CN103965469B - 液态外源性no供体及其制备和应用方法 - Google Patents
液态外源性no供体及其制备和应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的液态外源性NO供体，还提供了上述液态外源性NO供体的制备方法及其在制备防治脑卒中药物中的应用。本发明提供的液态外源性NO供体，经适当调制，能在一定条件下持续稳定释放NO，特别适合以鼻腔涂抹的方式给药。基于鼻腔和脑颅在解剖学上的结构关系和NO在防治脑卒中过程中的病理作用，其有望能成为一种生物利用率高、效果显著的防治脑卒中药物。其制备过程简便、可靠、易于实现。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，特别涉及一种液态外源性一氧化氮(NO)供体，以及该供体经鼻腔释放NO防治脑卒中的软膏药物及其制备方法。
背景技术
中国是世界上脑卒中发病率最高的国家之一。近二十年监测结果显示，脑卒中已经升为中国人的主要死因之一，年死亡人数逾200万，其中缺血性脑卒中占比接近80％。缺血性脑卒中是指局部脑组织因血液循环障碍，缺血、缺氧而发生的软化坏死。目前90％以上的脑血管扩张用药由于血脑屏障的存在而难以奏效。所以，基于鼻腔和脑颅在解剖学上的结构关系，鼻腔给药有望成为一种能绕过血脑屏障的脑部靶向给药手段。鼻腔给药试剂的研发和给药的转运途径也成为新的研究热点。
NO作为一种内源性的气态信号因子，已经被大量研究证明对于缺血性脑卒中导致的神经和脑组织的局部坏死有缓解症状和治疗作用。其原理主要是通过扩张脑血管，抑制血栓，从而增加缺血部位供血，同时调节神经元受体活性，起到神经保护作用。所以相关NO外源供体的设计是防治缺血性脑卒中的关键，而含有Diazeniumdiolate结构NO外源供体被认为是目前最有希望取得临床应用的一类供体。Diazeniumdiolate结构是由两个N原子和两个O原子形成的共振结构[N(O-)N＝O]-，这个结构连接到载体分子链上的N原子上，可以在生理条件下自发分解产生NO，每1mol共振结构能产生2mol NO，其机理如下图所示：
中国专利申请号为201210410372.2的专利文件公开了一种带有有机荧光分子的壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体的制备方法。有机荧光分子和壳聚糖及其衍生物通过静电自组装得到复合物，再复合物上构建Diazeniumdiolate结构后再与氯化铜在缓冲溶液中反应制得有机荧光分子-壳聚糖纳米复合物一氧化氮供体。该发明产品能在生理环境下持续稳定释放NO，并能进行原位实时探测，生物相容性好。
中国专利申请号为201110383271.6的专利文件公开了一种Diazeniumdiolate型一氧化氮供体的制备方法。将一定脱乙酰度的壳聚糖和壳聚糖衍生物与金属盐水溶液和硫族化合物溶液反应制得量子点复合物，再与一氧化氮在加压条件下反应制得一氧化氮供体。该发明产品生物相容性好，无生理毒性，在高血压、心脏病、呼吸道疾病等治疗和诊断方面有广阔前景。
中国专利申请号为200710172590.6的专利文件公开了一种以改性壳聚糖为载体的一氧化氮供体及其合成方法。通过羧化反应把壳聚糖分子上的伯胺基团转化为仲胺基团，再在甲醇钠的甲醇溶液中同NO气体分子进行反应，构建能释放NO的Diazeniumdiolate结构，所得到的亲核NO供体具有较大的负载量和不同的释放速率。
然而，以上专利文件都是基于壳聚糖聚合物得到的含有Diazeniumdiolate结构的NO外源性供体。开发新的含有Diazeniumdiolate结构的NO外源性供体对于脑卒中的预防和治疗具有重要的意义。
发明内容
发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于PEI修饰Diazeniumdiolate结构的液态外源性NO供体。
本发明的第二目的是提供上述液态外源性NO供体的制备方法及应用。
技术方案：本发明提供的液态外源性NO供体，其结构式如式(I)或式(II)所示：
