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CN104024277B - 用于通过多糖的羟基官能团来同时取代和交联多糖的方法 - Google Patents

用于通过多糖的羟基官能团来同时取代和交联多糖的方法 Download PDF

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CN104024277B
CN104024277B CN201280064284.XA CN201280064284A CN104024277B CN 104024277 B CN104024277 B CN 104024277B CN 201280064284 A CN201280064284 A CN 201280064284A CN 104024277 B CN104024277 B CN 104024277B
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Abstract

本发明涉及用于在水相中通过多糖的羟基官能团同时取代和交联多糖的方法，所述方法包括以下步骤：将多糖布置于水性介质中；向其中加入取代基的至少一种前体；向其中加入交联剂；以及产生经取代的和交联的多糖并将其分离。本发明的特征在于所述方法在酸催化剂或碱催化剂的存在下并且在低于60℃的温度下实施，所述催化剂的Sa浓度为3.16×10‑7mol/L至0.32mol/L。在一个实施方案中，所述多糖以凝胶或水凝胶的形式提供，其特别地用作填充生物材料。

Description

用于通过多糖的羟基官能团来同时取代和交联多糖的方法
本发明涉及新的交联的和经取代的生物相容性多糖，其特征在于，与常规的交联的多糖相比，由取代基引入的改进的流变性质和任选地表现出的有利性质例如增湿或亲脂作用，并且其可用作生物材料，特别是用于填料手术(filler surgery)、组织修复领域中或者用作关节材料或流体。
由现有技术已知许多经取代的和交联的多糖，但是现有技术的方法均无法获得根据本发明的表现出协同改进的流变性质的多糖。
在FIDIA名下的EP 0 256 116描述了由在多糖的-COOH官能团上的酯官能团所取代的交联化合物。具体地，通过酯桥来交联透明质酸链，所述酯桥是由脂肪族多元醇与多糖的羧酸官能团之间的分子内或分子间反应形成的。例如，还通过由携带羟基官能团的小分子(例如乙醇或苄醇)接枝的多糖的酯官能团来发生取代。
在同样为FIDIA名下的EP 0 341 745中，聚合物是“自交联的”，在这个意义上是指，酯官能团在多糖的羧基官能团与同一链或另一链上的羟基官能团之间形成而无需交联剂。该专利还公开了交联的和经取代的聚合物。在这种情况下，取代基也是醇链(例如乙醇或苄醇)并且通过多糖的羧基官能团将所述取代基接枝到多糖上。
在FIDIA名下的专利申请WO 99/43728报道了在N-位或O-位硫酸化的透明质酸。然后，将如上文提及的专利申请中的可自交联的或通过酯桥交联的这些多糖(EP 0 256 116和EP 0 341 745)与聚氨酯接枝。由此获得了不同共交联的聚合物的复杂基体。然而，这些产物也通过酯官能团交联并且在O-硫酸化或N-硫酸化多糖和聚氨酯的基体的情况下，还需要使用至少三个合成步骤。因此，其没有提出令人满意的解决方案。
在HERCULES名下的专利EP 0 749 982教导了由受阻酚化合物取代的聚合物的制备，所述聚合物具有抗氧化性，其可任选地被交联。所述交联是通过现有技术的常规手段使用多官能环氧化物或相应的卤代醇(US 4 716 224、US 4 863 907、EP 0 507 604 A2、US 4716 154、US 4 772419、US 4 957 744)、多元醇(US 4 582 865、US 4 605 691)、二乙烯基砜(US 5 128 326、US 4 582 865)和醛类(US 4 713 448)来进行的。根据优选的实施方案，所述聚合物通过与羧酸或多元酸的酸酐反应以再次导致酯的形成来交联。因此，在多数情况下，现有技术中描述的化合物具有高密度的酯官能团。
共交联聚合物在现有技术中也是已知的，例如在ANTEIS名下的专利申请WO 2005/012364中描述的那些，其通过由一种或更多种聚合物共交联形成基体来表现出改进的持久性。还可由具有低平均分子量的聚合物或小的非聚合分子来取代这些共交联的多糖。这些聚合物通常为与纤维素共交联的透明质酸，随后通过交联剂用携带苄酯的小聚合物(Mw＜50000kDa)(例如肝素或透明质酸)将化合物接枝到所述纤维素。在一些情况下，抗氧化剂(例如维生素C)也通过交联剂来接枝。
在Balazs(Biomatrix)名下的专利US 4 605 691也教导了共交联方法(形成共交联聚合物的方法)。这次，其涉及透明质酸与胶原、纤维素、肝素或胭脂红酸的共交联。
现有技术中描述的方法的共同特征是取代或接枝，其导致通过交联剂发生的官能化。与单独交联相比，其反映出通过交联剂进行交联反应与进行官能化反应之间的竞争。
因此，本领域技术人员应总是小心地适当调节交联剂的引入量以使官能化不限制交联，其会导致根据各自的反应动力学对凝胶的最终性质的修饰。
特别地，如果交联发生在引入官能化剂之前，则将必须小心地一方面将官能化剂均匀地引入交联的聚合物网络中，并且另一方面要保持足够的交联剂以使聚合物功能化。如果所有的交联剂都被消耗了，则必需添加额外量的交联剂；则就会产生可能过交联的风险。在一些情况下，本领域技术人员甚至将必须在交联之前进行取代以限制“竞争”效应。
因此，本领域技术人员将仍然面临选择：在交联聚合物之前或之后取代以及考虑到聚合物/交联剂和官能化剂/交联剂的反应速率来调节反应条件。因此，该选择变为该方法的至关重要和有问题的步骤。
由磺烷基和醚取代的水溶性纤维素(例如磺烷基纤维素)也是已知的。期望的目标是获得高官能化以获得水溶性磺烷基纤维素；参见例如在WOLFF WALSRODE名下的US 4 990609。对于这种类型的官能化，因为其高反应性也经常使用磺内酯，其可使得官能度高并且由于高浓度的磺酸盐/酯官能团的存在而改进最终产物的溶解性。然而，如果期望在第二步骤中交联，则高的取代度可阻碍令人满意的聚合物交联。此外，官能化条件对于多糖来说常常太过剧烈而将其破坏至无法挽回地削弱其流变性质的程度；参见例如在US 3 046 272中描述的化合物。
这是因为，已知多糖(例如透明质酸)表现出对碱性条件相对差的耐性，并且已知在透明质酸在氢氧化钠溶液中交联或脱乙酰期间，发生分解(Simkovic等，CarbohydratePolymers，41，2000，9-14)；实际上，现有技术中描述的反应通常是冗长的和/或在导致分解的pH条件下。
在一些方法中多糖所经受的高浓度的碱性条件下和在高温下，例如在US 4 321367或US 4 175 183中所描述的那些，已经证明(参见下文的比较例)发生了多糖的分解。
因此，在现有技术中描述的方法中，尽管相对容易进行，但用于产生交联的和经取代的聚合物的方法通常非常冗长并且需要若干个步骤，这是因为要连续添加多种成分以避免多种聚合物与将通过交联剂连接到多糖上的接枝物之间的竞争。此外，由于反应时间和反应条件，所得聚合物可具有受损的流变性质。
本发明使得可解决现有技术的方法的所有缺点并且使得其还可获得具有协同改进的流变性质的多糖。
本发明涉及用于制备交联的和经取代的多糖的方法。主要地，在相同的实验条件下并且在相同的反应位点(多糖的羟基官能团)上同时地进行该方法中的交联和取代反应，这是在所涉及的不同个体之间没有竞争，所述取代不通过交联剂进行的情况下。因此，所获得的取代度和交联度相当于通过随后进行的反应所获得的那些，并且改进了多糖的流变性质。
本发明还涉及通过根据本发明的方法获得的交联的和经取代的多糖，不但与简单取代的多糖相比，而且与单独交联的多糖相比以及与经取代并且然后交联的多糖相比，所述交联的和经取代的多糖的流变性(特别是其粘弹性)提高。
此外，取代基可将有利的性质(例如生物性质)引入根据本发明的多糖，所述多糖的流变性质得以改进。协同效应更是出人意料，因为其在经取代的和交联的多糖的灭菌期间仍然保留。
因此，本发明使得能够组合有关取代的优点与有关交联的优点，而不改变这些分开进行的改性的每一个的单独特征并且特别是不破坏流变性质，因为其是协同地改进的
本发明涉及一种用于在水相中通过多糖的羟基官能团同时地取代和交联多糖的方法，其包括以下步骤：
-将多糖置于水性介质中，
-向其中加入取代基的至少一种前体，
-向其中加入交联剂，
-获得经取代的和交联的多糖并将其分离，
其中，所述方法在碱性催化剂或酸性催化剂的存在下并且在低于60℃的温度下进行，所述碱性催化剂或酸性催化剂的浓度为3.16x10-7mol/L至0.32mol/L。
术语“通过多糖的羟基官能团”理解为是指所述取代和交联是在由多糖携带的-OH基团上进行的事实。
所述方法的特征还可在于反应性催化剂比率或RCR。
该反应性催化剂比率(RCR)定义为：
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.02：1至3：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.2：1至3：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.3：1至3：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.5：1至2：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.7：1至1.5：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为1.75：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为1：1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.8∶1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述反应性催化剂比率为0.06∶1。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述催化剂是碱。
