生物(例如遗传工程化变体)。可以通过mRNA组分表达的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(EGFP)、红色、蓝色、黄色、青色和宝石蓝色荧光蛋白，以及珊瑚礁荧光蛋白。可以通过mRNA组分表达的发光蛋白包括萤光素酶、水母发光蛋白(aequorin)及其衍生物。众多荧光和发光染料及蛋白质是本领域中已知的(参见例如美国专利申请公开文本2004/0067503；Valeur,B.,“MolecularFluorescence:Principles and Applications,”John Wiley and Sons,2002；Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,Molecular Probes,第9增补版,2002；和The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies,Invitrogen，第10版，在Invitrogen网站可获得；两篇都在此通过提述收录，如同本文中完整列出的)。
在其它方面，与中间位使能性抗体组合使用的中间位、抗体-中间位复合物、与中间位使能性抗体组合施用的多价拴系剂、或其组合可以与非蛋白质成像剂或投递媒介物诸如纳米颗粒、放射性物质(例如放射性同位素、放射性核素、放射性标记物或放射性示踪剂)、染料、造影剂、荧光化合物或分子、生物发光化合物或分子、酶和增强剂(例如顺磁性离子)进一步缀合或在其它方面结合。另外，应当注意的是，一些纳米颗粒例如量子点和金属纳米颗粒(在下文描述)也可以适合作为成像剂或治疗剂使用(例如使用高温和光动力学疗法以及通过荧光和或MRI反差的成像剂)。
中间位-单抗技术容许可以用于生成抗体-中间位复合物的系统，所述抗体-中间位复合物可以进一步与一种或多种中间位使能性抗体、治疗剂、成像剂或其组合缀合。如此，一组中间位或高亲和力中间位变体(每个与独特的细胞毒剂或成像剂缀合)会允许共施用期望的中间位缀合物和中间位使能性单抗进行治疗。所述中间位缀合物是目前的抗体-药物缀合物(其具有缺点如由于化学修饰或有效载荷的释放而导致的降低的特异性)的改善。
本文中提供了用于增强治疗性抗体或其功能性片段的结合亲和力的方法。这类方法可以包括经由任何合适的施用路径对受试者施用治疗有效量的药物组合物。所述药物组合物可以包含与中间位使能性抗体组合的中间位或中间位变体、与中间位使能性抗体组合的多价中间位或中间位变体拴系实体、中间位使能性治疗性抗体或其功能性片段组合、药学可接受载体、及其任意组合。多价中间位的增强的结合亲和力可以归因于与细胞表面结合的IgG的多价交联。交联IgG(经由亲本鼠425抗体或使用抗IgG IgM)显著影响信号传导、受体胞吞作用和再循环、以及细胞死亡。由此，多价肽可以与治疗性单克隆抗体协同起作用以增强其治疗效力。
在一些实施方案中，中间位(单独的或作为拴系实体的一部分)可以含有半胱氨酸或其它合适的烷化剂，其在结合位点处结合Fab半胱氨酸，如此创建半胱氨酸-半胱氨酸相互作用。或者，中间位可以在非天然氨基酸(例如对乙酰基苯丙氨酸)处结合Fab。将Cys中间位与任何物质缀合，并且其将缀合物引导至IgG。
抗体-中间位复合物也可以在对可以通过治疗性抗体靶向的疾病或状况中的特定类型的细胞或细胞群体的定向处理的方法中使用。这类治疗方法可以包括经由任何合适的施用路径对具有所述疾病或状况的受试者施用治疗有效量的药物组合物。药物组合物可以包含与中间位使能性抗体组合的中间位或中间位变体、与中间位使能性抗体组合的多价中间位或中间位变体拴系实体、中间位使能性治疗性抗体或其功能性片段。
在其它实施方案中，提供了用于对肿瘤或其它组织成像的方法。在这类方法中，可以施用未修饰的治疗性抗体以靶向过表达相应抗原的肿瘤或其它组织。随后，经由任何合适的施用路径施用用成像剂标记的多价中间位拴系实体，并且其会结合与靶肿瘤或组织结合的治疗性抗体。见图8。成像剂的例子包括但不限于放射性标记物(例如3H,14C,35S,90Y,99mTc,125I,131I,177Lu,166Ho和153Sm)、金属或磁性标记物(例如金、铁、钆)、生物素、螯合剂(例如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(“DOTA”))或上文描述的任何试剂。在一个实施方案中，与本文中描述的方法一起使用的成像剂是DOTA。
上文所描述的成像或治疗方法相对于已知方法有几个优点。首先，治疗性单克隆抗体的二价特征增强对肿瘤的选择性。如下文进一步论述的，此增强的选择性在使用scFv的情况中丧失，并且不能经由增强的亲和力完全弥补。其次，经标记的多价中间位拴系实体的质量会低于肾过滤阈值(小于60kD，可以低至约10kD)，从而允许其容易地滤出体外。相比之下，通常避免用成像剂或其它治疗剂直接标记治疗性抗体，因为它会在身体中循环延长的时段。如此，经常使用不太有选择性的scFv来实现肿瘤或其它患病器官的成像。
在别的实施方案中，可以使用中间位将两个或更多个治疗性分子连接起来以形成药用化合物，所述药用化合物可以作为药物组合物的部分以治疗有效量对受试者施用以治疗癌症、自身免疫性疾病或其它状况。所述两种或更多种治疗性分子可以包括但不限于能靶向肿瘤或疾病特异性受体的功能性抗体片段(例如F(ab’)2或Fab片段)、肽或其它小分子，如上文所描述的那些。治疗性分子可以是两个或更多个同一种治疗性分子，或者可选地，可以是靶向同一肿瘤或患病组织的两个或更多个不同分子。
在一些实施方案中，药用化合物或组合物可以包括专有的抗体或其部分如CovX-BodyTM。在一个例子中，中间位用作接头来将两个或更多个治疗性分子连接至特殊设计的CovX抗体。在一个例子中，与此类中间位结合的小分子、肽或scFv被CovX抗体的中间位结合位点(例如框架结合界面)识别。当将这些组分组合时，所得的二价CovX-BodyTM拥有小分子、肽或scFv的生物学作用，同时还保留抗体的延长的半衰期。
在一些实施方案中，提供的中间位、中间位使能性抗体及其复合物用于疾病或状况，包括可以使用治疗性抗体治疗或靶向的任何癌症、疾病或其它状况的治疗、诊断或成像。癌症通过主动抑制免疫系统来避开免疫监视。一种预想用于抵消此免疫抑制的方法是经由利用由肿瘤细胞独特地表达或过表达的抗原表位的疫苗接种。例如，已经在临床中成功执行阻断信号传导途径、扣留生长因子和/或诱导免疫应答的单克隆抗体(单抗)以治疗癌症和其它疾病。
如此，疾病和状况包括任何癌症，及其它疾病和状况，诸如那些使用治疗性单抗靶向的，包括但不限于白血病和淋巴瘤(其可以使用例如阿仑单抗、贝妥莫单抗、吉姆单抗、FBTA05、ibritumomab tiuzetan、奥法木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、乳腺癌(其可以使用例如曲妥珠单抗、阿德木单抗、厄马索单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、前列腺癌(其可以使用例如阿德木单抗、卡罗单抗喷地肽,伊瑞西珠单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、结肠直肠癌(其可以使用例如拉贝珠单抗、帕木单抗、altumumab pentetate、伏妥昔单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、胃肠癌(其可以使用例如arcitumumab、卡妥索单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、卵巢癌(其可以使用例如阿巴伏单抗、卡妥索单抗、伊瑞西珠单抗、伊戈伏单抗、奥戈伏单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、肺癌(其可以使用例如anatumumab mafenatox的中间位使能性型式治疗或成像)、胰腺癌(其可以使用例如clivatuzumab tetraxetan的中间位使能性型式治疗或成像)、肾癌(其可以使用例如吉利妥昔单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、黑素瘤癌(其可以使用例如伊瑞西珠单抗、易普利单抗、TRBS07的中间位使能性型式治疗或成像)、胶质瘤(其可以使用例如尼妥珠单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、骨转移(其可以使用例如地诺单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、头和颈癌(其可以使用例如扎芦木单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、心血管疾病(其可以使用例如阿昔单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、自身免疫性病症(其可以使用例如阿达木单抗、英夫利昔单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、类风湿性关节炎(其可以使用例如atlizumab、戈利木单抗、英夫利昔单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、移植物排斥(其可以使用例如巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗-CD的中间位使能性型式治疗或成像)、克罗恩(Crohn)氏病(其可以使用例如赛妥珠单抗、芳妥珠单抗、那他珠单抗、英夫利昔单抗、维西珠单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、血红蛋白尿(hemoglobinuria)(其可以使用例如依库利珠单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、银屑病(其可以使用例如依法利珠单抗、英夫利昔单抗、优特克单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、多发性硬化(其可以使用例如那他珠单抗、优特克单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、哮喘(其可以使用例如贝纳利珠单抗、美泊利单抗、奥玛珠单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、呼吸道合胞病毒(RSV)(其可以使用例如帕利珠单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、黄斑变性(其可以使用例如兰尼单抗的中间位使能性型式治疗或成像)、阑尾炎(其可以使用例如fanolesomab的中间位使能性型式治疗或成像)和任何其它可以用抗体靶向或治疗的状况。上文列出的抗体及相关疾病或病症仅是例子，而不限制平台。
在某些实施方案中，一个或多个中间位、中间位变体、多价中间位拴系剂或多价中间位变体拴系剂可以与一种或多种成像剂、治疗有效剂或治疗有效量的化合物或两者缀合，从而中间位或其变体对一种或多种具有治疗有效化合物的中间位使能性抗体的结合可以治疗、预防、诊断或监测疾病或状况。与中间位使能性单抗偶联的高亲和力和/或多价中间位的此类缀合提供高度通用的平台技术，其会显著改善基于单抗的治疗学和成像方法来治疗和检测疾病(参见图8)。
III.其它用途和组合物
还提供了用于稳定化scFv(单链Fab可变)片段的方法和组合物。一般地，scFv片段(例如给定Fab的scFv形式)比全长单抗和其它片段，诸如Fab自身以实质上更低的亲和力结合抗原。此类降低的亲和力至少部分归因于直接影响Fv域的取向、构象性波动的Fab恒定域的缺乏，以及可能归因于较差的接头设计。另一方面，scFv和其它较小的片段可以具有其它优点，包括更高的组织(例如肿瘤)穿透。
在一些实施方案中，提供了用于改善scFv片段的稳定性和亲和力的方法。在一个方面，如下实施方法，即通过将中间位掺入scFv片段中通过便于其与VH和VL区中对应于相应Fab或整个抗体的中间位结合位点内的残基的残基的相互作用，例如，通过在scFv和中间位之间引入接头，以稳定化scFv。还提供了含有与一个或多个中间位结合的scFv的复合物，和含有其的组合物，及其在提供的方法中的用途。在一些方面，此类方法会帮助执行可变域的正确取向，如此增强亲和力(图9)。
还提供了使用中间位的分离和纯化方法，包括用于纯化中间位使能性抗体及其片段，和/或表达此类抗体的细胞的方法，及用于该方法的组合物和试剂盒。在一个实施方案中，通过偶联中间位(例如任何提供的中间位)与固体支持物，诸如珠，例如磁珠、板、柱、或其它固体支持物实施此类方法。参见图10。在另一个例子中，具有序列CQFDLSTRRLRCGGGSK的中间位经由胺偶联与固体支持物成功连接，并且可用于例如biacore/表面等离振子共振研究。参见图29。通过在胺偶联的长中间位芯片上流过抗体实施某些实施方案中的此类biacore研究。
用于偶联蛋白质与固体支持物的方法是本领域技术人员公知的，并且可以与此实施方案结合使用。然后，可以将中间位使能性抗体或表达其的细胞暴露于固体支持物，由此将它们分离并纯化。
与其它可用的方法相比，此类纯化方法有几个优点。例如，将提供的中间位容易合成，并且可以容易地添加至常见的固体支持物(包括磁珠)。其次，中间位的亲和力容易地受到点突变调控，这使得能够微调纯化规程并避免通常用于从蛋白A或蛋白L洗脱抗体的严格条件如低pH。在一些实施方案中，这些蛋白A或蛋白L树脂通常含有全长(例如野生型)序列，其中存在有多达5个域。这些域中的一个或多个与本文中使用的蛋白L和蛋白A相同。在一些例子中，使中间位变为二价或多价(诸如下文实施例7中描述的那些中间位)，用于提取中间位使能性抗体，诸如完整的中间位使能性抗体。
在一些方面，提供的纯化和分离方法比使用蛋白A或蛋白L的其它纯化方法具有其它优点，包括与蛋白A或蛋白L生成有关的高成本的降低、与这些蛋白质的有限生命周期相比的改善、和避免引入与蛋白L或A的使用有关的外来生物学材料诸如细菌病原体的风险。
F.中间位和中间位使能性抗体的修饰和筛选
I.中间位使能性抗体的修饰
还提供了用于修饰中间位使能性抗体以改变抗体的一种或多种特性，诸如就中间位而言结合亲和力或特异性，和/或其它特性的方法。还提供了通过所述方法生成的经修饰的抗体及用于生成该抗体的文库。在一个实施方案中，将作为中间位使能性抗体的中间位结合位点衬里和/或在其它方面对于此类抗体对中间位的结合重要的残基系统性或随机改变(例如使用简并文库和选择)，例如，以增强和/或改变中间位或中间位类似物的特异性(关于进行改变的方法，参见例如，Sheedy等2007及Akamatsu等2007，在此通过提及并入本文)。在一些方面，用天然或非天然氨基酸或这两者取代残基，以改善中间位相互作用的亲和力和/或改变中间位-抗体相互作用的另一种特性。Hutchins等2011描述了在抗体中掺入非天然氨基酸以生成双特异性抗体。
可以经由氢键键合、离子、静电或空间相互作用系统性或随机改变以改善中间位亲和力的中间位使能性抗体中与中间位接触和/或其它方面重要(例如作为空穴衬里)的残基，例如，在结合的中间位的任何原子的内的残基可以包括但不限于一个或多个轻链残基(例如基于Kabat编码方式且参照西妥昔单抗、中间位使能性曲妥珠单抗、或中间位使能性M5A，轻链的P8,V9或I9,I10或L10,S14,E17,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,K107,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168或Y173，或其它中间位使能性抗体中的类似残基)，和/或一个或多个重链残基(例如基于Kabat编码方式且参照西妥昔单抗、中间位使能性曲妥珠单抗、或中间位使能性M5A，重链的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V109,T110,V111,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186或L187，或其它中间位使能性抗体中的类似残基)，或其组合。
例如，在一些方面，将轻链P8,V9或I9,I10或L10,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168和Y173中的一个或多个和/或重链Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V109,T110,V111,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186和L187(参照西妥昔单抗，或其它中间位使能性抗体中的类似残基)中的一个或多个突变。
可以将中间位结合位点内或附近的其它残基突变以容许中间位基团将其水合并且以高亲和力结合。例如，轻链残基Tyr87、重链残基Tyr91，或两者可以用于与源自中间位类似物的含有醛或硼的化合物形成水合物。在一些方面，如本文中的实施例中显示的，中间位不影响抗原结合，并且为了提高治疗性抗体的有效性和/或功效，且在靶向诊断(例如成像)方法等本文中描述的用途中，可以用于投递药物、雏菊链/交联抗体。如此，在一些实施方案中，将提供的中间位使能性抗体的中间位结合位点改变，例如，使得它可以以较高的亲和力结合中间位和/或可以结合一个或多个变体中间位、中间位类似物、和/或小分子，诸如DOTA或DOTA衍生物(对于放射性投递和/或预靶向成像)。
在一些实施方案中，通过系统性改变来改变中间位结合位点的残基。在一些方面，突变所有位点会牵涉>206，潜在地>2016个突变组合。如此，在一些方面，使用文库有效鉴定期望的突变，其中在DNA水平生成抗体中的突变。在一个方面，文库含有单独的成员，其共同表达在靶向突变的一个或多个位置处的每个单独的天然氨基酸。在一个例子中，在感兴趣的位点(例如本文中描述的任何一个或多个位点，例如重链的Ile89,Thr87,Leu108和Thr110和轻链的Lys103和Glu165)使用简并寡核苷酸，生成其中的成员在这些位点共同编码所有20种天然存在的氨基酸的文库来创建DNA文库。