本发明还提供了上述液态外源性NO供体的制备方法，包括以下步骤：
(1)环氧化物与聚乙烯亚胺(PEI)反应，将聚乙烯亚胺的伯氨基转化为仲氨基；
(2)在碱性有机金属化合物存在下，步骤(1)的产物与NO加成反应构建Diazeniumdiolate结构；纯化即得。
其中，步骤(1)中，所述环氧化物选自环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和环氧丁烷(BO)中的一种或几种。
其中，步骤(1)中，所述聚乙烯亚胺(PEI)选自线性聚乙烯亚胺和支化聚乙烯亚胺中的一种或两种，其分子量范围是500-200000，优选600-70000。
其中，步骤(1)中，反应温度为0-60℃，优选10-30℃；反应时间为4-48h，优选24-48h；环氧化物与聚乙烯亚胺的伯胺基的摩尔比为(1-10)：1，优选(3-5)：1；反应溶剂选自甲醇、乙醇和四氢呋喃中的一种或几种；反应溶剂与聚乙烯亚胺的用量比为(1-30)mL：1g。
其中，步骤(2)中，所述碱性有机金属化合物选自甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾和乙醇钾中的一种或几种；反应体系中，NO的压力为0.1-10MPa，优选0.3-1MPa；反应温度为常温；反应时间为1-10d，优选3-7d；反应溶剂选自甲醇、乙醇和四氢呋喃中的一种或几种；反应溶剂与步骤(1)的产物的用量比为(1-30)mL：1g；其中碱性有机金属化合物与步骤(1)产物中仲胺基团的摩尔比为(10-1):1，优选(3-1):1。
其中，步骤(2)中，纯化步骤为：步骤(1)的产物与NO加成反应产物滴加至4℃以下的无水乙醚中沉淀，过滤，洗涤，即得。
本发明还提供了上述液态外源性NO供体在制备防治脑卒中药物中的应用。
其中，所述药物包括液态外源性NO供体和药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种可用于涂抹鼻腔的软膏剂，包括上述液态外源性NO供体以及吸水性高分子材料，所述吸水性高分子材料选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、羧甲基纤维素(CMC)中的一种或几种；其中，所述外源性NO供体为1-100％，优选10-60％。
有益效果：本发明提供的液态外源性NO供体，经适当调制，能在一定条件下持续稳定释放NO，特别适合以鼻腔涂抹的方式给药。基于鼻腔和脑颅在解剖学上的结构关系和NO在防治脑卒中过程中的病理作用，其有望能成为一种生物利用率高、效果显著的防治脑卒中药物。其制备过程简便、可靠、易于实现。
具体而言，将本发明液态外源性NO供体涂抹到鼻腔后，其能够与水分接触逐渐释放出NO，一次涂抹后NO的释放时间可以持续1-24小时。NO释放后，被鼻腔毛细血管吸收进入循环，基于鼻腔和脑颅在解剖学上的结构关系，可以迅速到达脑部，扩张血管，增强脑部供血，从而起到缓解和防治脑卒中的作用。
附图说明
图1为PEI、PEI-PO和液态外源性NO供体的氢核磁共振(1H-NMR)谱图；
图2为液态外源性NO供体的紫外(UV)光谱图；
图3为液态外源性NO供体的NO释放曲线。
具体实施方式
实施例1
第一步，环氧丙烷(PO)封闭聚乙烯亚胺(PEI)伯胺基反应：称取2g分子量10000的支化PEI，用4mL无水乙醇磁力搅拌溶解并转入烧瓶中，在磁力搅拌下逐滴滴加环氧丙烷，加入的环氧丙烷的摩尔量是聚乙烯亚胺(PEI)的伯胺基的摩尔量的5倍，30℃反应48h。反应后在30℃下真空干燥后得到产物PEI-PO；
第二步，Diazeniumdiolate结构的构建：称取1.2gPEI-PO，用10mL甲醇和10mL四氢呋喃的混合溶剂溶解，转入聚四氟乙烯高压反应釜内胆中。另取甲醇钠溶解在16mL甲醇中并同样转入四氟乙烯高压反应釜内胆中，其中甲醇钠与第一步产物中仲胺基团的摩尔比为3:1，氮气鼓泡10分钟后装入高压反应釜。氮气吹洗3遍，抽真空，NO气体吹洗3遍后，通入NO气体使压力达到0.3Mpa，维持该压力搅拌反应3天。反应完成后，把反应混合溶液缓慢滴加到400mL4℃以下的低温无水乙醚中沉淀过滤，得到淡黄色粘稠液体产物。用甲醇和无水乙醚分别洗涤3遍，然后真空干燥12小时后，即得产物，放入-20℃环境冻存。