在该实施方案中，所述催化剂的反应性官能团是HO-离子。
在水相中，情况为pH＝14+log([HO-])和HO-＝10-(14-pH)。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的催化剂HO-的浓度为10-6mol/L至0.32mol/L，以使得10-6mol/L≤[HO-]≤0.32mol/L。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的催化剂HO-的浓度为3.16×10- 4mol/L至3.16×10-2mol/L，以使得3.16×10-4mol/L≤[HO-]≤3.16×10-2mol/L。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述催化剂是无机碱。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机碱选自纯碱(soda)(氢氧化钠)或钾碱(氢氧化钾)。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机碱的浓度按重量计为1.2×10-5％至1.3％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机碱的浓度按重量计为0.25％至1.1％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机碱的浓度按重量计为1％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机碱的浓度按重量计为0.5％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述催化剂是有机碱。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述有机碱是吡啶。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的水性反应介质的pH为碱性。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的水性反应介质的pH为8至13.5。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的水性反应介质的pH为10.5至12.5。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述催化剂是酸。
在该实施方案中，所述催化剂的反应性官能团是H3O+离子。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的催化剂H3O+的浓度为3.16×10- 7mol/L至0.01mol/L，以使得3.16×10-7mol/L≤[H3O+]≤0.01mol/L。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的催化剂H3O+的浓度为10-6mol/L至3.16×10-5mol/L，以使得10-6mol/L≤[H3O+]≤3.16×10-5mol/L。
在水相中，情况为pH＝-log([H3O+])和[H3O+]＝10-pH。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述酸是无机酸。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机酸是盐酸。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机酸的浓度按重量计为1.14×10-5％至1.15％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机酸的浓度按重量计为0.05％至1％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述无机酸的浓度按重量计为0.05％至0.36％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述催化剂是有机酸。
在一个实施方案中，所述有机酸选自谷氨酸和乙酸。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述有机酸的浓度按重量计为0.25％至2％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述有机酸的浓度按重量计为0.25％至1.1％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述有机酸的浓度按重量计为1％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述水性反应介质的pH为酸性。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述水性反应介质的pH为2至6.5。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述水性反应介质的pH为4.5至6。
所述碱性或酸性催化剂可溶于水性介质。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述多糖选自透明质酸或其一种盐、壳聚糖、纤维素及其衍生物。
在一个实施方案中，所述多糖是透明质酸。
在一个实施方案中，所述多糖是透明质酸钠。
在一个实施方案中，所述多糖是壳聚糖。
在一个实施方案中，所述壳聚糖是部分脱乙酰化的。
在一个实施方案中，使用具有约80％的脱乙酰度的壳聚糖。
在一个实施方案中，所述多糖是纤维素或其衍生物之一。
在一个实施方案中，所述多糖是羧甲基纤维素。
术语Mw或“分子量”用于描述所述多糖的重均分子量(以道尔顿度量)。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量为0.01MDa至4.0MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量为0.1MDa至3.6MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量为0.10MDa至0.15MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量为0.9MDa至2MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量为2.5MDa至3.6MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量Mw为2.7MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量Mw为1.5MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量Mw为1.0MDa。
在一个实施方案中，所述多糖的分子量Mw为120 000 Da。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂是双官能或多官能的。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述双官能或多官能交联剂具有至少一个环氧官能团。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述双官能或多官能交联剂选自乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、双环氧化物或多环氧化物(例如1，2，3，4-二环氧丁烷或1，2，7，8-二环氧辛烷)。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述双官能或多官能交联剂是表氯醇。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述双官能或多官能交联剂具有至少一个乙烯基官能团。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述双官能或多官能交联剂是二烷基砜，其中相同或不同的、直链或支链的烷基基团是具有1至4个碳原子的链。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述双官能或多官能交联剂是二乙烯基砜。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂是单醛、双醛或多醛。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂是甲醛。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂是戊二醛。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比为0.001至0.5。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比为0.01至0.3。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比为0.05至0.2。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比等于0.07。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比等于0.08。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比等于0.10。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比等于0.14。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述交联剂与所述多糖的摩尔比等于0.21。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述取代基的前体选自包含仅一个反应性官能团的分子的组，所述反应性官能团选自乙烯基、环氧基、烯丙基、酮、醛、硫氰酸盐/酯、卤化物、异氰酸盐/酯、卤化硅、腈和磺内酯官能团。