在一些方面，将锚定(例如GPI域)与文库的抗体成员，诸如与抗体(例如IgG)重链的C端偶联，以便于表达抗体的选择。可以使用标准的方法转染文库，并表达文库成员。
然后，可以选择具有一种或多种期望特征的文库的突变体抗体。在一些方面，对文库的成员选择其结合抗原的能力，例如以选择不影响抗原结合的突变。在一个例子中，例如通过FACS选择表达文库抗体的细胞，所述抗体结合经荧光标记的抗原(例如HER2,EGFR,IGFR,CLTA-4等)(图20)。在一些方面(在抗原结合选择后或代替抗原结合选择)，对表达文库抗体的细胞选择另一种特征，诸如对特定中间位、中间位类似物、或其它感兴趣分子(例如DOTA)的结合。在另一个例子中，同时选择两种或更多种特征。
将选择的文库成员(例如表达抗体的细胞)评估并表征，例如，以测定实现特定特性的期望突变或突变组合。在一个方面，通过PCR表征分选的细胞以鉴定所得的突变，其便于或增强中间位/类似物/小分子结合。
在一些方面，以重复方式，例如，通过重复突变、选择和表征过程(例如多次)实施所述方法，以“进化/优化”结合或其它期望的特征。
II.中间位类似物和片段
还提供了中间位类似物，及用于鉴定、生成和筛选此类类似物的方法。如此，在一些实施方案中，其它分子也以与中间位的功能特征相似的功能特征结合中间位使能性抗体的中间位结合位点。此类分子称作中间位类似物，并且包括但不限于小分子、适体、核酸分子、肽体和任何其它能够与中间位结合相同结合界面的物质。在一个例子中，类似物是DOTA衍生物。
在一个实施方案中，提供了用于鉴定此类类似物，包括模拟中间位的小分子类似物的筛选方法。此类方法包括荧光偏振测定法、基于衍射的和基于NMR的片段筛选、和拴系动力学组合方法。
在其它实施方案中，基于片段的药物发现方法用于鉴定结合中间位、中间位结合位点、和/或在中间位结合位点附近结合中间位使能性抗体的片段、小分子，诸如化学基团。参见例如，Erlanson,Top Curr Chem(2012)317:1-32。在一些例子中，将鉴定的片段与中间位偶联，例如，以改善其亲和力或与中间位结合位点相互作用的其它特性。在其它例子中，可以将它们扩充和/或连接在一起以生成用于与中间位或中间位使能性抗体偶联，或者用作中间位类似物的化合物。用于片段和/或中间位类似物发现的方法包括但不限于下列各项。在一些例子中，片段是约或为100-约或为1000Da。
荧光偏振测定法
在一些方面，所述方法包括荧光偏振测定法和/或其它基于竞争的测定法。在一个例子中，为了鉴定可以在中间位位点处结合并且用于类似功能的可选分子，将荧光标志物(例如Alexafluor、罗丹明、荧光素)与中间位缀合，例如使用合适的方法(例如胺、氢硫基、羧酸盐、糖或其它已知方法)进行，并且容许与中间位使能性抗体相互作用。一般地，经标记的中间位和中间位使能性抗体之间的相互作用引起荧光标签的荧光偏振/强度的变化。建立后，将测试化合物(潜在的类似物)，诸如小分子化合物(MW<1000Da)添加并平衡，例如用有荧光标签的中间位-抗体复合物，并且监测荧光偏振。阻断中间位-抗体相互作用的测试化合物会改变荧光偏振特性。因而，另一个实施方案是鉴定可以优化并用于目标投递的化合物的方法。可以将类似物或潜在的类似物筛选并进一步表征，例如通过结晶学或本文中描述的用于表征中间位的其它方法进行。
衍射方法
鉴定先导化合物的基于衍射的方法是完善建立的(Shuker等1996；Erlanson等2001；Hughes等2011)。由于西妥昔单抗和其它中间位使能性Fab衍射超出此办法在某些实施方案中用于鉴定可以与中间位偶联或用作类似物的先导化合物或小分子片段。例如，此类化合物包括片段，该片段然后连接在一起以形成合成的中间位类似物。在一个例子中，开发化合物文库以浸入西妥昔单抗或其它中间位使能性抗体的晶体中。将来自这些浸渍的衍射数据收集，并分析数据集。此类方法可以鉴定中间位使能性抗体上适合于片段生长和优化的其它位点。
将可以片段生长(化学衍生化)以增强其结合和特异性。也可以将片段与中间位化学拴系在一起。此化学偶联的优化可以显著增强中间位对中间位结合位点的总体结合亲和力。另外，可以将通过衍射方法发现的类似物优化，并代替中间位用于药物投递、多价支架化和其它功能。此外，可以进行轻链和重链中的突变以改变配体(中间位)的特异性，并且这些衍射方法(包括荧光偏振、NMR筛选、和噬菌体展示方法)可以用于优化可选配体。
NMR筛选
也可以使用NMR鉴定类似物和片段(例如肽片段、基于非肽的小分子)，其可以如本文中描述的那样优化和使用。在一个例子中，为了鉴定此类前导物，收集含有片段(例如15至20种片段)的合并物的一维(1D)光谱。在一个实施方案中，使用的片段是基于非肽的小分子。接着，将中间位使能性抗体添加至每个合并物，并且收集第二1D光谱。结合(瞬时)中间位使能性抗体的化合物经历快速的磁化转移，导致强度的损失。如此，在一些方面，比较中间位使能性抗体结合之前和之后的光谱并鉴定改变的峰，这指示相互作用。可以将这些峰预归入特定的化合物，如此理解知道，或者可以将合并物细分，并且再收集光谱。在几轮后，知道化合物的确切身份。在这些实验中，相互作用的精确位置是未知的。可以通过NMR或荧光偏振测定法测定结合位点。或者，可以用NMR活性和无活性核(例如13C,15N和2H)标记Fab片段，实施多个NMR实验以分配光谱，然后与片段文库一起使用以鉴定结合位置。
虚拟配体筛选
虚拟配体筛选是可以用于鉴定前导中间位类似物、片段、和其它化合物的另一种方法。使用晶体结构，标准程序(例如Schroerdinger Glide)可以限定大分子位点(中间位结合位点)附近的“框”，并且将已知的配体停靠到此位点。通过选择的能量函数对潜在的前导化合物评分，并且可以购买前50至200个化合物。在我们的初始研究中，已经鉴定出约100个前导化合物，并且使用晶体学，应当显示这些前导化合物证明它们结合中间位位点。
在一个实施方案中，本文中提供了筛选中间位或中间位类似物的方法。此类方法可以包括但不限于如下的步骤：使推定的中间位或小分子的文库与中间位使能性抗体接触；测定小分子的推定中间位是否在框架结合界面结合中间位使能性抗体；鉴定一种或多种候选中间位或中间位类似物；测定一种或多种候选物的结合亲和力；并且在结合解离常数小于0.70μM时将一种或多种候选物鉴定为中间位或中间位类似物。在其它背景中，低亲和力中间位是期望的，从而规定最小的解离常数，例如，0.70μM。在一些例子中，候选物在其展现出小于为或大约10μM，小于为或大约5μM，或小于为或大约2μM，小于为或大约1μM，小于为或大约500,400,300,200,100nm或更小的结合常数时鉴定为中间位或其类似物。在一些情况中，解离常数(诸如本文中所列的那些解离常数之任一)是使用特定技术测量的，所述特定技术诸如SPR、等温滴定量热术(ITC)、荧光、荧光偏振、NMR、IR、量热术滴定、动力学排除(Kinetic exclusion)、圆二色性、差别扫描量热术、或其它已知的方法。例如，在一些情况中，类似物或中间位展现出小于为或大约10μM、小于为或大约5μM、或小于为或大约2μM、小于为或大约1μM、小于为或大约500,400,300,200,100nm或更小的结合常数，如通过SPR测量的或如通过ITC测量的或者如通过任何这些方法测量的。
另外，还提供了筛选新颖框架结合界面的方法，并且在下文例子中进一步描述。
在另一个实施方案中，提供了用于鉴定和优化与中间位结合可用的片段的方法，诸如在建立中间位类似物中和/或在与中间位偶联中以改善其功能。还提供了此类类似物及片段和化合物。
已经参照实施方案和例示的实施例描述了本发明，本领域技术人员可以领回如描述并例示的对本发明的修改，其不偏离如说明书中公开的本发明的精神和范围。列出实施例以帮助理解本发明，但是并不意图且不应解释为以任何方式限制其范围。实施例不包括常规方法的详细描述。此类方法是本领域普通技术人员公知的，并且在许多出版物中描述。此外，上文和下文实施例中引用的所有出版物在此通过提及完整并入，就像本文中完整列出一样。
实施例
实施例1：中间位-抗体FAB晶体结构的测定
发现了中间位，其在西妥昔单抗的Fab区和Fab片段的中心空穴内以高特异性和亲和力结合。使这些中间位结合西妥昔单抗Fab，并且用结晶学测定结构。
材料和方法
试剂。如下获得西妥昔单抗的抗原结合片段(Fab)，即用固定化的木瓜蛋白酶(Pierce)消化西妥昔单抗IgG，接着用蛋白A和Superdex75柱(GEHealthcare)上的大小排阻层析(SEC)的逆纯化。合成西妥昔单抗的单链可变片段(scFvC225)，其在轻链和重链之间具有20个氨基酸的接头。将ScFvC225和可溶性表皮生长因子受体域III(sEGFRdIII)在Sf9细胞中表达并纯化，如先前描述的(Donaldson,J.M.,Kari,C.,Fragoso,R.C.,Rodeck,U.&Williams,J.C.Design and development of masked therapeutic antibodies to limit off-targeteffects:Application to anti-EGFR antibodies.Cancer Biol Ther8(2009))。
在希望之城合成和聚合物化学核心室(City of Hope Synthetic andPolymer Chemistry Core Facility)将中间位CQFDLSTRRLKC(cQFD；SEQ IDNO:1)和CQYNLSSRALKC(cQYN；SEQ ID NO:2)(至噬菌体展示生物淘选实验分离，如由Riemer,A.B.等,Vaccination with cetuximab mimotopes andbiological properties of induced anti-epidermal growth factor receptor antibodies,J Natl Cancer Inst97,1663-70(2005)描述的)合成，氧化，并纯化。
结晶和衍射数据。将西妥昔单抗Fab(5mg/mL)与cQFD和cQYN中间位以1:10摩尔比混合，并使用Qiagen JCSG Core Suites(IIV)于20℃筛选晶体形成。将衍射超出的共晶体在100mM磷酸/柠檬酸钠盐，pH4.5,2.5M磷酸钠/钾盐和1.6％w/v中赤藓糖醇中生长。将晶体芯吸通过14％w/v赤藓糖醇，并且在液氮中快速冷冻。在希望之城的X射线设施实施结晶试验和初始筛选研究。在斯坦福同步加速器放射实验室(Stanford Synchrotron Radiation Lab)，射束线(beam line)9.1和11.1收集衍射数据。在西妥昔单抗的无配体结构(pdb:1YY8–链A和B)(Li,S.等Structural basis for inhibition of theepidermal growth factor receptor by cetuximab.Cancer Cell7,301-11(2005))情况下使用程序Phaser(McCoy,A.J.等Phaser crystallographic software.J ApplCrystallogr40,658-674(2007))通过分子替换测定初始相。以Matthews系数3.26和溶剂含量62.4％将两个Fab置于不对称单元中。Z得分(均值上的解法标准差)是27和25(对于旋转搜索)以及38和71(对于平移搜索)。不能放置第三个Fab片段(不对称晶胞中的三个Fab在43％溶剂时产生2.18的合理Matthews系数)。使用Coot(Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-building tools formolecular graphics.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr60,2126-32(2004))andPhenix(Adams,P.D.等PHENIX:building new software for automatedcrystallographic structure determination.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr58,1948-54(2002))经由多个迭代将cQFD和cQYN中间位手动建立密度。
结晶和结构测定
如上文记录的，将西妥昔单抗Fab片段生成并纯化，并与cQFD中间位(SEQ ID NO:1的环肽)以1:10比率混合；使用商业工厂来筛选晶体形成。于20℃在1天后形成晶体。这些晶体的初始衍射分析指示晶胞维度和空间群与已经保存于蛋白质数据库(1YY8.pdb)中的西妥昔单抗Fab的晶胞维度和空间群(Li,S.等Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptorby cetuximab.Cancer Cell7,301-11(2005))类似。保存结构中的CDR环进行广泛晶体接触的观察结果可以已经提示了cQFD中间位不存在于晶体中。不过，通过分子替换解出结构，并检查实验图谱以鉴定与中间位一致的未建模的电子密度。初始Fo-Fc图谱清楚地指示在Fab片段中间的区域为潜在的结合位点(图1)。在仅使用Fab模型的一轮初始精化后，观察到与中间位一致的未建模密度的连续区段。将中间位建立密度，并且R和RFree相应地下降。在使用Phenix(Adams,P.D.等PHENIX:building new software for automatedcrystallographic structure determination.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr58,1948-54(2002))精化期间添加水分子。在下文表5中给出了衍射数据和精化统计学。
表5：中间位cQFD,cQYN的中间位-抗体共晶体的衍生数据和精化统计学
*括号中的数值针对最高分辨率壳
基于这些观察结果且作为比较点，生成与中间位cQYN(SEQ ID NO:2)结合的西妥昔单抗Fab的晶体。关于SEQ ID NO:1的中间位，在Fab中心观察到清楚的未建模电子密度。使用第一种结构，相应地对序列差异建模，并实施多轮精化。图1B中显示了两种中间位的代表性电子密度图谱。上文表5中还呈现了cQYN-Fab复合物的衍射数据和精化统计学。
实施例2：西妥昔单抗FAB的中间位结合位点的表征
如下文所讨论的，表征西妥昔单抗的中间位结合位点。证明了此中间位结合位点是独特的，并且尚未发现存在于至今为止检查的免疫球蛋白中。
在上文实施例1中描述的那些材料和方法外，还使用以下材料和方法。
中间位和点突变。如实施例1中所描述的，在希望之城合成和聚合物核心设施合成、氧化并纯化CQFDLSTRRLKC(cQFD；SEQ ID NO:1)和CQYNLSSRALKC(cQYN；SEQ ID NO:2)。在残基3(Phe3至Ala)、5(Leu5至Ala)、8(Arg8至Ala)和10(Leu10至Ala)处产生cQFD中间位中的丙氨酸点突变，并且通过在SMT3的C端编码肽以细菌生成突变体(Mossessova,E.&Lima,C.D.Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conservedinteractions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.MolCell5,865-76(2000))。通过透析到没有DTT的缓冲液中将肽氧化，并通过SEC纯化以获得单体。在表面等离振子共振(SPR)分析前，向样品添加泛素样蛋白酶(Ulp1)以释放所述肽。每种生物合成的突变体肽由于ULP1切割位点而含有N端的额外丝氨酸残基。Ulp1和SMT3作为对照运行，并且不与西妥昔单抗Fab相互作用。
中间位-Fab界面的表征。如先前描述的(Donaldson等，2009；Li等，2005,见上文)，通过SPR实施亲和力分析。简言之，使用胺化学将scFvC225或FabC225(西妥昔单抗Fab)固定化于CM5芯片上。于20℃通过平衡方法评估肽或sEGFRdIII亲和力，并拟合于等式RU＝{R最大值*[L]}/{[L]*Kd}+R偏移。使用Superdex20010/300柱(GE Healthcare)实施SEC。将蛋白质混合，于室温温育20分钟，并于4℃应用于柱。
使用EGFR表达性MDA-MB-468细胞系来测试在存在肽中间位情况下的西妥昔单抗结合。在有或无60μM cQFD肽的情况下，于4℃添加经标记的西妥昔单抗(AF488,Invitrogen)达20分钟。使用经标记的MOPS-21作为同种型对照。使用FACS Calibur仪(BD Biosciences)测定细胞荧光。
对中间位/Fab界面的分析
在中间位(SEQ ID NO:1)和西妥昔单抗Fab之间的结合位点界面测定为是由IgG Fab的所有4个域(例如可变重链和轻链域，轻链恒定区，和重链CH1)形成的。使用PISA服务器，在cQFD或cQYN中间位-Fab界面掩埋的表面积分别为904(±28)和787(±42)并且在轻链和重链之间大致相等分布。图2、35、和36显示了来自Fab的测定为接触中间位的残基和环。
两个中间位(SEQ ID NO:1和2)都测定为与西妥昔单抗Fab产生多个氢键和疏水性接触。将西妥昔单抗(鼠嵌合IgG)的氨基酸序列与在最初鉴定SEQID NO:1和2的中间位的噬菌体展示实验中作为同种型对照使用的嵌合单克隆IgG(ch14.18)和曲妥珠单抗(一种结合ErbB2的人源化单克隆抗体)比对(参见图2A)。还将曲妥珠单抗Fab的结构叠合到与SEQ ID NO:1的中间位结合的西妥昔单抗Fab的结构上。图2A显示了西妥昔单抗Fab(鼠嵌合IgG)及ch14.18和曲妥珠单抗的中心空穴中间位结合界面内的残基间的氨基酸差异。
