CN103987848A

CN103987848A - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

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Publication number: CN103987848A
Application number: CN201280051110.XA
Authority: CN
Inventors: C·勒佐; Y·D·崔; J·K·金; 郑镇瑞
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH; Crop Functional Genomics Center
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH; Crop Functional Genomics Center
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-08-13
Also published as: AR090034A1; EP2768961A4; KR101662483B1; EP2768961A1; WO2013057705A1; KR20140090974A; CA2846512A1; BR112014009488A2; MX2014004344A; IN2014CN02009A; US20150150158A1; AU2012324475A1

Abstract

本发明提供通过调节在过表达NAC1或NAC5编码基因时上调的核酸(本文中称为NUG或“NAC上调基因”)在植物中的表达来增强植物中的产量相关性状的方法。本发明还提供具有NUG的调节表达的植物，该植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供用于在植物中赋予非生物胁迫耐受性的方法，其包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在培养于非生物胁迫条件下的植物中的表达。与相应的野生型植物相比，除具有提高的非生物胁迫耐受性外，表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸的植物还具有增强的产量相关性状和／或修饰的根构造。本发明还提供用于该方法的构建体及通过该方法产生的植物。

Description

具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法

背景技术

本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及通过调节在过表达NAC1或NAC5编码基因时上调的核酸（本文中称为NUG或“NAC上调基因”）在植物中的表达来增强植物中的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有NUG的调节表达的植物，该植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还涉及用于在植物中赋予非生物胁迫耐受性的方法，其包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在培养于非生物胁迫条件下的植物中的表达。与相应的野生型植物相比，除具有提高的非生物胁迫耐受性外，表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸的植物还具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造（root architecture）。本发明还提供用于本发明的方法的构建体及通过本发明的方法产生的植物。

不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地助长了提高农业效率研究之势。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时不一定总是产生期望的性状。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质（一般为DNA或RNA的形式）以及随后将遗传物质引入植物。这类技术有能力输送具多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。

一种具有特别经济利益的性状是增加的产量。产量通常定义为作物可测量经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造（例如，分枝的数量）、种子产量、叶子衰老等等。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也是决定产量的重要因素。因此优化上述因素也可以促进作物产量的增加。

种子产量是尤其重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、卡诺拉（canola）和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工中所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(发芽和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈谷粒。

对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力（early vigour）。改良早期活力是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的恰当土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻的情况下，以及在植物必须迅速穿过水出苗的情况下，较长的枝条与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，Zea mays L.)杂交种。

另一重要的性状在于改良的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，使大多数主要作物植物的平均产量降低50%以上(Wang等,Planta218,1-14,2003)。非生物胁迫可由干旱、盐度、极端温度、化学毒性及氧化胁迫引起。提高非生物胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在不利条件下、在否则将不可能进行作物栽培的地区进行作物栽培。

因此通过优化上述因素之一可以增加作物产量。

视最终用途而定，可能更优先修饰某些产量性状。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料资源等应用，可能期望植物营养部分的增长，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增长。即便是在种子参数之中，也可能更优先其中的一些，这取决于应用。多种机制可促成增加的种子产量，无论形式是增加的种子大小、还是增加的种子数量。

广泛研究的干旱应答基因中有隶属于NAC（NAM、ATAF和CUC）基因家族的转录调节基因。NAC基因家族的成员仅见于植物中，并且它们中的许多涉及胁迫应答。NAC蛋白由高度保守的N端、其中蛋白质形成同二聚体或异二聚体的可以形成β-折叠的DNA结合结构域(Ernst等,2004；Hegedus等,2003；Jeong等,2009；Takasaki等,2010；Xie等,2000)和高度可变的C端区域(Zheng等,2009)组成。

WO2007/144190描述多种NAC编码核苷酸序列在提高非胁迫条件下或轻度干旱胁迫下的植物产量中的用途。

现已发现，可以通过调节在过表达NAC1或NAC5基因/核酸时上调的核酸在植物中的表达来增强植物中的多种产量相关性状。在过表达NAC1或NAC5基因/核酸时上调的核酸在本文中称为NUG或NAC上调基因。

还已发现，在培养于非生物胁迫条件下的植物中过表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸产生与相应的野生型植物相比具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造的植物，其中该核酸与组织特异性启动子有效连接。

现还已发现，可以通过在植物中过表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸来在植物中赋予非生物胁迫耐受性，其中核酸与组织特异性启动子有效连接。

发明详述

本发明显示，调节在过表达NAC1或NAC5基因/核酸时上调的核酸（本文中称为NUG或NAC上调基因）在植物中的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。

本发明还显示，在培养于非生物胁迫条件下的植物中过表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸产生相对于相应的野生型植物具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造的植物，其中该核酸与组织特异性启动子有效连接。

1.NUG或NAC上调基因

根据本发明的第一方面，提供用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括调节NUG在植物中的表达，并可选地选择具有增强的产量相关性状的植物。

根据本发明的另一方面，提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，其包括调节本文中所述的编码NUG多肽的核酸在植物中的表达，并可选地选择具有增强的产量相关性状的植物的步骤。

用于调节，优选增加编码NUG多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入和表达编码NUG多肽的核酸。

后文对“用于本发明方法的蛋白质”的任意提及意指本文中定义的NUG多肽。后文对“用于本发明方法的核酸”的任意提及意指能够编码NUG多肽的核酸。待引入植物（因此用于实施本发明的方法）的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的核酸，后文中也称为“NUG核酸”或“NUG基因”。

本文中定义的“NUG多肽”指表A或表B中所述的任意多肽，或表A或表B中所述的任意多肽的同源物。

本文中定义的“NUG”或“NUG核酸”指能够编码本文中定义的NUG多肽或其同源物的任意基因/核酸。

编码NUG多肽的核酸的实例在本文的表A和表B中给出；这类核酸用于实施本发明的方法。NUG多肽的同源物也用于实施本发明的方法。

表A显示与非转基因对照相比，RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中上调的根表达的基因。

表B显示与非转基因对照相比，RCc3:OsNAC5和/或GOS2:OsNAC5植物中上调的基因。

尤其优选的用于本发明方法的NUG包括以下：

a)O-甲基转移酶，尤其是Os09g0344500、OS10g0118000、OS10g0118200。

b)AAA型ATP酶，尤其是OS09g0445700。

c)亮氨酸重复序列，尤其是OS08g0202300。

d)DNA结合/同源域，尤其是OS11g0282700。

e)氧化还原酶,2OG-Fe(II)加氧酶，OS04g0581100。

f)钙转运ATP酶，尤其是OS10g0418100。

g)9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis epoxycaretenoid dioxygenase），尤其是OS07g0154100。

h)肉桂酰辅酶A还原酶1，尤其是OS02g0811800。

i)LLR激酶，尤其是OS07g0251800。

j)WRKY40，尤其是OS09g0417600。

k)萌发蛋白样GLP氧化还原酶，尤其是OS03g0694000。

l)C4二羧酸转运蛋白，尤其是OS04g0574700。

m)果糖二磷酸醛缩酶，尤其是OS08g0120600。

n)MnT，尤其是OS10g0118200。

o)氧代植物二烯酸还原酶（Oxo phytodienoic acid reductase），尤其是OS06g0215900。

p)细胞色素p450，尤其是OS12g0150200。

NUG多肽或其同源物在本文中定义为与表A或表B中给出的多肽序列中的一个或多个具有至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%总体序列同一性。

表A和B中给出的NUG多肽的直向同源物和旁系同源物也包含在术语“同源物”之内，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中所定义。直向同源物和旁系同源物可以通过进行定义部分中所述的所谓的交互blast搜索来容易地鉴定。

总体序列同一性可以用全局比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法来确定，优选使用默认参数，且优选使用成熟蛋白质的序列（即不考虑分泌信号或转运肽）。在一个实施方案中，通过在表A和表B中的多肽序列的全长内比较多肽序列来确定序列同一性水平。

还可以通过表A或表B中的多肽序列之一中存在的一个或多个保守结构域或基序与所讨论的NUG的同源家族成员中相应的保守结构域或基序相比的比较来测定序列同一性水平。与总体序列同一性相比，在仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常将更高。术语“结构域”、“标签序列”和“基序”在本文的“定义”部分中定义。

用于鉴定结构域的工具为本领域已知，且包括用来自表A或B的蛋白质序列或其同源序列查询数据库，如InterPro(Hunter等,Nucleic Acids Res.37(Database Issue):D224-228,2009)。基序的鉴定也为本领域已知，例如通过使用MEME算法(Bailey和Elkan,Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994)。为此，用一组同源蛋白质序列作为输入。在MEME基序内的每个位置，显示以高于0.2的频率存在于查询序列组中的残基。方括号内的残基表示备选残基。

在本发明的这种核酸序列在活植物细胞中转录和翻译时，编码NUG多肽的核酸序列赋予合成本文所述的增加产量或产量相关性状的NUG的信息。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。这类变体的实例包括编码本文表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文所定义。

还用于本发明方法的是编码本文表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法的同源物和衍生物具有与它们所衍生自的未修饰蛋白质基本上相同的生物学活性和功能活性。用于实施本发明方法的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除了miRNA靶位点的变体。

用于实施本发明方法的其他核酸变体包括编码NUG多肽的核酸的部分、与编码NUG多肽的核酸杂交的核酸、编码NUG多肽的核酸的剪接变体、编码NUG多肽的核酸的等位基因变体和通过基因改组获得的编码NUG多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组如本文中所述。

编码NUG多肽的核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达本文表A或表B中给出的核酸序列中的任一个的部分，或编码本文表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

例如，可以通过对核酸进行一个或多个缺失来制备核酸的部分。该部分可以以分离的形式使用，或者可以将它们与其他编码（或非编码）序列融合，以例如产生组合了几种活性的蛋白质。在与其他编码序列融合时，所得到的通过翻译产生的多肽可以比针对该蛋白质部分预测的大小更大。

用于本发明方法的部分编码本文定义的NUG多肽或至少其部分，且具有与本文表A或表B中给出的氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该部分是本文表A或表B中给出的核酸中任一个的部分，或者是编码表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸，该连续核苷酸属于表A或表B中给出的核酸序列中的任一个，或编码本文表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的核酸。

用于本发明方法的另一核酸变体是能够在严格性降低的条件下，优选在严格条件下，与编码本文定义的NUG多肽的核酸，或与本文定义的部分杂交的核酸。根据本发明，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达能够与编码表A或表B中给出的蛋白质中任一种的核酸杂交的核酸，或与编码表A或表B中给出的蛋白质中任一种的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。

用于本发明方法的杂交序列编码本文定义的NUG多肽，该NUG多肽与表A或表B中给出的、由与该杂交序列杂交的核酸编码的氨基酸序列具有基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与编码表A或表B中给出的蛋白质中任一种的核酸的互补序列杂交，或与这些序列中任一个的部分杂交，部分如本文所定义，或者该杂交序列能够与编码表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。杂交条件可以是本文定义的中等严格条件或高度严格条件。

优选地，该杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列包含存在于由与该杂交序列杂交的核酸编码的多肽序列中的基序或保守区的至少一些，和/或具有与由与该杂交序列杂交的核酸编码的多肽相同的生物学活性，和/或与由与该杂交序列杂交的核酸编码的多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高序列同一性。

在另一实施方案中，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文表A或表B中给出的蛋白质中任一种的核酸的剪接变体或等位基因变体，或编码表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体或等位基因变体。

优选的剪接变体或等位基因变体是那些变体，其中由该剪接变体或等位基因变体编码的氨基酸序列包含见于非变体序列中的基序或其他保守区的至少一些，和/或具有与非变体序列相同的生物学活性，和/或与非变体序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高序列同一性。等位基因变体存在于自然界中，且这些天然等位基因的使用包含在本发明方法的范围之内。

根据本发明的另一实施方案，提供用于在植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达表A或表B中给出的核酸序列中的任一个的变体，或包括在植物中引入和表达编码表A或表B中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，该变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含至少一些见于非变体序列中的基序或其他保守区，和/或具有与非变体序列相同的生物学活性，和/或与该变体所衍生自的非变体序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高序列同一性。

此外，核酸变体还可以通过位点定向诱变获得。可用几种方法来达到位点定向诱变，最常用的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。因一个或几个氨基酸（本文定义的取代、插入和/或缺失）而不同于表A或表B的序列的NUG多肽可以同等地用于在本发明的方法和构建体和植物中增加植物的产量。

编码NUG多肽的核酸可以衍生自任意天然或人工来源。该核酸可以通过有意的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰自其天然形式。

优选地，NUG多肽编码核酸来自植物，进一步优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科（Poaceae），最优选该核酸来自稻（Oryza sativa）。

本发明还延及包含用于本发明方法的核酸序列的重组染色体DNA的使用，其中该核酸由于重组方法而存在于染色体DNA中，但不存在于其天然遗传环境中。在另一实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。

本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。在本发明的具体实施方案中，本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增加的早期活力和/或增加的产量和/或增加的生物量和/或增加的种子产量的植物。术语“早期活力”、“生物量”、“产量”和“种子产量”在本文“定义”部分中更详细地描述。

因此，本发明提供用于相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括调节编码本文定义的NUG多肽的核酸在植物中表达。

根据本发明的另一实施方案，本发明方法的实施产生相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供用于增加植物的生长速率的方法，该方法包括调节编码本文定义的NUG多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施产生在非胁迫条件下或轻度干旱条件下生长时相对于生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在非胁迫条件下或轻度干旱条件下的植物中增强产量相关性状的方法，该方法包括调节编码NUG多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施产生在干旱条件下生长时相对于生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在干旱条件下的植物中增强产量相关性状的方法，该方法包括调节编码NUG多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施产生在养分不足条件下，尤其是在氮缺乏条件下生长时相对生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在养分缺乏条件下的植物中增强产量相关性状的方法，该方法包括调节编码NUG多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施产生在盐胁迫条件下生长时相对于生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在盐胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，该方法包括调节编码NUG多肽的核酸在植物中的表达。

本发明还提供遗传构建体和载体，以便于在植物中引入和表达编码NUG多肽的核酸。基因构建体可以插入载体，该载体可以是市售的，适合用于转化入植物或宿主细胞，且适合用于在转化细胞中表达目的基因。本发明还提供本文定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体而言，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码上文定义的NUG多肽的核酸；

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和可选的

(c)转录终止序列。

优选地，编码NUG多肽的核酸如上文所定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文所定义。

本发明的遗传构建体可以包含在宿主细胞、植物细胞、种子、农产品或植物中。用遗传构建体，如含有任意上述核酸的载体或表达盒转化植物或宿主细胞。因此，本发明还提供用上述构建体转化的植物或宿主细胞。具体而言，本发明提供用上述构建体转化的植物，该植物具有本文所述的增加的产量相关性状。

在一个实施方案中，在将本发明的遗传构建体引入该植物时，它赋予该植物增加的产量或一种或多种产量相关性状，该植物表达包含在该遗传构建体中的编码NUG的核酸。在另一实施方案中，本发明的遗传构建体赋予包含已引入该构建体的植物细胞的植物增加的产量或一种或多种产量相关性状，该植物细胞表达包含在该遗传构建体中的编码NUG的核酸。

技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖含有目的序列的宿主细胞而必须存在于遗传构建体上的遗传元件。目的序列与一个或多个控制序列（至少与启动子）有效连接。

有利地，可以用任意类型的（天然或合成的）启动子来驱动核酸序列的表达，但优选该启动子是植物来源的。组成型启动子在该方法中尤其有用。多种启动子类型的定义见本文“定义”部分。

该组成型启动子优选是中等强度的遍在组成型启动子。更优选地，它是植物衍生启动子，例如植物染色体来源的启动子，如GOS2启动子，或具有基本上相同的强度且具有基本上相同的表达模式的启动子（功能上等同的启动子），更优选地，该启动子是来自稻的GOS2启动子。组成型启动子的其他实例见本文“定义”部分。

可选地，一个或多个终止子序列可以用于引入植物的构建体。本领域技术人员知道可以适合用于实施本发明的终止子序列。优选地，该构建体包含含有组成型启动子（如GOS2）的表达盒，该组成型启动子与编码NUG多肽的核酸有效连接。该构建体可以进一步包含与NUG编码序列的3’端连接的终止子（如玉米醇溶蛋白终止子）。此外，引入植物的构建体上可以存在一个或多个编码选择标记的序列。

根据本发明的优选特征，该调节的表达是增加的表达。用于增加核酸或基因、或基因产物的表达的方法在本领域有充分的文献记载，实例在定义部分中提供。

如上文所述，用于调节编码NUG多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入和表达编码NUG多肽的核酸；但是，也可以用其他公知的技术（包括但不限于T-DNA激活标签、TILLING、同源重组）来达到实施该方法的效应，即增强产量相关性状。这些技术的描述在定义部分中提供。

本发明还提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文定义的NUG多肽的任意核酸。

更具体而言，本发明提供用于产生具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括：

(i)在植物或植物细胞中引入和表达NUG多肽编码核酸或包含NUG多肽编码核酸的遗传构建体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养该植物细胞。

(i)的核酸可以是能够编码本文定义的NUG多肽的核酸的任一种。

在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞可以包括或不包括再生和/或生长至成熟。因此，在本发明的具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞可再生为转化植物。在另一具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞不可再生为转化植物，即不能用本领域已知的细胞培养技术再生为植物的细胞。虽然植物细胞一般具有全能性的特征，但一些植物细胞不能用来从该细胞再生或繁殖完整的植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是这类细胞。在另一实施方案中，本发明的植物细胞是不以自养方式维持自身的植物细胞。

可以将核酸直接引入植物细胞或引入植物自身（包括引入植物的组织、器官或任意其他部分）。根据本发明的优选特征，优选通过转化来将核酸引入植物或植物细胞。术语“转化”在本文“定义”部分中更详细地描述。

在一个实施方案中，本发明延及通过本文所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，及其所有植物部分和繁殖体。

