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CN103946378B - 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 Download PDF

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CN103946378B CN201280050093.8A CN201280050093A CN103946378B CN 103946378 B CN103946378 B CN 103946378B CN 201280050093 A CN201280050093 A CN 201280050093A CN 103946378 B CN103946378 B CN 103946378B
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Abstract

本发明涉及具有改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。
相关技术说明
葡糖淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3）是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的一种酶。葡糖淀粉酶是由若干丝状真菌和酵母产生的，其中来自曲霉属的那些在商业上是最重要的。
在商业上，葡糖淀粉酶被用于将已通过α-淀粉酶部分地水解的淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用一种发酵有机体将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产品。商业发酵产品的实例包括醇类（例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇）；有机酸类（例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸）；酮类（例如，丙酮）；氨基酸（例如，谷氨酸）；气体（例如，H2和CO2）；以及更复杂的化合物，包含例如抗生素（例如，盘尼西林和四环素）；酶；维生素（例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素）；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程也通常被用于可食用酒精（例如，啤酒和白酒）、乳制品（例如，用于制造酸奶酪和干酪）工业中。
最终产品还可以是糖浆。例如，最终产品可以是葡萄糖，而且还可以例如通过葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎相等地葡萄糖和果糖构成的一种混合物。这种混合物，或另外地富集果糖的一种混合物，是在世界范围内商业化的最常用的高果糖玉米糖浆（HFCS）。
本发明的一个目的是提供多种具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且它们在发酵产物生产工艺，如乙醇生产工艺，包括由未胶凝化生（或未蒸煮的）淀粉进行的一步乙醇发酵工艺中提供高产率。共同未决的专利申请WO2011/127802披露了来自草酸青霉菌的野生型葡糖淀粉酶。
本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。
发明内容
在第一方面，本发明涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、571中的一个或多个位置处包含取代或缺失的葡糖淀粉酶变体，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
在第二方面，本发明涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468中的一个或多个位置处包含取代的变体葡糖淀粉酶催化结构域，其中该变体催化结构域具有葡糖淀粉酶活性。
在第三方面，本发明涉及一种包含本发明的变体多肽的组合物。
在另外的方面中，本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及在糖浆和/或一种发酵产品的生产中使用本发明的多肽的方法。
定义
葡糖淀粉酶：术语葡糖淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3）被定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的一种酶。出于本发明的目的，根据在此的‘材料与方法’部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。
本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性。在另一个实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:3的多肽的至少20%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及甚至最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性。
等位变体：术语“等位变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的（编码的多肽中无改变），或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的，从成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般是通过以起始密码子（例如ATG、GTG或TTG）开始并以终止密码子（例如TAA、TAG或TGA）结束的一个开放读码框来决定。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的（即，来自相同基因）或者外源的（即，来自不同基因），或者相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及在一个变体的产生中的任何步骤，包含但不局限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的控制序列的线性或环形DNA分子。
片段：术语“片段”意指使一个或多个（例如，若干个）氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至少465个氨基酸残基（例如，SEQ ID NO:2的氨基酸30至494）。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹（Southern blotting）程序，在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型，其具有包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。此类改进的特性包括但不限于改进的热稳定性。
分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然出现的物质，(2)任何物质，包含但不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质（例如编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子）。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰（例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等）之后处于其最终形式的多肽。在一方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是一个信号肽的程序SignalP（Nielsen（尼尔森）等人，1997，ProteinEngineering（蛋白质工程）10:1-6），成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至616。本领域已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽的混合物（即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸）。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP（尼尔森等人，1997，同上），这一成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的一种多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子，它包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指其中一个控制序列位于相对于一个多核苷酸的编码序列的适当位置处，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的配置。
亲本或亲本葡糖淀粉酶：术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种葡糖淀粉酶。该亲本可以是天然存在的（野生型）多肽或其变体或片段。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch）算法（尼德曼和翁施，1970，J.Mol.Biol.（分子生物学杂志）48:443-453）来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open SoftwareSuite（欧洲分子生物学开放软件套件），Rice（赖斯）等人，2000，Trends Genet.（遗传学趋势）16:276-277）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle（尼德尔）的输出（使用–nobrief选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
（一致的残基X100）/（比对长度-比对中的空位总数）
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼和翁施，1970，同上）确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite（欧洲分子生物学开放软件套件），赖斯等人，2000，同上）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL（NCBI NUC4.4的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle（尼德尔）的输出（使用–nobrief选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
（一致的脱氧核糖核苷酸X100）/（比对长度-比对中的空位总数）
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。在一方面，子序列含有至少1395个核苷酸（例如SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482）。
变体：术语“变体”意指具有葡糖淀粉酶活性的、包含一个改变（即在一个或多个（例如，若干个）位置处的一个取代、插入和/或缺失）的一种多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失意指占据一个位置的氨基酸的移除；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的葡糖淀粉酶活性。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:3的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的葡糖淀粉酶活性。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
野生型葡糖淀粉酶：术语“野生型葡糖淀粉酶”意指由天然存在的微生物（例如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌）表达的一种葡糖淀粉酶。用于变体表示的常规
出于本发明的目的，将包含在SEQ ID NO:2中的成熟多肽或由SEQ IDNO:3（PE001）组成的多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基。将另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的披露为氨基酸22至616或SEQ ID NO:3的披露为氨基酸1-595的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453）来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽或SEQ ID NO:3的多肽的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。
可以使用若干计算机程序通过多种多肽序列的比对来确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括，但不限于：MUSCLE（multiple sequencecomparison by log‐expectation（基于日志-期望值的多序列比较）；版本3.5或更新版本；Edgar（埃德加），2004，Nucleic Acids Research（核酸研究）32:1792-1797），MAFFT（版本6.857或更新版本；Katoh（卡托赫）和Kuma（库玛），2002，Nucleic Acids Research（核酸研究）30:3059-3066；Katoh（卡托赫）等人，2005，Nucleic Acids Research（核酸研究）33:511-518；Katoh（卡托赫）和Toh（都），2007，Bioinformatics（生物信息学）23:372-374；Katoh（卡托赫）等人，2009，Methods in Molecular Biology（分子生物学方法）537:_39-64；Katoh（卡托赫）和Toh（都），2010，Bioinformatics（生物信息学）26:_1899-1900），以及利用ClustalW的EMBOSS EMMA（1.83或更新版本；Thompson（汤普森）等人，1994，NucleicAcids Research（核酸研究）22:4673-4680），使用它们各自的缺省参数。