人源化曲妥珠单抗Fab(1NZ8.bdb)在西妥昔单抗Fab上的叠合指示，cQFD中间位的Arg9结合由鼠可变轻链创建的独特空穴。具体地，基于Kabat编码方式的西妥昔单抗的鼠可变轻链的Asp85、Ile83和Thr40就结合cQFD中间位的Arg9残基而言是重要的(图2B)。可变轻链的鼠框架区中的Asp85显示为与cQFD中间位的Arg9的胍基形成盐桥( )。Asp85的羧基也显示为与cQFD中间位的Leu10的主链酰胺氮形成氢键()。来自轻链的Thr40的羟基也显示为与中间位Arg9的胍基形成氢键(对于这两者，)。结构的叠合还显示了存在于人可变轻链序列中的Phe83中的苯基环和Pro40的吡咯烷环(分别对应于西妥昔单抗中的Ile和Thr)如下定位，使得它们会在空间上阻塞cQFD中间位中Arg9的侧链。
尽管cQFD中间位中Arg9侧链定位到鼠和人Fab序列之间的差异，但是cQYN中间位在与cQFD中间位中Arg9相同的位置处编码丙氨酸，并且如此能潜在地结合人Fab。虽然cQYN中间位不存在与cQFD中间位的Arg9至轻链的Asp85的胍盐基团的氢键，显示了轻链的Asp85的羧基基团保留其与cQYN中间位的Leu10的主链酰胺氮的氢键。测定cQFD和cQYN中间位之间的差异及其与西妥昔单抗Fab的相互作用。与西妥昔单抗Fab(具体地重和轻Fab链的Cα原子)结合的两个中间位(cQFD和cQYN)的结构叠合显示了每个中间位的残基Phe/Tyr3、Leu5和Leu10的疏水性侧链几乎相同定位，指示这些残基与抗体的相互作用对于结合是重要的(图2B)。显示了苯基环相对于重链可变区的保守Gln39(Kabat编码方式)包装；显示了Leu5侧链相对于重链可变区的Ile89和Leu108(Kabat编码方式)及来自中间位的Phe3/Tyr3的苯基环包装。显示了中间位的Leu10结合位于可变轻链上的暴露袋。
然而，cQFD和cQYN肽的主链迹线确实偏离。具体地，cQFD中间位的Arg8侧链结构是延长的，并且与Fab重链的Gln105主链羰基形成强主链氢键(dNH1···O＝C＝2.6和2.8；)。然而，cQYN肽中的Tyr3的羟基基团在空间上干扰Arg8侧链(图2B)，并且阻断cQYN中间位的Arg8和重链Gln105之间的相互作用。与此观察一致，cQYN复合物中的两条Arg8侧链在电子密度图谱中是较差限定的，并且采取至少两种不同旋转异构体。(在不对称单元中有两个Fab-中间位复合物)。伴随此变化，观察到主链氢键模式的移位。cQFD中间位中的Thr7的酰胺羰基与西妥昔单抗Fab轻链中的酰胺Asn41形成氢键()。此氢键在cQYN肽中Asn41主链的酰胺中移位至Arg8主链的羰基()。
叠合指示从人轻链序列中Pro40和Gly41至西妥昔单抗轻链中Thr和Asn的变化减轻空间约束，并且提供两个额外的点，用于与中间位形成氢键。在cQFD中间位-西妥昔单抗Fab结构中，显示了Fab Asn41的酰胺氮与中间位的Thr7的羰基相互作用()，并且显示了Fab Asn41的侧链酰胺与中间位的Ser6的羰基相互作用()。在cQYN中间位-西妥昔单抗Fab结构中，主链的转变导致氢键样式的转变。Fab Asn41的酰胺氮与cQYN的Arg8的羰基相互作用()，但是侧链与FabAsn41的相互作用是丧失的。
在这些结果外，将曲妥珠单抗(1N8Z；Cho等,Nature,“Structure of theextracellular region of HER2alone and in complex with the Herceptin Fab,”2003Feb13；421(6924):756-60)和利妥昔单抗(2OSL；Du等,J Biol Chem,2007May18；282(20):15073-80.Epub2007Mar29)Fab的分子结构叠合到中间位结合的西妥昔单抗Fab结构上进一步突出显示了框架的独特性。
总之，这些结果提示了西妥昔单抗和对照IgG的框架区中的差异(与CDR中的差异形成对比)造成针对Fab的中心空穴的中间位的选择(即，西妥昔单抗和噬菌体展示对照抗体在除CDR外的区域中不同)。
中间位不在Fab中诱导较大的构象变化
基于中间位-西妥昔单抗Fab界面的位置，测定中间位是否扰乱IgG域与未连接的和/或连接的结构的相对取向。首先，比较这两种中间位复合体的不对称晶胞内的轻链和重链，然后将每条链与未连接的和EGFR连接的结构比较。结合任一中间位的轻链可变域与西妥昔单抗的无配体结构是基本上相同的(r.m.s.d.平均值：cQFD,cQYN,)。然而，重链的可变域显示了更大的趋异(r.m.s.d.平均值：cQFD,cQYN,)。此趋异主要源自框架区2的位置(残基39-46)，因为将此区中的所述残基删除并重新计算r.m.s.d.产生低得多的数值(cQFD, cQYN,)(图6)。另外，还显示了此区在Fab C225-EGFR(西妥昔单抗Fab-抗原)共晶体结构中是替换的，并且其相对B-因子值提示它是柔性的(图6)。最后，相对于EGFR结合的或未结合的结构，中间位的存在没有导致对CDR结构的显著改变。尽管与结合任一中间位的Fab结构相比，显示了EGFR加配体的结构的重链CDR环3中的Tyr98的主链是翻转的，但是在无配体的西妥昔单抗Fab结构中也观察到此翻转(Li等，2005，见上文)。
中间位残基对抗体结合的贡献
基于cQFD中间位-Fab复合体的结构，以及cQYN与cQFD的序列相似性，产生cQFD中间位中的数处点突变(Phe3→Ala,Leu5→Ala,Arg8→Ala和Leu10→Ala)以表征这些残基对于中间位的总体结合亲和力的作用。为了评估结合亲和力，使用标准胺化学将西妥昔单抗Fab片段与CM5芯片偶联，并使用表面等离振子共振(SPR)测量各种中间位的结合特性。合成的cQFD和cQYN中间位对西妥昔单抗Fab的亲和力分别测量为950±30nM和3.5±0.1μM(n＝3)。还测量结合动力学(图3)。以双分子相互作用建模的结合常数对于cQFD和cQYN分别为4.2(±0.1)x104M-1s-1和1.8(±0.1)x104M-1s-1。解离常数对于cQFD和cQYN分别为2.5(±0.1)x10-2s-1和8.6(±0.1)x10-2s-1。基于这些测量的KD值(对于cQFD为430(±30)nM，对于cQYN为3.5(±0.1)μM)与平衡测量紧密一致。
接着，测量每种突变的cQFD中间位的亲和力。以与SMT3的C端融合物生成点突变和野生型cQFD中间位，并将其在分析前用Ulp1切割。生物学生成的野生型cQFD中间位以770nM的亲和力结合，这类似于合成生成的cQFD，而突变Phe3→Ala,Leu5→Ala和Arg8→Ala显著降低对西妥昔单抗Fab的亲和力(表6，下文)。具体地，Arg8→Ala突变导致结合亲和力损失约183倍。
在表6中，WT＝cQFD(SEQ ID NO:1)，F3A＝SEQ ID NO:26且在半胱氨酸前具有额外的丝氨酸，L5A＝SEQ ID NO:27且在半胱氨酸前具有额外的丝氨酸，R8A＝SEQ ID NO:28且在半胱氨酸前具有额外的丝氨酸，及L10A＝SEQ ID NO:29且在半胱氨酸前具有额外的丝氨酸。
表6：“WT”(cQFD)和突变体中间位的解离常数
cQFD中间位突变体的解离常数
最后，将曲妥珠单抗(一种人源化治疗性单克隆抗体)的Fab与CM5芯片偶联以表征cQFD和cQYN中间位对人框架的亲和力。平衡测量揭示两种中间位的解离常数超过150μM。
实施例3：中间位对除CDR外的区域的结合
材料和方法
证明了中间位cQFD和cQYN等对中间位使能性抗体(西妥昔单抗)的结合不影响抗体结合抗原的能力，这意味着中间位使能性抗体可以同时结合抗原和中间位。
在上文实施例1和2中描述的那些材料和方法外，还使用了以下材料和方法。
试剂。如上文描述的，用轻链和重链之间的20个氨基酸的接头合成西妥昔单抗的单链可变片段(scFvC225)。将scFvC225和可溶性表皮生长因子受体域III(sEGFRdIII)在Sf9细胞中表达，并纯化，如先前描述的(Donaldson等，2009)。
中间位和点突变。如上文所描述的，在希望之城合成和聚合物核心设施经由半胱氨酸氧化以创建二硫键来环化CQFDLSTRRLKC(cQFD；SEQ IDNO:1)和CQYNLSSRALKC(cQYN；SEQ ID NO:2)，并将其纯化。在残基3(Phe3至Ala)、5(Leu5至Ala)、8(Arg8至Ala)和10(Leu10至Ala)处生成cQFD中间位中的丙氨酸点突变，并且通过在SMT3的C端编码肽以细菌生成(Mossessova等，2000)。在表面等离振子共振(SPR)分析前，向样品添加泛素样蛋白酶(Ulp1)以释放所述肽。N端丝氨酸残基以蛋白酶切割位点的残余物保留。
EGFR和中间位与Fab的同时结合
将西妥昔单抗Fab与sEGFRdIII和cQFD一起温育，并应用于分析SEC柱。观察到13.9mL的峰，这指示这三种组分间的杂三聚体复合物的形成。峰的非还原性SDS-PAGE显示了存在所有三种组分(图4B)。比较而言，单独的组分在15.2mL(Fab C225)、15.6mL(sEGFRdIII)和16.3mL(SMT-CQFDLSTRRLKC；SEQ ID NO:1)洗脱。结果显示了中间位和EGFR可以同时结合西妥昔单抗，指示中间位结合不阻碍西妥昔单抗的抗原结合。
另外，使用共振能量转移(FRET)测量确认中间位不影响西妥昔单抗的抗原结合。从经Alexfluor488标记的西妥昔单抗Fab发射的荧光信号在结合经Alexafluor555标记的sEGFRdIII后被淬灭。用经标记的sEGFRdIII滴定经标记的西妥昔单抗提供20nM的结合常数，即与使用SPR观察到的数值基本上相同的数值(数据未显示)。为了测试变构性，在存在cQFD中间位(66μM)的情况中将经标记的西妥昔单抗Fab以范围为5至1000nM的浓度与sEGFRdIII一起温育。一式三份实施实验。与SEC研究类似，没有观察到Fab-sEGFRdIII相互作用的结合常数的实质性变化。
总之，这些生物化学研究指示中间位-Fab相互作用基本上不影响抗原结合。这些观察结果与用蛋白L和蛋白A(其也在不影响抗原对Fab的结合的情况下结合Fab框架区)得到的结果类似。
cQFD中间位不结合西妥昔单抗的CDR环
为了进一步确认中间位不结合CDR，评估cQFD中间位和西妥昔单抗的scFv片段之间的结合。在scFv中，CDR环仍然是完整的，但是Fab可变域经由短肽接头直接连接，从而消除Fab恒定域。换言之，大部分中间位结合袋在scFv中是消除的，而CDR受到最小程度的影响。SPR表明EGFR域III和cQFD中间位结合至拴系于CM5芯片的西妥昔单抗Fab(见图4D)。另外，EGFR域III以最小的亲和力损失结合拴系于第二CM5芯片的scFv。然而，相对于Fab结合，cQFD中间位在高达100μM浓度的中间位时没有使scFv饱和。这指示了中间位对CDR的最小程度(若有的话)亲和力，这与结晶学研究一致。
cQFD中间位结合不影响西妥昔单抗对EGFR表达细胞的结合
如上文描述的，西妥昔单抗ab能同时结合cQFD中间位和EGFR域III。进一步显示了此中间位不影响西妥昔单抗(完整的IgG)对表达EGFR的细胞的结合。为了测试这点，使用FACS分析来追踪IgG对MDA MB-468细胞(其过表达EGFR)的结合，作为中间位浓度的函数。将细胞在存在递增的cQFD中间位浓度的情况下与西妥昔单抗一起温育。即使在中间位浓度大于60μM的情况下，没有观察到西妥昔单抗对细胞的结合的显著变化。此观察与上文所描述的SEC研究一致，并且指示中间位并不起抗原结合的变构调节物作用。
在显著高于中间位KD的浓度显示EGFR域III和中间位对Fab的同时结合。与cQFD和cQYN中间位一样，超抗原SpA和PpL结合Fab框架区而并不影响抗原结合(参见Graille,M.等Crystal structure of a Staphylococcus aureus ProteinA domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody:structuralbasis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.Proc NatlAcad Sci U S A97,5399-404(2000))；Graille,M.等Complex betweenPeptostreptococcus magnus Protein L and a human antibody reveals structuralconvergence in the interaction modes of Fab binding proteins.Structure9,679-87(2001)；Young,W.W.,Jr.,Tamura,Y.,Wolock,D.M.&Fox,J.W.StaphylococcalProtein A binding to the Fab fragments of mouse monoclonal antibodies.JImmunol133,3163-6(1984)；Graille,M.等Evidence for plasticity and structuralmimicry at the immunoglobulin light chain-Protein L interface.J Biol Chem277,47500-6(2002))。
与其它Fab结合蛋白相关的中间位结合
Fab上的中间位结合位点不同于结合Fab的框架区的其它蛋白质的。例如，蛋白A(从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离)的域D结合人IgG的重链框架(VH)；蛋白L(从大消化链球菌分离)的B1域结合人IgG的kappa轻链的框架区(VL)；并且蛋白G(从链球菌菌株分离)的域II结合人IgG的重链的框架(VC)。与这些相互作用不同(其中界面主要限于溶剂暴露的单一Fab域)，显示了中间位-Fab界面由所有四个域(例如重链和轻链的可变和恒定域)形成。
显示了cQFD和cQYN中间位-西妥昔单抗Fab界面掩埋的表面积分别为和并且一般在轻链和重链之间相等分布。这些数值分别大致类似于与其Fab域结合的蛋白A、L和G域的界面的数值：(1DEE.pdb)、(1HEZ.pdb)、和(1QKZ.pdb)。存在有Fab的可变区和蛋白L(其掩埋)之间的两个独特界面及Fab的恒定区和蛋白G(其掩埋)之间的次要相互作用。
空间遮蔽
可以经由柔性接头将中间位拴系于鼠嵌合物或中间位使能性人单抗的轻链N端或重链N端(图11)。单抗IgG的N端与抗原结合位点并置，并且从N端延伸到柔性接头会在空间上干扰抗原结合。通过在接头中编码肿瘤特异性蛋白酶位点(例如MMP9、MMP14、前列腺特异性抗原(PSA)丝氨酸蛋白酶或其它合适的位点)，分子内“遮蔽”的IgG构建体的空间约束在肿瘤部位会切断，并且允许抗体结合。此设计原理会避免分子内“遮蔽”的IgG对健康组织的结合，而且避免由于脱靶结合所导致的不利副作用。西妥昔单抗上亲合素-肽遮蔽的解离速率测定显示了多价中间位以比单价中间位更高的亲和力结合，但是不遮蔽。
实施例4：中间位使能性抗体的生成
基于结构信息，生成其它中间位使能性抗体。
A.通过突变生成中间位使能性曲妥珠单抗
通过突变曲妥珠单抗生成中间位使能性HER2结合抗体。将与西妥昔单抗相比人IgG(曲妥珠单抗–1N8Z.pdb)的重链和轻链可变区框架区之间的序列差异定位到与cQFD中间位结合的西妥昔单抗Fab的晶体结构上。将人框架中与作为西妥昔单抗中中间位结合位点衬里的残基对应的残基突变为含有西妥昔单抗中存在的相应残基；另外，依照Kabat编码方式的轻链的S9和S10分别突变为异亮氨酸和亮氨酸。图23A和23C分别显示了突变体(中间位使能性)曲妥珠单抗的重链(SEQ ID NO:5)和轻链(SEQ ID NO:8)的一部分的核酸序列。图23B和23D分别显示了中间位使能性曲妥珠单抗的重链(SEQ IDNO:6)和轻链(SEQ ID NO:9)的一部分的氨基酸序列。图23B和23D还显示了这些氨基酸序列与野生型曲妥珠单抗的重链和轻链的一部分的那些氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10)的比较。
使用标准方法合成编码此突变体中间位使能性曲妥珠单抗的重链和轻链的核酸，并将其亚克隆到哺乳动物表达的标准载体中。将中间位使能性曲妥珠单抗IgG使用标准方法纯化，并表征结合HER2和cQFD中间位的能力。
中间位使能性曲妥珠单抗结合抗原和中间位，并且与野生型曲妥珠单抗 具有不能区别的PK/PD特性
在一个研究中，为了表征抗原结合，使用标准方案用Alexa647标记野生型曲妥珠单抗和中间位使能性曲妥珠单抗。使用相同的方案用Alexa488标记cQFD(SEQ ID NO:1)中间位-Fc融合蛋白(如实施例7中描述的那样生成，并且在图15和16中显示)。为了显示中间位-Fc结合中间位使能性曲妥珠单抗而不结合野生型曲妥珠单抗，将SKBR3细胞(0.5x106)(其过表达HER2)与经标记的野生型和中间位使能性曲妥珠单抗一起温育30分钟。将未结合的抗体清洗，并将细胞与中间位-Fc构建体一起温育30分钟。通过FACS分析来分析抗体结合和中间位结合。FACS数据证明了中间位使能性曲妥珠单抗结合SKBR3细胞上表达的HER2(例如可以在不损失抗原特异性的情况下将中间位位点嫁接到抗体上)(图22A)，且中间位-Fc结合中间位使能性曲妥珠单抗，但不结合野生型曲妥珠单抗(图22B)。
在另一个研究中，使用标准方案用Alexafluor488标记野生型和中间位使能性曲妥珠单抗。将SKBR3细胞(0.5x106)用胰蛋白酶处理，用0.1％BSA清洗一次，并与1,10或100nM野生型或中间位使能性曲妥珠单抗一起温育30分钟。将未结合的抗体清洗两次，并通过流式细胞术分析。结果显示于图43，证明了中间位使能性曲妥珠单抗对抗原表达细胞具有类似的亲和力，野生型曲妥珠单抗亦然。