本发明涵盖可通过本发明的方法获得的植物或其部分（包括种子）。植物或植物部分或植物细胞包含优选处于遗传构建体（如表达盒）中的编码上文定义的NUG多肽的核酸转基因。本发明进一步延及涵盖已通过任意前述方法产生的初级转化或转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代显示与本发明方法中的亲本所产生的那些相同的一种或多种基因型和/或表型特征。

在另一实施方案中，本发明延及含有本发明的表达盒、本发明的遗传构建体或编码NUG的核酸和/或上述NUG多肽的种子。

本发明还包括含有编码上文定义的NUG多肽的分离的核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。用于本发明方法的核酸、构建体、表达盒或载体的宿主植物基本上有利地是所有植物，其能够合成用于本发明方法的多肽。在具体实施方案中，本发明的植物细胞过表达本发明的核酸分子。

本发明的方法有利地可适用于任意植物，尤其是本文定义的任意植物。在本发明方法中尤其有用的植物包括隶属于超家族植物界（Viridiplantae）的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或青贮豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木。根据本发明的实施方案，植物可以为作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、三叶草、大豆、甜菜、糖用甜菜、向日葵、卡诺拉(canola)、苜蓿、油菜、亚麻籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。根据本发明的另一实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一实施方案，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦（spelt）、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱(milo)和燕麦。在具体实施方案中，用于本发明方法的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油籽油菜（包括卡诺拉）、甘蔗、糖用甜菜和苜蓿。有利地，本发明的方法比已知的方法更有效，因为本发明的植物与用于相当方法的对照植物相比具有增加的产量和/或对环境胁迫的耐受性。

本发明还延及植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎，该可收获部分含有编码NUG多肽的重组核酸。本发明还涉及衍生或产生自，优选直接衍生或产生自这种植物的可收获部分的产物，如干粒（dry pellets）、粉或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还包括用于制备产品的方法，其包括a)培养本发明的植物，和b)从或通过本发明的植物或其部分(包括种子)产生该产品。在另一实施方案中，该方法包括步骤a)培养本发明的植物，b)从该植物采集上文所述的可收获部分，和c)从或用本发明的植物的可收获部分产生该产品。

在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的产品是植物产品，例如但不限于食品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂、纤维、化妆品或药品。在另一实施方案中，该产生方法用来制备农产品，例如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等等。

还在另一实施方案中，本发明的多核苷酸或多肽包含在农产品中。在具体实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质序列可以用作产品标记，例如在通过本发明方法产生农产品时。这种标记可以用来鉴别通过有利的方法产生的产品，该方法不仅导致更高的加工效率，而且由于用于加工的植物材料和可收获部分的品质提高而导致产品质量提高。可以通过本领域已知的多种方法来检测这类标记，该方法例如但不限于用于核酸检测的基于PCR的方法，或用于蛋白质检测的基于抗体的方法。

本发明还涵盖在增强植物的任意前述产量相关性状中编码本文所述的NUG多肽的核酸的用途以及这些NUG多肽的用途。例如，可以在育种程序中使用编码本文所述的NUG多肽的核酸、或NUG多肽本身，其中鉴定可以与NUG多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。可以用该核酸/基因或该NUG多肽本身来定义分子标记。然后可以在育种程序中用此DNA或蛋白质标记来在本发明的方法中选择具有上文定义的增强的产量相关性状的植物。此外，NUG多肽编码核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。编码NUG多肽的核酸还可以用作探针来对包含其的基因进行遗传和物理作图，以及用作与那些基因连锁的性状的标记。这种信息可以在植物育种中使用，以培育具有所期望表型的品系。

2.NAC1和NAC5

根据本发明的第二方面，提供用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，其包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在植物中的表达。

在具体实施方案中，在植物生长在非生物胁迫条件下时，通过组织特异性启动子，优选通过根特异性启动子来驱动NAC1或NAC5编码核酸的表达。

在另一实施方案中，该增强的产量相关性状包括增加的种子产量和/或修饰的根构造。

根据本发明的另一方面，提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物的方法，其包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在生长在非生物胁迫条件下的植物中的表达，并可选地选择具有增强的产量相关性状的植物的步骤。

根据本发明的另一方面，提供用于在植物中赋予非生物胁迫耐受性的方法，其包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在植物中的表达。

在本发明关于NAC1和NAC5的背景中，对“用于本发明方法的蛋白质”的任意提及意指本文定义的NAC1或NAC5多肽。后文对“用于本发明方法的核酸”的任意提及意指能够编码NAC1或NAC5多肽的核酸。待引入植物（并因此用于实施本发明的方法）的核酸是编码现将描述的蛋白质类型的任意核酸，后文中还称为“NAC1核酸”或“NAC1基因”或“NAC5核酸”或“NAC5基因”。

本文定义的“NAC1多肽”或“NAC5多肽”指包含下文所述基序的任意一个或多个的任意多肽。

本文定义的“NAC1基因”或“NAC5基因”指编码本文定义的NAC1多肽或NAC5多肽的任意核酸。

基序I：KIDLDIIQELD，或按照递增的优选顺序与基序I的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序I优选K/P/R/G I/S/M D/A/E/Q L/I/V D I/V/F I Q/V/R/K E/D L/I/V D。

基序II：CKYGXGHGGDEQTEW，或按照递增的优选顺序与基序II的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序，其中‘X’表示任意氨基酸。

基序II优选C K/R Y/L/I G XXX G/Y/N D/E E Q/R T/N/S EW，其中‘X’表示任意氨基酸。

基序III：GWVVCRAFQKP，或按照递增的优选顺序与基序III的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序III优选GWVVCR A/V F X¹K X²，其中‘X¹’和‘X²’可以是任意氨基酸，优选X¹是Q/R/K，优选X²是P/R/K。

基序IV：PVPIIA，或按照递增的优选顺序与基序IV的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序IV优选A/P/S/N V/L/I/A P/S/D/V/Q V/I I A/T/G。

基序V：NGSRPN，或按照递增的优选顺序与基序V的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序V优选N G/S S/Q/A/V RP N/S。

基序VI：CRLYNKK，或按照递增的优选顺序与基序VI的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序VI优选C/Y R/K L/I Y/H/F N/K K K/N/C/S/T。

基序VII：NEWEKMQ，或按照递增的优选顺序与基序VII的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序VII优选N E/Q/T WEK M/V Q/R/K。

基序VIII：WGETRTPESE，或按照递增的优选顺序与基序VIII的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序VIII优选WGE T/A RTPES E/D。

基序IX：VPKKESMDDA，或按照递增的优选顺序与基序IX的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序IX优选V/L PK K/E E S/R/A/V M/V/A/Q/R D/E D/E/L A/G/D。

基序X：SYDDIQGMYS，或按照递增的优选顺序与基序X的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序X优选S L/Y DD L/I Q G/S L/M/P G/Y S/N。

基序XI：DSMPRLHADSSCSE，或按照递增的优选顺序与基序XI的序列具有至少50%、60%、70%、80%或90%序列同一性的基序。

基序XI优选DS M/V/I P R/K L/I/A H T/A/S D/E SS C/G SE。

基序I至XI的每一个可以在任意位置包含一个或多个保守氨基酸取代。

NAC1或NAC5多肽可以包含上文定义的基序中的至少1个或至少2个或至少3个或至少4个或至少5个或至少6个或至少7个或至少8个或至少9个或至少10个或至少11个。

存在于NAC1或NAC5多肽中的其他基序可以用MEME算法（Bailey和Elkan,Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,28-36页,AAAI Press,Menlo Park,California,1994）或用本领域已知的其他方法或工具来鉴定。

用于调节（优选增加）编码NAC1或NAC5多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入和表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸。

根据本发明的一个方面，提供用于相对于对照植物改善植物中的产量相关性状和/或修饰根构造的方法，其包括调节编码本文定义的NAC1或NAC5多肽的核酸在植物中的表达。

此外或备选地，NAC1或NAC5多肽按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸具有至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、 40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%总体序列同一性，条件是该同源蛋白质包含上文所列保守基序中的任意一个或多个。在具体实施方案中，NAC1多肽表示为SEQ ID NO:2。在具体实施方案中，NAC5多肽表示为SEQ ID NO:4。

总体序列同一性可以用全局比对算法，如GAP程序（GCG Wisconsin Package,Accelrys）中的Needleman Wunsch算法，优选以默认参数且优选以成熟蛋白质的序列（即不考虑分泌信号或转运肽）来确定。在一个实施方案中，通过在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的全长序列上比较多肽序列来确定序列同一性水平。

在另一实施方案中，通过将SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的一个或多个保守结构域或基序与其他NAC1和NAC5多肽中相应的保守结构域或基序相比较，来确定序列同一性水平。与总体序列同一性相比，在仅考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常将更高。优选地，NAC1或NAC5多肽中的基序按照递增的优选顺序与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15（基序I至XI）所示基序中的任意一个或多个具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。术语“结构域”、“标签序列”和“基序”如本文“定义”部分中所定义。

优选地，在用于构建系统发生树（如Ooka等,2003(DNA Research10,239-247)中给出的系统发生树）时，多肽序列与其他NAC1和NAC5家族成员而非与任意其他NAC聚类。

在按照本文实施例部分中所列的本发明方法在稻中表达时，编码 NAC1和NAC5多肽的核酸使植物在非生物胁迫条件下生长时具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量和/或修饰的根构造。编码NAC1和NAC5多肽的核酸序列的另一功能是赋予合成NAC1和NAC5的信息，在本发明的这种核酸序列在活植物细胞中转录和翻译时，其增加本文所述的产量或产量相关性状。

通过用SEQ ID NO:1所示的编码SEQ ID NO:2的多肽序列的核酸序列转化植物，以及通过用SEQ ID NO:3所示的编码SEQ ID NO:4的多肽的核酸序列转化植物来说明本发明。但是，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地用本文定义的NAC1编码核酸或NAC5编码核酸或NAC1多肽或NAC5多肽来实施。本文所用的术语“NAC1”或“NAC1多肽”还包括下文定义的SEQ ID NO:2的同源物。本文所用的术语“NAC5”或“NAC5多肽”还包括下文定义的SEQ ID NO:4的同源物。

编码NAC1和NAC5多肽的核酸的实例在本文表C中给出。这类核酸用于实施本发明的方法。实施例部分表C中给出的氨基酸序列是分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的NAC1和NAC5多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。其他直向同源物和旁系同源物可以容易地通过进行定义部分中所述的所谓交互blast检索来鉴定；其中查询序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，二次BLAST（反向BLAST）将针对稻序列。

核酸变体也可以用于实施本发明的方法。这类变体的实例包括编码本文表C中给出的氨基酸序列中任一个的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文所定义。还用于本发明方法的是编码实施例部分表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。用于本发明方法的同源物和衍生物具有与其所衍生自的未修饰蛋白质形式基本上相同的生物学活性和功能活性。用于实施本发明方法的其他变体是其中优化了密码子选择或其中去除了miRNA靶位点的变体。

用于实施本发明方法的其他核酸变体包括编码NAC1和NAC5多肽的核酸的部分、与编码NAC1或NAC5多肽的核酸杂交的核酸、编码NAC1或NAC5多肽的核酸的剪接变体、编码NAC1或NAC5多肽的核酸的等位基因变体及通过基因改组获得的编码NAC1或NAC5多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组如本文所述。

编码NAC1或NAC5多肽的核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文表C中给出的蛋白质中任一种的核酸，或编码表C中给出的氨基酸序列中任一种的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。

用于本发明方法的部分编码本文定义的NAC1或NAC5多肽或至少其部分，具有与本文表C中给出且由该部分所衍生自的核酸编码的氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该部分是编码表C中给出的蛋白质中任一种的核酸的部分，或者是编码表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选地，该部分长度为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个连续核苷酸，该连续核苷酸属于本文表C中给出的核酸序列中的任一个，或编码表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核酸的部分。优选地，该部分编码氨基酸序列的片段，该氨基酸序列包含基序I至XI（SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15）中的一个或多个，和/或具有与NAC1或NAC5相同的生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性。

用于本发明方法的另一核酸变体是能够在严格性降低或中等严格的条件下，优选在严格条件下，与编码本文定义的NAC1或NAC5多肽的核酸的互补序列，或与本文定义的部分杂交的核酸。根据本发明，提供用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达能够与编码本文表C中给出的蛋白质中任一种的核酸，或与编码表C中给出的核酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。

用于本发明方法的杂交序列编码本文定义的NAC1或NAC5多肽，该NAC1或NAC5多肽具有与表C中给出的、由与该杂交序列杂交的核酸编码的氨基酸序列基本上相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与编码本文表C中给出的蛋白质中任一种的核酸的互补序列，或与这些序列中任一个的部分杂交，部分如本文所定义，或者该杂交序列能够与编码表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选地，该杂交序列能够与编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的多肽或二者中任一个的部分的核酸的互补序列杂交。在一个实施方案中，该杂交条件是本文定义的中等严格条件，优选高度严格条件。

优选地，该杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列包含基序I至XI（SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15）中的一个或多个，和/或具有与NAC1或NAC5相同的生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高序列同一性。

在另一实施方案中，提供用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文表C中给出的蛋白质中任一种的核酸的任一种的剪接变体或等位基因变体，或编码本文表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体或等位基因变体。

优选的剪接变体或等位基因变体是编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核酸的剪接变体或等位基因变体，或编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 4的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体或等位基因变体。优选地，由该剪接变体或等位基因变体编码的氨基酸序列包含基序I至XI（SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15）中的一个或多个，和/或具有与NAC1或NAC5相同的生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性。

根据另一实施方案，提供用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文表C中给出的蛋白质中任一种的核酸的等位基因变体或剪接变体，或包括在植物中引入和表达编码本文表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因变体或剪接变体。

由用于本发明方法的等位基因变体或剪接变体编码的多肽具有与SEQ ID NO:2的NAC1多肽或SEQ ID NO:5的NAC5多肽或本文表C中所示的氨基酸中的任一个相同的生物学活性。等位基因变体存在于自然界中，且这些天然等位基因的使用包含在本发明方法的范围之内。优选地，该等位基因变体或剪接变体是编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核酸的变体，或编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的直向同源物或旁系同源物的核酸的变体。优选地，由该等位基因变体或剪接变体编码的氨基酸序列包含基序I至XI（SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15）中的一个或多个，和/或具有与NAC1或NAC5相同的生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性。

还在另一实施方案中，提供用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文表C中给出的蛋白质中任一种的核酸的变体，或包括在植物中引入和表达编码表C中给出的氨基酸序列中任一个的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，该变体核酸通过基因改组获得。

优选地，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列包含基序 I至XI（SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15）中的一个或多个，和/或具有与NAC1或NAC5相同的生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性。

此外，核酸变体还可以通过位点定向诱变获得。可用几种方法来达到位点定向诱变，最常用的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。因一个或几个氨基酸（本文定义的取代、插入和/或缺失）而不同于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的序列的NCG多肽可以同等地用于在本发明的方法和构建体和植物中增加植物的产量。

编码NAC1或NAC5多肽的核酸可以衍生自任意天然或人工来源。该核酸可以通过有意的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰自其天然形式。优选地，NAC1或NAC5多肽编码核酸来自植物，进一步优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选该核酸来自稻。

在另一实施方案中，本发明延及含有用于本发明方法的核酸序列的重组染色体DNA，其中该核酸由于重组方法而存在于染色体DNA中，但不存在于其天然遗传环境中。在另一实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。

本发明方法的实施产生具有增强的产量相关性状的植物。具体而言，本发明方法的实施产生具有增加的种子或谷粒产量和/或修饰的根构造的植物。术语“种子产量”在本文“定义”部分中更详细地描述。本文定义的术语“修饰的根构造”优选包括以下任意一项或多项的增加或改变或由以下任意一项或多项的增加或改变引起：鲜重或干重形式的根生物量增加、根数目增加、根直径增加、根增大、中柱增大、通气组织增大、通气组织形成增加、皮层增大、皮层细胞增大、木质部增大、分枝改变、穿透能力改善、表皮增大、根冠比增加。

因此，本发明提供用于相对于对照植物增加种子产量和/或修饰根构造的方法，该方法包括调节编码NAC1和NAC5多肽的核酸在生长在非生物胁迫条件下的植物中的表达。

本发明还提供用于在植物中相对于对照植物提高非生物胁迫耐受性的方法，该方法包括调节编码NAC1和NAC5多肽的核酸在生长在非生物胁迫条件下的植物中的表达。

根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生在非生物胁迫条件下生长时相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供用于增加植物的生长速率的方法，该方法包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在生长在非生物胁迫条件下的植物中的表达。

相对于生长在相当条件下的对照植物，在处于其营养生长阶段在植物（该植物生长在非胁迫条件下或轻度干旱条件下）中实施本发明的方法产生增强的产量相关性状和/或修饰的根构造。因此，根据本发明，提供用于在处于其营养生长期且生长在非胁迫条件下或轻度干旱条件下的植物中增强产量相关性状和/或修饰根构造的方法，该方法包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在该植物中的表达。

本发明方法的实施产生在干旱条件下生长时相对于生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在干旱条件下的植物中增强产量相关性状和/或修饰根构造的方法，该方法包括在组织特异性启动子，优选根特异性启动子的控制下调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在植物中的表达。

在正常或非胁迫生长条件下，在组成型启动子的控制下表达时，且在根特异性启动子的控制下表达时，表达NAC1编码核酸序列的稻植物产生增加的种子产量。相比之下，在干旱条件下，在根特异性启动子的控制下表达NAC1编码核酸的植物中，获得了显著提高的种子水平或谷粒产量。相反，与非转基因对照相比，生长在干旱胁迫下，且在组成型启动子控制下表达NAC1编码核酸序列的植物的种子或谷粒产量无明显差异。

