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CN103966138A - 孟加拉副球菌n74-1及其在水产养殖水质净化中的应用 - Google Patents

孟加拉副球菌n74-1及其在水产养殖水质净化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株新分离的孟加拉副球菌(Paracoccus bengalensis)N74-1,该菌保藏编号为CGMCC No.9148。本发明还提供菌株N74-1在水产养殖水质净化中的应用。本发明提供的孟加拉副球菌N74-1具有异养硝化及好氧反硝化功能,能够同时去除水体中的氨态氮和亚硝态氮,与复合菌剂的生产过程相比,制备工艺更为简单,兼具硝化和反硝化双重功能,适用于工厂化循环水养殖水处理。

Description

孟加拉副球菌N74-1及其在水产养殖水质净化中的应用
技术领域
本发明涉及水产养殖中氨态氮和亚硝态氮的生物处理技术领域,具体地说,涉及孟加拉副球菌N74-1及其在水产养殖水质净化中的应用。
背景技术
近年来,随着我国水产养殖业发展,早期的粗放式、半集约化养殖业逐渐向工厂式、高度集约化方向发展。然而在满足人们对各种水产品的要求同时,高密度养殖水体,也由于大量饵料的投入、频繁的换水和大量消毒及抗菌药的使用,使水环境污染负荷日益加重,病害频繁发生。在养殖过程中,水产动物的粪便、分泌物及残饵的累积,会升高水中氨态氮和亚硝态氮的浓度,导致养殖水产动物容易发病或死亡,使水产养殖的总产及单产下降,且提高了养殖成本。为了避免这种情况发生,需要及时、大量的换水以稀释有毒物质的浓度,不仅浪费了水资源而且额外增加了能源消耗。
水产养殖废水的生物处理能够去除废水中的氨态氮和亚硝态氮等有毒污染物,使养殖用水得到循环利用,既能满足集约化生产需求又避免了环境污染,而且节约用水,符合水产养殖业可持续发展的要求。水产养殖生物处理方法中普遍采用生物滤器,依靠附着在过滤载体上的微生物去处污染物。水产养殖环境中有机物含量少,生物滤器中载体上的生物膜成膜较慢,而且自养的硝化细菌倍增时间长,生长缓慢,由于整个生物反应器的挂膜效率低,从启动到正常运行往往需要半个月时间。通过添加外源的水质净化微生物菌剂能够强化载体过膜,缩短启动时间,但目前水产养殖微生物菌剂主要是针对养殖的微生态菌剂,其中光合细菌等,适用于池塘养殖的菌株,并不能在工厂化循环水养殖中很好地发挥作用。
发明内容
本发明的目的是提供孟加拉副球菌N74-1及其在水产养殖水质净化中的应用。
为了实现本发明目的,本发明从活性污泥中分离出一株可去除水产养殖水体中氨态氮及亚硝态氮的副球菌,该菌为孟加拉副球菌(Paracoccus bengalensis)N74-1,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101,保藏编号CGMCC NO.9148,保藏日期2014年5月12日。
孟加拉副球菌N74-1的16S rDNA序列如Seq ID No.1所示。
该菌的生理生化特性为:硝酸还原,吲哚反应阴性,不利用葡萄糖产酸;脲酶,葡萄糖苷酶,蛋白酶,半乳糖苷酶反应均为阴性;够利用碳源有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯醇、N-乙酰葡萄糖胺、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、乳酸钠、柠檬酸钠及苯乙酸;不利用糊精、纤维二糖、龙胆二糖、水苏糖、棉籽糖、乳糖、蜜二糖、3-甲酰葡糖、果糖、鼠李糖、肌苷、丝氨酸、天冬氨酸、癸酸、己二酸、苹果酸;能够耐受利福霉素、林肯霉素、盐酸胍,不能耐受醋竹桃霉素、万古霉素。
N74-1菌株在电子显微镜下的观察结果如图1所示。
本发明还提供由孟加拉副球菌N74-1制备的菌剂。
