CN109651220B - 一种兰雪醌硒酯类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种如下式(V)所示的兰雪醌硒酯衍生物及其制备方法，所述兰雪醌硒酯衍生物的制备方法为：在N2气氛及0～5℃条件下，将氢化钠溶于溶剂，加入兰雪醌搅拌10～30min，再加入异硒氰酸酯反应3～5h，最后经过后处理得到。本发明制备方法工艺简单，得到的兰雪醌硒酯衍生物对肝癌细胞和结直肠癌细胞的具有较好的靶向选择性和抑制活性，可以将其应用于制备抗肿瘤活性药物中，为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径，在药物开发体系中具有极广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及兰雪醌衍生物，具体涉及一种兰雪醌硒酯类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
兰雪醌(IV)是我国民间常用药白花丹的主要活性成分，是一种天然的萘醌类化合物，具有多种生物学活性以及抗肿瘤、抗肝纤维化、抗肝损伤、抗炎、抑菌等多种药理学作用。
硒是一种化学元素，可以用作光敏材料、电解锰行业催化剂、动物体必需的营养元素和植物有益的营养元素等。硒是人体必需的微量元素，具有不可替代的作用，硒还能直接作用于病毒，抑制病毒在体内的复制，并能参与细胞的修复，预防多种病毒和疾病(如乙肝、心炎等)。人类的四十多种疾病都与人体硒含量过低相关，如癌症、胰脏疾病、心血管病、白内障、糖尿病、肝病、生殖系统疾病等，当硒缺乏的时候，会使得人体免疫能力下降，威胁人类健康和生命。
由于兰雪醌具有诸多显著功效，为了进一步拓宽其应用领域，近年来，一些研究人员对其进行了化学修饰，如US9890106B2公开了一种白花丹素衍生物类抗癌化合物，还公开了白花丹素-5-O-乙酰基对乳腺癌细胞具有很好选择性细胞毒性，可用来治疗乳腺癌。
中国专利申请文献CN102617664公开了一种白花丹素-5-O-葡萄糖，具体以白花丹素为活性母核，通过糖基化反应制得，白花丹素-5-O-葡萄糖的水溶性较白花丹素显著提高，有效解决了白花丹素作为潜在抗肿瘤药物时水溶性欠佳的问题。
但是，现有技术中的化学修饰对兰雪醌的性质改善有限，尚未发现一种对人肝癌细胞(Hep G2)或人结直肠癌细胞(LOVO)有很好的靶向选择性和抑制活性的兰雪醌衍生物。
发明内容
本发明目的在于提供了一种兰雪醌硒酯类衍生物及其制备方法和应用，该兰雪醌硒酯类衍生物提高了对肝癌细胞和结直肠癌细胞的靶向选择性和抑制活性，将其应用于制备抗肿瘤活性药物中，为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种兰雪醌硒酯类衍生物，其结构式如下式(V)所示：
式(V)中，R是C1～C10烷基、被苯基或萘基取代的C1～C10烷基、未被取代或被任意取代的苯基。
优选地，所述的任意取代的苯基中取代基为C1～C3烷基、烷氧基或卤原子。
其中，“C1～C10烷基”是指直链或支链的具有1～10个碳原子的烷基；“被苯基或萘基取代的C1～C10烷基”是指直链或支链上的氢被苯基或萘基取代的具有1～10个碳原子的烷基；“被取代基取代的苯基”是指苯环上邻、间或对位上的氢被取代基取代的苯基；“卤原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子和砹原子。
本发明是通过对兰雪醌结构进行化学修饰，向结构中引入生物活性硒，由于兰雪醌与生物活性硒在结构上的协同作用，可以使得到的兰雪醌硒酯衍生物的药代动力学性质得到改善，其抗氧化和抗肿瘤活性也得到进一步提高。本发明还检测了所述兰雪醌硒酯衍生物对人肝癌细胞(Hep G2)、人结直肠癌细胞(LOVO)、中国仓鼠肺细胞(CHL)的抑制能力，结果表明兰雪醌硒酯衍生物具有良好的抗肿瘤活性，可用于开发成为相关的药物，为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。
作为优选，所述兰雪醌硒酯类衍生物的结构式为：
所优选的化合物对人肝癌细胞(Hep G2)或人结直肠癌细胞(LOVO)具有较好的抑制活性和靶向选择性，其可用于开发成为相关的药物，为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。
本发明还提供了式(V)所示的兰雪醌硒酯类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
其中，式(III)中R的定义与式(V)中相同；
具体反应过程为：在N2气氛及0～5℃条件下，将氢化钠溶于溶剂，加入兰雪醌搅拌10～30min，再加入式(III)所示的异硒氰酸酯反应3～5h，最后经过后处理得到所述兰雪醌硒酯衍生物。
本发明方法通过严格控制反应温度并先加入兰雪醌充分搅拌溶解后再进行后续反应，可以尽量避免副反应的发生，提高兰雪醌硒酯衍生物的产率。
所述的异硒氰酸酯、兰雪醌和氢化钠的物质的量之比为1：0.5～2：1～3，优选为1：0.9～1.1：1.8～2.2，所述反应时间优选为3.5～4.5h，在此优选用量比及反应时间内，副反应最少且反应最完全，减少了杂质的产生，进一步提高了产率。
所述溶剂为无水四氢呋喃，溶剂的体积用量以氢化钠的物质的量计为5～15L/mol。