在NAC5的情况下，在根特异性启动子的控制下表达NAC5编码核酸的植物和在组成型启动子的控制下表达NAC5编码核酸的植物在营养生长期显示提高的对干旱和高盐度的耐受性。在正常、非胁迫生长条件下，这些植物显示增加的种子或谷粒产量。但是，在干旱条件下，在根特异性启动子控制下表达NAC5的植物显示显著增加的种子或谷粒产量，而在组成型启动子控制下表达NAC5的植物与非转基因对照植物相比显示相似或降低的产量。

本发明方法的实施产生在养分不足条件下，尤其是在氮缺乏条件下生长时相对于生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在养分缺乏条件下的植物中增强产量相关性状和/或修饰根构造的方法，该方法包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在植物中的表达。

本发明方法的实施产生在盐胁迫条件下生长时相对于生长在相当条件下的对照植物具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造的植物。因此，根据本发明，提供用于在生长在盐胁迫条件下的植物中增强产量相关性状和/或修饰根构造的方法，该方法包括调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸在植物中的表达。

本发明还提供遗传构建体和载体，以便于在植物中引入和/或表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸。基因构建体可以插入载体，该载体可以是市售的，适合用于转化入植物或宿主细胞，且适合用于在转化细胞中表达目的基因。本发明还提供本文定义的基因构建体在本发明方法中的用途。

更具体而言，本发明提供构建体，其包含：

(a)编码上文定义的NAC1或NAC5多肽的核酸；

(c)转录终止序列。

优选地，编码NAC1或NAC5多肽的核酸如上文所定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文所定义。

在一个实施方案中，在将本发明的遗传构建体引入植物时，它赋予该植物增加的产量或一种或多种产量相关性状，该植物表达包含在该遗传构建体中的编码NAC1或NAC5多肽的核酸。在另一实施方案中，本发明的遗传构建体赋予包含已引入该构建体的植物细胞的植物增加的产量或一种或多种产量相关性状，该植物细胞表达包含在该遗传构建体中的编码NAC1或NAC5的核酸。

有利地，可以用任意类型的（天然或合成的）启动子来在植物的营养生长期驱动核酸序列的表达。优选地，该启动子是植物来源的。多种启动子类型的定义见本文“定义”部分。

用于本发明方法的尤其优选的启动子是根特异性启动子。根特异性启动子优选RCc3启动子(Plant Mol Biol.1995Jan;27(2):237-48)，或具有基本上相同的强度且具有基本上相同的表达模式的启动子（功能上等同的启动子），进一步优选地，该RCc3启动子来自稻，更优选地，该RCc3启动子表示为基本上类似于SEQ ID NO:21的核酸序列，最优选地，该启动子表示为SEQ ID NO:21。也可以用于实施本发明方法的其他根特异性启动子的实例在“定义”部分的表2b中显示。

尤其是在植物的营养生长期，组成型启动子也可以用于生长在胁迫或非胁迫条件下的植物中。组成型启动子也可以用于生长在基本上非胁迫的条件下且表达NAC1或NAC5编码核酸的植物中。组成型启动子优选中等强度的遍在组成型启动子。更优选地，它是植物衍生启动子，例如植物染色体来源的启动子，如GOS2启动子，或具有基本上相同的强度且具有基本上相同的表达模式的启动子（功能上等同的启动子），更优选地，该启动子是来自稻的GOS2启动子。进一步优选地，该组成型启动子表示为基本上类似于SEQ ID NO:20的核酸序列，最优选地，该组成型启动子如SEQ ID NO:20所示。组成型启动子的其他实例见本文“定义”部分。

应明确，本发明的适用性不限于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的NAC1或NAC5多肽编码核酸，本发明的适用性也不限于用于驱动NAC1或NAC5在植物中表达的稻GOS2或RCc3启动子。

可选地，一个或多个终止子序列可以用于引入植物的构建体。本领域技术人员知道可以适合用于实施本发明的终止子序列。

优选地，该构建体包含含有RCc3启动子的表达盒，该RCc3启动子与编码NAC1或NAC5多肽的核酸有效连接。更优选地，该构建体还包含与NAC1或NAC5编码序列的3’端连接的玉米醇溶蛋白终止子（t-玉米醇溶蛋白）。此外，引入植物的构建体上可以存在一个或多个编码选择标记的序列。

如上文所述，用于调节编码NAC1或NAC5多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中引入和表达编码NAC1或NAC5多肽的核酸；但是，也可以用其他公知的技术（包括但不限于T-DNA激活标签、TILLING、同源重组）来达到实施该方法的效应，即增强产量相关性状和/或修饰根构造。这些技术的描述在定义部分中提供。

本发明还提供用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状和/或修饰的根构造的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达编码本文定义的NAC1或NAC5多肽的任意核酸。

更具体而言，本发明提供用于产生具有增强的产量相关性状，尤其是增加的种子产量和/或修饰的根构造的转基因植物的方法，该方法包括：

(i)在植物或植物细胞中引入和表达NAC1或NAC5多肽编码核酸或包含NAC1或NAC5多肽编码核酸的遗传构建体；和

(ii)在非生物胁迫条件下培养该植物细胞。

(i)的核酸可以是能够编码本文定义的NAC1或NAC5多肽的核酸的任一种。

培养该植物细胞可以包括或不包括再生和/或生长至成熟。因此，在本发明的具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞可再生为转化植物。在另一具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞不可再生为转化植物，即不能用本领域已知的细胞培养技术再生为植物的细胞。虽然植物细胞一般具有全能性的特征，但一些植物细胞不能用来从该细胞再生或繁殖完整的植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是这类细胞。在另一实施方案中，本发明的植物细胞是不以自养方式维持自身的植物细胞。

本发明涵盖可通过本发明的方法获得的植物或其部分（包括种子）。植物或植物部分或植物细胞包含优选处于遗传构建体（如表达盒）中的编码上文定义的NAC1或NAC5多肽的核酸转基因。本发明进一步延及涵盖已通过任意前述方法产生的初级转化或转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代显示与本发明方法中的亲本所产生的那些相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。

在另一实施方案中，本发明延及含有本发明的表达盒、本发明的遗传构建体或编码NAC1或NAC5的核酸和/或上述NAC1或NAC5多肽的种子。

本发明还包括含有编码上文定义的NAC1或NAC5多肽的分离的核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。用于本发明方法的核酸、构建体、表达盒或载体的宿主植物基本上有利地是所有植物，其能够合成用于本发明方法的多肽。在具体实施方案中，本发明的植物细胞过表达本发明的核酸分子。

本发明的方法有利地可适用于任意植物，尤其是本文定义的任意植物。在本发明方法中尤其有用的植物包括隶属于超家族植物界的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或青贮豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木。根据本发明的实施方案，植物可以为作物植物。作物植物的实例包括但不限于菊苣、胡萝卜、木薯、三叶草、大豆、甜菜、糖用甜菜、向日葵、卡诺拉、苜蓿、油菜、亚麻籽、棉花、番茄、马铃薯和烟草。根据本发明的另一实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。根据本发明的另一实施方案，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱和燕麦。在具体实施方案中，用于本发明方法的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油籽油菜（包括卡诺拉）、甘蔗、糖用甜菜和苜蓿。有利地，本发明的方法比已知的方法更有效，因为本发明的植物与用于相当方法的对照植物相比具有增加的产量和/或对环境胁迫的耐受性。

本发明还延及植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎，该可收获部分含有编码NAC1或NAC5多肽的重组核酸。本发明还涉及衍生或产生自，优选直接衍生或产生自这种植物的可收获部分的产物，如干粒、粉或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还涵盖在增强植物的任意前述产量相关性状或修饰根构造中，编码本文所述的NAC1或NAC5多肽的核酸的用途，以及这些NAC1或NAC5多肽的用途。例如，可以在育种程序中使用编码本文所述的NAC1或NAC5多肽的核酸、或NAC1或NAC5多肽本身，其中鉴定可以与NAC1或NAC5多肽编码基因遗传连锁的DNA标记。可以用该核酸/基因或该NAC1或NAC5多肽本身来定义分子标记。然后可以在育种程序中用此DNA或蛋白质标记来在本发明的方法中选择具有本文定义的增强的产量相关性状或修饰的根构造的植物。此外，NAC1或NAC5多肽编码核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。编码NAC1或NAC5多肽的核酸还可以用作探针来对包含其的基因进行遗传和物理作图，以及用作与那些基因连锁的性状的标记。这种信息可以在植物育种中使用，以培育具有所期望表型的品系。

此外，本发明涉及以下具体实施方案。

A：用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，其包括调节编码表A或表B中给出的多肽中任一种或其同源物的NAC上调基因（NUG）在植物中的表达。

B：用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状和/或修饰根构造的方法，其包括调节编码NAC1或NAC5多肽或其同源物的核酸在植物中的表达，该核酸与组织特异性启动子有效连接。

C：实施方案A或实施方案B的方法，其中该调节的表达通过在植物中引入和表达编码NUG、NAC1或NAC5多肽或其同源物的核酸来实现。

D：实施方案A的方法，其中该增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量和/或生物量。

E：实施方案B的方法，其中该增强的产量相关性状包括增加的种子或谷粒产量，和/或其中该修饰的根构造包括以下任意一项或多项的增加或改变或由以下任意一项或多项的增加或改变引起：鲜重或干重形式的根生物量增加、根数目增加、根直径增加、根增大、中柱增大、通气组织增大、通气组织形成增加、皮层增大、皮层细胞增大、木质部增大、分枝改变、穿透能力改善、表皮增大、根冠比增加。

F：实施方案A或C至E中任一个的方法，其中该增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。

G：实施方案A至F中任一个的方法，其中该增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得。

H：实施方案B至G中任一个的方法，其中该NAC1或NAC5多肽包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:15所示的基序中的一个或多个。

I：实施方案A至H中任一个的方法，其中该编码NUG、NAC1或NAC5的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，进一步优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。

J：实施方案A至I中任一个的方法，其中该编码NUG、NAC1或NAC5的核酸编码表A、表B或表C中所列的多肽中的任一种，或是这种核酸的部分，或能够与这种核酸杂交的核酸。

K：实施方案A至J中任一个的方法，其中该核酸序列编码表A、表B或表C中给出的多肽中任一种的直向同源物或旁系同源物。

L：实施方案A至K中任一个的方法，其中该核酸编码SEQ ID NO:2所示的NAC1多肽。

M：实施方案A至L中任一个的方法，其中该核酸编码SEQ ID NO:4所示的NAC5多肽。

N：实施方案A和C至M中任一个的方法，其中该核酸有效连接至植物来源的组成型启动子，优选植物来源的中等强度组成型启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

O：实施方案B至M中任一个的方法，其中该组织特异性启动子是根特异性启动子，优选RCc3启动子，进一步优选来自稻的RCc3启动子。

P：可通过实施方案A至O中任一个的方法获得的植物，或其部分，或植物细胞，其中该植物、植物部分或植物细胞包含编码表A、表B或表C中给出的NUG、NAC1或NAC5多肽或其同源物、旁系同源物或直向同源物的重组核酸。

Q：构建体，其包含：

(i)编码表A、表B或表C中给出的NUG、NAC1或NAC5或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸;

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和可选的

(iii)转录终止序列。

R：实施方案Q的构建体，其中该核酸有效连接至植物来源的组成型启动子，优选植物来源的中等强度组成型启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

S：实施方案Q的构建体，其中该核酸有效连接至组织特异性启动子，优选根特异性启动子，优选RCc3启动子，进一步优选来自稻的RCc3启动子。

T：实施方案Q至S中任一个的构建体的用途，用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的种子产量和/或增加的生物量和/或修饰的根构造的植物的方法。

U：植物、植物部分或植物细胞，其用实施方案Q至S中任一个的构建体转化。

V：用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加和/或增加的种子产量和/或增加的生物量的转基因植物的方法，其包括：

(i)在植物细胞或植物中引入和表达编码表A或表B中给出的NUG多肽或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养(i)的该植物细胞或植物；或

(iii)在植物细胞或植物中引入和表达编码表C中给出的NAC1或 NAC5多肽或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸，该核酸与组织特异性启动子有效连接；和

(iv)在非生物胁迫条件下培养来自步骤(iii)的该植物细胞或植物，其中该植物具有增加的种子产量和修饰的根构造。

W：相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物，其源自编码表A、表B或表C中给出的NUG、NAC1或NAC5多肽或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸的调节表达。

X：实施方案P、U或W的转基因植物或从其衍生的转基因植物细胞，其中该植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿；或单子叶植物，如甘蔗；或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱或燕麦。

Y：实施方案X的植物的可收获部分，其中该可收获部分优选根生物量和/或种子。

Z：产品，其衍生自实施方案X的植物和/或实施方案Y的植物的可收获部分。

A’：编码表A、表B或表C中给出的NUG、NAC1或NAC5多肽或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸的用途，用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状。

B’：用于制备产品的方法，其包括培养实施方案P、U、W或X的植物，并从或通过该植物或其部分（包括种子）产生该产品的步骤。

定义

以下定义将在本申请通篇中使用。本申请中的节题目和标题仅是为了方便和引用目的，而不应以任何方式影响本申请的含义或解释。在本申请范围内使用的技术术语和表述通常将被赋予植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的相关领域中通常适用于它们的含义。以下术语定义全都适用于本申请的全部内容。与属性或值有关的“基本上”、“约”、“大约”等术语尤其还分别精确定义该属性或精确定义该值。在给定的数值或范围的背景中，术语“约”尤其涉及该给定的值或范围的20%之内、10% 之内或5%之内的值或范围。

肽/蛋白质

除非文中另有提及，术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在文中互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸多聚体。

多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中互换使用，是指任意长度的无支链形式的多聚核苷酸，该核苷酸或者为核糖核苷酸或者为脱氧核糖核苷酸或者为两者的组合。

同源物

蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其源自的未修饰蛋白质相似的生物活性和功能活性。

直向同源物和旁系同源物是两种不同形式的同源物，且涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其起源自祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其通过物种形成起源，并且也源自于共同的祖先基因。

“缺失”是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。

“插入”是指在蛋白质中的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

“取代”是指蛋白质中的氨基酸用具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替换。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以发生成簇取代，并且可以为1到10个氨基酸。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域众所周知(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。

表1：保守氨基酸取代的实例

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile;Val
Arg	Lys	Lys	Arg;Gln
				Asn	Gln;His	Met	Leu;Ile
Asp	Glu	Phe	Met;Leu;Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr;Gly
Cys	Ser	Thr	Ser;Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp;Phe
				His	Asn;Gln	Val	Ile;Leu
Ile	Leu,Val

可通过本领域已知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域已知的。例如，本领域的技术人员熟知在DNA中的预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB,Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案(见Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989)及年度更新资料)。

衍生物

“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与天然存在形式的蛋白质(如目的蛋白质)的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然存在的氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然存在的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与天然存在形式的多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然存在的改变的(糖基化、酰基化、异戊二烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然存在的改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报道分子或其他配体，如与之结合以便于衍生物检测的报道分子，以及相对于天然存在的蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(关于标签肽的综述，参见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)。

结构域、基序/共有序列/标签序列

术语“结构域”是指在进化相关蛋白质序列的比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可以因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”因其在所比对的家族蛋白质同源物序列中高度保守而得以鉴定，它们可以用作标识符来确定任意所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。

术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是高度保守的结构域部分，但也可以仅仅包括部分结构域，或者位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。

存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864;Letunic等(2002)Nucleic Acids Res30,242-244)、InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94;第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology)Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编辑,53-61页,AAAI Press,Menlo Park;Hulo等,Nucl.Acids.Res.32: D134-D137,(2004))或者Pfam(Bateman等,Nucleic Acids Research30(1):276-280(2002)。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res31:3784-3788(2003))。也可以利用常规技术如通过序列比对来鉴定结构域或基序。

为比较而进行序列比对的方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)的算法来寻找可以使匹配数最大化且空位数最小化的两序列间的全局比对(即跨越全序列)。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215:403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等BMC Bioinformatics.2003年7月10日4:29.MatGAT:an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于本领域技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序，采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者针对选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的（Smith TF，Waterman MS（1981）J.Mol.Biol147(1);195-7）。

交互BLAST

通常，这涉及以查询序列(例如，利用实施例部分的表A中所列的任一序列)针对任意序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的一次BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以可选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，然后反向BLAST理想地导致查询序列处于最高命中事件之列，则鉴定出了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不来自查询序列源自的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列处于最高命中事件之列，则鉴定出了直向同源物。

分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。

杂交

本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的两核酸都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠或任意其他树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其他二级结构。

术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，对于特定序列而言，在确定的离子强度和pH值下，低严格条件选择为比热解链NCGnt(T_m)低大约30℃。中等严格条件为温度比T_m低20℃，而高严格条件为温度比 T_m低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这类核酸分子。

T_m是在确定的离子强度和pH值下，50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。T_m取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于T_m值大约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用可见(对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50%甲酰胺能够使杂交在30到45℃进行，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点的碱基错配使T_m值下降约1℃。取决于杂交体的类型，T_m值可以利用下列公式计算：

1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984):

Tm=81.5℃＋16.6×log₁₀[Na⁺]^a＋0.41×%[G/C^b]－500×[L^c]^-1－0.61×%甲酰胺

2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体:

Tm=79.8℃＋18.5(log₁₀[Na⁺]^a)＋0.58(%G/C^b)＋11.8(%G/C^b)²-820/L^c

3)寡DNA或寡RNA^d杂交体:

<20个核苷酸:Tm=2(l_n)

20-35个核苷酸:Tm=22＋1.46(l_n)

^a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。

^b仅对于在30%到75%范围内的%GC精确。

^c L=双链体的碱基对长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，=引物的有效长度=2×(G/C数)＋(A/T数)。

非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一种来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下条件之一来进行系列杂交：(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃降至42℃)，或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50%降至0%)。熟练的技术人员知晓可以在杂交过程中改变，并将保持或者改变严格条件的多种参数。