本发明还提供一种水质净化剂,其有效成分为上述菌剂。菌株N74-1生长迅速,降解氨态氮及亚硝态氮效率高,同时可以去除水中的有机物,达到对水产养殖水体的净化作用,满足水产品养殖需要。
本发明还提供孟加拉孟加拉副球菌N74-1的发酵培养基,所述培养基配方为:牛肉膏2-4g/L、蛋白胨8-10g/L和氯化钠3-5g/L,pH值7.0-7.5,以水配制。优选地,所述培养基配方为:牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L,pH值7.0-7.5,以水配制。
本发明进一步提供菌株N74-1在水产养殖水质净化中的应用。
具体地,取孟加拉副球菌N74-1种子液,接种至该菌的发酵培养基中,于28-30℃,200rpm培养至总菌数达到1×108个/mL,将所得发酵液按1-3v/v‰的量加入待净化的水产养殖废水中,每日添加1次,连续添加5-7天,然后每周按1-3v/v‰的量补加1次,以降低水体中的氨态氮、亚硝态氮以及有机物的含量,实现水产养殖水体的循环利用。
本发明中涉及的N74-1液体菌剂的制备方法及使用方法如下:
(1)菌种活化:无菌条件下,挑取-80℃低温保存于甘油管的N74-1菌株1-2环,在新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线,28℃-30℃培养2-4天。
(2)挑取一环(1)的培养物至50-150ml牛肉膏蛋白胨液体细菌培养基中28-30℃摇床振荡培养,培养24-30小时至菌数达到1×107个/ml数量级,得到种子液。
(3)将上述种子液,按2-5%的体积比,接种至新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,28℃发酵培养,至总菌数达到1×108个/ml数量级,停止发酵,所得发酵菌液即为微生物水质净化菌剂。
使用方法:在使用初期,将菌液按水处理反应器的1-3v/v‰的量进行每日添加,要求连续添加5-7天,然后每周按1-3v/v‰的量补加1次,直到水产养殖系统中生物处理装置正常运转。
其中,牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法为:称取牛肉膏3g、蛋白胨10g和氯化钠5g,加入蒸馏水1L,用1mol/L的NaOH水溶液调pH至7.0-7.5,121℃,灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法为:在上述液体培养基的基础上添加1.5%-2%琼脂,121℃,灭菌20min。
菌株N74-1的主要性能:
1、菌株N74-1具有异养硝化能力,能够在有机物存在条件下快速生长,将氨态氮氧化为硝态氮,并且没有亚硝态氮的残留,有利于降低水产养殖水体中对养殖动物有毒的氨态氮浓度。优势在于能够迅速通过异养培养获得大量的菌体,从而强化水产养殖水处理反应器的启动过程。
2、菌株N74-1具有好氧反硝化功能,能够在好氧条件下去除亚硝态氮,降低水体中的亚硝酸盐含量,减少亚硝态氮对水产养殖的危害;同时也能消减水体中的总氮,达到消减污染物排放的目的。
本发明提供的由菌株N74-1发酵制备的菌剂能够同时去除水产养殖水体中的关键污染物:氨态氮和亚硝态氮,并且具有一定的降解COD的能力。此外,N74-1能够在异养培养基上快速生长,从而区别于自养硝化细菌,能够快速获得大量的菌体,添加后能迅速提高反应器去除氨态氮和亚硝态氮的能力。
本发明提供的孟加拉副球菌N74-1具有异养硝化及好氧反硝化功能,能够同时去除水体中的氨态氮和亚硝态氮,与复合菌剂的生产过程相比,制备工艺更为简单,兼具硝化和反硝化双重功能,适用于工厂化循环水养殖水处理。
附图说明
图1为本发明的菌株N74-1在电子显微镜下的观察结果。
图2为本发明实施例2中菌株N74-1在不同碳源条件下去除氨态氮的能力。
图3为本发明实施例2中菌株N74-1在不同碳源条件下的异养硝化效率。
图4为本发明实施例3中菌株N74-1的好氧反硝化效率。
图5为本发明实施例4中涉及的反应器示意图。