术语“反应性官能团”理解为是指能够与所述多糖的羟基官能团形成键的官能团。
在一个实施方案中，所述键是通过产生醚键来形成的。
在一个实施方案中，所述键是通过产生半缩醛键来形成的。
在一个实施方案中，所述键是通过产生氨基甲酸酯键来形成的。
在根据本发明所述的方法的条件下，由此排除了酯官能团的形成。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述取代基的前体选自还包含至少一个有利的官能团或基团的分子，所述有利的官能团或基团对于取代和交联反应为惰性，其选自磺酸盐/酯、直链或支链烷基、经取代或未经取代的芳族基团、硫酸盐/酯、硫醇、单糖、磷酸盐/酯、膦酸盐/酯、碳酸酯以及酯基团或官能团。
术语“惰性”理解为是指在方法的实施条件下不反应并且在根据本发明的方法获得的产物的储存条件下稳定的官能团。在方法的实施条件下官能团将能够不与多糖的任意官能团反应或者不与交联剂的任意官能团反应或者不与取代基的前体的任意反应性官能团反应，因此在方法的实施条件下为惰性。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述取代基的前体选自通式F-R-(G)x的分子，其中：
-F是选自以下的反应性官能团：经取代或未经取代的乙烯基、经取
代的或未经取代的环氧基、经取代或未经取代的烯丙基、酮、醛、硫氰酸盐/酯、卤化物、异氰酸盐/酯、卤化硅、腈和磺内酯官能团；R是键，或具有1至12个碳原子的、直链或支链的、经取代或未经取代的芳族的、饱和或不饱和的、任选地含有一个或更多个杂原子的烷基链；
-G是氢或有利的官能团或基团，所述官能团或基团是惰性的，选自磺酸盐/酯、直链或支链烷基、经取代或未经取代的芳族基团、硫酸盐/酯、硫醇、单糖、磷酸盐/酯、膦酸盐/酯、碳酸酯、酯基团或官能团；
-x是自然数，使得1≤x≤3。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的F是乙烯基官能团并且所述取代基的前体选自下式的化合物：
-R和G如上所定义，
-R1、R2和R3是相同或不同的，它们为氢原子或具有1至3个碳原子的烷基链。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的F是环氧官能团并且所述取代基的前体选自下式的化合物：
-R和G如上所定义，
-R1、R2和R3如上所定义。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的F是烯丙基官能团并且所述取代基的前体选自下式的化合物：
-R和G如上所定义，
-R1、R2和R3如上所定义，
-R4和R5是相同或不同的，它们为氢原子或具有1至3个碳原子的烷基链。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的G是硫酸盐/酯官能团。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的G是氢原子。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的G是磺酸盐/酯官能团。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述取代基的前体选自烯丙基硫酸盐/酯、环氧基硫酸盐/酯、乙烯基磺酸盐/酯和环氧基烷烃。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述取代基选自乙烯基磺酸及其盐、环氧丁烷和烯丙基硫酸钠。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述多官能交联剂是1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)并且所述取代基的所述前体是乙烯基磺酸钠。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述多官能交联剂是1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)并且所述取代基的所述前体是烯丙基硫酸钠。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述多官能交联剂是1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)并且所述取代基的所述前体是环氧基丁烷。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述多官能交联剂是二乙烯基砜并且所述取代基的前体是乙烯基磺酸钠。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比为0.001至4.00。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比为0.20至2.20。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于0.24。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于0.30。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于0.35。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于0.90。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于1.00。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于1.60。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的所述取代基的前体与所述多糖的摩尔比等于2.00。
主要地，在相同的实验条件下并且在相同的多糖反应位点上同时进行根据本发明所述的方法中的交联和取代反应，这是在所涉及的多种个体之间没有竞争的情况下。取代度和交联度与孤立地进行的反应的那些相同。
所述方法因此使得能够控制与取代无关的交联以促进凝胶的制备并且使得能够根据其用途容易地适应产物。
因为取代和交联是同时的，所以本发明使得能够限制多糖存在于碱性介质中的时间，如果停留的时间延长，则碱性介质分解所述多糖。特别地，众所周知的是，例如，在碱性介质中进行简单取代的情况下，透明质酸被迅速分解并失去其所有的胶凝和粘弹性性质。本发明的出乎意料的效果是这样的事实：交联和取代反应是同时的，这在反应期间保护了多糖并且使得能够获得有关流变性质的协同效应，特别是多糖的弹性，其大幅提高。
与交联/取代反应是同时的事实相关的优点并不限于在最终产物中可见的优点(例如更好的弹性、凝胶的良好同质性、取代基的均匀分布或在交联/取代期间多糖分解的限制)，而且还包括反应时间，特别是反应步骤的数量。本发明的方法使得能够同时引入所有反应物。仅一个单一的反应步骤不仅提供了相当可观的时间节约而且还限制了时间和溶剂的损失。与简单交联相比，因为涉及的所有反应(即，交联和取代反应)在相同的条件下发生，所以引入的催化剂将对两个反应有活性而不必增加其量。在交联和取代之间不存在竞争防止了必需添加过量的反应物以弥补其分解或其过度快速的消耗。
本发明的方法不使用简单的酸或碱之外的催化剂，不使用有机溶剂并且不使用活化剂，并且反应的原子平衡性好，没有形成副产物。
后一点是本发明的另一优点：本发明的方法不产生必须在纯化期间移除的副产物。其仅仅是清洗产物以移除过量的交联剂和催化剂的问题。鉴于获得的多糖的应用，特别是作为生物材料，该不存在副产物是真正的竞争优势。
使得能够获得本发明的化合物的方法不同于现有技术，其中其简单的实施使得能够出乎意料地同时取代或交联多糖而没有取代与交联竞争。因而产生对交联度或取代度的更好控制。
使得能够获得本发明的产物的方法提供了与同时地和分别地在反应介质中发生的每个反应的参数设置相关的完全自由。因此，可修改交联度而不影响取代，并且反过来，可修改取代度而不影响交联。
本发明的交联方法的实施使得能够获得可易于注射的高同质性的产物。出乎意料地，根据本发明所述的方法使得能够提高交联的多糖的流变性质而无须使用更多的交联剂。此外，其使得能够引入其他性质，例如水合作用或亲脂性。
本发明的方法是使得可设想同时进行最多三个反应的方法。术语“三个同时的反应”理解为是指交联与双取代同时进行。
在一个实施方案中，由根据本发明所述的方法获得的多糖是在多糖的羟基官能团上取代的。
将取代基引入度(DSI)定义为：