在另一个研究中，使用相同的标准方案用Alexafluor647标记cQFD(SEQID NO:1)中间位-蛋白L融合蛋白(MPL)。将SKBR3细胞用胰蛋白酶处理，用0.1％BSA清洗一次，然后预结合至野生型曲妥珠单抗(WT T)或中间位使能性曲妥珠单抗(TM)(通过温育30分钟进行)。然后，将细胞清洗，接着与0.1μM或1μM MPL再温育30分钟(右侧)。将细胞清洗两次，并通过流式细胞术(FACS)分析。没有预结合抗体(仅MPL(WT))的细胞用作阴性对照。图44中显示了结果。直方图表明与中间位使能性曲妥珠单抗结合的细胞，而非未结合的细胞或与野生型曲妥珠单抗结合，与中间位-蛋白L融合蛋白结合的细胞。点图显示了相对于仅MPL的对照在每个象限中的细胞的百分比。
如图45中显示的，使用中间位-蛋白L获得相同的结果，其中蛋白L中的除了1个外的所有赖氨酸突变为Arg/Asn残基(MPL-5K)。
这些数据证明了中间位使能性曲妥珠单抗能够与野生型抗体以相同的程度结合抗原，并且中间位使能性曲妥珠单抗(而非野生型曲妥珠单抗)结合中间位。如此，这些数据确认中间位与此抗体的中间位结合位点的结合在此研究中不影响抗原结合，证明了三重相互作用。
图50(顶部小图)显示了与西妥昔单抗结合的中间位18(SEQ ID NO:18，表3中所示，在第5位具有β,β’-二苯丙氨酸)(暗灰色棒)、与中间位使能性曲妥珠单抗结合的相同中间位(18)(白色棒)、和野生型曲妥珠单抗(略图)的结构的棒表示(重叠)。底部小图显示了比较野生型和中间位使能性曲妥珠单抗的带状草图。结果证明了对于与中间位结合重要的残基位置在西妥昔单抗和中间位使能性曲妥珠单抗中在几乎相同的地方。图50的右侧小图显示了野生型和中间位使能性曲妥珠单抗的带状草图，证明了结构的很小差异。
同样地，图51在上左小图中显示了曲妥珠单抗和曲妥珠单抗memAb(标记为“中间位使能性Memab”)的结构重叠，牵涉中间位使能性抗体中的中间位结合的某些残基以棒显示。上右小图显示中间位使能性曲妥珠单抗(memab)和西妥昔单抗的结构重叠，标记相同残基。如显示的，Ile83在相应的结构中呈现两个旋转异构体，其确定为不成问题，鉴于在中间位结合的中间位使能性曲妥珠单抗晶体结构中，它与西妥昔单抗中观察到的旋转异构体呈现相同的旋转异构体。底部小图显示了重叠的所有三种这些结构的“草图/带状图”，证明了总体上没有显著差异。观察到CDR环中的一些差异，如预期的(鉴于这些抗体对不同抗原的结合)。
另外，动物研究指示中间位使能性曲妥珠单抗和野生型曲妥珠单抗的生物分布是不能区别的。
这些数据证明了抗体可以是有效中间位使能化的，同时保留其它功能，其通过将残基突变为对应于那些在西妥昔单抗的中间位结合界面中的残基实现。
中间位使能性曲妥珠单抗结合中间位和抗原，无论序贯接触或者与中间 位预混合
另一项研究证明了中间位以类似的效率结合中间位使能性曲妥珠单抗，无论细胞与抗体预结合(序贯)还是将预形成的中间位-抗体复合物(预混合)应用于细胞。图46中显示了结果。在此研究中，将SKBR3细胞用胰蛋白酶处理，用0.1％BSA清洗一次，然后与10nM中间位使能性曲妥珠单抗(TM)温育30分钟，清洗，然后与4、20、或100nM MPL再温育30分钟(左侧小图)。或者，将10nM TM与4、20、或100nM MPL在冰上预混合30分钟，接着对细胞应用混合物1小时(右侧小图)。将细胞清洗两次，并且通过FACS分析。图注中显示了MPL阳性细胞相对于无处理对照的百分比。
B.通过CDR嫁接生成中间位使能性HER2结合抗体
通过将曲妥珠单抗的CDR嫁接到西妥昔单抗生成中间位使能性HER2结合抗体。
曲妥珠单抗重链的核酸和氨基酸序列显示于图25A(分别为SEQ ID NO:11和12)，其具有信号序列和其它序列。曲妥珠单抗轻链的核酸和氨基酸序列显示于图25B(分别为SEQ ID NO:13和14)，其具有信号序列和其它序列。
虽然单抗的CDR环的“边界”一般已经通过序列同源性结构方法清楚限定，但是将曲妥珠单抗的晶体结构重叠到西妥昔单抗上，并且检查每个残基的位置以解决在CDR环外部对CDR环的构象具有次要效应的潜在差异；基于此信息，超出修饰CDR的其它修饰。设计为在西妥昔单抗样框架上含有曲妥珠单抗样CDR的抗体轻链和重链的氨基酸序列转化成DNA序列，并且合成编码每种的基因。图47中显示了含有嫁接到西妥昔单抗样框架上的曲妥珠单抗样CDR的抗体的所得重链和轻链的氨基酸和核酸序列。具体地，图47A显示了嫁接有CDR的中间位使能性曲妥珠单抗(具有嫁接到西妥昔单抗样框架上的曲妥珠单抗样CDR)的轻链核酸(SEQ ID NO:60)和轻链氨基酸(SEQ ID NO:61)序列，信号序列和其它残基有阴影。图47B显示了此抗体的重链核酸(SEQID NO:62)和重链氨基酸(SEQ ID NO:63)。
然后，将基因以符合读码框的方式亚克隆到剩余的IgG DNA序列中，通过DNA测序确认，并且在各个表达载体中放置。将所得的表达载体转染入NS0细胞中，以共表达重链和轻链。由于表达的嫁接有CDR的全长IgG是分泌性的，将上清液通过离心澄清，浓缩，并通过蛋白A柱。使用低pH溶液将IgG洗脱，并立即中和。在还原性条件下对嫁接有CDR的全长IgG实施SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果指示具有与轻链和重链一致的表观质量的两个蛋白质条带。与野生型西妥昔单抗相比，条带的位置以相似的位置迁移。
为了表征抗原结合，使用标准方案用Alexafluor647标记野生型曲妥珠单抗和嫁接有曲妥珠单抗CDR的中间位使能性单抗(memAb)。如上文描述的，cQFD(SEQ ID NO:1)中间位-Fc(如实施例7中描述的那样生成并且在图15和16中显示)；使用相同的方案用Alexafluor488标记中间位-Fc。为了显示中间位-Fc结合嫁接有曲妥珠单抗CDR的中间位使能性单抗而不结合野生型曲妥珠单抗，将过表达HER2的SKBR3细胞(0.5x106)与如本实施例中生成的经标记的野生型或嫁接有CDR的中间位使能性曲妥珠单抗一起温育30分钟。将未结合的抗体清洗，并且将细胞与中间位-Fc构建体一起温育30分钟。通过FACS分析来分析抗体结合和中间位结合。作为“CDR–嫁接”的重要组分。图24中显示了结果。FACS数据显示了嫁接有曲妥珠单抗CDR的中间位使能性单抗结合SKBR3细胞上表达的HER2，证明了嫁接到中间位使能性抗体(西妥昔单抗)框架上的一种抗体(曲妥珠单抗)的CDR环保留结合抗原(HER2)的能力(图24A)。FACS数据还显示了中间位-Fc结合嫁接有曲妥珠单抗CDR的中间位使能性单抗，而不结合野生型曲妥珠单抗(图24B)，这证明了嫁接有CDR的中间位使能性抗体结合中间位。
注意到优化嫁接有CDR的中间位使能性曲妥珠单抗的生成会产生更多的材料以进行更严格/定量的表征。此研究中的少量材料及如此不太严格/定量的表征(例如中间位使能性曲妥珠单抗的最终浓度及其用Alexafluor647标记的不确定性)可能造成表观降低的亲和力。存在有优化抗原结合的公知方法。数据显示了嫁接有CDR的中间位使能性曲妥珠单抗结合曲妥珠单抗抗原(即结合过表达HER2的SKBR3细胞)，并且结合SEQ ID NO:1的中间位(即用嫁接有CDR的中间位使能性曲妥珠单抗预处理的抗原表达细胞结合中间位)。
C.通过突变生成中间位使能性CEA结合抗体(中间位使能性M5A)
另外，通过将残基突变为对应于西妥昔单抗的残基将抗CEA抗体(M5A)中间位使能化。具体地，如图56中用阴影法显示的，在M5A抗体的轻链中引入8处点突变，容许其结合中间位。将野生型重链序列和中间位使能性轻链序列克隆到Lonza谷氨酰胺选择表达载体中，并在NS0细胞中转染。获得2个稳定的品系，其以约5mg/L表达中间位使能性单抗。
通过FACS使用LS174T细胞证明中间位使能性M5A对M5A抗原(CEA)的结合。将500nM经Alexa Fluor488标记的野生型或中间位使能性M5A与经胰蛋白酶处理的细胞和9μM经Alexa Fluor647标记的中间位-蛋白L(参见实施例10)一起温育30分钟(室温)。将细胞用0.1％BSA清洗两次，并实施FACS分析。图57中显示了结果。鉴于M5A是一种与曲妥珠单抗具有相同主链的人源化抗体，结果显示了中间位-蛋白L容易结合野生型M5A。然而，用中间位使能性M5A(M5A8M)观察到增强的结合，这是由于从中间位和蛋白L两者的同时结合获得的亲合力。
另外，使用表面等离振子共振如本文中描述的那样实施SPR测量，确认各种中间位变体对此中间位使能性抗体(包括CQA(二苯基)DLSTRRLKC、CQFDA(二苯基)STRRLKC、中间位31、和cQYN中间位)的结合(图58)。
实施例5：中间位结合位点的修饰
将作为一种或多种提供的中间位使能性抗体(诸如西妥昔单抗)的中间位结合位点衬里的残基系统性或随机改变，例如，使用简并文库和选择进行，以增强和/或改变中间位或中间位类似物的特异性(关于进行改变的方法，参见Sheedy等2007及Akamatsu等2007)。用天然或非天然氨基酸或两者取代在这些位置处的残基，例如，以改善中间位相互作用的亲和力和/或改变中间位-抗体相互作用的另一种特性。
将中间位使能性抗体中与中间位接触，作为空穴衬里，和/或其它方面重要(诸如对本文中的修饰描述的残基)的残基突变。在一个例子中，结构数据，诸如上文描述的研究中获得的结构数据用于通过诱变替换Fab中的残基，例如，以添加额外的氢键，用氨基酸取代非天然氨基酸或改变疏水性界面，例如，以可以更好互补中间位结合的方式。(参见图21)。
在一个例子中，将单独的残基系统性改变，接着生成并表征突变体抗体。在另一个例子中，在感兴趣的位点使用简并寡聚物在DNA水平生成IgG的文库以产生在感兴趣的一个或多个位点共同表达所有20种天然存在的氨基酸的成员，使得文库产生在一个或多个给定位点处取代的每个氨基酸的文库的单独成员。
将GPI域添加至例如文库中抗体的Ig重链的C端。在一个例子中，使用标准方法转染文库；表达来自文库的抗体(例如IgG)。
为了依照这些方法证明对GPI连接的中间位使能性抗体的结合，生成GPI连接的中间位使能性曲妥珠单抗。图54显示了此GPI连接的中间位使能性曲妥珠单抗结合中间位-蛋白L(MPL)，其如下文实施例10中描述的那样生成。在此研究中，使用1x10^6个细胞/样品。通过温和移液从板取出细胞，并将其用PBS中的0.1％BSA(w/v)清洗一次。将AF647MPL在清洗缓冲液中稀释至10nM，并且与细胞于室温温育30分钟。将细胞清洗两次，然后通过FACS分析。
对从文库中生成的抗体筛选一种或多种期望的性状。在一个例子中，为了选择不影响抗原结合的突变，例如通过FACS选择来自文库(例如表达抗体的细胞)的抗体，其结合与抗体特异性结合的经荧光标记的抗原(例如HER2,EGFR,IGFR,CLTA-4等)(图20)。在一个例子中，将选择其抗原结合能力的抗体进行另一轮选择，例如，以选择结合特定中间位、中间位类似物或其它感兴趣分子的突变体抗体。
在选择后，表征选择的抗体以测定期望的突变组合。在一个例子中，在细胞分选后，使用PCR鉴定所的的突变，其促进或增强中间位/类似物/小分子结合。在一个例子中，将此过程重复多次以“进化/优化”期望的特征，例如结合、pH依赖性、PK、和/或PD。
实施例6：变体中间位
生成几种变体中间位。例如，合成表3和4(上文)中的某些中间位变体，证明了对西妥昔单抗的结合亲和力。对于表3中的肽，使用二硫化物连接来连接C和N端(除了中间位31含有额外的尾部外，这意味着二硫化物连接不在两个末端残基之间)。将中间位26、27、28、和29生物合成，因此在此实施例中含有第一个半胱氨酸前(即第0位)的额外丝氨酸。此外，在一些实施方案中，中间位31可以任选包含GGSK接头。对于表4中的肽，内酰胺桥(与二硫化物不同的连接)(诸如[3+2]环加成)，或无连接用作连接头。例如，中间位55是在中间位结合位点内结合的线性肽。这些表中的单独中间位在下文讨论。
如上文描述的，将环肽cQFD(SEQ ID NO:1)和cQYN(SEQ ID NO:2)鉴定，并与西妥昔单抗Fab共结晶，并且显示了在由Fab的轻链和重链创建的空穴中结合。使用生物物理和生物化学方法表征此相互作用。具体地，Phe3、Leu5、和Arg8至丙氨酸的突变将中间位对结合界面的亲和力降低44–183倍。参见表6和7。
中间位修饰和化学设计
基于结构和热力学数据，提供的中间位内的多个位置鉴定为修饰的靶物，例如用取代和/或非天然氨基酸，例如，以增强总体结合亲和力和/或改变另一种特性。修饰包括生成头至尾环状内酰胺肽、Arg8的修饰、Phe3的修饰、Leu5的修饰、Leu10的修饰、和掺入能水合的羰基官能性(参见图31)。
Arg8的修饰。
对Arg8进行修饰。基于结构数据，测定了未修饰的中间位(cQFD；SEQ IDNO:1)的Arg8是延长的，与中间位使能性抗体重链的Q105的重链羰基形成氢键。此残基周围的紧接区域是疏水但溶剂暴露的(图33A)。
结构数据指示维持中间位使能性抗体H-键键合的胍盐官能性，而同时将疏水性臂引入以部分填充空穴的经修饰的Arg8残基的掺入可以产生显著的结合增加(这是由于熵增加所致)，如通过配体停靠计算支持的。
如下生成第8位含有正丁基-精氨酸的变体中间位，即中间位54(SEQ IDNO:54，表4中显示)：
Fmoc-N-丁基Arg衍生物3(中间位54)的合成
对CH2Cl2(0.6mL)中上述15(23mg,0.03mmol)的搅拌溶液添加EDCI(12mg,0.06mmol,2当量)和正丁基胺(4.4mg,0.06mmol,2当量)。在于室温(rt)5分钟后，将溶剂在真空中除去。通过硅胶柱层析(40-50％EtOAc/Hex)纯化残留物以提供上述产物16(23mg,95％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78-7.70(m,2H),7.60-7.54(m,2H),7.42-7.37(m,2H),7.35-7.27(m,2H),5.95-5.83(m,1H),5.52-5.42(m,1H),5.36-5.22(m,2H),4.61(d,J＝5.4Hz,2H),4.44-4.30(m,3H),4.16(t,J＝6.4Hz,1H),3.30-3.02(m,4H),2.92(s,2H),2.54(s,3H),2.48(s,3H),2.07(s,3H),1.98-1.80(m,1H),1.76-1.50(m,3H),1.45(s,6H),1.36-1.26(m,4H),0.85(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.9,158.7,156.4,155.0,144.0,143.8,141.5,138.5,133.8,132.4,131.5,128.0,127.3,125.2,124.6,120.3,119.6,117.6,86.5,67.4,66.5,53.3,47.3,43.5,41.5,41.0,30.9,30.7,28.8,25.4,20.2,19.5,18.2,13.9,12.7；HRMS C41H52N4O7S[M+Na]+计算的767.3449，发现的767.3455。
对THF(0.8mL)中上述16(23mg,0.03mmol)的搅拌溶液添加N-甲基苯胺(10mg,0.09mmol,3等量)和Pd(PPh3)4(2mg,0.0015mmol,0.05等量)。在于rt持续45分钟，将溶剂在真空中除去。通过硅胶柱层析(MeOH:CH2Cl2:HOAc＝25:1:0.1)纯化残留物以提供上述产物17(20mg,90％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78-7.70(m,2H),7.60-7.54(m,2H),7.40-7.34(m,2H),7.30-7.24(m,2H),5.95-5.83(m,1H),4.48-4.10(m,5H),3.30-3.02(m,4H),2.90(s,2H),2.58(s,3H),2.50(s,3H),2.07(s,3H),2.00-1.86(m,1H),1.86-1.74(m,1H),1.72-1.60(m,2H),1.45(s,6H),1.30-1.22(m,4H),0.82(t,J＝7.2Hz,3H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ174.9,158.9,156.6,155.2,144.0,143.8,141.5,138.5,133.3,132.4,129.3,128.5,128.0,127.3,125.3,124.8,120.2,117.7,86.6,67.4,53.4,47.4,43.4,41.6,41.1,31.4,29.9,28.8,25.2,20.1,19.5,18.2,13.9,12.7；HRMS C38H48N4O7S[M+Na]+计算的727.3136,发现的727.3144。
参见Martin,N.I.,and Liskamp,R.M.J.Org.Chem.2008,73,7849–7851。
Arg-丁基中间位54的合成。
另外，使用Fmoc-N-丁基Arg衍生物17依照固相Fmoc合成方案制备中间位54((SEQ ID NO:54)，在上述结构中)。图59显示了中间位54的HPLC迹线和质谱。
图48中显示了与西妥昔单抗Fab片段结合的中间位54的结构(后视图)，5-位置β,β’-二苯丙氨酸中间位(SEQ ID NO:18,中间位18)和cQFD(中间位1,SEQ ID NO:1)的结构重叠。如下文表7中显示的，通过SPR测定中间位54以平均值KD为745.2nM结合西妥昔单抗。
在一些例子中，如本文中描述的，对这些研究中鉴定的此中间位使能性抗体结合袋探索新的接触(中间位或类似物)，该接触可以提高中间位-中间位使能性抗体相互作用的亲和力。
Phe3的修饰。