当从SEQ ID NO:2的成熟多肽中分叉分出其他酶，这样使得传统的基于序列的比较不能检测它们的关系（Lindahl（林达尔）和Elofsson（埃洛弗松），2000，分子生物学杂志295:613-615）时，则可以使用其他逐对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示（谱（profile））来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个谱并且能够检测远距离同源物（Atschul（阿特休尔）等人，1997，核酸研究25:3389-3402）。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序（例如GenTHREADER）（Jones（琼斯），1999，分子生物学杂志287:797-815；McGuffin（麦谷芬）和琼斯，2003，生物信息学19:874-881）利用自多种来源（PSI-BLAST，二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化潜力）的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough（高夫）等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法（例如距离比对矩阵（Holm（赫尔姆）和Sander（桑德尔），1998，Proteins（蛋白杂志）33:88-96）或者组合扩展（Shindyalov（辛迪亚洛夫）和Bourne（伯恩），1998，蛋白工程11:739-747））可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以额外利用这些算法的实施来用所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物（例如，赫尔姆和Park（帕克），2000，生物信息学16:566-567）。
在描述本发明的变体中，采用以下所述的命名法以方便参考。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
取代。对于一个氨基酸取代，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代被表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号（“+”）分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411上甘氨酸（G）被精氨酸（R）并且丝氨酸（S）被苯丙氨酸（F）取代。
缺失。对于一个氨基酸缺失，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号（“+”）分开，例如“Gly195*+Ser411*”或者“G195*+S411*”。
插入。对于一个氨基酸插入，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或者“G195GKA”。
在这类情况下，通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195195a195b
G G-K-A
多种变化。包含多种变化的变体由加号（“+”）分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195上的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同变化。可以在一个位置上引入不同的变化时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr，Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
发明详细说明
本发明涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、571中的一个或多个位置处包含取代的分离的葡糖淀粉酶变体，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
本发明还涉及在对应于SEQ ID NO:3的位置80、502、或504中的一个或多个位置处包含缺失的分离的葡糖淀粉酶变体，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
上面提及的具有取代或缺失的变体应该被理解为涵盖在指定的位置处的一个或多个取代或缺失的所有可能的组合。
变体
本发明提供了在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、571中的一个或多个位置处包含取代或缺失的葡糖淀粉酶变体，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
在一个另外的实施例中，除了特定的取代或缺失之外，该变体选自下组，该组由以下各项组成：
a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65%序列一致性的一种多肽；
b)由在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及
d)SEQ ID NO:3的多肽的具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。
在一个实施例中，该变体与成熟亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但小于100%的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、例如至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但小于100%的序列一致性。
在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个变化。
在另一方面，该变体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补体杂交（Sambrook（萨拉布鲁克）等人，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual（分子克隆实验指南），第二版，Cold Spring Harbor（冷泉港），纽约）。
在另一方面，一种变体在对应于位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的一个或多个（例如，若干个）位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的两个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的三个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的四个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的五个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的六个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的七个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的八个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的九个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的十个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的十一个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的十二个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的十三个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的十四个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，一种变体在对应于任意位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、以及571中的十五个位置处包含取代或缺失。
在另一方面，该变体包含在与位置1相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置1的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Lys或Glu取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代R1K或R1E或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置2相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置2的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代P2N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置3相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置3的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Trp或Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代D3W或D3N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置4相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置4的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser或Gly取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代P4S或P4G或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置5相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置5的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala或Gln取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K5A或K5Q或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置6相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置6的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Arg取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代G6R或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置7相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置7的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代G7A或G7V或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置8相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置8的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala或Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代N8A或N8S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置10相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置10的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Asp、Lys、或Glu取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代T10D、T10K、或T10E或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置11相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置11的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asp、Phe、Ser、或Ala取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代P11D、P11F、P11S、P11W、P11Y、P11H或P11A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置12相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置12的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Tyr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代F12Y或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置18相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置18的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代E18N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置26相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置26的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Cys或Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代D26C或D26N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置31相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置31的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代R31S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置33相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置33的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Cys或Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K33C或K33V或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置34相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置34的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Tyr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K34Y或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置65相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置65的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代T65A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置72相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置72的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代L72V或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置74相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置74的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代E74N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置79相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置79的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr，优选被Ala、Gly、Ile、Leu、Lys、或Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代V79A、V79G、V79I、V79L、V79S、或V79K或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置80相对应的一个位置上的一个缺失或者由该缺失组成。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的缺失F80*或者由该缺失组成。