除杂交条件外，杂交特异性通常还取决于杂交后洗涤的功能。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景信号的两倍的信号。通常，适用于核酸杂交测定或基因扩增检测方法的严格条件如上文所示。也可以选择更高或更低的严格条件。熟练的技术人员知晓可以在洗涤过程中改变，并将保持或者改变严格条件的多种参数。

例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在1×SSC中于65℃杂交或者在1×SSC和50%甲酰胺中于42℃杂交，接着在0.3×SSC中于65℃洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4×SSC中于50℃杂交或者在6×SSC和50%甲酰胺中于40℃杂交，接着在2×SSC中于50℃洗涤。杂交体的长度是针对杂交核酸预期的长度。当已知序列的核酸进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包含5×Denhardt’s试剂、0.5-1.0%SDS、100μg/ml片段化的变性鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠。

为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,N.Y.(1989及年度更新资料)。

剪接变体

本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这类变体将是基本上保持了蛋白质的生物活性的变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来达到。这类剪接变体可以是天然的或者可以是人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics6:25)。

等位基因变体

“等位基因”或“等位基因变体”为处于相同的染色体位置上的给定基因的备选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体的天然存在的多态性品系中形成最大的一组序列变体。

内源基因

本文述及的“内源”基因不仅指以其天然形式(即不存在任何人为干预)见于植物中的所讨论的基因，而且指随后(重新)引入到植物中的分离形式的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以发生转基因表达的大幅下降和/或内源基因表达的大幅下降。分离的基因可以从生物体分离，或者可以是人工例如通过化学合成制备的。

基因改组/定向进化

“基因改组”或“定向进化”为重复DNA改组，继之适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰的生物活性的蛋白质的核酸变体或其部分(Castle等(2004)Science304(5674):1151-4;美国专利5,811,238和6,395,547)。

构建体

能够在宿主细胞中复制，并用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物的人工DNA（如但不限于质粒或病毒DNA）。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli)或土壤杆菌属(Agrobacterium)物种细胞)、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌细胞或植物细胞的任意细胞。熟练的技术人员知晓为了成功转化、选择和繁殖含有目的序列的宿主细胞而必须存在于遗传构建体上的遗传元件。将目的序列与本文所述的一个或多个控制序列（至少与启动子）有效连接。另外的调控元件可以包括转录以及翻译的增强子。本领域技术人员将知晓可以适合用于进行本发明的终止子和增强子的序列。如定义部分中所述，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其他控制序列（除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外）可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。

本发明的遗传构建体可以还包含对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或黏粒分子)维持在细菌细胞中的情况。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸的转基因植物，有利的是使用标记基因(或报道基因)。因此，遗传构建体可以可选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。标记基因一旦不再需要，可以从转基因细胞中除去或切除。进行标记去除的技术为本领域已知，有用的技术在上文“定义”部分中有描述。

调控元件/控制序列/启动子

术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，按广义来理解，指能够实现与之连接的序列表达的调控核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合，由此指导有效连接的核酸的转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的精确转录起始所必需的TATA盒)，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语 “调控元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。

“植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调控元件。因此，植物启动子无需为植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，来源于攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以来源于植物细胞，例如，来源于用欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这同样适用于其他“植物”调控信号，例如“植物”终止子。位于用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不会干扰启动子、可读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外还有可能通过修饰启动子的序列来增加其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须如上文所述的那样，有效连接至或者包含适宜的启动子，该启动子将在正确的NCGnt时间点以所需的空间表达模式表达该基因。

为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将启动子与报道基因有效连接，并测定该报道基因在植物的多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。众所周知的适宜报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。然后可以将该启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)的启动子强度和/或表达模式相比较。备选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹结合放射自显影图的光密度测量分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等,1996Genome Methods6:986-994)，通过定量mRNA水平或者通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较来测定启动子强度。通常，“弱启动子”旨在表示驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”旨在表示每个细胞大约1/10,000个转录物到大约1/100,000个转录物、到大约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以高水平表达，或者说以每个细胞大约1/10个转录物到大约1/100个转录物、到大约1/1000个转录物的水平表达。通常，“中等强度启动子”旨在表示驱动编码序列以低于强启动子的水平、尤其是以在所有情况下均低于35S CaMV启动子控制下获得的水平的水平表达的启动子。

有效连接

本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够起始目的基因的转录。

组成型启动子

“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必是所有阶段，并且在大多数环境条件下在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的实例。

表2a：组成型启动子的实例

遍在启动子

“遍在启动子”基本上在生物体的所有组织或细胞中都有活性。

发育调控型启动子

“发育调控型启动子”在某些发育阶段或在经历发育改变的植物部分中有活性。

诱导型启动子

“诱导型启动子”响应化学(有关综述参见Gatz1997,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89-108)、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始；或者可以是“胁迫诱导型”，即在植物接触多种胁迫条件时激活；或者是“病原体诱导型”，即在植物接触多种病原体时激活。

器官特异性/组织特异性启动子

“器官特异性”或“组织特异性”的启动子是能够在某些器官或组织(如叶、根、种子等)中优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中具有转录活性的启动子，基本上排除了任意其他植物部分，但仍允许在这些其他植物部分中的任意渗漏表达。能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在本文中称为“细胞特异性”启动子。

根特异性启动子的实例列于下表2b中：

表2b：根特异性启动子的实例

“种子特异性启动子”主要在种子组织中但不必仅在种子组织中(渗漏表达的情况下)具有转录活性。种子特异性启动子可以在种子发育和/或萌发期间具有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉层/胚特异性的。种子特异性启动子（胚乳/糊粉层/胚特异性的）的实例显示于下表2c至表2f中。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol. J.2,113-125,2004)中给出，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。

表2c：种子特异性启动子的实例

表2d:胚乳特异性启动子的实例

表2e:胚特异性启动子的实例

基因来源	参考文献
		稻OSH1	Sato等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:8117-8122,1996
KNOX	Postma-Haarsma等,Plant Mol.Biol.39:257-71,1999
		PRO0151	WO2004/070039
PRO0175	WO2004/070039
		PRO005	WO2004/070039
PRO0095	WO2004/070039

表2f:糊粉特异性启动子的实例

本文中定义的“绿色组织特异性启动子”是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，基本上排除了任意其他植物部分，但仍允许在这些其他植物部分中的任意渗漏表达。

可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例显示于下表2g中。

表2g：绿色组织特异性启动子的实例

组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中具有转录活性，基本上排除了任意其他植物部分，但仍允许在这些其他植物部分中的任意渗漏表达。可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例显示于下表2h中。

表2h：分生组织特异性启动子的实例

终止子

术语“终止子”包括这样的控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，发送初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其他植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或备选地源自另一植物基因、或次优选地源自任何其他真核基因。

可选择标记(基因)/报道基因

“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报道基因”包括赋予细胞表型的任意基因，其中该表型在细胞中的表达便于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因通过一系列不同的原理使得能够鉴定核酸分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性、引入新的代谢性状或允许可视选择的标记。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因（例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予抗例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因）、赋予除草剂抗性的基因（例如提供抗Basta抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予抗例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲抗性的基因）、或者提供代谢性状的基因（如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或有关木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性）。可视标记基因的表达导致形成颜色（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal）、发光（如萤光素/萤光素酶系统）或萦光（绿色萦光蛋白GFP及其衍生物）。这仅仅是一小部分可能的标记的名单。技术人员熟悉此类标记。取决于生物体和选择方法，优选不同的标记。

已知对于核酸在植物细胞中的稳定或瞬时整合，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，仅少数细胞可以摄入该外来DNA，以及，如果期望的话，整合进其基因组。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记可以在例如突变体中使用，该突变体中原有的这些基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸分子可与编码本发明多肽的或用于本发明方法的序列包含在同一个载体中，或者在分开的载体中引入宿主细胞。已经稳定转染了所引入的核酸的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。

由于一旦成功引入了核酸后将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明用于引入核酸的方法有利地利用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法利用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体接收，或者在植物的情况下含有(高达40%或以上的转化体)，两个载体。在农杆菌转化的情况下，转化体通常只接收载体的一部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合在转座子中的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体来瞬时或稳定转化转化体。在一些情况下(约10%)，一旦成功进行了转化，转座子会跳离宿主细胞基因组并丢失。在另外一些情况下，转座子会跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交来消除标记基因。在微生物学领域，已经研发了使得可能或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于所谓的重组系统；其优势在于可以免除杂交消除。最著名的这类系统是称为Cre/lox系统的系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦转化成功后，其会因重组酶的表达而得以切除。其他重组系统有 HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan等,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

转基因的/转基因/重组

出于本发明的目的，就例如本发明的核酸序列、含有该核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用该核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指所有这些构建体都通过重组方法产生，其中：

(a)编码用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)有效连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)(a)和(b)。

不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可能采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为指在原始植物中天然的基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境至少位于核酸序列的一侧，长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间的天然存在的组合——经非天然的合成（“人工”）方法例如诱变处理而被修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述在例如，US5,565,350或WO00/15815中。

因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为指：在该植物的基因组中，本发明方法中所用的核酸不存在于该植物的基因组上，

或不源于该植物的基因组，或存在于该植物的基因组上但不位于该植物的基因组中的天然基因座上，其中该核酸可能进行同源或异源表达。不过，

正如所提到的那样，转基因也表示：尽管在植物基因组中根据本发明的或本发明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是该序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选理解为表示：根据本发明的核酸在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。

应进一步指出，在本发明的上下文中，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在一些情况下可以分别被视为“重组核酸”或“重组多肽”的同义词，指不位于其天然遗传环境中和/或已通过重组方法修饰的核酸或多肽。

调节

与表达或基因表达相关联时，术语“调节”是指与对照植物相比，该基因表达的表达水平被改变的过程，该表达水平可以增加或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA（rRNA、tRNA）或随后进行翻译的mRNA的任何类型的表达。出于本发明的目的，原始未调节的表达还可以是不存在任何表达。术语“调节活性”应理解为指，可以导致植物的产量增加和/或生长增加的本发明核酸序列或编码蛋白质的任何表达改变。表达可以从零（不存在或不可测量的表达）增加到一定量，或可以从一定量降低到不可测量的小量或零。

表达

术语“表达”或“基因表达”是指特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别地是指基因(一个或多个)或基因构建体至结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的转录，有或无后者至蛋白质的随后翻译。该过程包括DNA的转录和所获得的mRNA产物的加工。

增加的表达/过表达

本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。出于本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即不存在表达或不可测量的表达。

增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，且包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调编码目的多肽的核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，在体内改变内源启动子(见Kmiec,US5,565,350;Zarling等,WO9322443)，或者可以将分离的启动子在相对于本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。

如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其他植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或备选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其他真核基因。

也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。

降低的表达

本文述及“降低的表达”或者表达“减小或基本上消除”应理解为表示，内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。该减小或基本上消除按照递增的优选顺序为，与对照植物相比，减小至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%、99%或更多。

为减小或基本上消除植物中内源基因的表达，需要一段足够长度的、基本上连续核苷酸的核酸序列。为进行基因沉默，这可以少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，可选地，这可以多至完整的基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。此基本上连续的核苷酸链可以源自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)，或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸链能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸链按照递增的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性。对于本文所讨论的用于减小或基本上消除内源基因表达的多种方法而言，编码(功能性)多肽的核酸序列并非必需的。

减小或基本上消除表达可以利用常规工具和技术来实现。减小或基本上消除内源基因表达的一个优选方法是通过向植物中引入和表达基因构建体，其中，核酸(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码任一目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)以被间隔子(非编码DNA)分隔开的、(部分或完全地)反向重复的形式克隆在该构建体中。

在这样的优选方法中，利用核酸或其部分(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)的反向重复(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默，实现减小或基本上消除内源基因的表达。将该反向重复序列克隆进包含控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔子，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成该反向重复的两个反向核酸之间。该反向重复序列转录后，形成具有（部分或完全）自我互补结构的嵌合RNA。该双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA被植物加工成可以整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的siRNA。RISC进而切割mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。关于其他一般细节，参见例如Grierson等(1998)WO98/53083;Waterhouse等(1999)WO99/53050)。

本发明的方法的实施不依赖于向植物中引入和表达其中以反向重复形式克隆了核酸分子的基因构建体，而是可以使用几种公知的“基因沉默”法中的任一个或多个来实现相同的效应。

用于减小内源基因表达的一个这样的方法是RNA介导的基因表达的沉默(下调)。在该情况下沉默在植物中由双链RNA序列(dsRNA)触发，该双链RNA序列基本上与靶内源基因相似。该dsRNA被植物进一步加工成称为短干扰RNA(siRNA)的大约20至大约26个核苷酸。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录物，从而实质性减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。优选地，双链RNA序列相应于靶基因。

RNA沉默法的另一实例包括以有义取向，向植物中引入核酸序列或其部分(在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)。“有义取向”是指与其mRNA转录物同源的DNA序列。从而至少一个拷贝的核酸序列被引入植物。该额外的核酸序列将减小内源基因的表达，从而产生称为共抑制的现象。如果将几个额外拷贝的核酸序列引入植物，则基因表达的减小将更明显，因为在高转录水平与共抑制的触发之间存在正相关。

RNA沉默法的另一实例包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”中。术语“编码区”是指包含将翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”是指连接在编码区侧翼的5′和3′序列，其可被转录但不被翻译成氨基酸(也称为5′和3′非翻译区)。

可根据沃尔森和克里克碱基配对法则设计反义核酸序列。反义核酸序列可与整个核酸序列（在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链）互补，但也可以是仅对核酸序列的部分(包括mRNA5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起始位点的区域互补。适宜的反义寡核苷酸序列的长度在本领域内是已知的并且可以开始于长大约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少。可使用本领域内已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应，构建根据本发明的反义核酸序列。例如，反义核酸序列（例如，反义寡核苷酸序列）可使用天然存在的核苷酸或各种修饰核苷酸来化学合成，该修饰核苷酸经设计用以增加分子的生物学稳定性或增加反义与有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例在本领域是公知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“加帽”和用类似物例如肌苷对一个或多个天然存在的核苷酸的取代。核苷酸的其他修饰在本领域是公知的。

可使用已将核酸序列以反义取向（即，从插入的核酸转录的RNA针对目的靶核酸是反义取向）亚克隆入其中的表达载体，生物学地产生反义核酸序列。优选，植物中，通过稳定地整合的包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子的核酸构建体，产生反义核酸序列。

用于在本发明的方法中进行沉默的核酸分子（无论引入植物的还是原位产生的）与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白质的表达。杂交可通过常规核苷酸互补性以形成稳定的双链体或者，例如在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中的特定相互作用而产生。可通过转化或在特定组织位置直接注射，将反义核酸序列引入植物。可选地，可修饰反义核酸序列以靶向选择的细胞，然后全身性施用。例如，为了进行全身性施用，可以修饰反义核酸序列，以便其特异性结合选择的细胞表面上表达的受体或抗原（例如，通过将反义核酸序列连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体）。还可使用本文中描述的载体将反义核酸序列递送至细胞。

根据另一个方面，反义核酸序列是α-异头物核酸序列。α-异头物核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与常见的b单元（b-units）不同，链走向彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res15:6625-6641)。反义核酸序列还可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res15,6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215, 327-330)。

还可使用核酶减少或基本上消除内源基因的表达。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，该分子能够切割与其具有互补区的单链核酸序列例如mRNA。因此，核酶(例如，锤头核酶(Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334,585-591)中描述的)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA的数量。可设计具有对于核酸序列的特异性的核酶(参见例如:Cech等美国专利号4,987,071;和Cech等美国专利号5,116,742)。可选择地，可以使用相应于核酸序列的mRNA转录物，从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261,1411-1418)。核酶用于在植物中进行基因沉默的用途在本领域是已知的(例如,Atkins等(1994)WO94/00012;Lenne等(1995)WO95/03404;Lutziger等(2000)WO00/00619;Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。

基因沉默还可以通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)或通过Angell和Baulcombe((1999)Plant J20(3):357-62)、(Amplicon VIGS WO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)等所述的策略来实现。

如果在内源基因上存在突变和/或在随后引入植物的分离基因/核酸上存在突变，那么基因沉默也可发生。减少或基本上消除可通过非功能性多肽引起。例如，多肽可能结合多种相互作用的蛋白质；因此，可以通过一个或多个突变和/或截短，提供仍然能够结合相互作用的蛋白质（例如受体蛋白）但不能展示其正常功能（例如信号转导配体）的多肽。

进行基因沉默的另一个方法是通过用与基因的调控区（例如启动子和/或增强子）互补的核酸序列来打靶以形成三螺旋结构，所述结构阻止基因在靶细胞中的转录。参见Helene,C.,Anticancer Drug Res.6,569-84,1991;Helene等,Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-361992;和Maher,L.J.Bioassays14,807-15,1992。

其他方法，例如应用针对内源多肽的抗体在植物原位(in planta)抑制其功能、或干扰多肽所参与的信号传递通路，对于技术人员是公知的。特别地，可预期人造分子可用于抑制靶多肽的生物功能，或用于干扰其中靶多肽参与的信号转导途径。

备选地，可设置筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有减少的活性的多肽。这样的天然变体也可用于例如进行同源重组。

人工和/或天然微小RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA为单链小RNA，一般长度19-24个核苷酸。它们主要用于调控基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物microRNA(miRNA)具有与其靶序列完全或几乎完全的互补性。然而，存在具有达到5个错配的天然靶。miRNA利用Dicer家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的更长的非编码RNA加工而来。一旦加工后，它们通过结合RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白，而掺入到RNA诱导沉默复合物中。miRNA充当RISC的特异性组件，因为它们与细胞质中的靶核酸（大多数为mRNA）碱基配对。随后的调控事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的效应常反映为靶基因的降低的mRNA水平。

人工微小RNA(amiRNA)一般长度21个核苷酸，可以特异地遗传改造以负调控单个或多个目的基因的基因表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素在本领域公知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且可用来辅助设计特异性amiRNA(Schwab等,(2005)Dev Cell8:517-527,2005)。设计和生成amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等,(2006)Plant Cell18(5):1121-1133,2006)。