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度为0.001至4.00(0.001≤DSI≤4.00)。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度为0.20至2.20(0.20≤DSI≤2.20)。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于0.24。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于0.30。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于0.35。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于0.90。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于1.00。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于1.60。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所述取代基引入度等于2.00。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中获得的多糖是通过交联剂与多糖的羟基官能团的反应进行交联的。
将交联剂引入度(DCI)定义为：
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.001至0.5。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.01至0.3。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.07。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.08。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.10。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.14。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中的所述交联剂引入度为0.21。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为4％至20％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为6％至16％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为8％至14％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为5.7％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为6.3％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为10.3％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为11.1％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为12.2％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为13.5％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为14.3％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法中所使用的多糖的重量与所使用的水的重量之比按重量百分比计为15.8％。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法在室温下进行。
术语“室温”理解为是指18℃至25℃的温度。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法在高于25℃的温度下进行。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法在低于60℃的温度下进行。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法在39℃至60℃的温度下进行。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法在40℃的温度下进行。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法在50℃的温度下进行。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法进行了15分钟至48小时。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法进行了1小时至2小时。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法进行了2小时至3小时。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法进行了3小时至4小时。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法进行了4小时至5小时。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法还包括洗涤所获得的多糖的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法还包括用具有pH约为7的缓冲溶液洗涤所获得的多糖的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明所述的方法还包括用纯化水洗涤所获得的多糖的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中多糖的交联是通过式PS-O-(CH2)n-S(O2)-(CH2)n-O-PS的二乙基砜桥来进行的，其中“PS”表示多糖残基并且n表示整数，使得1≤n≤4。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中多糖的交联是通过式PS-O-CH2-CH2-S(O2)-CH2-CH2-O-PS的二乙基砜桥来进行的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中多糖的交联是通过式PS-O-CH2-CH(OH)-CH2-X-CH2-CH(OH)-CH2-O-PS的桥来进行的，X基团为具有2至6个碳原子的烷基链或聚醚链。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中多糖的交联是通过式PS-O-CH2-O-PS的醚桥来进行的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中多糖的交联是通过式PS-O-CH(OH)-(CH2)m-CH(OH)-O-PS的半缩醛桥来进行的，其中m是整数，使得0≤m≤4。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中的多糖在至少一个多糖的羟基官能团上带有来自乙烯基磺酸、2-乙氧基乙基磺酸的至少一个取代基。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中的多糖在至少一个多糖的羟基官能团上带有来自环氧丁烷、1-乙氧基丁-2-醇的至少一个取代基。
在一个实施方案中，根据本发明的方法获得的产物中的多糖在至少一个多糖的羟基官能团上带有来自烯丙基硫酸钠、3-丙氧基硫酸钠的至少一个取代基。
本发明涉及根据本发明的方法获得的水凝胶在配制粘弹性补充组合物中的用途。
根据本发明所述的方法还涉及包含由根据本发明的方法获得的多糖的组合物。
在一个实施方案中，由根据本发明所述的方法获得的多糖为凝胶或水凝胶形式。
根据交联和取代的结果，可通过以下方式有利地中和根据本领域已知的标准方法获得的凝胶：例如，当在碱性介质中进行所述方法时，通过添加酸，以及当在酸性介质中进行所述方法时，通过添加碱。
根据本发明方法的结果获得的混合物可任选地经历另外的水合步骤，以获得适于设想的应用的可注射水凝胶形式的凝胶。
根据所使用的多糖的性质，根据其各自的交联度并且还根据设想的用途，通常在水性介质中通过将交联的和经取代的凝胶与水性溶液(有利地缓冲的生理水溶液)简单混合来进行该水合，以便获得可在很宽的比例内变化的最终浓度。可使用的缓冲溶液可为，例如，表现出pH为约6.8至约7.5的等渗生理溶液。
总多糖的该最终浓度通常为约5mg/g至约100mg/g、优选为约5mg/g至约50mg/g、例如约20mg/g的水凝胶。
本发明涉及根据本发明的方法获得的多糖在配制粘弹性补充组合物中的用途。
本发明涉及根据本发明的方法获得的多糖在配制用于填充皱纹的组合物中的用途。
目标应用更特别地为通常在所使用的可注射多糖粘弹性制品的上下文中观察到的应用或者其可潜在地用于以下病理学或治疗中：
-美容注射：用于填充皱纹、皮肤缺损或体积(颧骨、下巴、嘴唇)的缺损；
-治疗骨关节炎，注射入关节来代替或补充不足的滑液；
-尿道周围注射以治疗由括约肌功能不全引起的尿失禁；
-手术后注射以特别地预防腹膜粘连；
-用于通过使用激光的巩膜切口进行的远视手术后注射；
-注射入玻璃体腔中。