在另一方面，该变体包含在与位置103相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置103的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S103N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置105相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置105的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Pro取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S105P或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置112相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置112的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQID NO:3的多肽的取代K112S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置161相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置161的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K161S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置172相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置172的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代I172V或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置218相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置218的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K218A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置220相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置220的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代G220N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置221相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置221的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asp取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K221D或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置245相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置245的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代Y245N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置253相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置253的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQID NO:3的多肽的取代Q253N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置255相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置255的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S255N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置279相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置279的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代D279N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置325相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置325的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代V325T或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置327相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置327的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Trp、Tyr或Phe取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代Q327W、Q327Y或Q327F或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置359相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置359的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S359N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置364相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置364的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Pro取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S364P或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置370相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置370的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代D370N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置375相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置375的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代I375A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置377相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置377的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S377T或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置405相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置405的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代Q405T或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置445相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置445的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代D445N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置447相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置447的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代V447S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置460相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置460的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr，优选被Ser或Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代V460S或V460T或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置463相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置463的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代T463N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置465相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置465的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代S465N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置468相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置468的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代P468T或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置477相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置477的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代T477N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置501相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置501的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Val取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代E501V或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置502相对应的一个位置上的一个取代或缺失或者由其组成。在另一方面，在对应于位置502的位置处的氨基酸缺失或被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的改变N502*或N502T或者由其组成。
在另一方面，该变体包含在与位置504相对应的一个位置上的一个取代或缺失或者由其组成。在另一方面，在对应于位置504的位置处的氨基酸缺失或被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的改变Y504*或Y504T或者由其组成。
在另一方面，该变体包含在与位置516相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置516的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Pro取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代T516P或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置524相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置524的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K524T或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置526相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置526的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代G526A或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置563相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置563的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代P563S或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置564相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置564的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val,优选被Asp取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代N564D或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置568相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置568的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Asn取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代T568N或者由该取代组成。