为优化性能，用来减小植物中内源基因表达的基因沉默技术需要应用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，而使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入到相同物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列来源于与其待引入的植物相同的植物物种并非是绝对必需的。内源靶基因与待引入的核酸之间基本上同源就足够了。

上文描述了减小或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。本领域技术人员将能够容易地调整上述沉默方法，以便例如通过应用适当的启动子而实现内源基因在整株植物或其部分中的表达减小。

转化

本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。备选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。备选地，可以选择不能再生为植物的植物细胞作为宿主细胞，即得到的转化植物细胞不具有再生为(整株)植物的能力。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等,(1882)Nature296,72-74;Negrutiu I.等,(1987)Plant Mol.Biol.8:363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等,(1985)Bio/Technol3,1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等,(1986)Mol.Gen Genet202:179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等,(1987)Nature327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta,199:612-617,1996);Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506,1993),Hiei等(Plant J.6(2):271-282,1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥属植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页。

除了转化体细胞（其之后不得不再生为完整植株），还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet208:1-9;Feldmann K(1992).在C Koncz,N-H Chua和J Shell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的NCGnt时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet,245:363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998).The Plant J.16,735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等,2004[Nature Biotechnology22(2),225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日;312(3):425-38或Maliga,P (2003)Progress towards commercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21,20-28给出。最近报道了其他生物技术进步，无标记的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等,2004,Nature Biotechnology22(2),225-229)。

遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者和Willmitzer的出版物。备选地，遗传修饰的植物细胞不可再生为整株植物。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子（酌情在灭菌后），从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对可选择标记例如上文所述标记的存在，筛选转化的植物。

DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析(DNA印迹)，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞已转化而含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。

T-DNA激活标签

T-DNA激活标签（Hayashi等Science（1992）1350-1353）包括将通常含有启动子（也可以是翻译增强子或内含子）的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb处，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶向基因表达的调控被破坏，基因由新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。可以例如，通过农杆菌感染将此T-DNA随机插入植物基因组中，并导致插入T-DNA附近的基因的表达被修饰。得到的转基因植物将由于紧靠引入的启动子的基因的修饰表达而表现出显性表型。

TILLING

术语“TILLING”为“靶向诱导的基因组局部损伤”(Targeted Induced Local Lesions In Genomes)的缩写，是一种用于生成和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以在强度、位置或时间(例如，如果突变影响启动子的话)上呈现出修饰的表达。这些突变变体可以比其天然形式基因呈现更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C,(1992)In Methods in Arabidopsis Research,Koncz C,Chua NH,Schell J编辑,新加坡,World Scientific Publishing Co,第16-82页;Feldmann等,(1994)In Meyerowitz EM,Somerville CR编辑,Arabidopsis.冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,第137-172页;Lightner J和Caspar T,(1998)In J Martinez-Zapater,J Salinas编辑,Methods on Molecular Biology,82卷Humana Press,Totowa,NJ,第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中合并物中存在的杂双链体在色谱图上检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域公知的(McCallum等(2002)Nat Biotechnol18:455-457,由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet5(2):145-50)。

同源重组

同源重组允许向基因组中的规定选定位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规用于低等生物体如酵母或剑叶藓（Physcomitrella）的标准技术。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10):3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol15(2):132-8)，并且存在无论靶生物种类的通常可应用的方法(Miller等,Nature Biotechnol.25,778-785,2007)。

产量相关性状

“产量相关性状”是与植物产量相关的性状或特性。产量相关性状可以包含下述非限制性特性列表中的一项或多项：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期活力、绿度指数、生长速率、农艺性状，例如耐淹性（这在稻中导致产量）、水利用效率（WUE）、氮利用效率（NUE）等。

本文述及的相对于对照植物增强的产量相关性状指，植物的一个或多个部分的早期活力和/或生物量增加中的一种或多种，该一个或多个部分可以包括(i)地上部分，优选地上可收获部分，和/或(ii)地下部分，优选可收获的地下部分。具体而言，这类可收获部分是种子

产量

术语“产量”通常表示具有经济价值的可测量产出，其典型地与规定的作物、面积和/或时期相关。各植物部分基于其数量、大小和/或重量对产量直接做出贡献，或者说真正的产量是每平方米作物的年产量，用总产量（包括收获的产量和估定的产量）除以种植的平方米来确定。

术语植物的“产量”和“植物产量”可互换使用，并且意指该植物的营养性生物量（如根和/或枝条生物量）、繁殖器官、和/或繁殖体（如种子）。

玉米的花是单性的；雄花序（雄穗）源于茎端，并且雌花序（雌穗）起于腋芽顶端。雌花序在中心轴（穗轴）的表面上产生成对的小穗状花序。雌小穗状花序各自包围两朵能育的小花，其中之一在受精后通常成熟为玉米粒。因此，玉米的产量增加可以表现为如下一个或多个方面：每平方米建植的植物数的增加、每株植物的雌穗数的增加、行数、行粒数、粒重、千粒重、雌穗长度/直径的增加、种子饱满率（其为饱满小花（即含有种子的小花）数除以小花总数并乘以100）的增加，等等。

稻植物中的花序被称为圆锥花序。圆锥花序具有小穗状花序，其为圆锥花序的基本单位，并且由花梗和小花组成。小花长在花梗上且包括由两个保护性颖片覆盖的花朵：较大的颖片（外稃）和较短的颖片（内稃）。因此，以稻为例，产量增加可以表现为如下一个或多个方面的增加：每平方米的植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗状花序数、每个圆锥花序的花朵（或小花）数、种子饱满率（其为饱满小花（即含有种子的小花）数除以小花总数并乘以100）的增加；千粒重的增加，等等。

早期开花时间

如本文使用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因此，这个术语指显示出较早的起始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数在播种和第一个花序出现之间的天数（“到开花的时间”）进行评估。植物的“开花时间”可以例如使用如WO2007/093444中所述的方法进行测定。

早期活力

“早期活力”是指活跃健康充分均衡的生长（特别是在植物生长的早期阶段），其可以因植物健康(fitness)增强引起，例如，由于植物更好地适应其环境(即，优化能源资源的利用以及在枝条和根之间的分配)引起。具有早期活力的植物也显示出增加的幼苗存活和更佳的作物齐苗，这往往产生高均匀度的田地(作物以齐整的方式生长，即大多数植物基本上同时达到各发育阶段)，以及往往是更优更高的产量。因此，早期活力可以通过测量多种因素来确定，如千粒重、萌发率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量，等等。

增加的生长速率

增加的生长速率可以特异于植物的一个或多个部分(包括种子)，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为指，从成熟种子生长至植物已经产生类似于起始材料的成熟干种子的阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如萌发速度、早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段，或者发生在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许再次播种同种植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再次播种和收获稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获玉米植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一砧木收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每平方米年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还允许在更广阔的地域栽培转基因植物，这是因为种植作物的地域限制常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过自生长曲线获得多种参数，确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50%所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的90%所需的时间)等等。

胁迫抗性

与对照植物相比，产量和/或生长速率的增加可以发生在植物处于非胁迫条件下时、或发生在植物暴露于不同的胁迫下时。植物通常通过更缓慢地生长来对暴露于胁迫作出反应。在重度的胁迫条件下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度的胁迫在此处定义为植物暴露于该胁迫后、不导致植物停止生长和丧失重新生长的能力的任何胁迫。在本发明的意义上，轻度胁迫导致受胁迫的植物与在非胁迫条件下的对照植物相比，生长减少不足40%、35%、30%或25%，更优选不足20%或15%。由于农业实践（灌溉、施肥、农药处理）的进步，在栽培的作物植物中通常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的减弱的生长通常是农业上不期望的特征。非生物胁迫可以由干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冻温度引起。

“生物胁迫”通常是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。

“非生物胁迫”可以是由水胁迫（例如由于干旱）、盐胁迫或冰冻结胁迫引起的渗透胁迫。非生物胁迫还可以是氧化胁迫或冷胁迫。“冰冻胁迫”意指由于冰冻温度引起的胁迫，所谓冰冻温度是指可用水分子在该温度冻结并转变为冰。“冷胁迫”也称为“寒冷胁迫”，意指低温，例如低于10℃、或优选低于5℃，但不使水分子冻结的温度。如Wang等人（Planta（2003）218:1-14）所报道的，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互关联，并可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。Rabbani等人（Plant Physiol（2003）133:1755-1767）描述了干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在着的一种特别高程度的“串话（cross-talk）”。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫常激活相似的细胞信号传递路径和细胞应答，如应激蛋白的产生、抗氧化剂的上调、相容性溶质的累积以及生长停滞。如本文所用的术语“非胁迫”条件为那些允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员知晓给定区域的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件（在非胁迫条件下生长）的植物一般产量按照递增的优先顺序是此类植物在给定环境中的平均产量的至少97%、95%、92%、90%、87%、85%、83%、80%、77%或75%。平均产量可以基于收获和/或季节进行计算。本领域技术人员知晓作物的平均产量产出。

特别地，可以在非胁迫条件下实施本发明的方法。在一个实例中，可以在非胁迫条件例如轻度干旱下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实施方案中，可以在胁迫条件下实施本发明的方法。

在一个实例中，可以在胁迫条件例如干旱下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

在另一个实例中，可以在胁迫条件例如养分缺乏下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

养分缺乏可以因诸如氮、磷酸及其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼等养分的缺乏所致。

在另外一个实例中，可以在胁迫条件例如盐胁迫下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语盐胁迫不局限于氯化钠(NaCl)，而可以是如下之任一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、CaCl₂等等。

在另外一个实例中，可以在胁迫条件例如冷胁迫或冰冻结胁迫下实施本发明的方法，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。

增加/提高/增强

术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，且在本申请意义上表示，与文中所定义的对照植物相比，产量和/或生长增加至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%，优选至少15%或20%，更优选25%、30%、35%或40%或更多。

种子产量

增加的种子产量可表现为如下一个或多个方面：

a)种子生物量（种子总重量）的增加，这可以是以单粒种子和/或每植株和/或每平方米为基础的增加；

b)每植株的花数的增加；

c)增加的种子数；

d)增加的种子饱满率（其表达为饱满小花数与小花总数的比率）的增加；

d)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产量除以地上植物部分的生物量的比率；和

f)增加的千粒重（TKW），这通过计数种子数和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且也可来自胚和/或胚乳大小的增加。

术语“饱满小花”和“饱满种子”可视为同义词。

种子产量的增加也可表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加自身也可表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。

绿度指数

如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿值相对于红值之比(在RGB模型中用于色度编码)。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在养分可利用度下降的生长条件下，在开花前的末次成像中测量植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物绿度指数。

生物量

如本文中所用，术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义范围内，可以区分植物的一个或多个部分的生物量，其可以包括以下任意一个或多个：

-地上部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地上可收获部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等；

-地下部分，例如但不限于，块茎、球茎、根生物量等；

-地下可收获部分，例如但不限于，块茎、球茎、根生物量等；

-部分处于地下的可收获部分，例如但不限于，块根和其他的植物下胚轴区域、根茎、匍匐枝或匍匐根茎；

-营养体生物量，例如根生物量、枝条生物量等；

-生殖器官；和

-繁殖体，例如种子。

标记辅助育种

这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此类程序可以起始于一系列无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，该变体提供增加的产量。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括使经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。

在（遗传作图）中用作探针

利用编码目的蛋白质的核酸进行基因的遗传和物理作图仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。此类核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可以用编码目的蛋白质的核酸探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。另外，可以使用所述核酸探测含有一组如下个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述该组个体为规定的遗传杂交的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算编码目的蛋白质的核酸在先前用此群体所获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。

有关在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和使用，描述于Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter4:37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行的遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其他个体组作图。这类方法是本领域技术人员公知的。

核酸探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In:Non-mammalian Genomic Analysis:A Practical Guide,Academic press1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接萦光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5:13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。

用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸序列进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241: 1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸的序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员公知的。在采用基于PCR的遗传作图的方法中，可能需要鉴定作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

植物

本文所用术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根（包括块茎）、花以及组织和器官，其中上述每一种都含有目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都含有目的基因/核酸。

尤其可以用于本发明方法中的植物包括，属于超家族植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自：槭树属(Acer spp.)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属(Agropyron spp.)、匍匐剪股颍(Agrostis stolonifera)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、固沙草(Ammophila arenaria)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、落花生属(Arachis spp)、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属(Castanea spp.)、吉贝(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可乐属(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属(Cucurbita spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、龙爪稷(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia unifora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或Soja max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、苹果属(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果 (Mangifera indica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属(Momordica spp)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musa spp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntia spp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、(例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、鳄梨属(Persea spp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Rapbanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salix sp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、白芥属(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、Triticum macha、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、沼生菰(Zizania palustris)、枣属(Ziziphus spp.)等等。

对照植物

选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子（nullizygote）。无效合子（或无效对照植物）是由于分离而丢掉转基因的个体。此外，对照植物培养在与本发明植物的生长条件相同的生长条件下，即在本发明植物附近和在同一时间培养。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。

附图简述

现将参考以下附图来描述本发明，其中：

图1是关于OsNAC1的表达的RNA凝胶印迹分析。(a)稻中OsNAC1应答胁迫条件的表达。使14日龄幼苗暴露于干旱、高盐度、ABA或低温所示的时间点。对于干旱胁迫，在28℃风干幼苗；对于高盐度胁迫，使幼苗在28℃暴露于400mM NaCl；对于低温胁迫，使幼苗暴露于4℃；对于ABA处理，使幼苗暴露于含有100μM ABA的溶液。(b)RCc3:OsNAC1、GOS2:OsNAC1的三个纯合T₅品系及NT植物的RNA凝胶印迹分析。通过使用溴化乙锭（EtBr）染色来确定等同的RNA上样。(-)和(+)分别表示无效品系和转基因品系。

图2.RCc3:OsNAC1ad GOS2:OsNAC1植物在营养阶段的胁迫耐受性。(a)干旱胁迫期间的植物图片。培养RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的三个独立的纯合T₅品系及NT对照两周，进行5天的干旱胁迫，然后按加号(+)所示在温室内重新浇水7天。(b)暴露于干旱、高盐度和低温胁迫条件的稻植物的叶绿素萦光(F_v/F_m)的比较。每个数据点代表三次重复实验(n=10)的平均值±SE。

图3.在正常(a)和干旱(b)条件下栽培两季（2009-2010），RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物在大田中的农艺性状。用Microsoft Excel将各转基因植物的三个独立的纯合T₅(2009)和T₆(2010)品系的农艺性状与NT对照一起作图。每个数据点代表平均值(n=30)的百分比，指定NT植物为100%。CL，秆长；PL，穗长；NP，每穴的穗数；NSP，每穗的小穗数；TNS，小穗的总数；FR，饱满率；NFG，饱满谷粒数；TGW，谷粒总重；1000GW，千粒重。

图4.生长在生殖的抽穗期的RCc3:OsNAC1、GOS2:OsNAC1和NT植物的根生长的比较。(a)上图显示各植物的代表性根系，而下图显示各植物的1条代表性根。上图和下图中的条分别为10cm和2mm。(b)横切的转基因和NT植物根的光学显微镜图像。根（上图）、中柱内的维管束（中图）及表皮和部分皮层（下图）的全断面。co，皮层；xy，木质部；ae，通气组织；箭头指示表皮。条在上图中为500μm，在中图和下图中为100μm。(c)对NT归一化的转基因植物根的体积、长度、干重和直径。值为50条根（五株植物每株10条）的平均值±SD。星号(^**)表示0.01水平的显著平均值差异(LSD)。

图5显示关于OsNAC5的表达的RNA凝胶印迹分析

A，从暴露于干旱、高盐度、ABA或低温所示时间的14日龄幼苗的叶和根组织制备10μg总RNA。对于干旱胁迫，在28℃风干幼苗；对于高盐度胁迫，使幼苗在28℃暴露于400mM NaCl；对于低温胁迫，使幼苗暴露于4℃；对于ABA处理，使幼苗暴露于含有100μM ABA的溶液。印迹总RNA，并用OsNAC5基因特异性探针杂交。然后针对Dip1(Oh等,2005b)和rbcS(Jang等,1999)基因重新探测印迹，Dip1和rbcS分别用作胁迫处理后关键基因上调和下调的标记。用溴化乙锭(EtBr)染色来确定等同的RNA上样。

B，用分别来自RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的三个纯合T₅品系及非转基因（NT）对照植物的根和叶的总RNA制备物进行RNA凝胶印迹分析。用OsNAC5基因特异性探针杂交印迹，还针对rbcS和Tubulin重新探测。用溴化乙锭染色来确定等同的RNA上样。(–)无效合子(无转基因的分离子)品系，(+)转基因品系。

图6显示RCc3:OsNAC5ad GOS2:OsNAC5植物的胁迫耐受性

A.干旱胁迫期间转基因植物的外观。在温室中培养RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的三个独立的纯合T₆品系及非转基因(NT)对照4周，进行3天的干旱胁迫，然后重新浇水7天。在所示时间点采集图像。‘+’表示在正常生长条件下重新浇水的天数。

B.干旱、高盐度和低温胁迫条件下稻植物的叶绿素萦光（Fv/Fm）的变化。使在MS培养基中生长14天的RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的三个独立的纯合T₆品系及NT对照经受实施例部分中所述的多种胁迫条件。在这些胁迫处理后，用脉冲调制萦光计（mini-PAM,Walze,德国）测量Fv/Fm值。所有植物在胁迫处理前都生长在150μmol m^-2s^-1的连续光照下。每个数据点代表三个重复实验（n=10）的平均值±SE。

C.通过用方程ΔW_OK=V_OKsample-V_OKcontrol计算的F_O至F_K的差异动力学揭示了干旱条件下的植物的L带；左轴。O至K期的双归一化；V_ok=(F_t-F_O)/(F_K-F_O)；右轴。