对cQFD的Phe3进行各种修饰。结构数据证明了与cQFD(中间位1)相比，中间位变体Phe3Tyr cQYN(SEQ ID NO:2)的羟基基团在Arg8侧链的延长构象中具有变化(参见图30C和35)。SPR证明了此变体对西妥昔单抗Fab的总体亲和力是降低的。ITC测量指示与未修饰的中间位(SEQ ID NO:1)相比结合后此Phe3Tyr cQYN变体的被有利的焓增加补偿的显著熵降低(从-2.1kCal/mol至-7.9kCal/mol[n＝3])(图30D)。结构数据提示了有利的氢键网络的形成，其中水与Fab结合。
测定了在与中间位使能性抗体结合时，Phe3的疏水性苯基环周围有中间位使能性抗体(西妥昔单抗)Fab的相当极性的一批侧链残基(图35)。期望的是，将一个或多个卤素原子引入苯基环上，该苯基环可以参与卤素键合(相对较强的非共价键合，与氢键类似，但是牵涉卤素诸如溴或氯与氧原子的相互作用)，诸如通过掺入正、间和/或对-溴苯基取代基以有利放置溴原子，分别与中间位使能性抗体的Tyr87(轻链)、Gln39、和/或Tyr91(重链)形成卤素键合。生成中间位36(SEQ ID NO:36)、37(SEQ ID NO:37)、和38(SEQ ID NO:38)，其分别含有2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、和4-溴-L-苯丙氨酸替换第3位的Phe。将这些中间位与西妥昔单抗Fab共结晶。通过SPPS掺入这些商品化衍生物。图39中显示了结构。图40中显示了衍射数据。通过SPR测定这些中一些中间位对西妥昔单抗Fab的亲和力(平均KD值)，并且下文表7中列出。
另外，基于含有Phe3His突变的中间位(中间位33,SEQ ID NO:33)的结构信息，合成在第3位具有β,β’-二苯丙氨酸的中间位(中间位17,SEQ ID NO:17)。如图41中显示的，通过SPR观察到对西妥昔单抗的结合亲和力的显著改善，这代表与cQFD相比大致4倍增加(约4至5倍的亲和力增加(约200nM))。
Leu5和Leu10的修饰。
对Leu5和Leu10进行修饰。测定了Leu5和Leu10侧链与中间位使能性Fab疏水性接触(图36，右侧小图；Leu10)。在一个例子中，天然氨基酸(Phe/Tyr/Trp)和/或非天然类似物(例如β,β’-二苯丙氨酸、支链烷基、延长的芳香族，诸如萘基等)经由SPPS在这些中的一个或两个位置系统性引入。在第3位引入β,β’-二苯丙氨酸提高对西妥昔单抗Fab的总体亲和力(参见图41-42)的上述观察结果证明了通过将此类非天然氨基酸引入中间位获得成功。因而，在第5位引入β,β’-二苯丙氨酸，并且通过SPR测定所得的中间位(中间位18,SEQ ID NO:18)的平均亲和力为687nM(参见下文表7)。这些数据确认使用结构生物学鉴定残基的改变和突变区域可用于改变中间位的特征，诸如以改善其结合动力学。在另一个实施方案中，可以对Leu10进行相同的修饰。
可选环化策略和二硫化物桥的替换
使用可选环化策略替换cQFD和其它中间位中的二硫化物桥。如表4中显示的，使用多种内酰胺环化策略，包括那些牵涉天然和非天然氨基酸(基于不同起始材料生成)，包括甘氨酸、β-Ala、7-氨基庚酸、二氨基丙酸、和异天冬氨酸的策略，以产生不同内酰胺环大小(参见图31，左侧和中间框)。
在一个例子中，使用7-氨基庚酸替换初始cQFD中间位的二硫化物桥，并且通过SPR测定所得的中间位对西妥昔单抗Fab片段的亲和力(中间位42,SEQ ID NO:42)。图41，底部小图中显示了SPR数据。虽然与cQFD相比结合亲和力是降低的，这些数据指示了可以对中间位进行修饰以解决在动物和人研究中的药动学、药效学和毒性的潜在问题。注意到，可选接头可以与中间位内其它位置处的非天然氨基酸组合。
使用甘氨酸、7-氨基庚酸、异门冬氨酸、β-丙氨酸和二氨基丙酸生成具有内酰胺连接的其它变体中间位(参见表4等中列出的中间位42,43,44,45,46,49,51,52,53和54)。表7中列出了这些中一些中间位变体对西妥昔单抗Fab的亲和力。
使用叠氮化物炔Huisgen环加成生成三唑作为中间位50中的连接，其通过掺入第12位炔丙基甘氨酸和第1位beta-叠氮丙氨酸，并实施这些末端之间的环化进行。
还使用其它环化策略，诸如“点击”化学和烯烃复分解(图31，右侧框)。例如，设计头至尾内酰胺肽，并且通过从Fmoc-Asp(Wang树脂LL)-Oall开始的固相肽合成(SPPS)合成(图31，下左框和图32)。显示了与SEQ ID NO:1(中间位1)的未修饰的中间位相比，具有FITC缀合的一种此类变体，即中间位32(SEQ ID NO:32)以类似的方式但是以略微降低的亲和力结合西妥昔单抗。生成的其它头至尾内酰胺变体中间位包括中间位33-47,49和50-54(参见表4和7)。表4中的中间位48工程化改造为具有二硫化物连接和4:11内酰胺连接。
将中间位32与荧光素偶联以进行FACS分析。在另一个例子中，此策略适用于缀合中间位与DOTA，用于体内PET成像。
结构数据证明了其它位置适合于环化，诸如通过残基3和11或4和11之间的环化。
将中间位55(一种线性肽)生成，并且证明其结合中间位使能性抗体，即西妥昔单抗，尽管以降低的亲和力。
能水合的羰基官能性。
在另一个例子中，开发具有能水合的羰基官能性的中间位以创建高度选择性但不可逆的相互作用。经由选择性捕获(selective trapping)利用中间位使能性抗体中围绕中间位空穴的几种携带羟基的Fab侧链，其使用能水合的使能性中间位通过形成其相应的半缩醛或缩酮进行。例如，中间位的Arg8延伸到依照Kabat编码方式的中间位使能性抗体轻链的Ser43()和重链的Tyr91(3.8和)附近(图36，左侧小图)。在一个例子中，在中间位的Arg8或Leu10末端掺入能水合的羰基官能性容许选择形成丝氨酸或酪氨酸半缩醛，其实质性提供不可逆的结合。在另一个例子中，将含有硼酸的残基整合到中间位中作为能水合的羰基基团的可选。硼酸在可以用于治疗多发性骨髓瘤的bortezamib()的结构活性中发挥重要的作用。图36或34中也显示了此类能水合残基的代表性例子，其中R＝-CH2CHO或–CH2B(OH)2。在一些例子中，使用SPPS修饰此类类似物(Duggan,P.J.and D.A.Offermann(2007).“The Preparation of Solid-Supported Peptide Boronic Acids Derivedfrom4-Borono-L-phenylalanine and their Affinity for Alizarin,"AustralianJournal of Chemistry,60(11):829-834。
其它方法
在一些例子中，使用荧光偏振测定法鉴定可以替换给定中间位，诸如SEQ ID NO:1的中间位变体。在其它例子中，使用相同的技术鉴定可以替换中间位的小分子，然后使用这些小分子作为模板以进一步改善中间位的结合亲和力。
中间位的表征
为了表征，将变体中间位肽冻干粉末在500μL10mM Tris pH8.0缓冲液中悬浮，并每次透析到1L H2O中，透析3次。将透析后的终体积小心测量，并且采取吸光度测量以评估浓度(通常1-10mM)。使用这些储备溶液以对HBS-EP缓冲液(10mM Hepes pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA和0.05％v/v上清液P20)进行稀释以进行SPR测量。使用CM5芯片在GE Biacore T100仪上实施SPR测量，所述CM5芯片具有使用胺偶联化学固定化的西妥昔单抗IgG或西妥昔单抗Fab配体。将配体以适合于动力学数据的低水平固定化。使用HBS-EP作为运行和再生缓冲液两者以30μL/min的流速实施典型的动力学SPR实验。使用Biacore T100评估软件第2.0.1版计算动力学参数。
使用Nano ITC量热计(TA Instruments)于25℃在100mM Hepes,pH7.4中实施等温滴定量热术实验。在一个典型的实验中，将250μl0.03-0.06mM蛋白质(Fab或IgG)上样到量热计池(163μl或185μl)中，并将滴定剂(中间位，为0.3-0.8mM)上样到50μl注射器中。将池溶液以250rpm搅拌，并且在平衡后，以2-2.5μl增量添加滴定剂。测量反应的热，并且使用NanoAnalyze软件(TAInstruments)处理数据。通过对最后4次测量取平均值或者通过扣除从将相同浓度的中间位滴定到不含蛋白质的缓冲液中获得的反应热来扣除背景热。
将多种中间位变体与西妥昔单抗Fab片段共结晶。将中间位纯化至>95％同质性，并且通过质谱术在结构上表征。将肽在水中透析。测量其浓度(例如，在一些情况中，通过UV-Vis进行)，并且用元素分析校正，并稀释(>100倍)到合适的缓冲液中。与SEQ ID NO:15-18,22-25和31-40对应的这些中间位变体中的一些的结构显示于图39。
通过X射线衍生表征各种中间位与中间位使能性抗体西妥昔单抗的相互作用。由于西妥昔单抗Fab片段和SEQ ID NO:1的中间位的共结晶条件是完善建立的，在1至3天，通常1天中获得衍生质量晶体。用自用资源(Rigaku007-HF和R-Axis IV++)在8至12小时中及在Stanford同步辐射光源(其容许快速表征中间位变体与西妥昔单抗的相互作用)在小于10分钟中收集完整的数据集。
对各种不同中间位-Fab(西妥昔单抗)复合物，包括含有cQFD(SEQ IDNO:1)和cQYN(SEQ ID NO:2)中间位和经修饰的中间位的复合物收集衍生数据。几种中间位的X-射线衍射数据显示于图40。显示了大多数的这些共晶体结构衍射超出并且充分精化，R和RFree分别小于20和24％。所有这些中间位变体具有非常好的立体化学值(高于第89个百分位数的Molprobity得分)。
对于SPR测量，将低密度和高密度芯片与西妥昔单抗Fab或完整的IgG缀合。首先，使用EGFR的整个胞外域的可溶性片段(残基1–621)表征每个芯片。如先前报告的，观察到类似的动力学和结合亲和力。使用低密度芯片，对未修饰的中间位测量的结合和解离速率，并且测量为分别是k结合＝9.2x10-4M-1s-1和k解离＝9.9x10-3s-1。在与ITC一致的SEQ ID NO:1和2的中间位的情况中，观察到缀合有Fab的芯片和缀合有IgG的芯片的类似数值，证明了任一者可以用于结合评估。
下文表7列出了关于表3和4中列出的几种中间位的平均解离常数(KD)(其通过SPR测量)的信息。
表7：通过SPR测量的解离常数
**在此研究中，中间位48水解成初始中间位。
通过ITC、SPR、X-射线衍射及其组合严格表征几种中间位与中间位使能性抗体西妥昔单抗的结合。在TA Instruments nanoITC上实施ITC测量，每次测量少到1–2mg肽。ITC、SPR和X-射线衍射数据例如共同提供原子详细以指导随后的化学修饰，并且最终改善中间位的亲和力和/或对中间位进行其他变化。基于ΔG＝-RT ln Ka的计算显示了中间位对西妥昔单抗的微摩尔和纳摩尔之间的差异源自在300K时约4kCal/mol(其相当于强氢键)的自由能变化。如此，从蛋白质结合袋丧失有序水分子或者氨基酸残基链的再定向可以足以改变结合达几个数量级。
本实施例中的数据证明了可以系统性且有效引入大量的中间位排列，指示可以产生大量中间位变体排列，例如以产生改变的中间位-中间位使能性抗体结合亲和力、药动学(PK)、药效学(PD)、毒性、和/或不同条件(诸如pH)下的结合能力或结合强度，例如pH依赖性，例如，以生成高亲和力中间位。
在一个例子中，在通过ITC、SPR和衍射方法表征后，随后将具有最高亲和力(或其它期望特性，例如pH依赖性)的中间位修饰，例如以进一步改善期望的特性(例如总体亲和力或pH依赖性)。
实施例7：多价中间位的生成
生成二价和其它多价中间位，例如用于增强选择性和/或结合亲和力，其通过“交联”表达抗原的细胞表面上的中间位使能性抗体进行。
二价中间位-Fc
使用Fc区“二聚化”配体是例如由Jazayeri JA&Carroll GJ.,“Fc-basedcytokines:prospects for engineering superior therapeutics,”BioDrugs,22(1):11-26(2008)建立并描述的。为了生成二价中间位，经由由甘氨酸和丝氨酸组成的长度为17个氨基酸的柔性肽接头将中间位cQFD(SEQ ID NO:1)与IgG的Fc区的N端融合。接头的长度选择为大致匹配IgG的Fab间的距离。所得的“中间位-Fc”的核酸和氨基酸序列显示于图15(分别为SEQ ID NO:3和4)。中间位-Fc的结构显示于图16。
为了证明由中间位-Fc的多价性提供的增强的对抗原的结合，于室温将0.5x106个MDA-MB-468细胞用10nM西妥昔单抗标记30分钟，清洗，然后于室温与0.1,0.3,1和3μM二价中间位-Fc或单体中间位一起温育30分钟，清洗，然后通过FACS分析。如图17中显示的，FACS分析证明了与中间位单体相比，中间位-Fc(在化学计量学方面校正)以更高的亲和力结合用西妥昔单抗预处理的细胞。证明了相互作用对于中间位使能性单抗(西妥昔单抗)是特异性的。这些数据证明了使用与中间位使能性单抗组合的中间位-Fc的协同性，如此可以用二价中间位替代二抗来产生协同效应。
在另一项研究中，用Alexa488标记中间位-Fc融合蛋白，如上文描述的。将MDA-MB-468细胞用西妥昔单抗或M425(一种鼠抗EGFR抗体)标记30分钟。将未结合的抗体清洗，并将细胞与中间位-Fc(600nM,180nM或60nM)一起温育30分钟。通过FACS分析来分析抗体结合和中间位结合。图49中显示的FACS数据证明了中间位-Fc结合与西妥昔单抗一起温育的细胞，但是不结合与M425一起温育的细胞或者那些不与任何抗体温育的细胞，在中间位-Fc的浓度较高时信号升高。
与上文描述的FACS实验类似，将MDA-MB-468细胞用经Alexa555标记的西妥昔单抗处理，清洗，与经Alexa488标记的中间位-Fc一起温育，并清洗。然后，通过显微术以20倍对细胞成像(图61A)。观察到较强的西妥昔单抗表面结合染色。中间位-FC也定位于细胞表面，并且似乎与西妥昔单抗共定位(图61A)。伴随此染色，我们还观察到经标记的中间位-Fc的共定位(图61A，白色箭头)。然而，此共定位在没有用西妥昔单抗预处理的细胞中是缺乏的(图61B)。
总之，这些实验显示了中间位结合用西妥昔单抗预处理的EGFR表达细胞，使用多价支架负担物创建对经西妥昔单抗预处理的细胞的更高表观亲和力，且在此研究中表观结合亲和力是更敏感的。
使用MTT测定法确认二价中间位-Fc与中间位使能性抗体西妥昔单抗结合诱导细胞死亡的能力。将4000个MDA-MB-468细胞在96孔板的每孔中在80μl培养基中分配。将10μl1μM西妥昔单抗与10μl0.1,1或10μM单价中间位(cQFD–(对照)或二价中间位-Fc(两个cQFDs)一起添加至终浓度0.1μM西妥昔单抗和0.01,0.1和1μM中间位或中间位-Fc。还单独添加每种组分，PBS作为对照。在温育48小时后，添加10μl MTT试剂，并容许再温育4小时。然后，将培养上清液除去，添加100μl MTT晶体溶剂试剂，并以630nm读板。单价中间位(单独或与西妥昔单抗一起)，或单独的中间位-Fc的添加都不能显著改变细胞生长。然后，与西妥昔单抗一起添加中间位-Fc抑制细胞生长，如图28A中显示的。
通过MTT测定法证明了多价中间位-Fc以与第二抗EGFR抗体相当的程度增强西妥昔单抗的细胞杀伤的能力。测定法比较增强西妥昔单抗介导的中间位-Fc和M425(一种小鼠抗EGFR抗体)对抗原表达肿瘤细胞生长的抑制。将4000个MDA-MB-468细胞在96孔板的每孔中在80μl培养基中放置。将10μl1μM西妥昔单抗与10μl2、4或8μM中间位-Fc或M425一起添加至终浓度0.1μM西妥昔单抗和0.2、0.4或0.8μM中间位-Fc或M425。使用仅与PBS一起添加的西妥昔单抗作为对照。在48小时温育期后，添加10μl MTT试剂，并容许混合物再温育4小时。将培养上清液除去，添加100μl MTT晶体溶剂试剂，并以630nm读板。如图28B中显示的，中间位-Fc和M425以类似的程度增强西妥昔单抗的细胞杀伤能力。
在一些例子中，系统性探索Fc和中间位的组成和之间的距离以优化亲和力和特异性。在一个例子中，在接头内的任何位置处取代每个天然的或非天然的残基，以进行优化。在另一个例子中，将接头“僵化”以限制旋转的半径及增强Fc-中间位的亲和力和特异性。在一个例子中，将螺旋卷曲域置于中间位和Fc之间(图18)。在另一个例子中，用惰性蛋白质域(例如免疫球蛋白折叠)取代接头。在一个例子中，将多个免疫球蛋白折叠置于中间位和Fc域之间。在某些例子中，接头的组成是人起源的以减轻潜在的抗原性。
多价支架
为了解决受体对接头的约束，将中间位与多价支架偶联。
多价中间位设计为“锁上”相邻的IgG，以形成“雏菊链”样阵列(参见图8)。使用化合物2(SEQ ID NO:32)，使用“点击”化学开发经FITC标记的二价中间位的合成。使用图13的模板4和5分别形成二价和三价中间位。在合成含有SEQ ID NO:32的中间位(中间位32)，即化合物13(在图13中显示)的经FITC标记的二价中间位中掺入PEG双功能性臂。也如图13中显示的，还成功合成三价中间位(化合物14)。图14显示了此经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的中间位化合物13的表征。
在其它例子中，使用聚乙二醇(PEG)(和其它)接头的不同长度，例如，以优化结合。在其它例子中，使用此合成方法掺入DOTA以进行放射性核素成像。IgG内CDR区之间的距离是约商品化PEG的末端至末端距离延伸到(Pierce)，其会超过IgG距离。在一个例子中，PEG接头的长度是系统性变化的，记住此约束。
在一些例子中，以使超过一个抗体“雏菊链化”为目的，使用三价或更高价的支架。在一些例子中，使用不同支架和接头生成高亲和力多价中间位。在一个例子中，使用DNA作为更具刚性的支架。
