CN115975860A - 一株传染病研究所副芽孢杆菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水体微生物修复技术领域，具体涉及一株传染病研究所副芽孢杆菌菌株及其用途。所述菌株为传染病研究所副芽孢杆菌(Metabacillus idriensis)ADOM08，已于2022年08月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25498。本发明提供的传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08可显著降解藻源溶解性有机质、降低水华水体有机污染，同时具有高效抑制有害微藻生长的作用，因此该菌株可用于控制水华，具有重要的现实意义和应用前景。

Description

一株传染病研究所副芽孢杆菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及水体微生物修复技术领域，具体涉及一株传染病研究所副芽孢杆菌菌株及其用途。

背景技术

当前，人类活动导致水体富营养化加剧，世界范围内有害微藻水华频繁发生，例如在水产养殖系统随着集约化水产业发展水华现象日趋严重，藻消亡及释放的藻毒素污染水体及水产品，最终危害人类的安全健康。因而水华的防治已成为研究热点和前沿科学问题，同时寻找能够有效防治有害微藻生长的技术方法是现阶段水生态保护与修复的重要内容之一。

尽管物理和化学方法已被应用于藻华治理，但外来添加物会引发二次环境污染问题，如大量使用的粘土悬浮于水体影响生物生长及存活，化学抑藻剂硫酸铜会造成水体重金属污染。现阶段，环境友好型藻华防治技术日益受到人们重视，主要包括利用大型水生植物(包括大型藻类植物)或微生物与微藻间的相互作用来防治藻华，但在水产养殖系统特别是以植食性为主(如草鱼)的系统中水生植物应用受限，而且水生植物的存在及大量生长也不利于养殖对象回拢收捕。而微生物因其分布广、种类多、代谢繁殖快及环境侵扰小等特点，在水华防治方面表现出巨大潜力，它们主要通过营养盐竞争或产生化感物质(次生代谢产物)等途径来抑制微藻生长。例如在水华发生过程中，藻细胞死亡释放大量的藻源溶解性有机质(algae-derived dissolved organic matter,ADOM)，ADOM经自然光降解后可转化为小分子营养盐供藻类生长需求从而使水华持续发生发展，而利用微生物加快ADOM的代谢利用，加强与微藻之间的营养竞争，减少藻类营养供给，可大大缩短水华历程，达到控制水华、修复污染的目的。再者，水华系统中乃至自然水体中会存在一些溶藻细菌，它们可代谢产生某些溶藻成分来直接杀死藻细胞，对维持藻类生物量平衡起着重要作用。因而近年来有益微生物在水华防治方面研究颇多，如以菌体为主体成分的微生物酶制剂的开发应用成为一大研究热点，但研究应用效果因不同菌种的潜能差异而存在较大不同。

发明内容

针对物理和化学水华控制技术中的二次环境污染的技术问题，本发明提供一株传染病研究所副芽孢杆菌菌株及其用途，该传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08可显著降解藻源溶解性有机质、降低水华水体有机污染，同时具有高效抑制有害微藻生长的作用，因此该菌株可用于控制水华，具有重要的现实意义和应用前景。

第一方面，本发明提供一株传染病研究所副芽孢杆菌(Metabacillus idriensis)ADOM08，该菌株已于2022年08月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25498。

第二方面，本发明提供一种传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08在防治微藻水华中的用途。

进一步的，使用传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08降解蓝藻源溶解有机质和/或抑制铜绿微囊藻生长。

进一步的，使用传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08的菌体悬液降解水体中的蓝藻源溶解有机质。

进一步的，按3％-10％的体积比将菌体悬液添加到含有蓝藻源溶解有机质的水体中进行降解，菌体悬液的活菌数为1×10⁸-2×10⁸个/mL，降解时间为12h以上。

进一步的，按5％的体积比将菌体悬液添加到含有蓝藻源溶解有机质的水体中进行降解，菌体悬液的活菌数为1.44×10⁸-2×10⁸个/mL，降解时间为72h以上。

进一步的，菌体悬液按照如下制备方法获得：

将传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08接种到灭菌LB培养基中，28℃、250rpm条件下摇床培养2天，离心菌体然后重悬在生理盐水中获得。

进一步的，使用传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08的发酵液抑制铜绿微囊藻生长。

进一步的，按0.3％-5％的体积比将发酵液添加到含有铜绿微囊藻的水体中进行藻生长抑制，发酵液的活菌数为8×10⁸-9×10⁸个/mL，抑藻培养时间为2天以上。

进一步的，抑藻培养条件为在30℃、光照强度4000lx、光暗比16h:8h下静置培养。

进一步的，按0.5％-2％的体积比将发酵液添加到含有铜绿微囊藻的水体中进行藻生长抑制，发酵液的活菌数为8.94×10⁸-9×10⁸个/mL，抑藻培养时间为5天以上。