D.说明最终电子受体的库大小的差异的V_OI≥1.0的事件；正常和干旱条件下V_OI=(F_t-F_O)/(F_t-F_O)。

图7显示在正常（A）和干旱（B）条件下生长在大田中的RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的农艺性状

用Microsoft Excel绘制处于正常和干旱条件下的RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的三个独立的纯合T₅和T₆品系及相应的非转基因(NT)对照的农艺性状的蛛网图。每个数据点代表表III和IV中所列的平均值（n=30）的百分比。为来自NT对照的平均测量结果指定100%参考值。CL，秆长；PL，穗长；NP，每穴的穗数；NSP，每穗的小穗数；TNS，小穗的总数；FR，饱满率；NFG，饱满谷粒数；TGW，谷粒总重；1000GW，千粒重。

图8显示RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的根生长的差异

A，对NT对照根的那些归一化RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的根体积、长度、干重和直径。^**平均值差异在0.01水平上显著（LSD）。值为50条根（5株植物每株10条）的平均值±SD。

B，培养至生殖的抽穗期的RCc3:OsNAC5、GOS2:OsNAC5和NT对照植物的一条代表性根。比例尺=2mm。

C，横切的RCc3:OsNAC5、GOS2:OsNAC5和NT根的光学显微镜图像。显示后生木质部导管（Me）和通气组织（Ae）的位置。比例尺，上图中为500μm，中图和下图中为100μm。

图9显示多种NAC1多肽的多重比对。星号表示在多种蛋白质序列中相同的氨基酸，冒号表示高度保守的氨基酸取代，圆点表示保守性较低的氨基酸取代；其他位置上不存在序列保守性。在使用保守氨基酸时，这些比对可以用来定义其他基序或标签序列。

图10显示多种NAC5多肽的多重比对。星号表示在多种蛋白质序列中相同的氨基酸，冒号表示高度保守的氨基酸取代，圆点表示保守性较低的氨基酸取代；其他位置上不存在序列保守性。在使用保守氨基酸时，这些比对可以用来定义其他基序或标签序列。

实施例

现将参考以下实施例来描述本发明，该实施例仅意在举例说明。如下实施例并非旨在限制本发明的范围。除非另有说明，本发明利用植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种中的常规技术和方法。

对于DNA操作，除非另有说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994),Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols第一卷和第二卷中的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)中。

A：实验方法

(i)质粒构建和稻的OsNAC1转化

按照厂家的说明使用RT-PCR系统（Promega），用引物对：正向 (5’-ATGGGGATGGGGATGAGGAG-3’)、反向(5’-TCAGAACGGGACCATGCCCA-3’)从总RNA扩增OsNAC1的编码区。为了在稻中过表达，用Gateway系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)将OsNAC1的cDNA连接至GOS2启动子用于组成性表达，连接至RCc3启动子用于根特异性表达。通过三亲杂交将质粒引入根癌农杆菌LBA4404，按之前所述（Jang等,1999）转化来自成熟种子的胚发生（稻栽培种日本晴（Oryza sativa cv Nipponbare））愈伤组织。

(ii)质粒构建和稻的OsNAC5转化

按照厂家的说明用RT-PCR系统（Promega,WI）从稻总RNA扩增OsNAC5(AK102475)的编码区。引物对如下：正向(5’-ATGGAGTGCGGTGGTGCGCT-3’)和反向(5’-TTAGAACGGCTTCTGCAGGT-3’)。为了能够在稻中过表达OsNAC5基因，用Gateway系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)将此基因的cDNA连接至GOS2启动子用于组成性表达，并连接至RCc3启动子用于根特异性表达。通过三亲杂交将质粒引入根癌农杆菌LBA4404，按之前所述（Jang等,1999）转化来自成熟种子的胚发生（稻栽培种日本晴）愈伤组织。

(iii)稻植物在营养阶段的干旱处理

在半强度MS固体培养基上萌发来自转基因和非转基因(NT)稻（稻栽培种日本晴）植物的种子，并在暗生长室中28℃放置4天。将幼苗移植入土壤，然后在28-30℃的温室（16小时光照/8小时黑暗周期）中培养。在进行干旱胁迫实验之前，在花盆（3x3x5cm；每盆1株植物）中培养来自各转基因和非转基因品系的18株幼苗4周。干旱胁迫通过对幼苗断水3-5天来模拟，而恢复测试通过重新对干旱胁迫的植物浇水并观察7天来进行。然后记录存活或继续生长的植株数。

(iv)RNA凝胶印迹分析NAC5

使稻（稻栽培种日本晴）种子在土壤中萌发，并栽培在28℃的温室（16小时光照/8小时黑暗周期）中。对于高盐度和ABA处理，在约1000μmol/m²/s连续光照下的温室中，将14日龄幼苗转移至含有400mM NaCl 或100μM ABA的营养液中所示的时间。对于干旱处理，切除14日龄幼苗，并在1000μmol/m²/s连续光照下风干所示时间。对于低温处理，将14日龄幼苗在150μmol/m²/s的连续光照下在冷室中暴露于4℃所示时间。按之前所报道（Jang等,2002）进行总RNA的制备和RNA凝胶印迹分析。

(v)Northern印迹分析

使来自稻（稻栽培种日本晴）的种子在土壤中萌发，并培养在22℃的温室中（16小时光照/8小时黑暗周期）。从暴露于干旱、高盐度、ABA或低温所示时间点的14日龄幼苗制备总RNA。对于高盐度和ABA处理，在约1000μmol/m²/s连续光照下的温室中将幼苗转移至含有400mM NaCl或100μM ABA的营养液所示时间。对于干旱处理，切下幼苗，并在约1000μmol/m²/s的连续光照下风干所示时程。对于低温处理，在150μmol/m²/s的连续光照下将幼苗在冷室中暴露于4℃所示时程。印迹10μg的总RNA，并用OsNAC1基因特异性探针杂交。然后用Dip1基因重新探测印迹，Dip1基因用作胁迫处理后关键基因上调的标记。用溴化乙锭（EtBr）染色来确定等同的RNA上样。从RCc3:OsNAC1、GOS2:OsNAC1的三个纯合T₅品系的每一个及NT植物的叶和根样品的总RNA（10μg）制备用于RNA凝胶印迹分析的样品。用OsNAC1基因特异性探针杂交印迹，并针对RbcS和Tubulin重新探测。通过使用溴化乙锭（EtBr）染色来确定等同的RNA上样。按照Jang等(2002)进行总RNA的制备和RNA凝胶印迹分析。

(vi)干旱、高盐度和低温条件下的叶绿素萦光的测量

使来自转基因和非转基因稻（稻栽培种日本晴）植物的种子萌发，并在半强度MS固体培养基上培养14天。生长室具有以下光照和黑暗设置：28℃下150μmol m^-2s^–1的16小时光照/8小时黑暗。然后在体外胁迫处理前用剪刀剪下约10株幼苗的绿色部分。所有胁迫条件都在150μmol m^-2s^–1的连续光照下进行。对于低温胁迫施用，在水中4℃孵育幼苗至多6小时。通过在400mM NaCl中28℃孵育2小时来诱导高盐度胁迫。为了模拟干旱胁迫，在28℃风干植物2小时。然后按之前所述（Oh等2005）测量F_v/F_m值。

(vii)稻3’-Tiling微阵列分析

按之前所述（Oh等,2009）用稻3’-Tiling微阵列来进行表达谱分析。使转基因和非转基因稻（稻栽培种日本晴）种子在土壤中萌发，并培养在22℃的温室（16小时光照/8小时黑暗）中。为了鉴定稻中的胁迫诱导NAC基因，从经受干旱、高盐度、ABA和低温胁迫条件的植物的14日龄叶制备总RNA（100μg）。对于高盐度和ABA处理，在约1000μmol m^-2s^-1连续光照下的温室中将14日龄幼苗转移至含有400mM NaCl或100μMABA的营养液2小时。对于干旱处理，同样在约1000μmol m^-2s^-1连续光照下风干14日龄幼苗2小时。对于低温处理，使14日龄幼苗在150μmolm^-2s^-1的连续光照下在冷室中4℃暴露6小时。为了鉴定RCc3:OsNAC1、GOS2:OsNAC1植物中上调的基因，从培养在正常生长条件下的14日龄转基因和非转基因稻幼苗（稻栽培种日本晴）的根和叶组织制备总RNA（100μg）。

(viii)大田中两年（2009和2010）的稻植物干旱处理和谷粒产量分析

为了在正常大田条件下评价转基因植物的产量成分，将RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的三个独立的T₅(2009)和T₆(2010)纯合品系与非转基因（NT）对照一起移植至Rural Development Administration,Suwon,韩国(2009)和Kyungpook National University,Gunwi,韩国(2010)的水稻田。对于2009-2010两个栽培季，利用具有三个重复的随机化设计。播种25天后，按每穴一株幼苗在15x30cm的间隔内随机移植幼苗。最后一次搅拌后及移植后45天按70N/40P/70K kg ha^-1施肥。每季每个转基因品系记录30株植物的产量参数。从数据记录排除位于边界处的植物。

为了在干旱大田条件下评价转基因植物的产量成分，将RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的每一种的三个独立的T₅(2009)和T₆(2010)纯合品系及NT对照移植至具有装有天然水稻土的1米深容器的可拆卸雨棚（位于Myongji University,Yongin,韩国）。

利用(Oh等,2009)所述的实验设计、移植间隔、肥料的使用、干旱处理和农艺性状的记录。在培养在正常和干旱条件下的植物已达到成熟且谷粒已成熟后，收获它们，并手工脱粒（从植物的营养部分分离种子）。然后将不饱满和饱满的谷粒分开，用Countmate MC1000H(Prince Ltd,韩国)分别计数，并称重。记录了以下农艺性状：穗长（cm）、每穴的穗数、每穗的小穗数、每穴的小穗数、饱满率（%）、每穴的饱满小穗数、谷粒总重（g）和千粒重（g）。通过单因素方差分析分别分析来自三个独立品系的结果，并与NT对照的结果相比较。用ANOVA来拒绝转基因品系和NT对照平均值等同的零假设（p<0.05）。用16.0版SPSS来进行这些统计学分析。

以上方法也用于RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物。

(ix)根的镜检

按Jeong等(2010)所述进行根的镜检。作为概述，用改进的Karnovsky固定剂在4℃过夜固定处于抽穗期的转基因和非转基因植物的根，并用相同的缓冲液洗涤三次，每次10分钟。将它们在相同的缓冲液中4℃后固定2小时，并用蒸馏水短暂洗涤两次。后固定的根组织在4℃过夜整块染色。然后将它们在梯度乙醇系列（30、50、70、80、95和100%）中脱水，且在100%乙醇中三次，每次10分钟。用氧化丙烯作为过渡流体进一步处理脱水的样品两次，每次30分钟，并包埋在Spurr培养基中。通过超薄切片机（MT-X;RMC Inc.,Tucson,AZ）用金刚石刀制备超薄切片（约1μm厚）。用1%甲苯胺蓝染色切片，并在光学显微镜下观察和拍照。

(x)JIP分析

按之前所述（Redillas等,2011a和2011b）用Handy-PEA萦光计(Plant Efficiency Analyzer,Hansatech Instruments Ltd.,King’s Lynn Norfolk,PE304NE,UK)测量植物的叶绿素α萦光瞬变。使植物暗适应至少30分钟，以确保反应中心（RC）的充分开放，即RC充分氧化。三个独立的T₆纯合品系中的每一个选择两株植物。选择每株植物的最高且目检外观健康的叶，并在它们的顶部、中部和底部测量。用Handy PEA软件（1.31版）平均读数。用以下程序设定Handy PEA萦光计：起始萦光设为O(50μs)，J(2ms)和I(30ms)为中间值，P为峰值(500ms-1s)。通过3个发光二极管提供的3,500μmol光子m^-2s^-1的650nm红光来诱导瞬变，聚焦在直径5mm 的斑点上，并以12比特分辨率记录1S。数据获取设在每10μs(从10μs至0.3ms)、每0.1ms(从0.2至3ms)、每1ms(从3至30ms)、每10ms(从30至300ms)和每100ms(从300ms至1s)。按照JIP测试的方程用Biolyzer4HP软件(v4.0.30.03.02)进行归一化和计算。通过从样品的归一化数据(V_OKsample)扣除未处理的NT(V_OKcontrol)来进行针对OK期计算的差异动力学(ΔW_OK)。各数据集的归一化按方程V_OK=(F_t-F_O)/(F_K-F_O)进行。用OriginPro8SR0v9.0724(B724)作图。

B：结果

实施例1：OsNAC1的转基因过表达赋予营养生长阶段的胁迫耐受性

我们用来自在一定时程内暴露于干旱、高盐度、低温和ABA的14日龄幼苗的叶和根的总RNA进行了RNA凝胶印迹分析。干旱、高盐度和ABA显著上调稻叶和根中内源性OsNAC1的表达，但低温条件上调较弱（图1a）。为了在转基因稻植物中过表达OsNAC1，将OsNAC1的全长cDNA连接至两种不同的启动子，用于根特异性表达的RCc3(RCc3:OsNAC1)和用于组成性表达的GOS2(GOS2:OsNAC1)。通过农杆菌介导的转化法产生每种构建体的15至20个独立的转基因品系。收集来自生长正常而无矮化的转基因品系的T_1-6种子，选择RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物二者的三个独立的T_5-6纯合品系用于进一步分析。通过RNA凝胶印迹分析来确认RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1在根和叶二者中的表达（图1b）。在RCc3:OsNAC1植物的叶中未检测到转基因OsNAC1的表达，而根显示高水平的转基因表达，验证了RCc3启动子的根特异性。转基因的表达水平在GOS2:OsNAC1植物的根和叶二者中类似地提高。此外，转基因的表达水平在RCc3:OsNAC1植物的根中比在GOS2:OsNAC1植物的根中高，而参考Tublin的这些表达水平保持一致。

为了评价OsNAC1过表达者在营养生长阶段的胁迫耐受性，使4周龄转基因和非转基因（NT）对照植物经受干旱胁迫至多5天（图2a）。在干旱处理期间，与NT相比，转基因植物显示延迟的卷叶。重新浇水后，转基因植物开始恢复，NT植物持续枯萎而无恢复迹象，证明了转基因植物在营养阶段的干旱耐受性。由于环境胁迫影响植物的光合机制，用脉冲振幅调制萦光计测量PSII的最大光化学效率（F_v/F_m：F_v，可变萦光；F_m，最大萦光）（图2b）。使14日龄植物经受一定时程的干旱、高盐度和低温胁迫，并测定它们的F_v/F_m值。在干旱和高盐度两种条件下，取决于胁迫的程度和转基因品系，RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物显示比NT对照植物高10-30%的F_v/F_m值。相反，在低温条件下，未在转基因和NT对照植物之间观察到F_v/F_m值的差异。总结起来，这些结果显示两种转基因植物在营养生长阶段对干旱胁迫的耐受性增强。

以下表I显示：2009和2010年正常生长条件下的RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中种子产生参数的分析。

表I.2009和2010年正常生长条件下的RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中种子产生参数的分析。

每个参数值代表RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物及各NT对照的平均值±SD(n=30)。显示RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的值与各NT对照的值之间的百分比差异(%Δ)。星号(^*)表示显著性差异(p<0.05)。

实施例2：OsNAC1的过表达增加正常和干旱条件下的谷粒产量

在两个栽培季(2009和2010)评价了转基因植物在正常和大田干旱条件下的产量成分。将RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的三个独立的T₅(2009)和T₆(2010)纯合品系与非转基因(NT)对照一起移植至水稻田，并培养至成熟。从三个重复记录每个转基因品系30株植物的产量参数。来自两年的大田试验的数据集通常一致，RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的谷粒总重分别增加了13-18%和13-32%。谷粒总重的增加在RCc3:OsNAC1植物中主要是由于穗长增加，在GOS2:OsNAC1植物中是由于穗长和穗数的增加(图3a；表I)。

为了在干旱条件下测试转基因植物，将RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的三个独立的T₅和T₆品系移植至具有可拆卸雨棚的水稻田。使植物在抽穗期（从抽穗前10天和抽穗后10天）暴露于干旱胁迫。在雨棚下施加的干旱胁迫的水平等同于产生在正常生长条件下获得的谷粒总重的40-50%的水平，该水平为NT植物在正常和干旱条件之间的谷粒总重水平的差异所证明（补充表格S1和S2）。记录的两个栽培季的产量参数的统计学分析显示，在RCc3:OsNAC1植物中，干旱条件下谷粒产量的减少显著小于在NT对照中观察到的减少。具体而言，在干旱处理的RCc3:OsNAC1植物中，取决于转基因品系，饱满率比干旱处理的NT植物高18-36%，其导致谷粒总重增加28-72%（图3b；表II）。相反，在干旱处理的GOS2:OsNAC1植物中，谷粒总重保持与干旱处理的NT对照相似。鉴于RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物在营养阶段的干旱耐受性水平相似，大田干旱条件下谷粒总重的差异是意外的。

还观察了转基因植物的根构造，测量培养至生殖的抽穗期的RCc3:OsNAC1、GOS2:OsNAC1和NT植物的根体积、长度、干重和直径。如图4b中所示，RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物的根直径分别比NT对照植物的根直径粗30%和7%。横切根的显微镜分析显示，根直径的增加由RCc3:OsNAC1根的中柱、皮层和表皮的增大引起。具体而言，与GOS2:OsNAC1和NT植物相比，RCc3:OsNAC1根中的通气组织（图4b中的ae）更大，其可以促成RCc3:OsNAC1根沿着增大的中柱增大。OsNAC1的根特异性过表达伴随更大的通气组织增加根直径的事实与转基因植物在生殖阶段的干旱耐受性增强相关。GOS2:OsNAC1根的体积、长度和干重分别相对于NT根增加50%、20%和35%，表明这些参数还影响正常生长条件下的植物的谷粒产量的增加。