所述后处理的方法为：反应结束后加水淬灭，蒸去溶剂，用二氯甲烷萃取，收集有机相洗涤、干燥、过滤、旋蒸得粗品；再以200～300目硅胶为柱填料，经薄层层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2为展开剂，v/v)，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂并干燥，得到最终产物。
所述异硒氰酸酯的制备方法，包括如下步骤：
其中，式(I)中R的定义与式(V)中相同；
具体反应过程为：将式(I)所示的胺与甲酸甲酯超声反应100～150min得到甲酰胺中间体，再将甲酰胺中间体溶于溶剂中，加入三光气和三乙胺搅拌回流反应4～10h，再加入硒粉继续反应4～10h，最后经过后处理得到异硒氰酸酯。
作为优选，加入三光气和三乙胺搅拌回流反应7～9h，再加入硒粉继续反应7～9h，在此优选范围内反应最完全，产物产率最高。
所述三光气、胺和硒粉的物质的量之比为1：1～5：5～10，优选为1：1～3：5～7；所述甲酸乙酯的体积用量以胺的物质的量计为1～5L/mol；所述溶剂为二氯甲烷，溶剂的体积用量以胺的物质的量计为2～6L/mol。
所述后处理的方法为：将反应结束后得到的反应液过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，再合并滤液和洗涤液；依次经水洗、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后，蒸除溶剂并进行柱层析分离，以200～300目硅胶为柱填料，经薄层层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝(10～20)：1为洗脱剂，v/v)，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂并干燥，得到异硒氰酸酯。
本发明还公开了上述兰雪醌硒酯类衍生物在用于制备治疗或/和预防肝癌或结直肠癌药物中的应用。
用于制备治疗或/和预防肝癌药物的兰雪醌硒酯类衍生物为下列结构式之一：
实验表明上述兰雪醌硒酯类衍生物对人肝癌细胞(Hep G2)具有很好的抑制活性和靶向选择性，可用于制备治疗肝癌的靶向药，为相关疾病的治疗提供了极有价值的现实意义。
用于制备治疗或/和预防结直肠癌药物的兰雪醌硒酯类衍生物为下列结构式之一：
实验表明上述兰雪醌硒酯类衍生物对人结直肠癌细胞(LOVO)具有较好的抑制活性和靶向选择性，可用于制备治疗结直肠癌的靶向药，为相关疾病的治疗提供了极有价值的现实意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过异硒氰酸酯与兰雪醌反应，制备了新型兰雪醌硒酯类衍生物，该制备方法简单易控，适合大规模生产应用；
(2)本发明的兰雪醌硒酯类衍生物具有很好的抗肿瘤活性，尤其是对人肝癌细胞(Hep G2)或人结直肠癌细胞(LOVO)有很好的抑制活性和靶向选择性，远高于兰雪醌本身的抑制活性；
(3)将兰雪醌硒酯类衍生物应用于制备抗肿瘤活性药物中，为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径，在药物开发体系中具有极广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：异硒氰酸酯(III)的制备
以苯丙基异硒氰酸酯(III-1)的制备方法为例，说明本发明中所使用的异硒氰酸酯(III)的制备方法，具体方法如下：
反应式如下：
将苯丙基胺(I-1)1.352g(10mmol)与甲酸乙酯(30mL)的混合物超声120分钟，TLC检测苯丙基胺反应完全，蒸干过量的甲酸乙酯，得到N-甲酰苯丙基胺。用40mL二氯甲烷溶解得到的N-甲酰苯丙基胺，再向其中加入三光气1.484g(5mmol)和三乙胺7.0mL(50mmol)，搅拌回流反应8小时，再加入2.37g硒粉(30mmol)，再继续回流反应8小时，停反应，过滤，收集滤液并蒸干溶剂，残留物经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝(10-20)：1，Rf＝0.4-0.5)纯化后得苯丙基异硒氰酸酯(III-1)1.592g，收率71％。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.34-7.31(m,2H),7.27-7.18(m,3H),3.56-3.54(m,2H),2.77-2.75(m,2H),2.11-1.92(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ139.3,128.3,128.1,126.1,44.2,32.0,30.5；MS(EI)m/z:225[M]+。
实施例2：兰雪醌硒酯类衍生物(V-1)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入224mg苯丙基异硒氰酸酯(III-1)(1eq，1.0mmol)，冰水浴下反应4h，反应过程用TLC检测，直至(Ⅲ-1)反应完全。