还使用生物学和化学起源的不同支架来实现多价性。这包括但不限于使用链霉抗生物素蛋白或胶原(http://ip.com/patapp/EP2065402A1)、链霉抗生物素蛋白作为四价支架、独特支架(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283)、OrigamiDNA(http://www.nature.com/nnano/journal/v4/n4/abs/nnano.2009.5.html)等构建二价或三价支架。也可以使用分子创建化学支架，所述分子包括但不限于DNA(单链、双链体、Holliday连结体、适体等)、RNA(单链、发夹、茎环、适体等)、PNA(肽核酸)、实现刚性的DNA/PNA双链体和三链体、无机或有机纳米颗粒(直接偶联或经由有机聚合物诸如PEF偶联)、可以自身和/或与DNA或PNA形成双链体的有机聚合物。
多价中间位表征
在一个例子中，通过SPR和ITC表征多价中间位，以确认与多价支架的缀合不影响中间位-IgG相互作用。
在其它例子中，使用FACS分析、细胞存活力测定法、和其它测定法。例如，如上文对中间位-Fc描述的，使用细胞存活力测定法以量化多价中间位直接对过表达由选择的中间位使能性抗体识别的抗原(诸如中间位使能性抗体或西妥昔单抗时为EGFR)的细胞的影响。例如，使用MTT，即3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)量化活细胞的数目或百分比。在一些例子中，观察到比对相应单价中间位的观察远远更低浓度时的转变和/或转变的细胞百分比的相对增加。
在一些例子中，对于在此类测定法中表明活性的多价中间位，实施Western印迹分析以追踪其它参数，诸如在靶向EGFR信号传导途径的抗体，诸如西妥昔单抗的情况中EGFR、AKT、和MAPK的磷酸化状态。在一个例子中，将数据与来自仅经抗体(例如西妥昔单抗)处理的细胞和用抑制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂(AG1478))处理的细胞的数据比较。观察到作为多价中间位浓度函数的细胞死亡增加。
在一个例子中，为了进一步确认多价中间位的添加效应，使用非标记的单价中间位与经标记的多价中间位竞争抗原结合的西妥昔单抗。
实施例8：作为pH函数的中间位结合亲和力
改变中间位的组成以影响作为pH函数的结合亲和力。如图27中显示的，三种不同中间位变体的结合亲和力作为缓冲液pH的函数测量。结果证明了cQYD(SEQ ID NO:16,中间位16)中间位变体在较低的pH对中间位使能性抗体西妥昔单抗具有明显降低的亲和力。cQYN变体中将天冬氨酸取代为天冬酰胺产生平坦的pH依赖性。cQFD中间位(SEQ ID NO:1)的亲和力测定为在较高的pH时略大。这些数据共同证明了可以针对使用的pH改编中间位-memAb相互作用的亲和力，例如，以生成在低pH，诸如在用于药物投递的溶菌酶中特异性释放的中间位变体，和/或在低氧环境(诸如肿瘤基质)中以较高的亲和力结合。
实施例9：中间位类似物、片段、和其它化合物
实施筛选方法以鉴定中间位类似物和化合物，诸如小分子、片段、适体、核酸分子、肽体和/或其它物质，其在中间位结合位点附近结合中间位使能性抗体，且在一些方面可以与中间位连接，例如，以改善其对中间位结合位点的亲和力。
荧光偏振测定法：为了鉴定化合物，包括可以在中间位使能性抗体的中间位结合位点结合，并且如此用于类似功能的可选分子，建立了置换测定法。将环状中间位合成并化学附接于荧光素，生成以下序列的经荧光素标记的中间位：AcCQFDLSTRRLRCGGGSK(SEQ ID NO:31，半胱氨酸形成二硫化物桥)-荧光素。然后，用西妥昔单抗滴定此荧光标记的肽，并测量荧光偏振。经标记的中间位和单抗之间的相互作用引起荧光标签的荧光偏振/强度的变化。解离常数1μM紧密匹配从表面等离振子共振和等温滴定量热术获得的数值。使用非标记的中间位AcCQFDLSTRRLRCGGGSK(SEQ ID NO:31)置换与西妥昔单抗预结合的荧光素-标记物肽。监测荧光偏振。阻断中间位-抗体相互作用的化合物改变荧光偏振特性。如图37中显示的，观察到指示竞争反应的S形曲线。因而，此方法可用于鉴定中间位类似物。
基于这些数据，实施鉴定能够置换中间位的小分子的初始筛选。在此研究中，从30,000种小分子化合物的文库鉴定50μM浓度的42种前导化合物。图38显示了5种此类前导化合物。
在另一个例子中，例如，通过结晶学进一步表征这些化合物。
衍射方法。显示了西妥昔单抗Fab衍射超出如上文显示的。使用建立的基于衍射的方法(完善建立用于鉴定前导化合物(Shuker等1996；Erlanson等2001；Hughes等2011))鉴定候选化合物，包括可以与中间位偶联，例如，以改善对中间位结合位点的亲和力的化合物。开发小分子的文库以浸入西妥昔单抗的晶体中。收集来自这些浸渍的衍射数据，并分析几个数据集。在这些初步研究中，在西妥昔单抗上鉴定适合于片段生长和优化的两个额外的位点。
在另一个例子中，将此类片段(可以充当较大实体的构件块的小分子)，诸如化学基团，例如咪唑或其它化学基团延长(化学衍生化)以增强其结合和特异性和/或与中间位化学拴系。此化学偶联的优化可以显著增强总体结合亲和力。
NMR筛选：使用NMR鉴定用于优化中间位的片段，例如通过与中间位连接，和/或替换中间位使用(即，作为中间位类似物)。为了鉴定这些前导物，将含有15至20个片段的合并物的一维(1D)光谱收集。将西妥昔单抗添加至每个合并物，并收集第二1D光谱。与西妥昔单抗(瞬时)结合的化合物经历快速的磁化传递，导致强度的损失。在添加西妥昔单抗之前和之后比较光谱，并且鉴定改变的峰，指示相互作用。
在一个例子中，将这些峰预先归入特定的化合物，并且如此立即知道。或者，将合并物细分，并且将光谱再收集。在几个轮次后，已知化合物的精确身份。在这些实验中，相互作用的精确位置是未知的。通过NMR或荧光偏振测定法测定结合位点。或者，用NMR活性和无活性核(例如13C,15N和2H)标记Fab片段，接着实施多个NMR实验以分配光谱，并使用片段文库鉴定结合位置。使用此规程，已经鉴定一组初始前导化合物(图19，底部)。
虚拟配体筛选：使用虚拟配体筛选鉴定发挥中间位功能的前导化合物。使用晶体结构，使用标准程序(例如Schroerdinger Glide)限定大分子位点(中间位结合位点)周围的“框”；将已知的配体停靠到此位点。通过选择的能量函数对潜在的前导化合物评分。在此研究中，鉴定约100种前导化合物。
在另一个例子中，将通过衍射方法找到的其它类似物优化，并代替中间位用于药物投递、多价支架化和其它功能。
在另一个例子中，进行轻链和重链中的突变以改变配体(中间位)的特异性，并且使用所有上文描述的方法(包括荧光偏振、NMR筛选、噬菌体展示、和衍射方法)来优化可选配体。
实施例10：中间位-蛋白L融合
通过与中间位结合的cQFD中间位使能性Fab片段的衍射进行的表征证明了中间位的N和C端与结合的蛋白L(一种结合人IgG的细菌蛋白)的位置并列。参见图52，其显示了中间位18(5-β,β’-二苯基)、蛋白L(左侧)、蛋白A(右侧)和Fab(灰色草图)和中间位使能性曲妥珠单抗Fab的晶体结构。
为了生成经由能量相加性(energy additivity)以更大的亲和力结合中间位使能性抗体的中间位，生成中间位-蛋白L融合多肽。基于结构数据信息，引入4个甘氨酸以连接cQFD中间位的C端和蛋白L的N端。SEQ ID NO:56中列出了中间位-蛋白L融合蛋白的编码序列。
下文且在SEQ ID NO:57中列出了编码蛋白质的氨基酸序列，包括His6-Smt3标签(无格式文本)，中间位(加下划线)、和蛋白L(粗体)：
HHHHHHSSGLVPRGSHMASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG(SEQ ID NO:57)
切割标签后中间位-蛋白L融合蛋白的氨基酸序列在下文列出(中间位加下划线；环化的两个半胱氨酸(例如通过过氧化物或用空气过夜)以粗体文本列出)SEQ ID NO:58：
SCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG(SEQ ID NO:58)。
通过表面等离振子共振(SPR)测量此融合蛋白与中间位使能性抗体曲妥珠单抗的相互作用(及分开地，每个单独组分的相互作用)的结合常数。蛋白L和中间位使能性曲妥珠单抗之间的相互作用的结合常数是约0.5μM。对于中间位和中间位使能性曲妥珠单抗Fab片段之间的相互作用，它是约1μM。然而，中间位-蛋白L融合蛋白和IgG之间的相互作用的结合常数是165pM。图53显示了中间位-蛋白L融合(MPL)的表面等离振子共振(SPR)数据：顶部小图显示了以多达10nM的浓度对中间位使能性曲妥珠单抗添加的MPL的迹线。拟合数据指示165pM的结合亲和力。底部小图显示了以相同浓度对中间位使能性曲妥珠单抗添加的蛋白L(仅有)的迹线，显示了在此研究中在此浓度时没有结合。此结果证明了与单独的相互作用相比，融合蛋白和中间位使能性抗体之间远远更强的结合，指示经由相加性得到的改善的亲和力。
在蛋白L和中间位中创建点突变以确保特异性。如预期的，在这两种情况中，结合常数是降低的。
为了便于各种分子，诸如治疗剂和诊断剂，例如细胞毒素、放射性核素，例如，DOTA、蛋白质、固体支持物和其它分子的缀合，例如用于药物投递、成像、或纯化，蛋白L-中间位融合蛋白中除了一个外的所有赖氨酸突变为精氨酸或另一个残基。使用图52中显示的晶体结构鉴定蛋白L和中间位上的所有赖氨酸，其在缀合时会在空间上阻碍中间位-蛋白L/中间位使能性抗体相互作用。基于此信息，生成具有SEQ ID NO:59中所列的序列(SCQFDLSTRRLRCGGGGSEVTIRVNLIFADGNIQTAEFRGTFEEATAEAYRYAALLARVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG)的中间位-蛋白L融合(MPL)，其中蛋白L/中间位中的某些赖氨酸(在图52中以黑色显示：除了1个外的所有赖氨酸)突变为Arg或Asn。在上文显示的序列中，从赖氨酸突变为精氨酸/天冬酰胺的残基以粗体文本显示。没有突变的赖氨酸(上文加下划线)指向溶剂。如此，在所得的中间位-蛋白L融合蛋白中，留下N端胺和epsilon胺以进行缀合，后者是溶剂暴露的且可能更具反应性。
在另一个例子中，使用此突变体中此独特的赖氨酸残基使MPL进行PEG化，例如以解决潜在的抗原性。
MPL-DOTA-NHS缀合物
在用多个比率(0.5:1,2:1,10:1,30:1,60:1,120:1,240:1)的起始材料(DOTA-NHS:MPL)在磷酸盐缓冲液(80mM)中于pH＝10(与N端缀合相比，其有利于与赖氨酸的缀合)实施10分钟的反应中将具有SEQ ID NO:59中所列的序列的MPL与DOTA-NHS缀合。单-DOTA-缀合物产物通过增加DOTA-NHS而增加。以60:1比率形成大量的MPL-单-DOTA-MPL，并且大量的MPL-单-DOTA和MPL-二-DOTA两者以120:1比率形成(图60)。
本发明的前述实施例和方法仅是例示性的，而并不意图以任何方式限制本发明。本领域普通技术人员会认可前述的各种修改在本发明的意图范围内。
参考文献
下文和上文说明书中引用的所有参考文献在此通过提及完整并入，就像本文中完整列出一样。
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Claims (115)

1.一种分离的中间位使能性抗体或其片段，其包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中：
所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸，第41位除甘氨酸外的残基，和第85位的天冬氨酸或天冬酰胺；
所述抗体或片段不特异性结合由西妥昔单抗(cetuximab)特异性结合的EGFR表位；并且
所述抗体或片段结合中间位(meditope)，该中间位是具有选自下组的氨基酸序列的肽或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54,或55中列出的序列。
2.权利要求1的中间位使能性抗体(meditope-enabled antibody)或片段，其中所述VH区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含依照Kabat编码方式的第40位丝氨酸或脯氨酸和第89位异亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、或色氨酸。
3.权利要求1或2的中间位使能性抗体或片段，其中所述VL区的氨基酸序列进一步包含依照Kabat编码方式的第10位异亮氨酸或亮氨酸和第83位异亮氨酸。
4.权利要求1-3中任一项的中间位使能性抗体或片段，其中所述VL区的氨基酸序列进一步包含依照Kabat编码方式的第9位缬氨酸或异亮氨酸和第100位除谷氨酰胺外的残基。
5.权利要求1-4中任一项的中间位使能性抗体或片段，其中所述VL区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、和第85位天冬氨酸。
6.权利要求1-5中任一项的抗体或片段，其中所述VH区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第40位丝氨酸和第89位异亮氨酸。
7.权利要求1-6中任一项的抗体或其片段，其中：
所述VL区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第9位缬氨酸或异亮氨酸、第10位异亮氨酸或亮氨酸、第39位精氨酸、第40位苏氨酸、第41位天冬酰胺、第42位甘氨酸、第43位丝氨酸、第83位异亮氨酸、第85位天冬氨酸、和第100位丙氨酸；并且
所述VH区的氨基酸序列具有依照Kabat编码方式的第40位丝氨酸和第89位异亮氨酸。
8.一种分离的抗体或其片段，其包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中：
所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO:71或SEQ IDNO:61中所列的轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3、和FR-L4，和至少一个与SEQ ID NO:71中所列的轻链序列的CDR不同的CDR；并且
所述VH区具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID NO:72或SEQ IDNO:63中所列的重链序列的重链FR1(FR-H1)、FR-H2、FR-H3、和FR-H4，和至少一个与SEQ ID NO:72中所列的重链序列的CDR不同的CDR。
9.权利要求8的抗体或片段，其中：
所述至少一个与SEQ ID NO:71中所列的轻链序列的CDR不同的CDR包括SEQ ID NO:61中所列的轻链序列的CDR；且
所述至少一个与SEQ ID NO:72中所列的重链序列的CDR不同的CDR包括SEQ ID NO:63中所列的重链序列的CDR。
10.权利要求8的抗体或片段，其中所述VL包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，且所述VH包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
11.一种分离的抗体或其片段，其包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中：
所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO:9中所列的轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3、和FR-L4；且
所述VH区具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID NO:6中所列的重链序列的重链FR1(FR-H1)、FR-H2、FR-H3、和FR-H4。
12.权利要求11的抗体或其片段，其中：
所述VL区包含至少一个与SEQ ID NO:9中所列的VL序列的CDR不同的互补决定区(CDR)；且
所述VH区包含至少一个与SEQ ID NO:6中所列的VH序列的CDR不同的CDR。
13.权利要求11的抗体，其中：
所述VL区包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；且
所述VH区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
14.一种分离的抗体或其片段，其包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中：
所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO:68中所列的轻链序列的轻链框架区(FR)1(FR-L1)、FR-L2、FR-L3、和FR-L4。
15.权利要求14的抗体或其片段，其中：
所述VL区包含至少一个与SEQ ID NO:69中所列的轻链序列的CDR不同的互补决定区(CDR)；且
所述VH区包含至少一个与SEQ ID NO:70中所列的重链序列的CDR不同的CDR。
16.权利要求14的抗体，其中所述VL区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