在另一方面，该变体包含在与位置571相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在对应于位置571的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser或Glu取代。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代K571S或K571E或者由该取代组成。
在另一方面，该变体在对应于位置65和327的位置处包含改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置65和501的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置65和504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置327和501的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置327和504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置501和504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置65、327、以及501的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置65、327、以及504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置65、501、以及504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置327、501、以及504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体在对应于位置65、327、501、以及504的位置处包含多个改变或由其组成，例如上面描述的那些。
在另一方面，该变体包含选自下组的一个或多个（例如，若干个）取代或由其组成，该组由以下各项组成：T65A、Q327F、E501V、Y504T、Y504*。
在另一具体方面，该变体包含以下取代或取代的组合之一：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*
更确切地说，根据本发明的变体包含SEQ ID NO:3的多肽的取代或缺失的以下组合或由其组成。
E501V+Y504T；
T65A+K161S；
T65A+Q405T；
T65A+Q327W；
T65A+Q327F；
T65A+Q327Y；
P11F+T65A+Q327F；
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；
P11F+T65A+Q327W；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
T65A+Q327F+E501V+Y504T；
T65A+S105P+Q327W；
T65A+S105P+Q327F；
T65A+Q327W+S364P；
T65A+Q327F+S364P；
T65A+S103N+Q327F；
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；
S255N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T
这些变体在一个或多个（例如，若干个）其他位置处可以进一步包含一个或多个额外的取代。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的较小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸序列（tract）、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）、以及小氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath（诺伊拉特）和R.L.Hill（希尔）1979年描述于The Proteins（蛋白质）中，Academic Press（学术出版社），纽约。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变本质是多肽的物理化学特性的改变。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。
可以根据本领域已知程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（Cunningham（坎宁安）和Wells（威尔斯），1989，Science（科学）244:1081-1085）。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的葡糖淀粉酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton（希尔顿）等人，1996，J.Biol.Chem.（生物化学杂志），271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如deVos（德福斯）等人，1992，Science（科学）255:306-312；Smith（史密斯）等人，1992，J.Mol.Biol.（分子生物学杂志）224:899-904；Wlodaver（沃勒达尔）等人，1992，FEBS Lett.（欧洲生物化学学会联盟通讯）309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。
催化结构域变体
在一个实施例中，这些变体可以由至少465个氨基酸的催化结构域组成，例如，在如具有如在此所描述的取代和/或缺失的SEQ ID NO:2所示的亲本葡糖淀粉酶中的氨基酸30至494。
本发明的第二方面涉及在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468中的一个或多个位置处包含取代的变体葡糖淀粉酶催化结构域，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
在一个实施例中，该变体葡糖淀粉酶催化结构域可以选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸30至494具有至少65%序列一致性的一个催化结构域；
(b)由在中严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
(c)由与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482具有至少65%的序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；以及
(d)在一个或多个（例如，若干个）位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸30至494的变体；
并且其中该催化结构域具有葡糖淀粉酶活性。
在一个实施例中，该催化结构域可被认为包含来自SEQ ID NO:2的氨基酸495至506的接头区域。SEQ ID NO:2的氨基酸507至615与一个淀粉结合域相对应。
在一个实施例中，该变体葡糖淀粉酶催化结构域与亲本葡糖淀粉酶催化结构域的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但是小于100%的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与包含在SEQ ID NO:2中的催化结构域（例如SEQ IDNO:2的氨基酸30至494）具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、例如至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但小于100%的序列一致性。
在另一方面，该变体葡糖淀粉酶催化结构域由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的催化结构域编码序列、或者(ii)(i)或(ii)的全长互补体杂交（萨拉布鲁克等人，1989，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港，纽约）。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体葡糖淀粉酶多肽具有改进的热稳定性。
在一个实施例中，与亲本催化结构域相比，该变体催化结构域具有改进的热稳定性。
亲本葡糖淀粉酶
该亲本葡糖淀粉酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%序列一致性的一种多肽；(b)由在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；或者(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽。
在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或者100%的序列一致性，该亲本具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽的不同之处不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸30至494或者由其组成。
在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的、包含至少465个氨基酸残基、例如至少470个氨基酸残基以及至少475个氨基酸残基的一个片段。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位变体。
在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)或(ii)的全长互补体杂交（萨拉布鲁克等人，1989，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港，纽约）。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种的菌株的亲本的DNA。具体地说，可以使用此类探针，遵循标准DNA印迹程序，与感兴趣细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别并分离出其中的对应的基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该至少为15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因（例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白）。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自这些文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将该载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸在非常低至非常高严谨度条件下与跟以下各项相对应的一个标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长补体；或者(iv)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或者100%的序列一致性。
多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C末端。
该亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽（Cooper（库珀）等人，1993，EMBOJ.（欧洲分子生物学学会杂志）12:2575-2583；Dawson（道森）等人，1994，Science（科学）266:776-779）。
融合多肽可以进一步包括两个多肽之间的一个切割位点。在融合蛋白分泌之后，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于以下各项中披露的位点：Martin（马丁）等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.（工业微生物学与生物技术杂志.）3:568-576；Svetina（斯韦蒂纳）等人，2000，J.Biotechnol.（生物技术期刊）76:245-251；Rasmussen（拉斯马森）-Wilson（威尔逊）等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.（应用与环境微生物学）63:3488-3493；Ward（华德）等人，1995，Biotechnology（生物技术）13:498-503；以及Contreras（孔特拉斯）等人，1991，Biotechnology（生物技术）9:378-381；Eaton（伊顿）等人，1986，Biochemistry（生物化学）25:505-512；Collins（柯林斯）-Racie（莱斯）等人，1995，Biotechnology（生物技术）13:982-987；Carter（卡特）等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics（蛋白质:结构、功能和遗传学）6:240-248；以及Stevens（史蒂文斯），2003，Drug Discovery World（世界药物发现）4:35-48。
在一个具体实施例中，这一杂交多肽包含融合到一个接头和一个碳水化合物结合域上的变体葡糖淀粉酶催化结构域。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由一种多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是一种真菌性葡糖淀粉酶。例如，该亲本可以是一种青霉菌葡糖淀粉酶，例如像一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
在另一方面，该亲本是一种草酸青霉菌，例如SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶或其成熟多肽。