加10mL水淬灭反应，蒸去THF，用2×25mL二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×30mL后，饱和NaCl水溶液洗涤2×30mL，收集有机相用无水Mg2SO4干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产品，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2为展开剂，v/v)，收集Rf＝0.3-0.5的组分得到兰雪醌硒酯衍生物(V-1)，产率77％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),7.84-7.82(m,2H),7.58(s,1H),7.36-7.18(m,6H),3.58-3.57(m,2H),2.73-2.70(m,2H),2.32(s,3H),2.09-1.93(m,2H)；MS(ESI)m/z413(M)+；HRMS:calcd for C21H19NO3Se m/z:413.0530；Found:413.0543。
实施例3：兰雪醌硒酯类衍生物(V-2)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入196mg苄基异硒氰酸酯(III-2)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-2)，产率78％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.51(s,1H),7.83-7.80(m,2H),7.57(s,1H),7.33-7.14(m,6H),4.43(s,1H),2.33(s,3H)；MS(ESI)m/z385(M)+；HRMS:calcd for C19H15NO3Se m/z:385.0217；Found:385.0206。
实施例4：兰雪醌硒酯类衍生物(V-3)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入274mg萘丙基异硒氰酸酯(III-3)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-3)，产率75％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.73(s,1H),7.98-7.15(m,11H),3.38-3.3.30(m,2H),2.75-2.71(m,2H),2.33(s,3H),2.10-1.94(m,2H)；MS(ESI)m/z 463(M)+；HRMS:calcd forC25H21NO3Se m/z:463.0687；Found:463.0695。
实施例5：兰雪醌硒酯类衍生物(V-4)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入182mg苯基异硒氰酸酯(III-4)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-4)，产率80％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.80(s,1H),7.81-7.76(m,2H),7.56(s,1H),7.20-6.71(m,6H),2.32(s,3H)；MS(ESI)m/z371(M)+；HRMS:calcd for C18H13NO3Se m/z:371.0061；Found:371.0053。
实施例6：兰雪醌硒酯类衍生物(V-5)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入196mg对甲基苯基异硒氰酸酯(III-5)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-5)，产率79％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.91(s,1H),7.84-7.80(m,2H),7.55(s,1H),7.27-6.64(m,5H),2.30-2.33(d,6H)；MS(ESI)m/z 385(M)+；HRMS:calcd for C19H15NO3Se m/z:385.0217；Found:385.0226。
实施例7：兰雪醌硒酯类衍生物(V-6)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入200mg对氟苯基异硒氰酸酯(III-6)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-6)，产率76％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.96(s,1H),7.81-7.76(m,2H),7.52(s,1H),7.21-6.64(m,5H),2.33(s,3H)；MS(ESI)m/z389(M)+；HRMS:calcd for C18H12FNO3Se m/z:388.9966；Found:388.9977。
实施例8：兰雪醌硒酯类衍生物(V-7)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入217mg对氯苯基异硒氰酸酯(III-7)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-7)，产率78％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.94(s,1H),7.82-7.78(m,2H),7.54(s,1H),7.41-6.78(m,5H),2.32(s,3H)；MS(ESI)m/z405(M)+,407(M+2)+；HRMS:calcd for C18H12ClNO3Se m/z:404.9671；Found:404.9662。