17.权利要求8-16中任一项的抗体或片段，其中所述抗体或片段结合具有选自下组的氨基酸序列的中间位或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54或55中所列的序列。
18.权利要求1-7和17中任一项的抗体或片段，其中根据表面等离振子共振(SPR)的测量，所述抗体或片段以小于10μM的解离常数结合所述中间位。
19.权利要求18的抗体或其片段，其中所述解离常数小于5μM。
20.权利要求19的抗体或片段，其中所述解离常数小于2μM。
21.权利要求1-7和17-20中任一项的抗体或片段，其中所述中间位是自SEQ ID NO:1或2中所列的氨基酸序列的肽衍生的环肽。
22.一种分离的抗体或其片段，其包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中：
根据SPR的测定，所述抗体以小于10μM的解离常数结合中间位，其中所述中间位是自具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的肽衍生的环肽；且
所述抗体不特异性结合由西妥昔单抗特异性结合的EGFR表位。
23.权利要求22的抗体或片段，其中所述VL区不含依照Kabat编码方式的第40位P、第41位G、或第85位T，且所述VH区不含依照Kabat编码方式的第40位N或A或第89位V。
24.权利要求22或23的抗体或其片段，其中所述VL区不含依照Kabat编码方式的第10位S、第40位P、第41位G、第83位F、或第85位T，且所述VH区不含依照Kabat编码方式的第40位N或A或第89位V。
25.权利要求1-24中任一项的抗体或其片段，其进一步包含人恒定区。
26.权利要求1-25中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或片段与选自下组的抗体或抗体片段竞争抗原结合或者结合相同表位：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、anatumomab、麻安莫单抗(anatumomabmafenatox)、阿西莫单抗(arcitumomab)、atlizumab、巴利昔单抗(basiliximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、ectumomab、贝利木单抗(belimumab)、贝纳利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、brentuximab、卡那单抗(canakinumab)、卡罗单抗(capromab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、clivatuzumabtetraxetan、达克珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依库利珠单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、法索单抗(fanolesomab)、Fbta05、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、吉利妥昔单抗(girentuximab)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、英夫利昔单抗(infliximab)、易普利单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫罗单抗(muromonab)、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗(natalizumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥玛珠单抗(omalizumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕木单抗(panitumumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙妥莫单抗(satumomab)、硫索单抗(sulesomab)、替伊莫单抗、ibritumomabtiuxetan、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、Trbs07、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏妥昔单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、brodalumab、安芦珠单抗(anrukinzumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、dalotuzumab、demcizumab、ganitumab、伊珠单抗(inotuzumab)、mavrilimumab、moxetumomab pasudotox、利妥木单抗(rilotumumab)、sifalimumab、他尼珠单抗(tanezumab)、tralokinumab、tremelimumab、由杂交瘤10B5生成的抗体、和urelumab。
27.权利要求1-25中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或片段含有选自下组的抗体或抗体片段的至少一个互补决定区(CDR)：阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、anatumomab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、atlizumab、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、贝纳利珠单抗、贝伐珠单抗、brentuximab、卡那单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、clivatuzumab tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库利珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、伊瑞西珠单抗、厄马索单抗、fanolesomab、Fbta05、芳妥珠单抗、吉姆单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥玛珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗、ibritumomab tiuxetan、托珠单抗、托西莫单抗、Trbs07、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、brodalumab、安芦珠单抗、巴匹珠单抗、dalotuzumab、demcizumab、ganitumab、伊珠单抗、mavrilimumab、moxetumomab pasudotox、利妥木单抗、sifalimumab、他尼珠单抗、tralokinumab、tremelimumab、由杂交瘤10B5生成的抗体、和urelumab。
28.权利要求27的抗体或片段，其中所述至少一个CDR包含重链CDR1、2、和3及轻链CDR1、2、和3。
29.权利要求1-28中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合选自下组的抗原：CA-125、糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体、TNF-alpha、CD52、TAG-72、癌胚抗原(CEA)、白介素-6受体(IL-6R)、IL-2、白介素-2受体a链(CD25)、CD22、B细胞活化因子、白介素-5受体(CD125)、VEGF、VEGF-A、CD30、IL-1beta、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD3、EpCAM、EGF受体(EGFR)、MUC1、人白介素-2受体、Tac、RANK配体、C5或其它补体蛋白、EpCAM、CD11a、alpha-v beta-3整联蛋白、玻连蛋白受体alpha v beta3整联蛋白、HER2、neu、CD3、CD15、CD20、干扰素gamma、CD33、CA-IX、TNF alpha、CTLA-4、癌胚抗原、IL-5、CD3epsilon、CAM、Alpha-4-整联蛋白、IgE、IgE Fc区、RSV抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)的F(或融合)蛋白、TAG-72、NCA-90(粒细胞细胞抗原)、IL-6、GD2、GD3、IL-12、IL-23、IL-17、CTAA16.88、IL13、白介素-1beta、beta-淀粉状蛋白、IGF-1受体(IGF-1R)、delta样配体4(DLL4)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体的alpha亚基、肝细胞生长因子、IFN-alpha、神经生长因子、IL-13、CD326、PD-L1)、CD47、和CD137。
30.权利要求1-29中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体具有轻链和重链，所述轻链具有依照Kabat编码方式的P8,V9或I9,I10或L10,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168和Y173，所述重链具有依照Kabat编码方式的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V111,T110,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186和L187。
31.一种复合物，其包含与中间位结合的权利要求1-30中任一项的抗体。
32.一种分离的中间位，其包含结合中间位使能性抗体的中间位结合位点的肽，其中所述肽不是SEQ ID NO:1或2的肽或自其衍生的环肽。
33.权利要求32的中间位，其中通过表面等离振子共振(SPR)测量，所述肽以小于10μM的解离常数结合所述中间位结合位点。
34.权利要求32或33的中间位，其中所述中间位结合位点包含依照Kabat编码方式的所述中间位使能性抗体轻链的残基40、41、83、和85，和依照Kabat编码方式的所述中间位使能性抗体重链的残基39、89、105、和108。
35.权利要求31-34中任一项的中间位，其中所述中间位结合中间位使能性抗体，该中间位使能性抗体具有：
包含SEQ ID NO:71中所列的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:72中所列的氨基酸序列的重链；
具有SEQ ID NO:9中所列的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列的重链；或
具有SEQ ID NO:68中所列的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:70中所列的氨基酸序列的重链。
36.权利要求32-35中任一项的中间位，其中所述肽的长度为5-16个氨基酸。
37.权利要求32-36中任一项的中间位，其中所述肽具有式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(式I)
其中：
X1＝Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮丙氨酸、或空；
X2＝Gln或空；
X3＝Phe、Tyr、β-β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、或4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、经修饰的Phe、能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X4＝Asp或Asn；
X5＝Leu；β-β’-二苯基-Ala；Phe；苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸的非天然类似物；能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X6＝Ser或Cys；
X7＝Thr或Ser或Cys；
X8＝Arg、经修饰的Arg、或能水合的含有羰基或硼酸的残基；
X9＝Arg、Ala；
X10＝Leu、Gln、Glu、β-β’-二苯基-Ala；Phe；苯丙氨酸、色氨酸、或酪氨酸的非天然类似物；能水合的含有羰基的残基；或含有硼酸的残基；
X11＝Lys；且
X12＝Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸、或空，
其中：
所述经修饰的Arg具有图34中所示的式的结构，
所述经修饰的Phe是具有掺入苯基环中的一个或多个卤素的Phe，且
式I不是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或自其衍生的环肽。
38.权利要求32-37中任一项的中间位，其中所述肽是环肽。
39.权利要求38的中间位，其中通过二硫化物桥、硫醚桥、内酰胺连接、环加成环化。
40.权利要求38或39的中间位，其中所述肽是式I的肽，且经由X1和X12、X1和X11、X3和X11、X4和X11、或X2和X12之间的连接环化。
41.权利要求37-40中任一项的中间位，其中所述肽是式I的肽，且非天然氨基酸是β-β’-二苯基-Ala、支链烷基、或延长的芳香族。
42.权利要求37-40中任一项的肽，其中所述肽是式I的肽，且所述一个或多个卤素中的每个是邻、间、或对溴苯基取代基。
43.权利要求32-42中任一项的肽，其中所述肽是具有选自下组的氨基酸的肽或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54或55中所列的序列。
44.一种分离的中间位，其包含式(X)的化合物或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代；
其中所述化合物不是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的化合物。
45.权利要求44的中间位，其中m是0或1。
46.权利要求44的中间位，其中R3是H或苯基，且R3’是苯基、2-溴苯基、3-溴苯基、或4-溴苯基。
47.权利要求44的中间位，其中R5是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、或叔丁基，其各自任选用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、-B(OH)2、-CO2H、和–CONH2基团，或者用1或2个各自任选用溴或氯取代基取代的苯基基团取代。
48.权利要求44的中间位，其中R8是-OH、-NH2、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re。
49.权利要求48的中间位，其中Rc是H或甲基，Rd是H或C1-4烷基，且Re是C1-4烷基，或–NH(C1-4烷基)。
50.权利要求44的中间位，其中R9是甲基或乙基，其任选用-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2取代。
51.权利要求44的中间位，其中R10是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、或叔丁基，其各自任选用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、-B(OH)2、-CO2H、和–CONH2基团。
52.权利要求44的中间位，其中–X-NH-是–Cys-Cys-、-Gly-Gly-、-C(O)(CH2)6-NH-、-β-Ala-β-Ala-、-C(O)CH(NH2)CH2CH＝CHCH2CH(CO2H)-NH-、-C(O)CH(NH2)CH2NHC(O)CH2CH(CO2H)-NH-、-β-Ala-C(O)CH2CH(CO2H)-NH-、或–C(O)CH(NH2)CH2-三嗪基-CH2-CH(CO2H)-NH-。
53.一种用于纯化中间位使能性抗体或其片段或表达中间位使能性抗体或其片段的细胞的方法，其包括：
(a)在所述中间位使能性抗体或片段结合肽的条件下使含有所述中间位使能性抗体、片段、或细胞的组合物与中间位接触；并
(b)分离所述抗体或片段或细胞，
由此纯化所述抗体、片段、或细胞，
其中所述中间位是结合所述中间位使能性抗体的中间位结合位点的肽。
54.权利要求53的方法，其中通过表面等离振子共振(SPR)测量，所述肽以小于10μM的解离常数结合所述中间位结合位点。
55.权利要求53或54的方法，其中所述肽的长度为5-16个氨基酸。
56.权利要求53-55中任一项的方法，其中所述肽是式(X)的肽：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
57.权利要求53-56中任一项的方法，其中所述中间位与固体支持物偶联。
58.权利要求53-57中任一项的方法，其中所述分离通过pH变化实现。
59.一种经标记的中间位，其包含：
中间位，其包含结合中间位使能性抗体的中间位结合位点的肽；和