更特别地，在美容手术中，根据其粘弹性性质和持久性性质，可使用根据本发明的方法获得的水凝胶：
-用于填充细小的、中等的或深的皱纹并且可用细针(例如，27针距(gauge))注射；
-用作增容制品，其中通过具有更大直径(例如22针距至26针距)和更长长度(例如，30mm至40mm)的针注射；在这种情况下，其内聚性将使得能够保证将其保持在注射位点处。
根据本发明的方法获得的多糖还具有例如在关节手术和用于填充牙周袋的牙科手术中的重要应用。
这些实施例没有任何方式的限制，将根据本发明的方法获得的多糖更广泛地提供用于：
-填充体积；
-在某些组织中产生空间，从而促进其最佳功能；
-代替不足的生理液体。
根据本发明的方法获得的多糖还具有在骨代用品的制备中的应用。
根据本发明的方法获得的多糖还可具有完全有利的应用，其作为基体以释放预先分散在其中的一种(或更多种)活性成分(active principle)。术语“活性成分”理解为是指具有药理活性的任何产物：药用活性成分、抗氧化剂活性成分(山梨糖醇和甘露糖醇等)、抗菌活性成分、抗炎活性成分和局部麻醉活性成分(利多卡因等)等。
实际上，可将根据本发明的方法获得的多糖(优选地在纯化和水合之后以得到水凝胶)包装(例如在注射器中)，以及根据本身已知的任何手段(例如通过高压灭菌)灭菌从而出售和/或直接使用。
根据另一方面，本发明涉及包装在无菌注射器中的包含根据本发明的方法获得的多糖的试剂盒。
根据本发明的方法获得的多糖的特征在以下实施例中证明。
实施例
将以下实施例中的取代基引入度(DSI)、交联剂引入度(DCI)和反应性催化剂比率定义为：
交联剂引入度：
DCI＝引入到反应介质中的交联剂的摩尔数/引入到反应介质中的二糖单元的摩尔数
取代基引入度：
DSI＝引入到反应介质中的取代基的反应性官能团的摩尔数/引入到反应介质中的二糖单元的摩尔数
反应性催化剂比率
RCR＝引入到反应介质中的催化剂的反应性官能团的摩尔数/引入到反应介质中的二糖单元的摩尔数
实施例1：
证明与取代与交联同时进行的流学性质相关的协同效应
下面描述了以下步骤：
○VSA(乙烯基磺酸的钠盐)在未交联的NaHA(透明质酸钠)上取代○表征取代
○通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)来交联NaHA
○VSA(乙烯基磺酸的钠盐)在NaHA上取代，同时通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)来交联NaHA。
○VSA(乙烯基磺酸的钠盐)在NaHA上取代，接着通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)来交联NaHA。
○证明与由取代与交联同时进行所引入的流变性质相关的协同效应
●凝胶G1A的合成：在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，VSA(乙烯基磺酸的钠盐)在未交联的NaHA上取代
步骤a)：未交联的凝胶形式的透明质酸钠纤维的水合
将注射级的透明质酸钠纤维(0.9g，即，2.24mmol；分子量：约2.7MDa)在容器中称重。加入在水(7.4g)中的1％的氢氧化钠水溶液(0.25mol/L，即，将1.85mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝0.8∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约1小时。
步骤b)：取代
将VSA(102mg，即，0.78mmol)加入到在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。接着将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。取代基引入度DSI等于约0.35。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH并使得其可水合或溶胀，从而获得包含20mg/gHA(透明质酸)的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了经取代的和灭菌的NaHA水凝胶G1A。
●凝胶REF1A的合成
根据上述凝胶G1A的步骤合成了凝胶REF1A，用肠胃外注射用水(WPI)代替VSA。
●通过液体1H NMR来表征对凝胶G1A和REF1A的化学改性：
在图1中示出了凝胶G1A的NMR谱。
在图2中示出了凝胶REF1A的NMR谱。
图1和图2的谱图的比较使得能够确认VSA在NaHA的羟基官能团上的化学取代(通过共价键)。
●凝胶G1B的合成：在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)来交联NaHA
步骤a)：与合成凝胶G1A的步骤a)相同
步骤b)：交联
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.14。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在填充到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的和灭菌的NaHA水凝胶G1B。
●凝胶G1C的合成：在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
步骤a)：与合成凝胶G1A的步骤a)相同
步骤b)：交联和取代
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)和VSA(102mg，即，0.78mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.14并且取代基引入度DSI等于约0.35。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的、经取代的和灭菌的NaHA水凝胶G1C。
●凝胶G1D的合成：在40℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，VSA(乙烯基磺酸的钠盐)在NaHA上取代，接着通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)交联
步骤a)：与合成凝胶G1A的步骤a)相同
步骤b)：取代
将VSA(102mg，即，0.78mmol)加入到在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。接着将合并的混合物置于40℃水浴中保持1小时00分钟。取代基引入度DSI等于约0.35。与G1A测试相比，减少了时间和温度以保持足够用于以下交联步骤的凝胶厚度。
步骤c)：交联
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)加入在前述步骤中获得的未交联经取代的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.14。
步骤d)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了经取代的、然后交联的和灭菌的NaHA水凝胶G1D。
●证明与由取代与交联同时进行而引入的流变性质相关的协同效应
在25℃下的受控应力条件下，在TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征了灭菌凝胶的粘度η。在0.02s-1的应力下记录粘度值。
在25℃下的振荡中，在TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征了灭菌凝胶的弹性组分G′和粘性组分G"。在1Hz的频率下记录弹性组分和粘性组分的值。
在下表I中示出了流变学结果：
表 I
G1A G1B G1C G1D
粘度：在0.02s-1下的η(Pa.s) 7 1822 1959 1502
弹性组分：在1Hz下的G′(Pa) 0.5 107 131 78
粘性组分：在1Hz下的G″(Pa) 3 27 29 22
在凝胶上取代与交联同时进行(G1C测试)引入了与以下凝胶相比更好的粘弹性性质：
○仅仅取代的(凝胶G1A)，
○仅仅交联的(凝胶G1B)，
○首先取代然后交联的(凝胶G1D)。
出乎意料地，取代与交联同时进行协同地改进了所获得的凝胶的流变性质。
实施例2：
在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
通过测量流变性质，该实施例使得能够证明：
○在交联期间乙烯基官能团在NaHA上的取代以及由取代所引入的结构的不同，
○对经取代的和交联的凝胶的自由基分解的更好耐性。
●凝胶G2的合成
步骤a)：未交联的凝胶形式的透明质酸钠纤维的水合
将注射级的透明质酸钠纤维(0.9g，即，2.24mmol；分子量：约2.7MDa)在容器中称重。加入在水(7.4g)中的1％的氢氧化钠水溶液(0.25mol/L，即，将1.85mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝0.8∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约1小时。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)和VSA(70mg，即，0.54mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.14并且取代基引入度DSI等于约0.24。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的、经取代的和灭菌的NaHA水凝胶G2。
●凝胶REF2的合成