在正常生长条件下，与非转基因(NT)对照相比，两种植物都显示更高的谷粒产量。RCc3:OsNAC1植物谷粒总重的提高主要是由于穗长的增加，而GOS2:OsNAC1植物谷粒总重的提高是由于包括穗长、穗数和小穗数的许多性状。相反，在干旱条件下，RCc3:OsNAC1植物的谷粒总重主要由于饱满率增加而显著增强28-72%，而GOS2:OsNAC1植物显示这两种性状没有一种显著改变。

OsNAC1的根特异性过表达明显在尤其是干旱条件下的稻产量的提高中发挥重要作用。T₅或更晚世代的RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物未显示任何不想要的多效性作用，如生长迟缓、不正常叶形和颜色及穗发育不良，如果存在任何多效性作用，其已在更早世代的预筛选过程中分离出去。因此，与NT对照相比，RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物在T_5-6显示的反应改变仅由转基因促成。

与NT对照和GOS2:OsNAC1植物的根特征相比，处于生殖抽穗期的RCc3:OsNAC1植物的根特征显示根直径的增加。该增加明显由增大的木质部、更大的皮层细胞和表皮引起。木质部增大的粗根促成更好的水通量，且具有比细根小的形成空洞的风险（Yambao等,1992）。另外，更大的根在干旱耐受性中具有直接作用，因为大尺寸的根直径与穿透(Clark等,2008;Nguyen等,1997)和分枝(Fitter,1991;Ingram等,1994)能力相关。

以下表II显示：2009和2010年干旱胁迫条件下的RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中种子产生参数的分析。

表II.2009和2010年干旱胁迫条件下的RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中种子产生参数的分析。

实施例3：鉴定由过表达的OsNAC1上调的基因

对RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1根进行表达谱分析来鉴定过表达OsNAC1后上调的基因。在从培养在正常条件下的14日龄植物的根提取的RNA样品上进行了稻3’-Tiling微阵列。每个数据集获自两个重复的生物样品。使用单因素方差分析(p<0.01)的统计学分析鉴定出46个OsNAC1过表达后在RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1根中上调超过3倍的基因(表I)。还鉴定出9个和28个分别对RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1根特异的基因(表A)。两种转基因根共有的高度上调的靶基因包括9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（用于ABA生物合成的基因）、钙转运ATP酶（用于导致通气组织形成的皮层细胞死亡（凋亡）的Ca²⁺信号发放的成分）、肉桂酰辅酶A还原酶1（涉及用于通气组织周围的屏障（凯氏带）形成的木质素合成的基因）。有趣地，O-甲基转移酶（用于同样为屏障形成所必需的木栓质生物合成的基因）仅在RCc3:OsNAC1根中特异性上调。这类在转基因根中特异性上调的靶基因可以解释根构造的差异，从而解释生殖阶段的干旱耐受性。

共有的靶基因包括9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶、钙转运ATP酶和肉桂酰辅酶A还原酶1。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）氧化切割顺式-环氧类胡萝卜素来产生黄质素（xanthoxin）是ABA生物合成的调节中的关键步骤和限速步骤(Tan等,1997)。NCED基因在两种转基因植物中都上调超过20倍，其可以促成植物在暴露于干旱胁迫时的敏感性。Ca²⁺转运ATP酶（Ca²⁺-ATP酶）在RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中分别上调26倍和32倍。衍生自从质外体空间内流或从内部储存释放的胞质Ca²⁺的瞬时增加是植物细胞中对低温、干旱和盐度胁迫的早期响应(Knight,2000)。与胞质Ca²⁺的增加偶联的是液泡膜的破裂，其也指示先于根皮层细胞死亡的早期事件，然后形成通气组织——根的皮层区中充满气体的空间。这解释了在RCc3:OsNAC1根中观察到的更大的皮层细胞的贡献。通气组织作为稻中的解剖学适应，其帮助最小化O₂丧失至周围土壤，用于顶端分生组织的呼吸。这些结构包括栓化下皮和紧靠下皮内侧的一层木质化细胞，二者都只具有轻微的气体通透性(Drew等,2000)。有趣地，OsNAC1过表达后，RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）（编码木质素生物合成中的关键酶（EC1.2.144）的基因）上调。CCR是对导致产生monolignol对-香豆醇、松柏醇和芥子醇，控制木质素的数量和质量的生物合成途径特异的第一种酶(Jones等,2001)。AtCCR1（拟南芥同源物）的下调导致植物表型的显著改变(Goujon等,2003)。另外，玉米中的功能丧失突变(Zmccr1^-/-)导致木质素含量的轻微降低，并导致木质素结构的显著改变(Tamasloukht等,2011)。发现玉米基因ZmCCR2由干旱条件诱导，且可以主要在根中检测到(Fan等,2006)。肉桂醇脱氢酶（CAD）（编码涉及木质素生物合成的酶的另一个基因）也与CCR一起在两种植物中都上调。CAD在木质素生物合成途径中催化羟基肉桂醛（monolignal）至monolignol的最终转化(Sattler等2009)。此外，O-甲基转移酶（编码涉及木栓质生物合成的酶（EC=2.1.1-）的基因）在RCc3:OsNAC1植物中特异性上调。在拟南芥中，发现编码O-甲基转移酶的mRNA ZRP4优先累积在根中，且主要定位于内皮层的区域中，低水平见于叶、茎和其他枝条器官中(Held等,1993)。由于其涉及木栓质生物合成，用根特异性启动子上调三个O-甲基转移酶基因可以促成RCc3:OsNAC1植物相对于GOS2:OsNAC1和NT植物增强的干旱耐受性。木质素与木栓质一起，在通过根周围层的壁在称为屏障形成的过程中的木质化和/或栓化来阻止径向氧丧失中具有主要作用。内皮和外皮细胞的径向和横切壁上的此屏障形成通常与凯氏带（CS）相关。CS的主要功能是通过封闭根中的选择性质外体支路来抑制水和盐转运入中柱(Ma等,2003)。Cai等(2011)报道，CS在耐受盐和干旱的Liaohan109中的内皮和外皮上的出现早于对盐中度敏感的Tianfeng202和对盐敏感的日本晴发生。该小组还报道，甚至在营养液中不含盐的情况下，也显示CS在Liaohan109中的出现，并增加。因此，微阵列的结果为我们提供关于植物如何忍受干旱胁迫及OsNAC1特异性在根中或在整个植物体中的过表达如何影响基因的调节的认识。

来自微阵列的结果显示RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1根共有的46个上调的靶基因（表A）。此外，发现9个和28个靶基因分别在RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1根中特异性上调（表A）。共有的靶基因包括9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶、钙转运ATP酶和肉桂酰辅酶A还原酶1。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）氧化切割顺式-环氧类胡萝卜素来产生黄质素是ABA生物合成的调节中的关键步骤和限速步骤(Tan等,1997)。NCED基因在两种转基因植物中都上调超过20倍，其可以促成植物在暴露于干旱胁迫时的敏感性。Ca²⁺转运ATP酶（Ca²⁺-ATP酶）在RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中分别上调26倍和32倍。衍生自从质外体空间内流或从内部储存释放的胞质Ca²⁺的瞬时增加是植物细胞中对低温、干旱和盐度胁迫的早期响应(Knight,2000)。与胞质Ca²⁺的增加偶联的是液泡膜的破裂，其也指示先于根皮层细胞死亡的早期事件，然后形成通气组织——根的皮层区中充满气体的空间。这解释了在RCc3:OsNAC1根中观察到的更大的皮层细胞的贡献。通气组织作为稻中的解剖学适应，其帮助最小化O₂丧失至周围土壤，用于顶端分生组织的呼吸。这些结构包括栓化下皮和紧靠下皮内侧的一层木质化细胞，二者都只具有轻微的气体通透性(Drew等,2000)。有趣地，OsNAC1过表达后， RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）（编码木质素生物合成中的关键酶（EC1.2.144）的基因）上调。CCR是对导致产生monolignol对-香豆醇、松柏醇和芥子醇，控制木质素的数量和质量的生物合成途径特异的第一种酶(Jones等,2001)。AtCCR1（拟南芥同源物）的下调导致植物表型的显著改变(Goujon等,2003)。另外，玉米中的功能丧失突变(Zmccr1^-/-)导致木质素含量的轻微降低，并导致木质素结构的显著改变(Tamasloukht等,2011)。发现玉米基因ZmCCR2由干旱条件诱导，且可以主要在根中检测到(Fan等,2006)。肉桂醇脱氢酶（CAD）（另一编码涉及木质素生物合成的酶的基因）也与CCR一起在两种植物中都上调。CAD在木质素生物合成途径中催化羟基肉桂醛（monolignal）至monolignol的最终转化(Sattler等2009)。此外，O-甲基转移酶（编码涉及木栓质生物合成的酶（EC=2.1.1-）的基因）在RCc3:OsNAC1植物中特异性上调。在拟南芥中，发现编码O-甲基转移酶的mRNA ZRP4优先累积在根中，且主要定位于内皮层的区域中，低水平见于叶、茎和其他枝条器官中(Held等,1993)。由于其涉及上文所述的木栓质生物合成，用根特异性启动子上调三个O-甲基转移酶基因可以促成RCc3:OsNAC1植物相对于GOS2:OsNAC1和NT植物增强的干旱耐受性。因此，微阵列的结果为我们提供关于植物如何忍受干旱胁迫及OsNAC1特异性在根中或在整个植物体中的过表达如何影响基因的调节的认识。

表A.与非转基因对照相比在RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物中上调的根表达的基因。

^a相应的基因的全长cDNA序列的序列识别号。^b两个重复的生物样品的平均值。c通过单因素方差分析来分析p值（p<0.01）。这些微阵列数据集可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/(Gene Expression Omnibus,GEO,Accession number)上找到。

表A序列的SEQ ID NO:

实施例4：OsNAC5的转基因过表达增加植物对干旱和高盐度条件的耐受性

为了考察OsNAC5在胁迫条件下的转录水平，我们用来自暴露于高盐度、干旱、ABA和低温的14日龄稻幼苗的叶和根组织的总RNA进行了RNA凝胶印迹分析（图5A）。干旱、高盐度和ABA处理显著诱导OsNAC5在叶和根组织二者中的表达，但低温条件不然。OsNAC5的转录水平在干旱和盐处理后0.5小时开始增加，在胁迫施用2小时达到峰值，而用外源ABA处理时转录水平逐渐增加，直至6小时。

为了在转基因稻植物中过表达OsNAC5，通过将OsNAC5的cDNA与分别用于根特异性表达和保守表达的RCc3(Xu等,1995)和GOS2(de Pater等,1992)融合，制备了RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5两个表达载体。用农杆菌介导法(Hiei等,1994)将表达载体转化入稻(稻栽培种日本晴)，每种构建体产生15-20株转基因植物。收集来自生长正常而无矮化的转基因品系的T_1-6种子，选择RCc3:OsNAC1和GOS2:OsNAC1植物二者的三个独立的T_5-6纯合品系用于进一步分析。为了测定OsNAC5在转基因植物中的表达水平，用来自培养在正常生长条件下的14日龄幼苗的叶和根的总RNA进行了RNA凝胶印迹分析。仅在RCc3:OsNAC5植物的根中及在GOS2:OsNAC5植物的叶和根二者中，而未在非转基因（NT）和无效合子（无转基因的分离子）植物中检测到OsNAC5表达水平提高（图5B）。

为了评价转基因植物对干旱胁迫的耐受性，通过在温室中不浇水来用干旱胁迫处理1月龄转基因和NT对照植物。在干旱处理的时程中，两种转基因植物都表现得比NT对照好，显示延迟的胁迫诱导的损伤的症状，如萎蔫和卷叶，伴随叶绿素丢失（图6A）。转基因植物还在重新浇水直至7天的过程中恢复得更好。转基因植物的存活率在60%至80%的范围内，而NT对照植物没有恢复的迹象。

为了进一步验证转基因植物的胁迫耐受性，我们测量了Fv/Fm值的改变，Fv/Fm值是光系统II（PSII）在暗适应状态下的光化学效率的指示。用干旱、高盐度和低温处理2周龄转基因和NT对照植物的叶盘所示时间。非胁迫植物的Fv/Fm值约为0.8。在干旱（0.5小时）和高盐度（2小时）条件的起始阶段，RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的Fv/Fm水平比NT对照的Fv/Fm水平高15-22%（图6B）。但是，在延长的干旱（2小时）和高盐度（6小时）胁迫以及低温条件下，该水平保持与NT对照的水平相似，表明该转基因植物中等水平的耐受性。JIP测试提供了通过分析暗适应的植物在光照后50μs和300μs之间的叶绿素α萦光瞬变来测量胁迫耐受性的备选方式(Redillas等,2011a和2011b)。JIP测试携带关于PSII单元的天线(antennas)之间的连接性的信息。此连接性可以解释为显示所谓的L带的差异动力学。在该植物的连接性高于（或低于）未处理的NT对照的连接性时，此带为阴性（或阳性）。此连接性用F_v/F_m分析不可测量，F_v/F_m分析还测量植物的叶绿素α萦光。我们在处于生殖阶段的植物上进行了JIP测试，显示两种转基因植物在干旱条件下都具有比NT对照高的连接性（图6C和D）。更具体而言，该连接性在RCc3:OsNAC5植物中高于GOS2:OsNAC5植物中，而在RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物中都高于NT对照，显示生殖阶段的干旱耐受性差异。

表III.RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5转基因稻植物在正常大田条件下的农艺性状

每个参数值代表RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物及各NT对照的平均值±SD(n=30)。显示RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的值与各NT对照的值之间的百分比差异(%Δ)。星号(^*)表示显著性差异(p<0.05)。

实施例5：OsNAC5的过表达在正常和干旱条件下都增加谷粒产量

在正常和干旱条件下在水稻田中评价了RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的大田表现两个栽培季。将RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的三个独立的T₅(2009)和T₆(2010)纯合品系与非转基因（NT）对照一起移植至水稻田，并培养至成熟。从三个重复记录每个转基因品系的30株植物的产量参数。来自两年的大田试验的数据集通常一致，RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的谷粒总重分别增加了9-15%和13-26%。两种转基因植物中谷粒总重的增加与每穗的小穗数和小穗总数的增加及与NT对照相似的饱满率相偶联（图7A；表III）。

为了在干旱条件下测试转基因植物，将RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的三个独立的T₅(2009)和T₆(2010)品系移植至配有可拆卸雨棚的改良大田。使植物在抽穗期（从抽穗前10天至抽穗后10天）暴露于干旱胁迫。胁迫至完全卷叶后，过夜灌溉植物，并立即再次进行第二轮的干旱处理，直至完全卷叶。完成干旱处理后，在种子成熟期灌溉植物，以允许恢复。在雨棚下施加的干旱胁迫的水平等同于产生在正常生长条件下获得的谷粒总重的40%的水平，该水平为NT植物在正常和干旱条件之间的谷粒总重水平的差异所证明（表III和IV）。记录的两个栽培季的产量参数的统计学分析显示，在RCc3:OsNAC5植物中，干旱条件下谷粒产量的减少显著小于在GOS2:OsNAC5或NT对照中观察到的减少。具体而言，在干旱处理的RCc3:OsNAC5植物中，小穗数和/或饱满率比干旱处理的NT植物中高，取决于转基因品系，其使谷粒总重增加33-63%(2009)和22-48%(2010)(图7B；表III)。相反，在干旱处理的GOS2:OsNAC5植物中，谷粒总重减少(2009)或保持与干旱处理的NT对照相似(2010)。鉴于RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物在营养阶段的干旱耐受性水平相似，大田干旱条件下谷粒总重的差异是非常意外的。这些观察结果促使我们检查了转基因植物的根构造。我们测量了培养至生殖抽穗期的 RCc3:OsNAC5、GOS2:OsNAC5和NT植物的根体积、长度、干重和直径。如图4A和B中所示，RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的根直径分别比NT对照植物的根直径大30%和10%。横切根的显微镜分析显示，根直径的增加是由于RCc3:OsNAC5根的中柱和通气组织增大。具体而言，与NT根相比，后生木质部（Me）（中柱的主要部分）和通气组织（Ae）（源自皮层细胞死亡的组织）在RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5根中更大（图8C）。之前已将后生木质部和通气组织的尺寸与生殖阶段的干旱耐受性相关联（Yambao等,1992；Zhu等,2010）。RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5根的体积和干重也增加，表明这些参数与直径一起促成正常和/或干旱条件下的转基因植物的谷粒产量的增加。

表IV.RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5转基因稻植物在大田干旱条件下的农艺性状

实施例6：鉴定OsNAC5过表达后上调的基因

为了鉴定由OsNAC5的过表达上调的基因，我们在正常生长条件下进行了RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物的表达谱分析，与NT对照相比较。使用从培养在正常条件下的14日龄植物的根提取的RNA样品，用稻3′-tiling微阵列进行了此谱分析。每个数据集获自两个生物学重复。使用单因素方差分析的统计学分析鉴定出25个靶基因，与NT对照相比，其在OsNAC5过表达后在两种转基因根中上调超过3倍(P<0.05)。还在相同的分析中鉴定出19个和18个分别在RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5根中特异性上调的靶基因(表B)。之前进行的微阵列实验（GEO检索号GSE31874）显示62个靶基因中的总计22个（共有、RCc3:OsNAC5特异和GOS2:OsNAC5特异的基因分别为7个、8个和7个）可在干旱、高盐度、冷和ABA下胁迫诱导（表B）。此外，涉及细胞生长和发育的基因GLP(Yin等,2009)、PDX(Titiz等,2006)、MERI(Verica和Medford,1997)和O-甲基转移酶(Held等,1993)在RCc3:OsNAC5根中特异性上调，表明它们在改变根构造中的作用。在OsNAC5转基因根中共同或特异性上调的那些靶基因可以解释改变的根构造，从而解释干旱耐受性提高的表型。