图6为本发明实施例4中N74-1菌剂对氨态氮和亚硝态氮的去除效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1微生物水质净化菌剂及其制备方法
在200ml水中配制牛肉膏蛋白胨培养基,加入牛肉膏0.6g,蛋白胨2g,氯化钠1g,用1mol/L NaOH水溶液调pH至7.0,分装250ml三角瓶,各100ml,121℃,灭菌20分钟。接种经过固体平板活化的N74-1菌株两瓶,28℃200转/分钟,摇床培养24h,作为种子液。在7L小型发酵罐中加入5L水,并加入牛肉膏15g,蛋白胨50g,酵母膏15g,NaCl15g,用1mol/L NaOH水溶液调pH至7.0,121℃,灭菌20min。培养基温度降至28℃时,将2瓶种子液混合接种于发酵罐内,温度28℃,通气量5L/分钟,搅拌转速150-200rpm,加入2.5ml泡敌作为消泡剂,每两小时取样一次,稀释后测600nm下的吸光度,至菌浓度达到1×108个/mL时,停止发酵,发酵液即为微生物水质净化菌剂。
实施例2菌株N74-1的异养硝化特性实验
1、材料和方法
(1)培养基
异养硝化培养基:葡萄糖5g,NH4Cl0.76g,NaCl0.3g,酵母膏0.5g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.3g,蒸馏水1L,1mol/L盐酸调pH至7.5,121℃,灭菌20min。
(2)碳源实验
①在异养硝化培养基的基础上分别用蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠各5g替代葡萄糖,配制不同碳源的异养硝化培养基。
②菌种活化:挑取-80℃保存的甘油管菌株一环,于新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线,28℃培养两天,再各挑取一环至5ml灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基,28℃,200rpm培养,培养时间12小时。
③接种:将活化的菌液按2%(v/v)的比例接种至100ml灭菌的上述配制的不同碳源的异养硝化培养基中,28℃,200rpm培养24小时。每24小时取样一次,取1ml样品与-20℃冷冻保存,至实验结束后测每隔10h取样检测一次氨态氮含量。
④氨态氮浓度的检测方法:纳氏试剂光度法(《水和废水检测分析方法》第四版),检测试剂购自连华科技有限公司。
⑤亚硝态氮浓度检测方法:分子吸收光度法(GB7493-87)。
2、实验结果与分析
菌株N74-1在不同碳源条件下去除氨态氮的能力如图2所示。菌株N74-1在不同碳源条件下的异养硝化效率如图3所示。菌株N74-1在乙酸钠和丁二酸钠为碳源时,利用氨态氮能力最强,35小时能将约320mg/L氨态氮利用75%以上,结果表明小分子酸类更易于被菌株N74-1利用,用于异养硝化,经检测,培养液没有亚硝态氮积累。水产养殖中氨态氮浓度基本维持在5mg/L以下,远远低于实验浓度,所以该菌可以很好地适用于水产养殖水体的净化。
实施例3菌株N74-1的好氧反硝化特性实验
1、材料和方法
(1)好氧反硝化培养基:葡萄糖5g,NaNO20.78g,NaCl0.3g,酵母膏0.5g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.3g,蒸馏水1L,1mol/L盐酸调pH至7.5,121℃,灭菌20min。
(2)菌种活化:挑取-80℃保存的甘油管菌株一环,于新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线,28℃培养两天,再各挑取一环至5ml灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基,28℃,200rpm培养,培养时间12h。