进一步的，发酵液按照如下制备方法获得：

将传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08接种到灭菌LB培养基中，30℃、250rpm条件下摇床培养5天后获得。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08对蓝藻源溶解有机质具有较强的降解及污染修复能力、对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生长具有显著抑制作用，可大大改善水体生态状况，有望开发环境友好型抑藻菌剂应用于水华的生物防控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例2筛选到的5株活性菌株对蓝藻源溶解有机质的降解效果对比图。

图2是实施例2筛选到的5株活性菌株对铜绿微囊藻的生长抑制效果对比图。

图3是实施例2中菌株ADOM08的系统发育树。

图4是实施例3的光吸收系数变化曲线。

图5是实施例3的化学需氧量变化曲线。

图6是实施例4中菌株ADOM08发酵液添加体积比对铜绿微囊藻的生长影响变化曲线。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1ADOM培养基的制备

选取蓝藻水华发生草鱼养殖池塘取水样，取样水体的主要藻类组成如下表1所示。水样经离心获得藻浆，将藻浆用超纯水洗净后取10g(湿重)加入50mL超纯水混匀，用超声波细胞粉碎机超声粉碎，再放入液氮中快速冷冻，再解冻，重复2遍，将藻细胞打破，经0.45μm滤膜过滤，高压湿热灭菌(121℃、20min)后获得10倍藻源溶解有机质储备液，密封防菌、避光、低温保存。临用时，取适量储备液用0.9％生理盐水稀释至工作浓度，调pH值至7.8，分装于锥形瓶中灭菌(121℃、20min)备用。

表1取样水体主要藻类组成

实施例2活性菌株分离筛选

采集水华发生草鱼养殖池塘水体作为降解菌分离源，采用实施例1配制的ADOM培养基富集培养7天后，应用涂布平板及划线分离法分离纯化菌种，最终获得19株细菌，依次命名为ADOM01-ADOM19。

将各株细菌分别置于100mL灭菌的营养肉汤培养基(商品)中，28℃、250rpm条件下活化培养1-2天，然后从中各取出5mL菌培养液分别加入到100mL ADOM培养基中培养，培养条件为28℃、250rpm、避光，并以相同体积的灭菌营养肉汤培养基代替菌培养液作为空白对照，于48h后取样，经0.22μm滤膜过滤后测定ADOM的紫外-可见光谱吸收曲线。

检测条件为：波长230-500nm、1cm石英比色皿、间隔1nm、以纯水做参比。以280nm处的光吸收系数α₍₂₈₀₎表征ADOM含量，并计算降解率，公式如下：

比较各菌株对ADOM的降解效果。结果如图1所示，发现共有5株细菌(ADOM05、ADOM08、ADOM09、ADOM11、ADOM18)具有较高促进蓝藻源溶解有机质分解的能力，它们对ADOM的48h降解率分别为50.72％、61.16％、56.96％、65.46％和54.42％，菌株之间降解效果差异显著，以ADOM11>ADOM08>ADOM09＝ADOM18>ADOM05。将5株细菌接入LB斜面培养基，4℃保存备用。

将上述5株细菌制成发酵液，每株取10mL单独接种于100mL灭菌的LB培养基，30℃、250rpm摇床培养发酵5天。随后取1mL发酵液接种入50mL处于对数生长期的铜绿微囊藻藻液中，置于光照培养箱静置培养，培养条件为30℃、光照强度4000lx、光暗比16h:8h，并以相同体积的灭菌LB培养基代替发酵液作为空白对照，每天定时摇动3～5次。培养5天后取样镜检测定藻细胞密度，计算每株菌的抑藻率，公式如下：

比较各菌株铜绿微囊藻生长的抑制效果。结果如图2所示，5株细菌(ADOM05、ADOM08、ADOM09、ADOM11、ADOM18)的发酵液在添加体积比为2％时，对铜绿微囊藻5天抑制率分别为81.49％、89.31％、79.54％、70.31％和53.51％，菌株之间抑藻效果差异显著，以ADOM08>ADOM05＝ADOM09>ADOM11>ADOM18。

最终综合比较，认为ADOM08具有较强的蓝藻源溶解有机质降解和铜绿微囊藻生长抑制能力，活性最优。

对菌株ADOM08进行革兰氏染色，观察菌落形态、菌体显微形态。菌株ADOM08为好养或兼性厌氧、革兰氏阳性，杆状，运动，产芽孢，在营养肉汤培养基上生长时，菌落圆形、橘黄色、不透明、扁平、表面湿润。

将经纯化、发酵培养后的菌株ADOM08送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA分子片段扩增测序。