将理解的是，对于上述种类而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态两者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而忽略它们为人所知的种类名称。本领域普通技术人员将容易地识别鉴定适当等效物。
公众在许多培养物保藏中心易于获得这些种类的菌株，如美国典型培养物保藏中心（ATCC）、德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSMZ）、荷兰菌种保藏中心（Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS），及美国农业研究菌种保藏中心南方地区研究中心（NRRL）。
该亲本可以从其他来源鉴别并获得，这些其他来源包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等）分离的微生物或者使用上述探针直接从天然材料（例如，土壤、堆肥、水等）获得的DNA样品。用于直接地从天然生境分离微生物和DNA的技术是本领域中众所周知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的一个基因组DNA或cDNA库或混合的DNA样品来获得编码一个亲本的一种多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码一个亲本的一种多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸（参见，例如萨拉布鲁克等人，1989，同上）。
变体的制备
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组、等。
定点诱变是其中在编码该亲本的多核苷酸内的一个或多个限定的位点处引入一个或多个（例如，若干个）突变的一种技术。
通过涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的使用的PCR可以体外实现定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变：涉及由一种限制性内切酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行切割的盒式诱变，并且随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如Scherer（谢雷尔）和Davis（戴维斯），1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国国家科学院院刊）76:4949-4955；以及Barton（巴顿）等人，1990，核酸研究，18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；Storici（斯托西）等人，2001，Nature Biotechnol.（自然生物技术）19:773-776；Kren（卡伦）等人，1998，Nat.Med.（自然医学）4:285-290；以及Calissano（卡利萨诺）和Macino（马奇诺），1996，Fungal Genet.Newslett.（真菌遗传学通讯）43:15-16。
在本发明中，可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如由Tian（田）等人（2004，自然432:1050-1054）描述的基于多重微芯片的技术以及其中在光可编程的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson（瑞德哈尔-奥尔森）和Sauer（萨奥尔），1988，科学241:53-57；Bowie（鲍依）和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊86:2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示（例如，Lowman（洛曼）等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204）以及定区诱变（Derbyshire（德比希尔）等人，1986，Gene（基因）46:145；Ner（内尔）等人，1988，DNA7:127）。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性（Ness（内斯）等人，1999，Nature Biotechnology（自然生物技术）17:893-896）。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyQ）、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyL）、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP）、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因（amyM）、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB）、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏芸金芽孢杆菌cryIIIA基因（Agaisse（阿盖斯）和Lereclus（里瑞克拉斯），1994，MolecularMicrobiology（分子微生物学）13:97-107）、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子（Egon（埃贡）等人，1988，Gene（基因）69:301-315），天蓝色链霉菌琼脂酶基因（dagA）、和原核β-内酰胺酶基因（Villa（维拉）-Kamaroff（卡玛诺夫）等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国国家科学院院刊）75:3727-3731），连同tac启动子（DeBoer（德波尔）等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国国家科学院院刊）80:21-25）。另外的启动子描述于“Usefulproteins from recombinant bacteria（来自重组细菌的有用蛋白）”，Gilbert（吉尔伯特）等人，1980，Scientific American（科学美国人），242:74-94；以及萨姆布鲁克等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶（glaA）、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶（WO96/00787）、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶（WO00/56900）、镶片镰孢菌Daria（达莉亚）（WO00/56900）、镶片镰孢菌Quinn（奎恩）（WO00/56900）、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，连同NA2tpi启动子（来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子）；及其突变的、截短的、和杂交的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶（ENO-1）、酿酒酵母半乳糖激酶（GAL1）、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶（ADH1、ADH2/GAP）、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶（TPI）、酿酒酵母金属硫蛋白（CUP1）、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos（罗马诺斯）等人，1992，Yeast（酵母）8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
该控制序列还可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子获得自克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprH）、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（amyL）、以及大肠杆菌核糖体RNA（rrnB）的基因。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C（CYC1）、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos（罗马诺斯）等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定区，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（WO94/25612）和枯草芽孢杆菌SP82基因（Hue（化）等人，1995，Journalof Bacteriology（细菌学杂志）177:3465-3471）。
该控制序列还可以是一个前导子，即一种对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的合适的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶（ENO-1）、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶（ADH2/GAP）。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
Guo（郭）和Sherman（谢尔曼），1995，Mol.Cellular Biol.（分子与细胞生物学杂志）15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。
控制序列还可以是编码连接至一个变体的N末端上的一个信号肽并指导该变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区。该多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该变体的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，一种外源信号肽编码序列可简单地替换该天然的信号肽编码序列以便提高该变体的分泌。然而，可以使用指导所表达的变体进入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT、nprS、nprM）、以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen（西蒙纳）和Palva（帕尔瓦），1993，Microbiological Reviews（微生物学评论）57:109-137描述了另外的信号肽。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉葡聚糖内切酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos（罗马诺斯）等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于一个变体的N末端的前肽的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶（proenzyme）或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原（zymogen））。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprE）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT）、嗜热毁丝霉漆酶（WO95/33836）、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入供表达的适当载体中来进行表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体（例如，质粒或病毒）。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA）、或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌可选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性（例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性）的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括，但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不局限于amdS（乙酰胺酶）、argB（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar（草丁膦乙酰转移酶）、hph（潮霉素磷酸转移酶）、niaD（硝酸还原酶）、pyrG（乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶）、sC（硫酸腺苷基转移酶）、以及trpC（邻氨基苯甲酸合成酶）、连同其等效物。优选在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不依赖该基因组而自主复制的一种或多种元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及的复制起点。
用于在酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米（2micron）的复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1（Gems（格姆斯）等人，1991，Gene（基因）98:61-67；Cullen（卡伦）等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO00/24883）。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含可扩增的选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，并且由此是该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的（参见，例如Sambrook（萨拉布鲁克）等人，1989，同上）。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不局限于似马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。