(3)接种:将活化的菌液按2%(v/v)的比例接种至100ml灭菌的好氧反硝化培养基中,28℃,200rpm培养24小时。每6小时取样一次,取1ml样品与-20℃冷冻保存,至实验结束后取样检测亚硝态氮及硝态氮含量。
(4)亚硝态氮浓度检测方法:分子吸收光度法(GB7493-87)。
(5)硝态氮浓度检测方法:紫外分光光度法(《水和废水检测分析方法》第四版)。
2、实验结果与分析
菌株N74-1的好氧反硝化效率如图4所示。在初始亚硝态氮浓度为160mg/L条件下,该菌能够在异养培养基中迅速利用亚硝态氮,经过85小时后能将亚硝态氮浓度降低到10mg/L以下,说明该菌具有良好的亚硝态氮耐受性和好氧反硝化能力,同时也能够降低培养基中的硝态氮浓度。水产养殖用水中亚硝态氮浓度远远低于实验浓度(1mg/L以下),所以该菌能够适用于水产养殖水体中亚硝态氮及硝氮的去除。
实施例4利用微生物水质净化菌剂强化移动床填料挂膜实验
1、材料和方法
模拟水产养殖水:蛋白胨20mg,NH4Cl38.2mg,NaHCO371.4mg,NaHPO418.85mg,自来水1L。
模拟养殖池体积:8L,移动床体积:2L,悬浮填料:600ml。
反应器运行方法:序批式运行,即氨态氮降至1mg/L后重新按38.2mg/L添加NH4Cl。
菌剂添加方法:实验组和对照组反应器内初始均为水产养殖水体(来自北京市通州某观赏鱼养殖基地),运行第1、8天,实验组添加2‰(v/v)的实施例1中制备的微生物水质净化菌剂(即N74-1菌剂)。
反应器示意图如图5所示,循环水箱为模拟水产养殖池,通过浓缩液池泵入配水以提供足够的氨氮浓度用于模拟水产养殖水体。模拟水产养殖水通过蠕动泵泵入反应器,经过附着在填料上的微生物作用去除水体中的氨氮、亚硝氮等污染物,然后通过出水管流回循环水箱。
2、结果和分析
N74-1菌剂对氨态氮和亚硝态氮的去除效果如图6所示。从图6可以看出,菌剂的添加显著提高了实验组氨态氮的去除效率,减少亚硝态氮的产生,在20天内氨态氮和亚硝态氮浓度降低到水产养殖需求以内,反应器启动成功。而未添加菌剂的对照组亚硝态氮长期积累,虽然后期降低后,重新补加氨态氮后不能迅速降解,导致养殖池中氨态氮浓度积累,反应器运行不稳定。该实验表明添加N74-1菌剂能够缩短移动床反应器的启动,可以快速稳定的为水产养殖提供循环出水。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.孟加拉副球菌(Paracoccus bengalensis)N74-1,其特征在于,其保藏编号为CGMCC No.9148。
2.由权利要求1所述孟加拉副球菌N74-1制备的菌剂。
3.一种水质净化剂,其特征在于,其有效成分为权利要求2所述的菌剂。
4.权利要求1所述孟加拉副球菌N74-1的发酵培养基,其特征在于,所述培养基配方为:牛肉膏2-4g/L、蛋白胨8-10g/L和氯化钠2-5g/L,pH值7.0-7.5,以水配制。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基,其特征在于,所述培养基配方为:牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L和氯化钠5g/L,pH值7.0-7.5,以水配制。
6.权利要求1所述孟加拉副球菌N74-1在水产养殖水质净化中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,取孟加拉副球菌N74-1种子液,接种至权利要求4或5所述的发酵培养基中,于28-30℃,200rpm培养至总菌数达到1×108个/mL,将所得发酵液按1-3v/v‰的量加入待净化的水产养殖废水中,每日添加1次,连续添加5-7天,然后每周按1-3v/v‰的量补加1次,以降低水体中的氨态氮、亚硝态氮以及有机物的含量,实现水产养殖水体的循环利用。
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