根据上述凝胶G2的步骤合成了凝胶REF2，用肠胃外注射用水(WPI)代替VSA。
●凝胶G2和REF2的挤出力或“注射能力”以及弹性的表征
在50mm/分钟的压缩速率以及27G1/2"针下，于Mecmesin拉伸/压缩测试机器上表征挤出力；结果在下表中给出。
在25℃下的振荡中，在TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征灭菌凝胶的弹性，在1Hz的频率下记录弹性值；结果在下表II中示出。
表 II
G2 REF2
挤出力(N)，27G1/2″针，速率50mm/分钟 35 38
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 116 105
取代使得能够获得具有更好流变能力(+10％)以及轻微降低(-8％)的注射能力水平的最终产物。这些流变学数据证实了对NaHA的化学改性以及由此证实了在交联期间乙烯基官能团在NaHA上的取代。
●对凝胶G2和REF2的自由基分解的测试
还通过于37℃下在体外对自由基分解的测试对凝胶进行了表征。该测试使得能够模拟注射的凝胶在体内(皮内和关节内等)的后续持久性。
其是在出版物“Antioxidant activities of sulfated polysaccharides frombrown and red seaweeds”，Rocha de Souza，J.Appl.Phycol.(2007)，19，153-160中描述的测试的基础上开发的。
通过由过氧化氢与亚铁离子之间的芬顿(Fenton)反应产生的自由基来分解凝胶。由在37℃下的流变能力来监测分解，测量了复数粘度。这2个凝胶的分解结果的趋势曲线随后使得能够评估这些不同凝胶的半衰期(使n*＝n*0/2所必须的时间段，以分钟计，其中n*0＝表征的凝胶在t0处的复数粘度)。所获得的半衰期在下表III中给出。
表III
G2 REF2
半衰期(分钟) 8.0 5.1
因此，由于轻微降低并且使得其能够保持对手术操作的良好控制的注射能力，根据本发明获得的改性凝胶的半衰期较长，保证了体内持久性的更长时间，即使在测试的低取代度的情况下亦如此。
实施例3：
在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明引入到凝胶中的弹性作为取代度的函数的提高。
●凝胶G3A和凝胶G3B的合成
所述凝胶的合成与凝胶G1C和G2的合成相同，其中将VSA的量调节至测试的取代基引入度；参见下表IV。
表 IV
DSI
G3A 1.00
G3B 2.00
●凝胶G3A和G3B的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征凝胶的弹性；结果在下表V中给出。
表 V
G2 G1C G3A G3B REF2
取代基引入度，DSI 0.24 0.35 1.00 2.00 -
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 116 131 199 213 105
在图3中图示性地表示的结果示出凝胶的弹性G′随着取代基引入度的提高而提高：化学改性确实是造成凝胶的粘弹性性质优化的原因。
实施例4：
在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，在NaHA上的EB(环氧丁烷)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明在NaHA上的环氧基官能团取代与交联同时进行。
●凝胶G4的合成
步骤a)：与合成凝胶G1A的步骤a)相同。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)和EB(147mg，即，2.02mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.14并且取代基引入度DSI等于约0.90。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的、经取代的和灭菌的NaHA水凝胶G4。
●凝胶REF4的合成
根据上述凝胶G4的步骤合成了凝胶REF4，用肠胃外注射用水(WPI)代替EB。
●凝胶G4和REF4的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征凝胶的弹性；结果在下表VI中给出。
表 VI
G4 REF4
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 180 150
由流变学结果证实了包含环氧基反应性基团的分子在NaHA上的取代：化学改性使得能够获得具有更高弹性的最终产物。
这些流变学数据证实了在交联期间环氧官能团在NaHA上的取代。
实施例5：
在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.7∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明在低分子量的NaHA上的取代。●凝胶G5的合成
步骤a)：未交联的凝胶形式的透明质酸钠纤维的水合
将注射级的透明质酸钠纤维(0.9g，即，2.24mmol；分子量：约1.5MDa)在容器中称重。加入在水(6.3g)中的1％的氢氧化钠水溶液(0.25mol/L，即，将1.57mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝0.7∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约1小时。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(30mg，即，0.15mmol)和VSA(87mg，即，0.67mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.07并且取代基引入度DSI等于约0.30。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的和经取代的NaHA水凝胶G5。
●凝胶REF5的合成
根据上述凝胶G5的步骤合成了凝胶REF5，用肠胃外注射用水(WPI)代替VSA。
●凝胶G5和REF5的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征凝胶的弹性；结果在下表VII中给出。
表 VII
G5 REF5
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 519 433
取代使得其能够获得具有较高弹性的最终产物。这些流变学数据，如同实施例2的那些(高分子量的NaHA)，证实了取代可在具有不同分子量的NaHA上进行。
实施例6：
在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝1∶1)中，在CMC(羧甲基纤维素)上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明了在NaHA以外的多糖上的取代。
●凝胶G6的合成
步骤a)：未交联的凝胶形式的CMC的水合
将0.93g(即，2.20mmol)的CMC钠(由Sigma提供，分子量：约1.0MDa)在容器中称重。加入在水(9.0g)中的1％的氢氧化钠水溶液(0.25mol/L，即，将2.25mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝1∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约90分钟。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(37mg，即，0.18mmol)和VSA(87mg，即，0.67mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的CMC凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持3小时35分钟。交联剂引入度DCI等于约0.08并且取代基引入度DSI等于约0.30。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含30mg/g CMC的凝胶。随后，在包装到注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的和经取代的CMC水凝胶G6。
●凝胶REF6的合成
根据上述凝胶G6的步骤合成了凝胶REF6，用肠胃外注射用水(WPI)代替VSA。
●凝胶G6和REF6的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征凝胶的弹性；结果在下表VIII中给出。
表 VIII
G6 REF6
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 524 483
取代使得能够获得具有较高弹性的最终产物。这些流变学数据，如同实施例2的那些(NaHA)，证实了取代可在不同多糖骨架特别是纤维素衍生物上进行。
实施例7：
在50℃的温度下并且在弱酸性介质(RCR＝0.06∶1)和强酸性介质(RCR＝1∶1)中，在CH(壳聚糖)上的EB(环氧丁烷)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明在酸性介质中取代与交联同时进行。
●凝胶G7a的合成(在弱酸性介质中)
步骤a)：未交联的凝胶形式的CH的水合