通过原生质体转化（参见例如，Chang（常）和Cohen（科恩），1979，Mol.Gen.Genet.（分子遗传学与基因组）168:111-115）、感受态细胞转化（参见，例如，Young（杨格）和Spizizen（斯皮兹曾），1961，J.Bacteriol.（细菌学杂志）81:823-829；或者Dubnau（杜博楠）和Davidoff-Abelson（大卫多夫-阿贝尔森），1971，分子生物学杂志56:209-221）、电穿孔（参见，例如，Shigekawa（茂川）和Dower（道尔），1988，Biotechniques（生物技术）6:742-751）、或者轭合（参见，例如Koehler（凯勒）和Thorne（索恩），1987，J.Bacteriol.（细菌学杂志）169:5271-5278）可以实现将DNA引入到一个芽孢杆菌细胞之中。通过原生质体转化（参见例如，Hanahan（哈那汗），1983，J.Mol.Biol.（分子生物学杂志）166:557-580）或电穿孔（参见例如，Dower（道尔）等人，1988，核酸研究16:6127-6145）可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。通过原生质体转化、电穿孔（参见例如，Gong（宫）等人，2004，Folia Microbiol.（微生物学报）（Praha（布拉格））49:399-405）、轭合（参见，例如，Mazodier（马佐迪耶）等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585）、或转导（参见，例如，Burke（布尔克）等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294）可以实现将DNA引入到一个链霉菌细胞中。通过电穿孔（参见例如，Choi（崔）等人，2006，J.Microbiol.Methods（微生物学方法杂志）64:391-397）或轭合（参见例如，Pinedo（皮内多）和Smets（斯梅茨），2005，Appl.Environ.Microbiol.（应用与环境微生物学）71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌细胞中。通过天然感受态（参见例如，Perry（佩里）和Kuramitsu（仓光），1981，Infect.Immun.（感染与免疫）32:1295-1297）、原生质体转化（参见，例如，Catt（卡特）和Jollick（朱力克），1991，Microbios（微生物）68:189-207）、电穿孔（参见，例如，Buckley（巴克利）等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.（应用与环境微生物学）65:3800-3804）或者轭合（参见，例如，Clewell（克拉维尔），1981，Microbiol.Rev.（微生物学评论）45:409-436）可以实现将DNA引入到链球菌细胞中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。
该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、以及接合菌门（Zygomycota）、连同卵菌门（Oomycota）和全部有丝分裂孢子真菌（如由Hawksworth（霍克斯沃思）等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典（Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi），第8版，1995，国际应用生物科学中心（CAB International），大学出版社（University Press），英国剑桥（Cambridge,UK）中进行定义的）。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊孢子酵母（内孢霉目）、产担子酵母，以及属于半知菌（芽生菌）的酵母。由于酵母的分类未来可能改变，故出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast（酵母生物学与活性）（Skinner（斯金纳），Passmore（帕斯莫）及Davenport（达文波特）编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium（应用细菌学学会），第9辑，1980）中所描述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如产乳糖酶酵母、卡氏酵母（Saccharomycescarlsbergensis）、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母（Saccharomyces douglasii）、克鲁费酵母（Saccharomyces kluyveri）、诺地酶母（Saccharomyces norbensis）、卵形酵母、或亚罗解脂酵母（Yarrowialipolytica）细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门（如由Hawksworth（霍克斯沃思）等人，1995，同上所定义）。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母（例如酿酒酵母）的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属（Ceriporiopsis）、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球酵母属、Filibasidium、镰刀菌属、腐质霉属、大毁壳属、毛霉菌属、蚀丝霉属、新美鞭菌属（Neocallimastix）、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌（Ceriporiopsiscaregiea）、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌（Ceriporiopsispannocinta）、环带拟蜡菌（Ceriporiopsisrivulosa）、微红拟蜡菌（Ceriporiopsissubrufa）、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌（Chrysosporiuminops）、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌（Chrysosporiumlucknowense）、粪状金孢子菌（Chrysosporiummerdarium）、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum）、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉和木霉宿主细胞的合适程序描述于EP238023，Yelton（约尔顿）等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国国家科学院院刊）81:1470-1474,以及Christensen（克里斯滕森）等人，1988，Bio/Technology（生物/技术）6:1419-1422中。Malardier（马拉迪耶）等人，1989，Gene（基因）78:147-156和WO96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。可以使用Becker（贝克尔）和Guarente（瓜伦特）在Abelson,J.N.（阿贝尔森）和Simon,M.I.（西蒙）编辑，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology（对酵母遗传学和分子生物学的指导），Methods in Enzymology（酶学方法），194卷，pp182-187,Academic Press,Inc.（学院出版社有限公司），纽约；Ito（伊藤）等人，1983，J.Bacteriol.（细菌学杂志）153:163；以及Hinnen（希南）等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美国国家科学院院刊）75:1920中描述的程序来转化酵母。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包含：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种重组宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵）来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成（例如，在美国模式培养物保藏所目录中）来制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体，以获得大致上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法（例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱）、电泳程序（例如，制备型等电点聚焦）、有差别的溶解（例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE、或萃取（参见，例如Protein Purification（蛋白纯化），Janson（詹森）和Ryden（赖登）编辑，VCH出版社（VCH Publishers），纽约，1989）。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，该组合物还包含一种运载体和/或一种赋形剂。更优选地，这些组合物富含这样一种多肽。术语“富含”指示该组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。
该组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
在一个具体的实施例中，该组合物包含一种α淀粉酶和根据本发明的多肽。
在一个更具体的实施例中，该组合物进一步包含一种蛋白酶。
例如可以通过属于以下属的一种微生物来产生额外的一种或多种酶：曲霉属，优选棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、泡盛曲霉、烟曲霉菌、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；镰刀菌属，优选杆孢状镰刀菌、纹镰刀菌、克鲁克威尔镰孢菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾镰刀菌、异孢镰刀菌、合欢木镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰刀菌、硫色镰刀菌、囊珠镰刀菌、拟丝孢镰刀菌、或镰孢霉；腐质霉属，优选特异腐质霉或柔毛腐质霉；或者木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉。
这些多肽组合物可以根据本领域中已知的方法制备，并且可以呈液体或干燥组合物的形式。例如，该多肽组合物可以呈颗粒或微粒的形式。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法进行稳定化。
以下给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
葡糖淀粉酶与α淀粉酶的组合
根据本发明的这一方面，本发明的一种葡糖淀粉酶可以与一种α-淀粉酶组合。优选地，酸性α淀粉酶与葡糖淀粉酶之间的比率是在0.05AFAU/AGU与5.0AFAU/AGU之间。更优选地，酸性α-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率是至少0.10、至少0.15、至少0.20、至少0.25、至少0.30、至少0.35、至少0.40、至少0.45、至少0.50、至少0.55、至少0.60、至少0.65、至少0.70、至少0.75、至少0.80、至少0.85、至少0.90、至少0.95、至少1.00、至少1.05、至少1.10、至少1.20、至少1.30、至少1.40、至少1.50、至少1.60、至少1.70、至少1.80、至少1.85、或甚至至少1.90AFAU/AGU。然而，酸性α-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率应当优选地小于4.50、小于4.00、小于3.50、小于3.00、小于2.50或甚至小于2.25AFAU/AGU。
以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产品，例如乙醇。
以下给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
应用
本发明还针对本发明的一种多肽在一个液化过程、一个糖化过程、和/或一个发酵过程中的用途。可以在一个单个过程中，例如在一个液化过程、一个糖化过程、或一个发酵过程中使用该多肽。也可以在多个过程的一个组合中、例如在一个液化和糖化过程、在一个液化和发酵过程中、或者在一个糖化和发酵过程中（优选是与淀粉转化有关）使用该多肽。
在本发明的一个优选方面，这一液化、糖化、和/或发酵过程包括依序或同时地进行的液化和糖化过程。
在常规的酶液化过程中，添加热稳定的α-淀粉酶并且将长链淀粉降解成支链且线性的更短单位（麦芽糊精），但是没有添加葡糖淀粉酶。本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的，所以在液化过程中添加该葡糖淀粉酶是有利的。当在液化过程中与一种α淀粉酶组合时，本发明的葡糖淀粉酶具有一种协同效应。在常规的糖化过程中，将在液化过程中产生的糊精进一步水解以产生能被发酵有机体代谢的低分子量的糖类DP1-3。水解典型地使用葡糖淀粉酶完成；可替代地，除了葡糖淀粉酶之外，还可以使用α-葡糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。
当将本发明的葡糖淀粉酶（可能结合α-淀粉酶）应用于液化和/或糖化过程、尤其是一个同时的液化和糖化过程中时，可以在更高的温度下进行该过程。通过在更高的温度下进行这一液化和/或糖化过程，可以在更短的时段内进行该过程，或者可替代地可以使用更低的酶剂量来进行该过程。此外，当在更高温度下进行液化和/或糖化过程时，微生物污染的风险减小。
含淀粉的材料的转化
本发明提供了本发明的葡糖淀粉酶用于从淀粉中产生葡萄糖和类似物的用途。总体上，该方法包括单独或在一种α-淀粉酶存在下使用本发明的葡糖淀粉酶部分地水解前体淀粉的步骤。
本发明的葡糖淀粉酶还可以结合仅水解在包含至少四个葡糖残基的分子中的α-(1,6)-糖苷键的一种酶来使用。
在另一个方面，本发明涉及本发明的一种葡糖淀粉酶在淀粉转化中的用途。此外，可以在包括一个连续的糖化过程的一个连续淀粉转化过程中使用本发明的葡糖淀粉酶。
糖浆、饮料和/或发酵产品的产生
本发明的葡糖淀粉酶的用途包括将淀粉转化成例如糖浆饮料和/或一种发酵产品（包含乙醇）。
本发明还提供了一种使用本发明的葡糖淀粉酶，由含淀粉的材料生产糖浆（如葡萄糖等）的方法。在“含淀粉的材料”部分中例证说明了适合的起始材料。总体上，该过程包含以下步骤：在本发明的葡糖淀粉酶单独或结合α淀粉酶的存在下部分或完全水解含淀粉的材料（液化和/或糖化）以从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放葡萄糖。
本发明的葡糖淀粉酶还能以被固定的形式来使用。这适合且经常用于产生特种糖浆（例如麦芽糖糖浆）连同用在与果糖糖浆（例如，高果糖糖浆（HFS））的产生有关的寡糖的残液流中。
本发明的葡糖淀粉酶还可以用于产生不同的饮料，例如但不局限于番茄、马铃薯、甘薯、甜薯、和/或南瓜的饮料。
发酵产品