结构表征，见图1至3。
图1为1H-NMR谱图，由图可知，原来处在2.7ppm左右的亚甲基峰向低场偏移至3.0ppm，证明了Diazeniumdiolate结构中的吸电子基团[N(O)NO]-成功引入到PEI分子链上。
图2为紫外光谱图，由图可知，Diazeniumdiolate结构中[N(O)NO]-在250nm左右的紫外特征吸收峰很明显地出现在了图谱中，这直接证明了在PEI分子链上构建了能自发分解产生NO的Diazeniumdiolate结构。
图3为液态外源性NO供体的NO释放曲线，由图可知，NO可以在48小时内持续释放，并且在最初的6小时中释放较快。
实施例2
第一步，环氧乙烷(EO)封闭聚乙烯亚胺(PEI)伯胺基反应：称取2g分子量600的支化PEI，用60mL无水甲醇磁力搅拌溶解并转入烧瓶中，在磁力搅拌下逐滴滴加环氧丙烷，加入的环氧丙烷的摩尔量是聚乙烯亚胺(PEI)的伯胺基的摩尔量的1倍，0℃反应24h。反应后在30℃下真空干燥后得到产物PEI-EO；
第二步，Diazeniumdiolate结构的构建：称取1.2gPEI-EO，用10mL甲醇溶解，转入聚四氟乙烯高压反应釜内胆中。另取乙醇钠溶解在10mL甲醇中并同样转入四氟乙烯高压反应釜内胆中，其中乙醇钠与第一步产物中仲胺基团的摩尔比为10:1，氮气鼓泡10分钟后装入高压反应釜。氮气吹洗3遍，抽真空，NO气体吹洗3遍后，通入NO气体使压力达到10Mpa，维持该压力搅拌反应1天。反应完成后，把反应混合溶液缓慢滴加到400mL4℃以下的低温无水乙醚中沉淀过滤，得到淡黄色粘稠液体产物。用甲醇和无水乙醚分别洗涤3遍，然后真空干燥12小时后，即得产物，放入-20℃环境冻存。
其氢谱、紫外光谱和释放曲线与实施例1一致。
实施例3
第一步，环氧丁烷(BO)封闭聚乙烯亚胺(PEI)伯胺基反应：称取2g分子量70000的线性PEI，用2mL无水四氢呋喃磁力搅拌溶解并转入烧瓶中，在磁力搅拌下逐滴滴加环氧丙烷，加入的环氧丙烷的摩尔量是聚乙烯亚胺(PEI)的伯胺基的摩尔量的10倍，60℃反应4h。反应后在30℃下真空干燥后得到产物PEI-BO；
第二步，Diazeniumdiolate结构的构建：称取1.2gPEI-BO，用0.6mL四氢呋喃溶解，转入聚四氟乙烯高压反应釜内胆中。另取甲醇钾溶解在0.6mL四氢呋喃中并同样转入四氟乙烯高压反应釜内胆中，其中甲醇钾与第一步产物中仲胺基团的摩尔比为5:1，氮气鼓泡10分钟后装入高压反应釜。氮气吹洗3遍，抽真空，NO气体吹洗3遍后，通入NO气体使压力达到0.1Mpa，维持该压力搅拌反应10天。反应完成后，把反应混合溶液缓慢滴加到400mL4℃以下的低温无水乙醚中沉淀过滤，得到淡黄色粘稠液体产物。用甲醇和无水乙醚分别洗涤3遍，然后真空干燥12小时后，即得产物，放入-20℃环境冻存。
其氢谱、紫外光谱和释放曲线与实施例1一致。
实施例4
第一步，环氧丙烷(PO)封闭聚乙烯亚胺(PEI)伯胺基反应：称取2g分子量200000的支化PEI，用30mL无水乙醇磁力搅拌溶解并转入烧瓶中，在磁力搅拌下逐滴滴加环氧丙烷，加入的环氧丙烷的摩尔量是聚乙烯亚胺(PEI)的伯胺基的摩尔量的3倍，10℃反应36h。反应后在30℃下真空干燥后得到产物PEI-PO；
第二步，Diazeniumdiolate结构的构建：称取1.2gPEI-PO，用5mL乙醇溶解，转入聚四氟乙烯高压反应釜内胆中。另取乙醇钾溶解在5mL乙醇中并同样转入四氟乙烯高压反应釜内胆中，其中乙醇钾与第一步产物中仲胺基团的摩尔比为10:1，氮气鼓泡10分钟后装入高压反应釜。氮气吹洗3遍，抽真空，NO气体吹洗3遍后，通入NO气体使压力达到1Mpa，维持该压力搅拌反应7天。反应完成后，把反应混合溶液缓慢滴加到400mL4℃以下的低温无水乙醚中沉淀过滤，得到淡黄色粘稠液体产物。用甲醇和无水乙醚分别洗涤3遍，然后真空干燥12小时后，即得产物，放入-20℃环境冻存。