实施例9：兰雪醌硒酯类衍生物(V-8)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入261mg对溴苯基异硒氰酸酯(III-8)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-8)，产率76％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.97(s,1H),7.85-7.80(m,2H),7.55(s,1H),7.31-6.72(m,5H),2.31(s,3H)；MS(ESI)m/z449(M)+,451(M+2)+；HRMS:calcd for C18H12BrNO3Se m/z:448.9166；Found:448.9176。
实施例10：兰雪醌硒酯类衍生物(V-9)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入213mg对甲氧基苯基异硒氰酸酯(III-9)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-9)，产率77％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.75(s,1H),7.83-7.79(m,2H),7.52(s,1H),7.18-6.70(m,5H),3.79(s,3H),2.34(s,3H)；MS(ESI)m/z401(M)+；HRMS:calcd for C19H15NO4Se m/z:401.0166；Found:401.0178。
实施例11：兰雪醌硒酯类衍生物(V-10)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入217mg间氯苯基异硒氰酸酯(III-10)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-10)，产率75％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.80(s,1H),7.85-7.82(m,2H),7.61-6.60(m,6H),2.34(s,3H)；MS(ESI)m/z405(M)+,407(M+2)+；HRMS:calcd for C18H12ClNO3Se m/z:404.9671；Found:404.9680。
实施例12：兰雪醌硒酯类衍生物(V-11)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入217mg邻氯苯基异硒氰酸酯(III-11)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-11)，产率76％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.57(s,1H),7.84-7.81(m,2H),7.58-7.15(m,6H),2.31(s,3H)；MS(ESI)m/z405(M)+,407(M+2)+；HRMS:calcd for C18H12ClNO3Se m/z:404.9671；Found:404.9683。
实施例13：兰雪醌硒酯类衍生物(V-12)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入204mg正庚基异硒氰酸酯(III-12)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-12),产率65％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),7.81-7.78(m,2H),7.51(s,1H),7.23-7.21(d,1H),3.39-1.24(s,12H),2.33(s,3H),0.87(t,3H)；MS(ESI)m/z393(M)+；HRMS:calcdfor C19H23NO3Se m/z:393.0843；Found:393.0851。
实施例14：兰雪醌硒酯类衍生物(V-13)的制备
反应式如下：
在氮气气氛下，称取88mg纯度为60％的氢化钠(2eq，2mmol)溶于无水的THF(20mL)，冰水浴下加入188mg兰雪醌(IV)(1eq，1.0mmol)，搅拌20分钟后，加入162mg正丁基异硒氰酸酯(III-13)(1eq，1.0mmol)，以下操作同实施例2。
最后得到兰雪醌硒酯衍生物(V-13)，产率68％，其结构表征如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H),7.82-7.80(m,2H),7.52(s,1H),7.21-7.18(d,1H),3.37-1.25(s,6H),2.33(s,3H),0.88(t,3H)；MS(ESI)m/z351(M)+；HRMS:calcd forC16H17NO3Se m/z；351.0374；Found:351.0366。
下面给出上述实施例得到的化合物的生物活性方面的应用实例。
(一)细胞来源
人肝癌细胞(Hep G2)、人结直肠癌细胞(LOVO)、中国仓鼠肺细胞(CHL)，购自中国科学院细胞库。
(二)细胞培养
(1)人肝癌细胞(Hep G2)培养