术语“发酵产品”意指通过包括使用一种发酵有机体的一个发酵过程的过程产生的产品。根据本发明考虑的发酵产品包括醇类（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol）、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、甘油（glycerin）、山梨醇、以及木糖醇）；有机酸类（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸）；酮类（例如，丙酮）；氨基酸类（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸）；一种烷烃（例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷）；一种环烷烃（例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷）；一种烯烃（例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯）；多种气体（例如，甲烷、氢气（H2）、二氧化碳（CO2）、以及一氧化碳（CO））；抗生素类（例如，盘尼西林和四环素）；酶类；维生素类（例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素）以及激素类。在一个优选方面，发酵产品是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即适于饮用的浓酒精（neutral spirits）；或者在可食用酒精工业（例如啤酒和白酒）、乳制品工业（例如，发酵的乳制品）、皮革工业、以及烟草工业中使用的工业乙醇或产品。优选的啤酒类型包括淡色啤酒、黑啤酒、英国产烈黑啤酒（porter）、窖藏啤酒、苦啤酒、麦芽酒、低麦芽啤酒（happoushu）、高酒精啤酒、低酒精啤酒、低热量啤酒或轻淡啤酒。优选使用的发酵过程包括本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵过程是本领域熟知的厌氧发酵过程。
酿造
本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的并且因此它们可以用于在高温下需要淀粉水解的工业中。例如，本发明的葡糖淀粉酶可以用于酿造工业中。按本领域普通技术人员可容易确定的有效量来添加本发明的葡糖淀粉酶。
液化、糖化和/或发酵产品的产生
在这个方面，本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生一种液化、糖化和/或发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：用本发明的一种多肽处理含淀粉的材料。
在以下“含淀粉的材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。优选地，本发明的过程包含用单独的或与一种α-淀粉酶一起的本发明的一种多肽来处理含淀粉的材料。本发明的液化和/或糖化产品是糊精、或低分子量糖（例如，DP1-3）。在液化过程中，通过添加本发明的一种葡糖淀粉酶提高了淀粉到葡萄糖、糊精和/或低分子量糖的转化。发酵之后，这一发酵产品（例如乙醇）可以任选例如通过蒸馏来回收。该发酵优选地是在酵母，优选酵母属菌株存在下进行。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。
由含胶凝化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在这一方面，本发明涉及一种由含淀粉的材料生产发酵产物，尤其是乙醇的方法，该方法包括液化步骤及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。
本发明涉及一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)使用一种α-淀粉酶，使含淀粉的材料液化；
(b)使用一种葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；并且
(c)使用发酵有机体对糖化的材料进行发酵。
优选地，步骤(a)还包括使用本发明的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，在步骤(b)中还存在/添加了本发明的葡糖淀粉酶。
发酵产物，如尤其是乙醇，能可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。在以下“含淀粉的材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。液化优选地是在α-淀粉酶存在下进行。发酵优选地是在酵母，优选地酵母属菌株存在下进行。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。在多个优选实施例中，依序或同时进行步骤(b)和(c)（即，作为SSF过程）。
在一个具体实施例中，本发明的方法在步骤（a）之前进一步包含以下步骤：
x)优选地通过研磨来减小该含淀粉的材料的粒度；并且
y)形成包含该含淀粉的材料和水的浆料。
该水性浆料可以包含从10wt%至40wt%、优选25wt%至35wt%的含淀粉的材料。该浆料被加热到高于胶凝化温度，并且可以添加α-淀粉酶，优选地细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以开始液化（稀释）。在一个实施例中，该浆料可以进行喷射蒸煮（jet-cooked）以使该浆料在经历本发明步骤（a）中的α-淀粉酶之前进一步胶凝化。
更确切地说，液化可以作为一个三步热浆料方法进行。该浆料被加热到介于60℃到95℃，优选地80℃到85℃之间，并且添加α-淀粉酶以开始液化（稀释）。然后，该浆料可以在介于95℃到140℃，优选地105℃到125℃之间的温度下进行喷射蒸煮1-15分钟，优选地3-10分钟，尤其是约5分钟。该浆料被冷却到60℃到95℃，并且再添加α-淀粉酶以结束水解（二次液化）。液化过程经常是在pH4.5-6.5，特别是在介于5与6之间的pH下进行的。经过研磨并且液化的完整细粒称为糊状物（mash）。
步骤(b)中的糖化可以使用本领域中众所周知的条件进行。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵工艺（SSF工艺）中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从30℃到65℃，典型地约60℃的温度下，并且在介于4与5之间的pH，通常在约pH4.5下进行。
在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化与发酵（SSF）方法，在该方法中，糖化不存在保温阶段，意味着发酵有机体（如酵母）以及一种或多种酶可以一起添加。SSF可以典型地在介于25℃与40℃之间，如介于29℃与35℃之间，如介于30℃与34℃之间，如约32℃的温度下进行。根据本发明，该温度可以在发酵期间上下调整。
根据本发明，发酵步骤(c)包括且不限于，用于生产醇类（例如乙醇、甲醇、丁醇）；有机酸（例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸）；酮类（例如丙酮）；氨基酸类（例如谷氨酸）；气体类（例如H2和CO2）；抗生素类（例如青霉素和四环素）；酶类；维生素类（例如核黄素、B12、β-胡萝卜素）；以及激素的发酵方法。优选的发酵方法包括醇发酵方法，如本领域中众所周知的。优选的发酵方是厌氧发酵方法，如本领域中众所周知的。
由含未胶凝化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在这一方面，本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，其中这一含淀粉的材料没有进行胶凝化（即，未蒸煮的含淀粉的材料）。根据本发明，可以在不对包含了该含淀粉的材料的水性浆料进行液化的情况下，生产希望的发酵产物，如乙醇。在一个实施例中，本发明的一种方法包括在低于胶凝化温度下、在一种α淀粉酶存在下将（碾磨的）含淀粉的材料（例如颗粒状淀粉）糖化以产生可以通过一种适合的发酵有机体发酵成所希望的发酵产物的多种糖。在另一个实施例中，在糖化和发酵过程中使用了本发明的葡糖淀粉酶和一种α淀粉酶。在一方面，本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生发酵产品的过程，该过程包含：
(a)在低于所述含淀粉的材料的起始胶凝化温度的温度下，用根据本发明的一种成熟葡糖淀粉酶来使含淀粉的材料糖化，该葡糖淀粉酶优选具有如SEQ ID NO:2中的氨基酸22至616所示的序列，
(b)使用一种发酵有机体进行发酵。
本发明方法的步骤(a)和(b)可以依序地或同时地进行。在一个实施例中，在步骤(a)之前制备包含水和含淀粉的材料的一种浆料。
在一个优选实施例中，步骤(a)包括添加一种α淀粉酶。
该发酵方法可以进行一段1到250小时，优选地从25到190小时，更优选地从30到180小时，更优选地从40到170小时，甚至更优选地从50到160小时，又更优选地从60到150小时，甚至又更优选地从70到140小时并且最优选地从80到130小时的时间。
术语“起始胶凝化温度”意指淀粉胶凝化开始时的最低温度。在水中加热的淀粉在介于50℃与75℃之间开始胶凝化；胶凝化的确切温度取决于具体淀粉，并且可以容易地由熟练的业内人士确定。因此，起始胶凝化温度可以根据植物种类、该植物种类的特定品种连同生长条件而变化。在本发明的背景下，一种给定的含淀粉的材料的起始胶凝化温度是使用由Gorinstein（高瑞斯坦）和Lii（李），1992，（淀粉）44(12):461-466所述的方法使得5%的淀粉颗粒的双折射丧失的温度。
在步骤(a)之前，可以制备具有10wt.%到55wt.%的干燥固体的含淀粉的材料，优选地25wt.%到40wt.%的干燥固体，更优选地30wt.%到35wt.%的干燥固体的含淀粉的材料（如颗粒状淀粉）的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物（逆流）、洗涤水、蒸发器凝结水或蒸馏水、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或其他发酵产物工厂工艺用水。由于本发明的方法是在该胶凝化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，故如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，该水性浆料包含从约1vol.%到约70vol.%的釜馏物，优选地15vol.%到60vol.%的釜馏物，尤其是从约30vol.%到50vol.%的釜馏物。
该含淀粉的材料可以通过将粒度减小（优选地通过干式或湿式研磨）到0.05到3.0mm，优选地0.1-0.5mm来制备。在经历本发明的方法之后，将至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或优选地至少99%的该含淀粉的材料的干燥固体转化成可溶性淀粉水解产物。
本发明的方法是在低于初始胶凝化温度的温度下进行的。优选地，步骤（a）进行的温度是介于30℃到75℃之间，优选地介于45℃到60℃之间。
在一个优选的实施例中，步骤(a)和步骤(b)是以依序或同时的糖化和发酵方法来进行的。在这种优选的实施例中，该方法典型地在介于25℃与40℃之间，如介于29℃与35℃之间，如介于30℃与34℃之间，如约32℃的温度下进行。根据本发明，该温度可以在发酵期间上下调整。
在一个实施例中，进行同时糖化和发酵，这样使得糖水平（例如葡萄糖水平）保持在一个低水平下，例如低于6wt%、优选低于约3wt%、优选低于约2wt%、更优选低于约1wt%、甚至更优选低于约0.5wt%、或甚至更优选0.25wt%、例如低于约0.1wt%。这种低糖水平可以通过简单地采用调整的量的酶和发酵有机体来实现。本领域的普通技术人员可以容易地确定使用多少量的酶和发酵有机体。所采用的酶和发酵有机体的量还可以经过选择以在发酵液中维持较低的麦芽糖浓度。例如，该麦芽糖水平可以保持低于约0.5wt.%或低于约0.2wt.%。
该过程可以是在pH3与pH7之间的范围内、优选从pH3.5至pH6、或更优选从pH4至pH5的pH下进行。
本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的,所以可以在高于常规的预糖化和/或糖化温度下进行本发明的预糖化和/或糖化。在一个实施例中，本发明的一个方法包括在同时糖化和发酵（SSF）方法之前将含淀粉的材料预糖化。在移入SSF之前，可以在高温（例如，50℃-85℃，优选是60℃-75℃）下进行预糖化。
含淀粉的材料
根据本发明，可以使用任何适合的含淀粉的起始材料（包括颗粒状淀粉）。该起始材料一般是基于希望的发酵产物选择的。适合在本发明的方法中使用的含淀粉的起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷粒、玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯（cassava）、树薯（tapioca）、高粱、稻米、豌豆、豆类、或甜薯、或其混合物、或者谷类、含糖原料（例如糖蜜）、水果材料、甘蔗或甜菜、马铃薯、以及含纤维素的材料（例如木材或植物残渣）、或其混合物。考虑了蜡质和非蜡质两种类型的玉米和大麦。
发酵有机体
“发酵有机体”是指适合在发酵过程中使用并且能够产生所希望的发酵产品的任何有机体，包括细菌和真菌有机体。尤其适合的发酵有机体能够使糖（例如葡萄糖或麦芽糖）直接或间接发酵成、即转化成所希望的发酵产品。发酵有机体的实例包括真菌有机体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌株，特别是酿酒酵母。可商购的酵母包括例如Red StarTM/乐斯福（Lesaffre）乙醇红（可从美国红星/乐斯福（Red Star/Lesaffre）获得）、FALI（可从美国伯恩斯菲利普食品有限公司（Burns Philp Food Inc.）的分公司弗莱施曼酵母（Fleischmann’s Yeast）公司获得）、SUPERSTART（可从阿尔泰克公司（Alltech）获得）、GERTSTRAND（可从瑞典的Gert Strand AB公司获得）、以及FERMIOL（可从帝斯曼食品配料部（DSMSpecialties）获得）。
酶
葡糖淀粉酶
该葡糖淀粉酶优选地是本发明的葡糖淀粉酶。然而，如上文所提到的，本发明的葡糖淀粉酶也可以与其他葡糖淀粉酶组合。
该葡糖淀粉酶的添加量可以为0.001到10AGU/g DS，优选地从0.01到5AGU/g DS，如为约0.05、0.1、0.3、0.5、1或2AGU/g DS，尤其是0.05到0.5AGU/g DS或0.02到20AGU/gDS，优选地0.1到10AGU/g DS。
α-淀粉酶
根据本发明，α-淀粉酶可以是任何来源的。优选的是真菌或细菌来源的α-淀粉酶。
在一个优选方面，该α-淀粉酶是一种酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加的一种α-淀粉酶（E.C.3.2.1.1）在pH3至pH7的范围内、优选从pH3.5至pH6、或更优选从pH4至pH5下具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
根据本发明，一种细菌α-淀粉酶可优选来源于芽孢杆菌属。