其氢谱、紫外光谱和释放曲线与实施例1一致。
实施例5
与实施例1基本相同，只是将第一步中的环氧丙烷用量增加到1.5ml，得到液态外源性NO供体。
实施例6
与实施例1基本相同，只是将第一步中的环氧丙烷换成等摩尔量的环氧丁烷，得到液态外源性NO供体。
实施例7
与实施例1基本相同，只是将第一步中的反应时间改为24h，得到液态外源性NO供体。
实施例8
与实施例1基本相同，只是将第一步中的反应溶剂乙醇换成等体积的四氢呋喃，得到液态外源性NO供体。
实施例9
与实施例1基本相同，只是将第一步中的反应温度由室温改为30℃恒温反应，得到液态外源性NO供体。
实施例10
与实施例1基本相同，只是将第二步中的混合有机溶剂改为纯甲醇溶剂，得到液态外源性NO供体。
实施例11
与实施例1基本相同，只是将第二步中的有机金属化合物换成乙醇钠，得到液态外源性NO供体。
实施例12
与实施例1基本相同，只是将第二步中的NO气体压力增加到1.0Mpa，得到液态外源性NO供体。
实施例13
与实施例1基本相同，只是将第二步中的高压反应时间由3天增加到7天，得到液态外源性NO供体。
实施例14
与实施例2基本相同，只是第一步中取分子量为500的支化PEI，得到液态外源性NO供体。
Claims (7)
1.液态外源性NO供体，其结构式如式(I)或式(II)所示：
所述的液态外源性NO供体通过以下方法制备：
(1)环氧化物与聚乙烯亚胺(PEI)反应，将聚乙烯亚胺的伯胺基转化为仲胺基；
(2)在碱性有机金属化合物存在下，步骤(1)的产物与NO加成反应构建Diazeniumdiolate结构；纯化即得；
步骤(1)中，所述聚乙烯亚胺(PEI)选自线性聚乙烯亚胺和支化聚乙烯亚胺中的一种或两种，其分子量范围是500-200000；
步骤(1)中，反应温度为0-60℃；反应时间为4-48h；环氧化物与聚乙烯亚胺的伯胺基的摩尔比为(1-10)：1；反应溶剂选自甲醇、乙醇和四氢呋喃中的一种或几种；反应溶剂与聚乙烯亚胺的用量比为(1-30)mL：1g。
2.根据权利要求1所述的液态外源性NO供体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述环氧化物选自环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和环氧丁烷(BO)中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的液态外源性NO供体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱性有机金属化合物选自甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾和乙醇钾中的一种或几种；反应体系中，NO的压力为0.1-10MPa；反应温度为常温；反应时间为1-10d；反应溶剂选自甲醇、乙醇和四氢呋喃中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的液态外源性NO供体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，纯化步骤为：步骤(1)的产物与NO加成反应产物滴加至4℃以下的无水乙醚中沉淀，过滤，洗涤，即得。
5.权利要求1所述的液态外源性NO供体在制备防治脑卒中药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物包括液态外源性NO供体和药学上可接受的载体。
7.一种可用于涂抹鼻腔的软膏剂，其特征在于：包括权利要求1所述的液态外源性NO供体以及吸水性高分子材料，所述吸水性高分子材料选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、羧甲基纤维素(CMC)中的一种或几种；其中，所述外源性NO供体为10-60％。
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