将0.99g(即，2.93mmol)的具有约80％的脱乙酰度的CH(由Kitozyme提供，分子量：约120000Da)在容器中称重。加入在水(9.0g)中的1％的谷氨酸水溶液(0.07mol/L)。由于谷氨酸是弱酸，所以其在水中部分解离。可通过下式计算水溶液的pH(作为近似值的结果确定)：pH＝(1/2pKa)-(1/2log[谷氨酸])，即pH＝(1/2×2.19)-(1/2×log(0.07))＝1.67。可通过下式计算水合氢H3O+离子的浓度：[H3O+]＝10-pH，即[H3O+]＝0.02mol/L，即将0.19mmol的水合氢离子引入反应介质(RCR＝0.06∶1)中。并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约90分钟。反应介质的pH为5.3。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(60mg，即，0.30mmol)和EB(337mg，即，4.68mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的CH凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持。交联剂引入度DCI等于约0.10并且取代基引入度DSI等于约1.60。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N氢氧化钠溶液来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含22mg/gCH的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的、经取代的和灭菌的CH水凝胶G7a。
●凝胶G7b的合成(在强酸性介质中)
步骤a)：未交联的凝胶形式的CH的水合
将0.99g(即，2.93mmol)的具有约80％的脱乙酰度的CH(由Kitozyme提供，分子量：约120000Da)在容器中称重。加入在水(9.0g)中的1.15％的盐酸水溶液(0.32mol/L，即，将2.88mol的H3O+离子引入反应介质中＝＞RCR＝1∶1)。并且使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约90分钟。反应介质的pH为3。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(60mg，即，0.30mmol)和EB(337mg，即，4.68mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的CH凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持。交联剂引入度DCI等于约0.10并且取代基引入度DSI等于约1.60。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N氢氧化钠溶液来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含22mg/gCH的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的、经取代的和灭菌的CH水凝胶G7b。
●凝胶REF7的合成
根据上述凝胶G7的步骤合成了凝胶REF7，用肠胃外注射用水(WPI)代替EB。
●凝胶G7a和REF7的粘度的表征
这2种凝胶G7a和REF7一致地相对于弹性而言更具粘性，因此以粘度来表征。
在实施例1中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征灭菌的凝胶的粘度；结果在下表IX中给出。
表 IX
G7a REF7
粘度(Pa.s) 67.1 35.4
取代使得能够获得具有更好流变能力的最终产物。这些流变学数据，如同实施例2(在碱性条件下的NaHA)和实施例6(在碱性条件下的CMC)，证实了可在不同的多糖骨架上并且在酸性和碱性两种条件下来进行取代。
实施例8：
在40℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝1.75∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过DVS(二乙烯基砜)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明在用不同的交联剂桥接的NaHA上的取代。
●凝胶G8的合成
步骤a)：未交联的凝胶形式的透明质酸钠纤维的水合
将注射级的透明质酸钠纤维(0.9g，即，2.24mmol；分子量：约2.7MDa)在容器中称重。加入在水(15.7g)中的1％的氢氧化钠水溶液(0.25mol/L，即，将3.92mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝1.75∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约1小时。
步骤b)：交联和取代
将DVS(57mg，即，0.48mmol)和VSA(87mg，即，0.67mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于40℃水浴中保持1小时00分钟。交联剂引入度DCI等于约0.21并且取代基引入度DSI等于约0.30。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的和经取代的NaHA水凝胶G8。
●凝胶REF8的合成
根据上述凝胶G8的步骤合成了凝胶REF8，用肠胃外注射用水(WPI)代替VSA。
●凝胶G8和REF8的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征凝胶的弹性；结果在下表X中给出。
表 X
G8 REF8
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 110 103
取代使得能够获得具有较高弹性的最终产物。这些流变学数据，如同实施例2的那些(用BDDE交联)，证实了取代可与多糖的桥接同时进行，无论交联剂的性质如何。
实施例9：
在50℃的温度下并且在碱性介质(RCR＝0.8∶1)中，在NaHA上的SAS(烯丙基硫酸钠)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
该实施例使得能够通过流变能力证明：
-在交联期间烯丙基官能团在NaHA上的取代以及由取代引入的结构上的不同，
-对用硫酸盐/酯侧基(pendant group)取代的凝胶的自由基分解的更好耐性。
●凝胶G9的合成
步骤a)：与合成凝胶G1A的步骤a)相同。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)和SAS(111mg，即，0.68mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于50℃水浴中保持2小时10分钟。交联剂引入度DCI等于约0.14并且取代基引入度DSI等于约0.30。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含20mg/g HA的凝胶。随后，在包装到由高压灭菌灭菌的注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的、经取代的和灭菌的NaHA水凝胶G9。
●凝胶REF9的合成
根据上述凝胶G9的步骤合成了凝胶REF9，用肠胃外注射用水(WPI)代替SAS。
●凝胶G9和REF9的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征灭菌的凝胶的弹性；结果在下表XI中给出。
表 XI
G9 REF9
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 123 105
取代使得能够获得具有更好流变能力(+17％)的最终产物。这些流变学数据证实了在NaHA上的烯丙基官能团取代与交联同时进行。
●对凝胶G9和REF9的自由基分解的测试
还通过实施例2中描述的在所述温度下对体外自由基分解的测试来表征凝胶。所获得的半衰期在下表XII中给出。
表 XII
G9 REF9
半衰期(分钟) 12.6 6.6
因此，根据本发明获得的用硫酸盐/酯侧基取代的凝胶的半衰期较长，保证了更长时间的体内持久性。
反例
反例1：
该反例类似于在现有技术的剧烈温度和pH条件下进行的实施例1。
a)凝胶G1Ca的合成：在80℃的温度下并且在浓碱性介质(RCR＝4.1∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
步骤a)：未交联的凝胶形式的透明质酸钠纤维的水合
将注射级的透明质酸钠纤维(0.9g，即，2.24mmol；分子量：约2.7MDa)在容器中称重。加入在水(7.4g)中的5％的氢氧化钠水溶液(1.25mol/L，即，将9.25mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝4.1∶1)并且使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约1小时。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)和VSA(102mg，即，0.78mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于80℃水浴中保持2小时10分钟以获得约0.14的交联剂引入度DCI和约0.35的取代基引入度DSI。
在80℃下20分钟之后，反应介质已经完全分解(液体，褐色，“焦糖状”外观)。