培养条件：人肝癌细胞Hep G2完全培养液(购自中国科学院细胞库，其配方参照中国科学院细胞库提供的配方)，37℃，气相：空气(95％)、二氧化碳(5％)；人肝癌细胞Hep G2完全培养液配方(100ml)如下：MEM(Invitrogen，11090081)87ml，FBS(Gibco)10ml，Glutamax(invitrogen35050061)1ml，Non-essential Amino Acids，100x(Invitrogen，11140050)1ml，Sodium Pyruvate 100mM Solution(invitrogen 11360070)1ml。
冻存条件：人肝癌细胞Hep G2完全培养液+5％DMSO。
传代方法：细胞在培养瓶中生长到80-90％并仍为单层时进行传代。弃去旧液，向培养瓶中加入2mLPBS缓冲液(pH值为7.2±0.1)，清洗后弃掉，重复两次。加入消化液(0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA)1mL消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成3-5个抱团细胞后加入2mL人肝癌细胞Hep G2完全培养液终止消化，吹打细胞至显微镜下呈单细胞状态，细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，人肝癌细胞Hep G2完全培养液重悬细胞重复两次。培养液重悬细胞混匀后分装到T25培养瓶中，补加培养液至4-5mL，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)人结直肠癌细胞(LOVO)培养
培养条件：Ham's F-12K(Kaighn's)培养液+10％/牛血清，37℃，5％CO2培养箱。
冻存条件：Ham's F-12K(Kaighn's)培养液+10％/胎牛血清+5％DMSO。
传代方法：细胞在培养瓶中生长到80-90％并仍为单层时进行传代。弃去旧液，向培养瓶中加入2mLPBS缓冲液(pH值为7.2±0.1)，清洗后弃掉，重复两次。加入消化液(0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA)1mL消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成3-5个抱团细胞后加入2mL(Ham's F-12K(Kaighn's)培养液+10％/牛血清)培养液终止消化，吹打细胞至显微镜下呈单细胞状态，细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，Ham'sF-12K(Kaighn's)培养液重悬细胞重复两次。培养液重悬细胞混匀后分装到T25培养瓶中，补加培养液至4-5mL，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(3)中国仓鼠肺细胞(CHL)培养
培养条件：RPMI1640培养液+10％/牛血清，37℃，5％CO2培养箱。
冻存条件：RPMI1640培养液+10％/胎牛血清+10％DMSO。
传代方法：细胞在培养瓶中生长到80-90％并仍为单层时进行传代。弃去旧液，向培养瓶中加入2mLPBS缓冲液(pH值为7.2±0.1)，清洗一下，弃掉，重复两次。加入消化液(0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA)1mL消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成3-5个抱团细胞后加入2mL(RPMI1640培养液+10％/牛血清)培养液终止消化，吹打细胞至显微镜下呈单细胞状态，细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，RPMI1640培养液重悬细胞重复两次。培养液重悬细胞混匀后分装到T25培养瓶中，补加培养液至4-5mL，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(三)实验方法
(1)抗肿瘤活性实验(MTT法)
分别将HEP G2、LOVO细胞贴壁至T25瓶约90％时，经消化制成细胞悬浮液，均匀铺于96孔板，浓度为(1.6～2)×104个/孔。实验设6个浓度梯度加药组，1个对照组，1个调零组，每组3个平行，对照组以助溶剂代替药物，调零组加同体积培养基，96孔板边缘加PBS缓冲液。
细胞于37℃，5％CO2培养箱培养24h，至细胞贴壁分裂生长至占瓶壁70-80％后，加药组加入不同浓度梯度(用80μL助溶剂DMSO+920μL相应细胞的培养液进行配制，终浓度为2.5μM，1.875μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.15625μM)的兰雪醌(IV)及待测样品，对照组加入对应相同体积的溶液(即80μL助溶剂DMSO+920μL相应细胞的培养液)，调零组则加入相应细胞的培养液，所有组别在96孔板中每孔加液量均为200μL。于37℃、5％CO2培养箱培养24h。加药组、对照组和调零组加入20μL MTT(5mg/mL，PBS现配过膜使用)作用4h，吸出培养液，加200μL DMSO，平板振荡器摇匀10min后至沉淀充分溶解；使用酶标仪于570nm处测量吸光度，计算各自的抑制率，利用SPSS20.0软件计算IC50值。
(2)抗肿瘤活性对照实验(MTT法)
CHL细胞贴壁至T25瓶约90％时，经消化制成细胞悬浮液，均匀铺于96孔板，浓度为(1.6～2)×104个/孔。实验设6个浓度梯度加药组，1个对照组，1个调零组，每组3个平行，对照组以助溶剂代替药物，调零组加同体积培养基，96孔板边缘加PBS缓冲液。