除在两种植物共同上调的25个根表达的基因外，微阵列实验还鉴定出19个和18个分别在RCc3:OsNAC5和GOS2:OsNAC5植物中特异性上调的根表达的基因。许多在胁迫反应中发挥作用的基因在两种转基因根中都上调。这些包括细胞色素P450、ZIM、氧化酶、胁迫反应蛋白和热休克蛋白。还在两种转基因根中鉴定出了转录因子，如WRKY、bZIP和锌指，以及活性氧类别清除系统，如多铜氧化酶、几丁质酶和糖基水解酶。那些靶基因的表达增加可促成对干旱条件的耐受性增强。RCc3:OsNAC5根中特异性上调的靶基因中有已知在细胞生长和发育中发挥作用的GLP、PDX、MERI5和O-甲基转移酶。已提出拟南芥GLP4（其特异性结合IAA）调节细胞生长（Yin等,2009）。PDX涉及维生素B6生物合成，拟南芥pdx1.3突变体强烈减少初生根生长，并提高对盐胁迫和渗透胁迫高敏感性（Titiz等,2006）。MERI5在拟南芥中的过表达导致伴随细胞扩大改变的异常发育（Verica和Medford,1997）。O-甲基转移酶（编码涉及木栓质生物合成的酶的基因）也在RCc3:OsNAC5根中特异性上调。在拟南芥中，发现ZRP4（编码O-甲基转移酶的基因）的转录物优先累积在根；主要定位在内皮层区域，在叶、茎和其他枝条器官中低水平可检测（Held等,1993）。由于其涉及木栓质生物合成，通过根特异性启动子上调三个O-甲基转移酶基因可以促成RCc3:OsNAC5植物相对于GOS2:OsNAC5和NT植物二者增强的干旱耐受性。木质素和木栓质在通过根周围层的壁在称为屏障形成的过程中的木质化和/或栓化来阻止径向氧丧失中发挥主要作用。概括而言，这类靶基因在RCc3:OsNAC5根中增加的表达增大了根组织，增强生殖阶段对干旱胁迫的耐受性。

以下表B显示：与非转基因对照相比RCc3:OsNAC5和/或GOS2:OsNAC5植物中上调的基因

^a相应的基因的全长cDNA序列的序列识别号。^bABA（A）、冷（C）、干旱（D）和盐（S）的胁迫负责基因基于我们的微阵列谱分析数据（检索号：GSE31874）。^c两个独立的生物学重复的平均值。黑体数字表示上调超过3倍（P<0.05）。^d通过单因素方差分析来分析p值。文中讨论的基因为黑体。这些微阵列数据集可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/(Gene Expression Omnibus,GEO)上找到，Accession number：GSE31856。

表B

以上表B中的序列的SEQ ID NO:

实施例7：鉴定与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4相关的序列

利用了数据库序列搜索工具，例如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所保持的序列中，鉴定了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间的局部相似的区域。例如，在TBLASTN算法中，利用了SEQ ID NO:1的核酸编码的多肽，其中使用默认设置，开启过滤器以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在一些情况下，可调整缺省参数来改变搜索的严格性。例如增加E值以显示不太严格的匹配。这样，可鉴定到短的几乎完全的匹配。

表C：NAC1(SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:35)和NAC5(SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:47)核酸和多肽：

序列已经由研究机构如基因组研究机构(Institute for Genomic Research,TIGR；始于TA)尝试性地进行了装配并向公众公开。例如，可以通过关键词搜索，或是采用BLAST算法，运用目的核酸序列或多肽序列，利用真核基因直向同源物(Eukaryotic Gene Orthologs,EGO)数据库来鉴定这样的相关序列。已经针对特定的生物，例如一些原核生物，创建了专门的核酸序列数据库，例如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。此外，对私有数据库的使用也已允许鉴定新型的核酸和多肽序列。

实施例8：NCG多肽序列的比对

以标准设置（慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开放罚分10，空位延伸罚分：0.2）用Clustal2.0渐进式比对算法（Thompson等人（1997）Nucleic Acids Res25:4876-4882；Chenna等人（2003）Nucleic Acids Res31:3497-3500）进行多肽序列的比对。进行微小的人工编辑以进一步优化比对。见图9和10。

实施例9：计算多肽序列之间的全局同一性百分比

利用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034:29.MatGAT:an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.Campanella JJ,Bitincka L,Smalley J;软件由Ledion Bitincka托管)来确定用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比。MatGAT无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法进行一系列的两两比对，计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。

产生基于特定结构域的子序列的MATGAT表格，其可以基于NUG多肽的多重比对。选择保守序列用于MaTGAT分析。此方法在NUG蛋白质的总体序列保守性较低时有用。

实施例10：鉴定用于实施本发明方法的多肽序列中所含的结构域

蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of Protein Families,Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索的常用标签数据库的一个整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，这些数据库利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息来产生蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的、多重序列比对和隐马尔可夫模型的大集合。Pfam由位于英国的桑格研究所服务器（Sanger Institute server）托管。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。

实施例11：NCG多肽序列的拓扑学预测

TargetP1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配所基于的是如下任一N-末端前序列的预测性存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所基于的分值并非真正的概率，且加起来并不必为1。不过，根据TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之间的关系(可靠性级别)可作为该预测的可靠性的指标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。对于预测为包含N-末端前序列的序列，还可以预测潜在的切割位点。TargetP由丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器维护。

在分析序列之前选择许多参数：如生物组别(非植物或植物)、截断值设置(无、预定的截断值设置、或用户指定的截断值设置)和预测切割位点的计算（是或否）。

许多其他算法可用于进行这类分析，包括：

-在丹麦技术大学的服务器上托管的ChloroP1.1；

-在澳大利亚布里斯班的昆士兰大学分子生物科学学院（Institute for Molecular Bioscience）的服务器上托管的Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor1.2版;

-在Edmonton,Alberta,Canada的阿尔伯特大学（University of Alberta）的服务器上托管的PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB2.5;

-在丹麦技术大学的服务器上托管的TMHMM；

-PSORT(URL:psort.org)

-PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003)。

实施例12：其他作物转化

玉米转化

用Ishida等(1996)Nature Biotech14(6):745-50所述方法的改良方案进行玉米(Zea mays)转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型适于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源，但是也可以成功使用其他基因型。授粉后约11天(DAP)，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植物。切离的胚依次生长在含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基、和玉米再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

小麦转化

运用Ishida等(1996)Nature Biotech14(6):745-50描述的方法，进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(可从CIMMYT,Mexico(墨西哥)获得)常用来进行转化。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植株。与农杆菌孵育后，胚依次体外生长在含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基，和再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。绿芽从每个胚转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝 T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

大豆转化

根据Texas A&M专利US5,164,310所述方法的改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(可以得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))常用来进行转化。对大豆种子消毒以进行体外播种。从七日龄幼苗中切出下胚轴、胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。切离这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗涤外植体并转移到选择培养基中。切离再生的芽，置于芽伸长培养基中。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

油菜/卡诺拉转化

利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养并根据Babic等(1998,Plant Cell Rep17:183-188)进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉种子表面消毒，进行体外播种。从体外幼苗中切离附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬浮液中来接种农杆菌(含有表达载体)。随后外植体在含有3mg/l BAP、3%蔗糖、0.7%植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中7天，然后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5,含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)中进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

苜蓿转化

利用(McKersie等1999Plant Physiol119:839–847)的方法转化苜蓿 (紫花苜蓿(Medicago sativa))的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植株的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业(Agriculture Canada))或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture4:111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。可选的，已经选择了RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))用于组织培养(Walker等,1978Am J Bot65:654-659)。子叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等,1999Plant Physiol119:839–847)或LBA4404的过夜培养物进行共培养。外植体在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。将外植体在一半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，但该培养基不含乙酰丁香酮而含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到了花盆中并在温室中生长。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。

棉花转化

按照US5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。于3%次氯酸钠溶液中20分钟，对棉花种子表面消毒，并且在具有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中进行洗涤。然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵(benomyl)的SH培养基中进行萌发。从4至6日龄的幼苗中取出下胚轴，切成0.5厘米的小块，置于0.8%琼脂上。将农杆菌悬浮液（每ml大约108个细胞，从用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物稀释的）用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3天后，将组织转移至具有Murashige和Skoog盐和B5维生素(Gamborg等,Exp.Cell Res.50:151-158(1968))、0.1mg/l2,4-D、0.1mg/l6-糠氨基嘌呤(6-furfurylaminopurine)和750μg/ml MgCL2、以及50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素(以杀死残留细菌)的固体培养基(1.6g/l Gelrite)。在2至3个月（每4至6周进行一次传代培养）后分离单细胞系并且将其在选择培养基上进一步培养以进行组织扩增(30℃,16小时光周期)。接着将转化的组织在非选择培养基上进一步培养2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长的健康外貌的胚转移至具有SH培养基（于细小蛭石中）的试管中，所述培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠氨基嘌呤和赤霉酸。将胚在30℃和16小时的光周期下进行培养，将2至3叶期的小植株转移入具有蛭石和营养物的花盆。使植物变硬，然后转移至温室以进一步栽培。

糖用甜菜转化

将糖用甜菜(Beta vulgaris L.)种子于70%乙醇中消毒1分钟，接着在20%次氯酸盐漂白剂例如Clorox常规漂白剂(可从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA94612,USA购得)中摇动20分钟。以无菌水清洗种子，风干后铺种在萌发培养基上(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(Murashige,T.,和Skoog,1962.Physiol.Plant,15卷,473-497)，包含B5维生素(Gamborg等;Exp.Cell Res.,50卷,151-8.)，添加有10g/l蔗糖和0.8%琼脂)。使用下胚轴组织，基本上按照Hussey和Hepher(Hussey,G.,和Hepher,A.,1978.Annals of Botany,42,477-9)，起始芽培养，并在添加有30g/l蔗糖和0,25mg/l苄氨基嘌呤以及0,75%琼脂,pH5,8的基于MS的培养基上、以23-25℃和16小时光周期，维持生长。用携带含有例如nptII选择标记基因的双元质粒的根癌农杆菌菌株进行转化实验。转化前一天，包含抗生素的液体LB培养物在摇床上(28℃，150rpm)培养至600nm处光密度(O.D.)达到约为1。将过夜培养的细菌培养液离心，重悬于包含乙酰丁香酮(Acetosyringone)的接种培养基(pH5,5)(O.D.为约1)中。将芽基组织切割成薄片(大约1.0cm x1.0cm x2.0mm)。将组织浸入液体细菌接种培养基中30秒。通过滤纸吸取，除去过剩的液体。在包含30g/l蔗糖的基于MS的培养基上共培养24-72小时，接着在包含30g/l蔗糖和1mg/l BAP的基于MS的培养基上进行非选择性培养周期，以诱导芽的发育，并以头孢噻肟消除农杆菌。3-10天后，将外植体转移到包含例如卡那霉素或 G418(50-100mg/l，取决于基因型)的类似选择培养基上。每2-3周将组织转移到新鲜培养基上以维持选择压力。芽的迅速发生(3-4天后)表明现存分生组织的再生而不是新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮继代培养后，将小芽转移到包含5mg/l NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基上。采取额外的步骤以降低产生嵌合的(部分转基因的)转化植物的可能性。用来自再生芽的组织样品进行DNA分析。用于糖用甜菜的其他转化方法为本领域已知，例如Linsey和Gallois的方法(Linsey,K.,和Gallois,P.,1990.Journal of Experimental Botany;41卷,No.226;529-36)或作为WO9623891A公开的国际申请中公开的方法。

甘蔗转化

从田间生长的6月龄甘蔗植株分离长茎(spindles)(Arencibia等,1998.Transgenic Research,7卷,213-22;Enriquez-Obregon等,1998.Planta,206卷,20-27)。通过浸入到20%次氯酸盐漂白剂例如Clorox常规漂白剂(可从Clo-rox商业获取,1221Broadway,Oakland,CA94612,USA)中20分钟，对材料进行消毒。将约0.5cm的横切片以顶部向上的方向放置于培养基上。在包含B5维生素(Gamborg,O.等,1968.Exp.Cell Res.,50卷,151-8)、添加有20g/l蔗糖、500mg/l酪蛋白水解物、0.8%琼脂和5mg/l2,4-D的基于MS(Murashige,T.和Skoog,1962.Plant,15卷,473-497)的培养基上，在暗处23℃培养植物材料4周。4周后将培养物转移到新鲜的相同培养基上。用携带含有例如hpt选择标记基因的双元质粒的根癌农杆菌菌株进行转化实验。转化前一天，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床（25℃,150rpm）上培养至600nm处光密度(O.D.)达到约0.6。将过夜培养的细菌培养液离心，重悬于包含乙酰丁香酮(pH5,5)的基于MS的接种培养基中(O.D.为约0.4)。基于致密结构和黄颜色的形态特征，分离甘蔗胚发生愈伤组织块(2-4mm)，在层流罩中干燥20分钟后浸入到液体细菌接种培养基中10-20分钟。通过滤纸吸除过剩的液体。在置于包含B5维生素和1mg/l2,4-D的基于MS的培养基顶部的滤纸上，在黑暗中共培养3-5天。在共培养后，以无菌水清洗愈伤组织，接着在类似的培养基上进行非选择性培养周期，该培养基包含500mg/l头孢噻肟用于消除农杆菌细胞。3-10天后，将外植体转移到包含B5维生素、1mg/l2,4-D和25mg/l潮霉素(取决于基因型)的基于MS的选择培养基上再培养3周。所有处理均在23℃于黑暗条件下进行。将抗性愈伤组织在缺乏2,4-D、包含1mg/l BA和25mg/l潮霉素的培养基上，于16小时光周期下进一步培养，由此形成芽结构。分离芽，并在选择性生根培养基(基于MS，包含20g/l蔗糖、20mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟)上培养。用来自再生芽的组织样品进行DNA分析。用于甘蔗的其他转化方法为本领域已知，例如参见以WO2010/151634A公开的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。

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Claims

1.用于在生长在非生物胁迫条件下的植物中增强产量相关性状和／或修饰根构造的方法，其包括在植物中引入和表达编码SEQ ID NO4所示的NAC5多肽的核酸，或编码SEQ ID NO：2所示的NAC1多肽的核酸，或编码与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的同源物的核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述核酸有效连接至组织特异性启动子，优选根特异性启动子，进一步优选RCc3启动子，进一步优选来自稻的RCc3启动子。

3.权利要求1的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子，优选GOS2启动子，进一步优选来自稻的GOS2启动子。

4.权利要求1的方法，其中所述增强的产量相关性状包括增加的种子产量或增加的谷粒产量。

5.权利要求1至4的方法，其中所述修饰的根构造包括以下任意一项或多项的增加或改变，或由以下任意一项或多项的增加或改变引起：鲜重或干重形式的根生物量增加、根数目增加、根直径增加、根增大、中柱增大、通气组织增大、通气组织形成增加、皮层增大、皮层细胞增大、木质部增大、分枝改变、穿透能力改善、表皮增大、根冠比增加。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫或盐胁迫的条件下获得。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述NAC5或NAC1多肽包含SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：15所示的基序中的一个或多个。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码NAC5或NAC1的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，进一步优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码NAC5或NAC1的核酸编码表C中所列的多肽中的任一种，或是这种核酸的部分，或能够与这种核酸杂交的核酸。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表C中给出的多肽中任一种的直向同源物或旁系同源物。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸编码SEQ ID NO：4所示的NAC5多肽，或其中所述核酸编码SEQ ID NO：2所示的NAC1多肽。

12.可通过前述权利要求中任一项的方法获得的植物，或其部分，或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码表C中给出的NAC5多肽；或NAC1多肽；或其同源物、旁系同源物或直向同源物的重组核酸。

13.构建体，其包含：

(i)编码表C中给出的NAC5多肽；或NAC1多肽；或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸；

(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列，其至少包含组织特异性启动子；和可选的

(iii)转录终止序列。

14.权利要求13的构建体，其中所述核酸有效连接至植物来源的组成型启动子，优选植物来源的中等强度组成型启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。

15.权利要求13的构建体，其中所述组织特异性启动子优选根特异性启动子，进一步优选RCc3启动子。

16.权利要求13至15中任一项的构建体的用途，用于制备相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的种子产量，和／或增加的生物量和／或修饰的根构造的植物的方法中。

17.植物、植物部分或植物细胞，其用权利要求13至15中任一项的构建体转化。

18.用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状，优选增加的产量相关性状，和／或相对于对照植物具有增加的种子产量和／或增加的生物量的转基因植物的方法，其包括：

(i)在植物细胞或植物中引入和表达编码表C中给出的NAC1或NAC5多肽或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸；和

(ii)在非生物胁迫条件下培养来自步骤(i)的所述植物细胞或植物，其中所述植物具有增加的种子产量和修饰的根构造。

19.权利要求18的方法，其中所述核酸有效连接至组织特异性启动子，优选根特异性启动子，进一步优选RCc3启动予，进一步优选来自稻的RCc3启动子。

20.权利要求18的方法，其中所述核酸有效连接至组成型启动子，优选GOS2启动子，进一步优选来自稻的GOS2启动子。

21.相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物，其源自编码表C中给出的NAC1或NAC5多肽；或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸的调节表达。

22.权利要求12、17或21的转基因植物或从其衍生的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，如甜菜、糖用甜菜或苜蓿；或单子叶植物，如甘蔗；或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱或燕麦。

23.权利要求22的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是根生物量和／或种子。

24.产品，其衍生自权利要求22的植物和／或权利要求23的植物的可收获部分。

25.编码表C中给出的NAC1或NAC5多肽；或其同源物、旁系同源物或直向同源物的核酸的用途，用于在植物中相对于对照植物增强产量相关性状。

26.用于制备产品的方法，其包括培养权利要求12、17、21或22的植物，并从或通过所述植物或其部分(包括种子)产生所述产品的步骤。