引物为27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

最终得到菌株ADOM08的16S rDNA序列为：

GGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATACTATGTCAAACCGCATGGTTTGACATTCAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTGCCGGAGTAACTGCCGGCACCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGCCACTTCTAGAGATAGAAGGTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAG。

将ADOM08的测序序列提交至GenBank进行比对，然后构建该菌株的系统发育树，如图3所示，鉴定菌株ADOM08为传染病研究所副芽孢杆菌(Metabacillus idriensis)。

实施例3菌株ADOM08对ADOM的降解及污染修复效果

将菌株ADOM08在LB斜面培养基上活化后，接种到灭菌LB培养基中，28℃、250rpm条件下摇床培养2天，取5mL菌液离心(10000r/min，30min)获得菌体细胞，然后重悬在5mL生理盐水中获得活菌数为1.44×10⁸个/mL的菌体悬液。

将菌体悬液全部添加于100mL灭菌ADOM培养基中，28℃、250rpm、避光培养，并以相同体积的灭菌生理盐水代替菌体悬液作为空白对照，分别于0h、12h、24h、48h、72h、96h取样并经0.22μm滤膜过滤后测定ADOM的紫外-可见光谱吸收曲线，检测条件同实施例2。采用酸性高锰酸钾法测定滤液的化学需氧量(COD_Mn)，评估水体有机污染程度的变化。

结果如图4、图5所示。空白对照在培养期间紫外-可见光谱吸收曲线未发生任何变化；而添加ADOM08菌体悬液的处理组中，蓝藻源溶解有机质在72h内表现出快速降解趋势，72hADOM降解率达69.23％，至96h有所升高，可能与菌体细胞死亡释放细菌性溶解有机质有关。化学需氧量COD_Mn有相似的变化趋势，72h有机污染(COD_Mn)去除率达72.40％。

实施例4菌株ADOM08发酵液对铜绿微囊藻的抑藻效果

将菌株ADOM08在LB斜面培养基上活化后，取10mL接种到100mL灭菌LB培养基中，30℃、250rpm条件下摇床培养5天，得到活菌数为8.94×10⁸个/mL的发酵液。取发酵液100μL、250μL、500μL、1000μL分别添加至50mL处于对数生长期的铜绿微囊藻藻液中，使其添加体积比为0.2％、0.5％、1％、2％四个梯度，并以不添加发酵液处理为空白对照，随后置于光照培养箱中静置培养，培养条件为30℃、光照强度4000lx、光暗比16h:8h，每天定时摇动3～5次，每天定时取样镜检检测藻细胞密度，计算抑藻率，连续监测5天。

结果如图6所示，除0.2％外，ADOM08发酵液在0.5％、1％、2％的供试添加体积比下对铜绿微囊藻的生长均有显著抑制作用，且添加比例越大抑藻效果越明显，各梯度5天抑藻率分别为34.21％、78.02％和82.53％，2％的添加体积比下抑藻效果最佳。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株传染病研究所副芽孢杆菌(Metabacillus idriensis)ADOM08，其特征在于，该菌株已于2022年08月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25498。

2.一种如权利要求1所述的传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08在防治微藻水华中的用途，其特征在于，使用传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08降解蓝藻源溶解有机质和/或抑制铜绿微囊藻生长。

3.如权利要求2所述的用途，使用传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08的菌体悬液降解水体中的蓝藻源溶解有机质。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，按3％-10％的体积比将菌体悬液添加到含有蓝藻源溶解有机质的水体中进行降解，菌体悬液的活菌数为1×10⁸-2×10⁸个/mL，降解时间为12h以上。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，按5％的体积比将菌体悬液添加到含有蓝藻源溶解有机质的水体中进行降解，菌体悬液的活菌数为1.44×10⁸-2×10⁸个/mL，降解时间为72h以上。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，菌体悬液按照如下制备方法获得：

将传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08接种到灭菌LB培养基中，28℃、250rpm条件下摇床培养2天，离心菌体然后重悬在生理盐水中获得。

7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，使用传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08的发酵液抑制铜绿微囊藻生长。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，按0.3％-5％的体积比将发酵液添加到含有铜绿微囊藻的水体中进行藻生长抑制，发酵液的活菌数为8×10⁸-9×10⁸个/mL，抑藻培养时间为2天以上。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，按0.5％-2％的体积比将发酵液添加到含有铜绿微囊藻的水体中进行藻生长抑制，发酵液的活菌数为8.94×10⁸-9×10⁸个/mL，抑藻培养时间为5天以上。

10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，发酵液按照如下制备方法获得：

将传染病研究所副芽孢杆菌ADOM08接种到灭菌LB培养基中，30℃、250rpm条件下摇床培养5天后获得。

Images