细胞于37℃，5％CO2培养箱培养24h，至细胞贴壁分裂生长至占瓶壁70-80％后，加药组加入不同浓度梯度(用80μL助溶剂DMSO+920μL相应细胞的培养液进行配制，终浓度为2.5μM，1.875μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.15625μM)的兰雪醌(IV)及待测样品，对照组加入对应相同体积的溶液(即80μL助溶剂DMSO+920μL相应细胞的培养液)，调零组则加入相应细胞的培养液，所有组别在96孔板中每孔加液量均为200μL。于37℃、5％CO2培养箱培养24h。加药组、对照组和调零组加入20μL MTT(5mg/mL，PBS现配过膜使用)作用4h，小心吸出培养液，加200μL DMSO，平板振荡器摇匀10min左右至沉淀充分溶解；使用酶标仪于570nm处测量吸光度，计算各自的抑制率，利用SPSS20.0软件计算IC50值。
兰雪醌硒酯衍生物(V-1)、(V-2)、(V-3)、(V-6)、(V-11)、(V-12)、(V-13)以及兰雪醌(IV)对HEP G2、LOVO和CHL细胞的抑制活性结果见下表1所示。
表1
注：1)、*表示没有抑制活性或者抑制活性远远大于500μM。
2)、SIHEP G2＝IC50(HEP G2)/IC50(CHL)，SILOVO＝IC50(LOVO)/IC50(CHL)，SI越小，药物对肿瘤细胞的选择性越高。
由表1可知，化合物(V-1)、(V-2)、(V-3)、(V-6)、(V-13)具有较强抗人肝癌细胞(Hep G2)作用，其活性均大于兰雪醌(IV)；特别是(V-1)、(V-3)具有极强抗人肝癌细胞(HepG2)作用，(V-1)、(V-2)和(V-3)对人肝癌细胞(Hep G2)的选择性也非常好。
化合物(V-1)、(V-3)、(V-6)、(V-11)、(V-12)具有较好的抗人结直肠癌细胞(LOVO)细胞作用，活性均大于兰雪醌(IV)；特别是(V-1)、(V-3)、(V-11)具有极强抗人结直肠癌细胞(LOVO)细胞作用，(V-1)、(V-3)、(V-6)和(V-12)对人结直肠癌细胞(LOVO)细胞的选择性也非常好。
Claims (9)
1.一种兰雪醌硒酯类衍生物，其特征在于，其结构式如下式(V)所示：
式(V)中，R是C1～C10烷基、被苯基或萘基取代的C1～C10烷基、未被取代或任意取代的苯基，所述任意取代的苯基中的取代基为C1～C3烷基、烷氧基或卤原子。
2.如权利要求1所述的兰雪醌硒酯类衍生物，其特征在于，所述兰雪醌硒酯类衍生物为下列结构式之一：
3.如权利要求1所述的兰雪醌硒酯类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
其中，式(III)中R的定义与式(V)中相同；
具体反应过程为：在N2气氛及0～5℃条件下，将氢化钠溶于溶剂，加入兰雪醌搅拌10～30min，再加入式(III)所示的异硒氰酸酯反应3～5h，最后经过后处理得到所述兰雪醌硒酯衍生物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的异硒氰酸酯、兰雪醌和氢化钠的物质的量之比为1：0.5～2：1～3。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为无水四氢呋喃，溶剂的体积用量以氢化钠的物质的量计为5～15L/mol。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述异硒氰酸酯的制备方法包括如下步骤：
其中，式(I)中R的定义与式(V)中相同；
具体反应过程为：将式(I)所示的胺与甲酸乙酯超声反应100～150min得到甲酰胺中间体，再将甲酰胺中间体溶于溶剂中，加入三光气和三乙胺搅拌回流反应4～10h，再加入硒粉继续反应4～10h，最后经过后处理得到异硒氰酸酯。
7.如权利要求1或2所述的兰雪醌硒酯类衍生物在用于制备治疗或/和预防肝癌或结直肠癌药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，用于制备治疗或/和预防肝癌药物的兰雪醌硒酯类衍生物为下列结构式之一：
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，用于制备治疗或/和预防结直肠癌药物的兰雪醌硒酯类衍生物为下列结构式之一：
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Denomination of invention: Lanxuequinone selenium ester derivative and its preparation method and Application Effective date of registration: 20211011 Granted publication date: 20200807 Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Hangzhou Zhaohui sub branch Pledgor: SINOCHEM LANTIAN Co.,Ltd. Registration number: Y2021330001830 |
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