高温(80℃)和浓氢氧化钠溶液的使用分解了多糖网络并且因此中断了聚合物链的取代和交联。
b)凝胶G1Cb的合成：在80℃的温度下并且在浓碱性介质(RCR＝8.2∶1)中，在NaHA上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
步骤a)：未交联的凝胶形式的透明质酸钠纤维的水合
将注射级的透明质酸钠纤维(0.9g，即，2.24mmol；分子量：约2.7MDa)在容器中称重。加入在水(7.4g)中的10％的氢氧化钠水溶液(2.5mol/L，即，将18.5mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝8.2∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约1小时。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(65mg，即，0.32mmol)和VSA(102mg，即，0.78mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的透明质酸钠(NaHA)凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于80℃水浴中保持2小时10分钟以获得约0.14的交联剂引入度DCI和约0.35的取代基引入度DSI。
在80℃下15分钟之后，反应介质已经完全分解(液体，褐色，“焦糖状”外观)。
高温(80℃)和浓氢氧化钠溶液的使用分解了多糖网络并且因此中断了聚合物链的取代和交联。
反例2：
该反例类似于在现有技术的剧烈温度和pH条件下进行的实施例6。a)在80℃的温度下并且在浓碱性介质(RCR＝5.1∶1)中，在CMC(羧甲基纤维素)上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
●凝胶G6a的合成
步骤a)：未交联的凝胶形式的CMC的水合
将0.93g(即，2.20mmol)的CMC钠(由Sigma提供，分子量：约1.0MDa)在容器中称重。加入在水(9.0g)中的5％的氢氧化钠水溶液(1.25mol/L，即，将11.25mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝5.1∶1)并使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约90分钟。
步骤b)：交联和取代
将BDDE(37mg，即，0.18mmol)和VSA(87mg，即，0.67mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的CMC凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于80℃水浴中保持3小时35分钟以获得约0.08的交联剂引入度DCI和约0.30的取代基引入度DSI。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含30mg/gCMC的凝胶。随后，在包装到注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的和经取代的CMC水凝胶G6a。
该凝胶具有过度液体的、过度分散的以及弹性不充分的外观。
b)在80℃的温度下并且在浓碱性介质(RCR＝10.2∶1)中，在CMC(羧甲基纤维素)上的VSA(乙烯基磺酸的钠盐)取代与通过BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的交联同时进行
●凝胶G6b的合成
步骤a)：未交联的凝胶形式的CMC的水合
将0.93g(即，2.20mmol)的CMC钠(由Sigma提供，分子量：约1.0MDa)在容器中称重。加入在水(9.0g)中的10％的氢氧化钠水溶液(2.5mol/L，即，将22.5mmol的HO-引入到介质中)(RCR＝10.2∶1)并且使用刮铲将合并的混合物在室温和900mmHg下均质化约90分钟。步骤b)：交联和取代
将BDDE(37mg，即，0.18mmol)和VSA(87mg，即，0.67mmol)加入在前述步骤中获得的未交联的CMC凝胶中，使用刮铲将合并的混合物在12℃至14℃的温度下均质化约30分钟。随后将合并的混合物置于80℃水浴中保持3小时35分钟以获得约0.08的交联剂引入度DCI和约0.30的取代基引入度DSI。
步骤c)：中和、纯化
随后通过添加1N HCl来中和经交联的和经取代的最终凝胶并且将其置于磷酸盐缓冲浴中以稳定pH且使得其能够水合或溶胀，从而获得包含30mg/gCMC的凝胶。随后，在包装到注射器中之前，将该凝胶均质化。由此获得了交联的和经取代的CMC水凝胶G6b。
该凝胶具有过度液体的、过度分散的以及弹性不充分的外观。
c)凝胶G6a和G6b的弹性的表征
在实施例2中描述的TA Instruments AR 2000 Ex流变仪上表征凝胶的弹性；结果在下表中给出。
G6a G6b G6 REF6
弹性：在1Hz下的G′(Pa) 17 12 524 483
流变学数据证实了观察到的方面：凝胶不具有期望的稠度并且其没有表现出目标应用所需的粘弹性性质。
高温(80℃)和浓氢氧化钠溶液的使用分解了多糖网络并且因此中断了聚合物链的接枝和交联。

Claims (19)

1.一种在水相中通过多糖的羟基官能团同时取代和交联多糖的方法，包括以下步骤：
-将多糖置于水性介质中，向其中加入取代基的至少一种前体，
-向其中加入交联剂，所述交联剂是双官能或多官能的，
-获得经取代的和交联的多糖并将其分离，
其中，所述方法是在碱性催化剂的存在下并且在39℃以上但低于60℃的温度下进行，所述碱性催化剂的浓度为3.16×10-7mol/L至0.32mol/L，并且所述多糖为透明质酸或其一种盐，其中所述方法进行1至5小时，
其中所述双官能或多官能交联剂选自乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、双环氧化物、多环氧化物、二乙烯基砜、甲醛或戊二醛，
其中所述取代基的前体选自包含仅一个反应性官能团的分子，所述反应性官能团选自经取代或未经取代的乙烯基、经取代或未经取代的环氧化物、经取代或未经取代的烯丙基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中反应性催化剂比率RCR为0.02:1至3:1，其定义为：
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述RCR为0.2:1至3:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是选自氢氧化钠或氢氧化钾的无机碱并且其中所述催化剂的所述反应性官能团是OH-离子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述无机碱的浓度按重量计为1.2×10-5％至1.15％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中催化剂OH-的浓度为10-6mol/L至0.32mol/L，以使得10-6mol/L≤[OH-]≤0.32mol/L。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中水性反应介质的pH是碱性并且为8.5至13.5。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多糖的分子量Mw为0.01MDa至4.0MDa。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述双环氧化物选自1,2,3,4-二环氧丁烷或1,2,7,8-二环氧辛烷。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述取代基的前体选自还包含选自以下的至少一个有利的官能团或基团的分子：磺酸盐/酯、直链或支链烷基、经取代或未经取代的芳族基团、硫酸盐/酯、磷酸盐/酯、膦酸盐/酯和碳酸酯。
11.根据权利要求1或10所述的方法，其中所述取代基的前体选自烯丙基硫酸盐/酯、乙烯基磺酸盐/酯、环氧基硫酸盐/酯和环氧基烷烃。
12.根据权利要求1或10所述的方法，其中所述取代基的前体选自乙烯基磺酸及其盐、环氧丁烷和烯丙基硫酸钠。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所获得的多糖表现出为0.001至4.00的取代基引入度DSI，其定义为：
14.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所获得的多糖表现出为0.001至0.5的交联剂引入度DCI，其定义为：
15.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括洗涤所获得的多糖的步骤。
16.一种包含由根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得的多糖的组合物。
17.一种根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得的多糖在配制粘弹性补充组合物中的用途。
18.一种根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得的多糖在配制用于填充皱纹的组合物中的用途。
19.一种包装在无菌注射器中的包含根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得的多糖的试剂盒。
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