治疗剂或诊断剂。
60.权利要求59的经标记的中间位，其中所述治疗剂或诊断剂选自下组：与金属离子结合的金属螯合剂、小分子、化学治疗剂、治疗性抗体或功能性片段、毒素、放射性同位素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、寡核苷酸、有机或无机纳米颗粒、RNAi分子、siRNA、螯合剂、硼化合物、光敏剂(photoactive agent)、染料、荧光或发光物质、酶、增强剂、放射性物质、和螯合剂。
61.一种多价中间位，其包含两个或更多个中间位和一个或多个接头，其中所述两个或更多个中间位中的每个是结合中间位使能性抗体的中间位结合位点的肽。
62.权利要求61的多价中间位，其中所述两个或更多个中间位包含至少三个中间位。
63.权利要求61或62的多价中间位，其中所述一个或多个接头包含肽、小化学支架、生物素-链霉抗生物素蛋白、有机或无机纳米颗粒、多核苷酸序列、肽核酸、有机聚合物、或免疫球蛋白Fc域。
64.一种分离的中间位使能性抗体-中间位复合物，其包含：
与中间位结合的权利要求1至30中任一项的抗体或片段，其中所述中间位包含结合所述抗体或片段的中间位结合位点的肽。
65.权利要求64的复合物，其中通过表面等离振子共振(SPR)测量，所述肽以小于10μM的解离常数结合所述中间位结合位点。
66.权利要求64或65的复合物，其中所述肽的长度为5-16个氨基酸。
67.权利要求64-66中任一项的复合物，其中所述肽具有式(X)的化合物或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
68.权利要求64-67中任一项的复合物，其中所述中间位是多价中间位。
69.一种分离的抗体-中间位复合物，其包含：
与权利要求31-50中任一项的中间位、权利要求59或60的经标记的中间位、或权利要求61-63中任一项的多价中间位结合的中间位使能性抗体或其片段。
70.一种药物组合物，其包含：
权利要求64-69中任一项的复合物；和
药学可接受载体。
71.一种治疗方法，其包括对受试者施用权利要求70的药物组合物。
72.一种诊断方法，其包括：
(a)对受试者施用权利要求64-69中任一项的抗体-中间位复合物；并
(b)检测所述抗体-中间位复合物对所述受试者中的抗原的结合。
73.一种治疗方法，其包括：对受试者施用权利要求1至30中任一项的抗体或其片段。
74.一种治疗方法，其包括：对受试者施用中间位使能性抗体或其片段，并对所述受试者施用一个或多个中间位，其中序贯或同时施用所述中间位使能性抗体或片段和一个或多个中间位，并且所述一个或多个中间位包含结合所述中间位使能性抗体或片段的中间位结合位点的肽。
75.权利要求71的治疗方法，其中所述中间位使能性抗体或片段包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸、第41位除甘氨酸外的残基、和第85位天冬氨酸或天冬酰胺。
76.权利要求74或75的方法，其中使所述中间位使能性抗体或片段与所述一个或多个中间位结合，使得所述中间位使能性抗体和所述一个或多个中间位的施用包括施用所述中间位使能性抗体和所述中间位的复合物。
77.权利要求74或75的方法，其中在施用所述一个或多个中间位前施用所述中间位使能性抗体。
78.权利要求74-77中任一项的方法，其中所述肽是式(X)的化合物或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
79.权利要求73的方法，其中使所述抗体或其片段与一个或多个中间位结合，其中所述一个或多个中间位包含式(X)的肽或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
80.权利要求73的方法，其进一步包括然后对所述受试者施用一个或多个中间位，其中所述一个或多个中间位包含式(X)的肽或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
81.权利要求74-80中任一项的方法，其中所述一个或多个中间位包括多价中间位。
82.权利要求74-81中任一项的方法，其中所述一个或多个中间位与治疗剂偶联。
83.权利要求82的方法，其中所述治疗剂选自下组：药物、化学治疗剂、治疗性抗体、毒素、放射性同位素、酶、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料、金属、金属合金、和纳米颗粒。
84.一种诊断方法，其包括：
(a)对受试者施用权利要求1至30中任一项的抗体或其片段；并
(b)检测所述抗体或片段对所述受试者中的抗原的结合。
85.一种诊断方法，其包括：对受试者施用中间位使能性抗体或其片段和一个或多个中间位，并检测所述抗体或片段对所述受试者中的抗原的结合，其中：
序贯或同时施用所述中间位使能性抗体或片段和一个或多个中间位；且
所述一个或多个中间位包含结合所述中间位使能性抗体或片段的中间位结合位点的肽。
86.权利要求85的诊断方法，其中所述中间位使能性抗体或片段包含：重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VL区具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含依照Kabat编码方式的第40位苏氨酸、丝氨酸、或天冬氨酸，第41位除甘氨酸外的残基，和第85位天冬氨酸或天冬酰胺。
87.权利要求85或86的方法，其中使所述中间位使能性抗体或片段与所述一个或多个中间位结合，使得所述中间位使能性抗体和所述一个或多个中间位的施用包括施用所述中间位使能性抗体和所述中间位的复合物。
88.权利要求85或86的方法，其中在施用所述一个或多个中间位前施用所述中间位使能性抗体。
89.权利要求85-88中任一项的方法，其中所述肽是式(X)的化合物或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
90.权利要求84的方法，其中使所述抗体或片段与一个或多个中间位结合，其中所述一个或多个中间位包含式(X)的肽或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
91.权利要求84的方法，其进一步包括对所述受试者施用一个或多个中间位的步骤(c)，其中所述一个或多个中间位包含式(X)的肽或其药学可接受盐：
其中：
以“*”标记的中心为“R”或“S”构型；
R3和R3’各自独立是H或苯基，任选地，其用1、2或3个独立选自下组的取代基取代：C1-4烷基、-OH、氟、氯、溴、和碘；
R5是：
(A)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CO2C1-4烷基、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和–CONH2基团；或
(B)C1-4烷基基团，其用以下取代：
a)一个或两个苯基基团，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；或
b)萘基、咪唑、或吲哚基团；
R6是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
R7是–C1-4烷基-OH或–C1-4烷基-SH；
m是0、1、2、3、4、或5；
R8是：
(a)–OH、-NRaRb、-N(Rc)C(O)Re、或-N(Rc)C(＝NRd)Re；
其中：
Ra是H；
Rb是H或C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、和缩酮、-B(OH)2、-SH、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、或-CO2C1-4烷基基团；
Rc是H、C1-8烷基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基；
Rd是H或C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基、C3-8环烷基、支链烷基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、卤素、氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、–CO2H、和-CO2C1-4烷基基团；和
Re是H；–NHRd；或C1-12烷基、C3-8环烷基、C2-12烯基、C2-8炔基、或芳香基基团，任选地，其各自用一个或多个选自下组的取代基取代：-N3、-NH2、-OH、-SH、氧代、C2-4缩醛、C2-4缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、和-CO2C1-4烷基基团；或
(b)C1-12烷基，其用氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、-SH、-OH、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、或-CO2C1-4烷基基团取代；
R9是C1-4烷基或–C1-2亚烷基-Rx；
其中Rx是-CO2H、-CONH2、-CH2NHC(O)NH2、或–CH2NHC(＝NH)NH2；
R10是：
(1)C1-8烷基，任选地，其用一个或多个选自下组的取代基取代：氧代、缩醛、缩酮、-B(OH)2、硼酸酯、磷酸酯、原酸酯、-CH＝CH-CHO、-CH＝CH-C(O)C1-4烷基、-CH＝CH-CO2C1-4烷基、-CO2C1-4烷基、-CO2H、和–CONH2基团；或
(2)C1-4烷基基团，其用1个或2个苯基基团，或1个萘基、咪唑、或吲哚基团取代，其中任选地，每个苯基用1、2、或3个独立选自下组的取代基取代：-OH、氟、氯、溴、和碘；
n是0或1；
p是0或1；
X是C1-8亚烷基或C2-8亚烯基，其每个碳任选用-CO2H、-NH2、或-NHC(O)Ry取代；
其中所述亚烷基的1个碳任选用-C(O)NH-、5元杂芳香基环、或-S-S-替代；且
Ry是–C1-4烷基或–CH(Rz)CO2H；
其中Rz是–H或–C1-4烷基，其任选用–OH、-SH、或–NH2取代。
92.权利要求85-91中任一项的方法，其中所述一个或多个中间位是多价中间位。
93.权利要求85-92中任一项的方法，其中所述中间位与诊断剂偶联。
94.权利要求93的方法，其中所述诊断剂是成像剂。
95.权利要求94的方法，其中所述成像剂选自下组：荧光物质、发光物质、染料、指示剂、和放射性物质。
96.权利要求95的方法，其中所述成像剂是DOTA。
97.一种生成中间位使能性抗体或其片段的方法，其包括：
在模板抗体或其片段中实现一处或多处氨基酸取代，所述取代包括依照Kabat编码方式的VL区第40位、第41位、或第85位，或VH区的第40位或第89位取代，
由此生成结合中间位的中间位使能性抗体或其片段，所述中间位是具有选自下组的氨基酸序列的肽或自其衍生的环肽：SEQ ID NO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55中所列的序列。
98.权利要求97的方法，其中所述模板抗体或其片段选自下组：阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、anatumomab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、atlizumab、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、贝纳利珠单抗、贝伐珠单抗、brentuximab、卡那单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、clivatuzumab tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库利珠单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、伊瑞西珠单抗、厄马索单抗、fanolesomab、Fbta05、芳妥珠单抗、吉姆单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥玛珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗、ibritumomab tiuxetan、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Trbs07、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、brodalumab、安芦珠单抗、巴匹珠单抗、dalotuzumab、demcizumab、ganitumab、伊珠单抗、mavrilimumab、moxetumomab pasudotox、利妥木单抗、sifalimumab、他尼珠单抗、tralokinumab、tremelimumab、urelumab、B6H12.2、和由杂交瘤10B5生成的抗体。
99.权利要求97或98的方法，其中通过SPR测量，所述中间位使能性抗体以小于10μM的解离常数结合所述中间位。
100.权利要求99的方法，其中所述解离常数小于5μM。
101.权利要求100的方法，其中所述解离常数小于2μM。
102.权利要求97-101中任一项的方法，其中所述中间位是SEQ ID NO:1或2中所列的氨基酸序列的肽或自其衍生的环肽。
103.权利要求97-102中任一项的方法，其中所述一处或多处氨基酸取代中的每处在选自下组的位置处：依照Kabat编码方式的轻链的位置8,9,10,38,39,40,4142,43,44,45,82,83,84,85,86,87,99,100,101,102,103,104,105,142,162,163,164,165,166,167,168和173，或重链的位置6,9,38,39,40,41,42,43,44,45,84,86,87,88,89,90,91,103,104,105,106,107,108,109,110,147,150,151,152,173,174,175,176,177,185,186和187。
104.权利要求103的方法，其中所述中间位使能性抗体含有轻链和重链，所述轻链具有依照Kabat编码方式的P8,V9或I9,I10或L10,Q38,R39,T40,N41G42,S43,P44,R45,D82,I83,A84,D85,Y86,Y87,G99,A100,G101,T102,K103,L104,E105,R142,S162,V163,T164,E165,Q166,D167,S168和Y173，所述重链具有依照Kabat编码方式的Q6,P9,R38,Q39,S40,P41,G42,K43,G44,L45,S84,D86,T87,A88,I89,Y90,Y91,W103,G104,Q105,G106,T107,L108,V111,T110,Y147,E150,P151,V152,T173,F174,P175,A176,V177,Y185,S186和L187。
105.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1至30中任一项的抗体或其片段的核苷酸序列。
106.一种载体，其包含权利要求105的多核苷酸。
107.一种文库，其包含权利要求106的载体。
108.一种筛选方法，其包括：
(a)从权利要求107的文库表达抗体或其片段；
(b)从表达的抗体或片段中选择抗体或其片段。
109.权利要求108的筛选方法，其中所述选择基于选择的抗体或其片段的结合亲和力、pH耐受性、pH依赖性、毒性、PK、或PD。
110.权利要求108或109的方法，其中通过使所述抗体或其片段与中间位接触，并且检测对一个或多个所述抗体或其片段的结合实现所述选择。
111.一种选择中间位类似物或中间位变体的方法，其包括：
(a)组合中间位和中间位使能性抗体或其片段，由此所述中间位非共价结合所述抗体或其片段；并
(b)添加候选中间位变体或类似物；并
(c)测量所述候选中间位变体或类似物对所述中间位的置换，其中所述候选变体或类似物对所述中间位的置换将其鉴定为所述中间位变体或类似物。
112.一种用于修饰中间位的方法，其包括：
对具有SEQ ID NO:1,2,16-18,23,29,31,32,36,39,42,43,45,46,51,52,54和55中任一项中所列的序列的肽或自其衍生的环肽实现一处或多处氨基酸取代、插入、或缺失，由此改变所述肽对权利要求1-30中任一项的抗体或片段的结合亲和力的pH依赖性。
113.权利要求112的方法，其中所述方法降低在溶酶体pH水平时所述肽对所述抗体或片段的结合亲和力。
114.权利要求112或113的方法，其中所述方法提高低氧环境中的结合亲和力。
115.一种用于修饰中间位使能性抗体的方法，其包括：在依照Kabat编码方式的所述中间位使能性抗体的轻链位置8,9,10,38,39,40,4142,43,44,45,82,83,84,85,86,87,99,100,101,102,103,104,105,142,162,163,164,165,166,167,168和/或173，或重链位置6,9,38,39,40,41,42,43,44,45,84,86,87,88,89,90,91,103,104,105,106,107,108,109,110,147,150,151,152,173,174,175,176,177,185,186和/或187处实现一处或多处修饰。
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