在一个优选方面，芽孢杆菌α-淀粉酶是来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但还可以是来源于其他芽孢杆菌种类。所考虑的α-淀粉酶的具体实例包括示出在WO99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（BLA）、示出在WO99/19467的SEQ ID NO:5中的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶（BAN）、以及示出在WO99/19467的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（BSG）。在本发明的一个实施例中，该α-淀粉酶是与如WO99/19467中的SEQ ID NO:1、2、3、4、或5所示的任何序列分别具有至少60%、优选至少70%、更优选至少80%、甚至更优选至少90%、例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的一致性程度的一种酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂交种，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂交种：WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059、以及WO02/10355（所有文件都通过引用结合在此）。确切考虑的α-淀粉酶变体被披露在美国专利号6,093,562、美国专利号6,297,038或美国专利号6,187,576（通过引用结合在此）中，并且包括具有以下的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（BSGα-淀粉酶）变体：在位置179至182中具有一个或两个氨基酸的缺失，优选披露在WO1996/023873（参见，例如，第20页，第1至10行）（通过引用结合在此）中的一种双缺失（优选与WO99/19467披露的SEQ ID NO:3中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于δ（181-182）的双缺失）、或者使用WO99/19467（该参考文献通过引用结合在此）的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸179和180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶、尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与WO99/19467中披露的SEQ ID NO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有与δ（181-182）相对应的一种双缺失并且进一步包含一个N193F取代（也被表示为I181*+G182*+N193F）。
该α-淀粉酶还可以是一种产麦芽糖α-淀粉酶。一种“产麦芽糖α-淀粉酶”（葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133）能够将直链淀粉和支链淀粉水解成处于α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的一种产麦芽糖α-淀粉酶是从丹麦诺维信股份有限公司（Novozymes A/S）可商购的。该产麦芽糖α-淀粉酶被描述在美国专利号4,598,048、美国专利号4,604,355以及美国专利号6,162,628中，将其通过引用结合在此。
细菌杂合α-淀粉酶
确切考虑的一种杂合α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（示出为WO99/19467中的SEQ ID NO:4）的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶（示出为WO99/194676中的SEQ ID NO:3）的37个N-末端氨基酸残基，它们具有一个或多个、尤其是全部的以下取代：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S（使用地衣芽孢杆菌编号）。还优选的是具有一个或多个以下突变（或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶骨架中的对应突变）的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V、以及Q264S；和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失、优选E178和G179的缺失（使用WO99/19467的SEQ ID NO:5编号）。
真菌α-淀粉酶
真菌酸性α-淀粉酶包括来源于曲霉属的一种菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉、黑曲霉、或白曲霉（Aspergillus kawachii）α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是一种真菌淀粉样（Fungamyl-like）的α-淀粉酶，该α-淀粉酶优选地来源于米曲霉菌株。在本披露中，术语“真菌淀粉样的α-淀粉酶”指示了与WO96/23874中的SEQ ID NO:10中所显示的氨基酸序列的成熟部分展现出高一致性，即，超过70%，超过75%，超过80%，超过85%，超过90%，超过95%，超过96%，超过97%，超过98%，超过99%或甚至100%的一致性的一种α-淀粉酶。
另一种优选的酸性α-淀粉酶是来源于黑曲霉菌株。在一个优选方面，酸性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且在WO89/01969（实例3）中进行更详细描述的黑曲霉的一种α-淀粉酶。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶还在WO2004/080923（诺维信）中示出为SEQ ID NO:1，将其通过引用结合在此。还考虑了与WO2004/080923中的SEQ ID NO:1具有至少70%一致性、例如至少80%或甚至至少90%一致性、例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的所述酸性真菌淀粉酶的多种变体。
在一个优选方面，α-淀粉酶是来源于白曲霉并且是由Kaneko（金子）等人,J.Ferment.Bioeng.（发酵与生物工程杂志）81:292-298（1996）“Molecular-cloning anddetermination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stablealpha-amylase from Aspergillus kawachii（编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的一种基因的核苷酸序列的分子克隆和测定）”所披露；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370。
该真菌酸性α-淀粉酶还可以是包括一个碳水化合物结合模块（CBM）和一个α-淀粉酶催化结构域的一种野生型酶（即，非杂合的），或其变体。在一个实施例中，该野生型α-淀粉酶是来源于白曲霉菌株。
根据本发明，可以按以下量添加一种酸性α-淀粉酶：0.01至10AFAU/gDS、优选0.01至5AFAU/g DS、尤其是0.02至2AFAU/g DS。
真菌杂合α-淀粉酶
在一个优选方面，该真菌酸性α-淀粉酶是一种杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括在WO2005/003311或美国专利公开号2005/0054071（诺维信）或美国专利申请号2006/0148054（诺维信）中披露的那些，将其通过引用结合在此。杂合α-淀粉酶可以包括一个α-淀粉酶催化结构域（CD）和一个碳水化合物结合结构域/模块（CBM）及可任选的一个接头。
所考虑的杂合α-淀粉酶的具体实例包括但不局限于在美国专利申请号2006/0148054中所披露的那些，包括具有催化结构域JA118和罗氏阿太菌（Athelia rolfsii）SBD的真菌淀粉样变体（在美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:100）、具有罗氏阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）α-淀粉酶（在美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:101）、以及具有罗氏阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌（Meripilus giganteus）α-淀粉酶（在美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:102）；以及具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和CBM的微小根毛霉α-淀粉酶（在国际公开号WO2007/144424中的SEQ ID NO2）。
所考虑的杂合α-淀粉酶的其他具体实例包括但不局限于在美国专利公开号2005/0054071中披露的那些，包括在第15页的表3中披露的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
商用α-淀粉酶产品
包含α-淀粉酶的优选商用组合物包括：来自帝斯曼（DSM）（吉斯特·布罗卡德斯有限公司（Gist Brocades））的MYCOLASE，BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMSC、LIQUOZYMETMSC DS、以及SANTMSUPER、SANTMEXTRA L（诺维信股份有限公司）、以及CLARASETML-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETMFRED、SPEZYMETMAA、SPEZYMETMEthyl、以及SPEZYMETMDELTA AA（杰能科国际有限公司（Genencor Int.））。
以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料和方法
葡糖淀粉酶活性
可以按单位AGU来测量葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶活性（AGU）
葡糖淀粉酶单位（AGU）被定义为在标准条件下（37℃，pH4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的）每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。
葡糖淀粉酶孵育
底物： 麦芽糖100mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 6分钟
酶工作范围： 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL
通过3个反应步骤描述分析原理：
步骤1是一个酶反应：
葡糖淀粉酶（AMG）EC3.2.1.3(外-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶）水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。
步骤2和步骤3引起一个终点反应：
在由己糖激酶催化的一个反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab30分析仪（赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific））。
酸性α-淀粉酶活性
当根据本发明使用时，可以按AFAU（酸性真菌α-淀粉酶单位）来测量任何酸性α-淀粉酶的活性。可替代地，酸性α-淀粉酶的活性能以KNU-s（基洛诺维信单位（Kilo NovozymesUnit）（拖麦米尔（Termamyl）SC））测量。
酸性α-淀粉酶活性（AFAU）
可按AFAU（酸性真菌α-淀粉酶单位）来测量酸性α-淀粉酶活性。1AFAU被定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶的量。
酸性α-淀粉酶是一种内-α-淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖-葡糖淀粉酶，E.C.3.2.1.1），它水解在淀粉分子的内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。
蓝色/紫色t=23秒无色
标准条件/反应条件：
DNA操纵
除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操纵和转化：萨拉布鲁克等人（1989），分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港实验室，纽约；奥苏贝尔·F·M（Ausubel,F.M.）等人（编辑）“分子生物学实验指南（Current protocols inMolecular Biology）”，约翰威立父子公司，1995；哈伍德·C·R（Harwood,C.R.）&卡廷·S·M（Cutting,S.M.）（编辑）。
DNA测序
通过电穿孔（BIO-RAD基因脉冲发生器（BIO-RAD Gene Pulser））或化学地进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法（分子克隆，冷泉港）或使用质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰（Qiagen）凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎（PTC-200DNA Engine）进行PCR。使用ABI PRISMTM310基因分析器来测定所有的DNA序列。
培养基
YP-2%麦芽糖是由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨以及20g/L麦芽糖组成的。
MLC培养基是由40g/L葡萄糖、50g/L大豆粉、4g/L柠檬酸组成的，pH为5.0。
M410培养基是由50g/L麦芽糖-1H2O、8g/L酵母提取物、2g/LMgSO4.7H2O、4g/L柠檬酸-1H2O、50g/L葡萄糖、2g/L K2HPO4、0.5ml/L AMG痕量金属溶液、以及2g/L尿素组成的，pH为4.5。AMG痕量金属溶液是由13.9g/L FeSO4.7H2O、13.5g/L MnSO4.1H2O、6.8g/L ZnCl2、2.5g/L CuSO4.5H2O、0.24g/L NiCl2.6H2O、以及3g/L柠檬酸组成的。
除非另外说明，否则培养基是根据以下来制备的：萨拉布鲁克等人（1989），分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。
FT X-14培养基是如下所示组成的。
酶
葡糖淀粉酶：
如WO2011/127802的SEQ ID NO:2所披露的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。
埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）葡糖淀粉酶（它在国际公开号WO99/28448被披露为SEQ ID NO:7）
黑曲霉葡糖淀粉酶（uniprot：P69328）（它被披露于Svensson（斯文松），B.Larsen（拉森），K.Gunnarsson（贡纳松），A.；“Characterization of a glucoamylase fromAspergillus niger.（来自黑曲霉的葡糖淀粉酶G2的表征）”；Eur.J.Biochem.（欧洲生物化学杂志）154:497-502（1986）中）
瓣环栓菌（Trametes cingulata）葡糖淀粉酶，如WO2006/069289的SEQ ID NO:2中所披露的且从诺维信股份有限公司可获得。
α-淀粉酶：
酸性α-淀粉酶，在国际公开号WO2005/003311中被披露为变体JA001
由地衣芽孢杆菌产生的α-淀粉酶，例如TermamylTM SC（从丹麦巴格斯瓦尔德（Bagsvaerd）的诺维信股份有限公司可商购的α-淀粉酶）
杂合α-淀粉酶，由具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶组成、在WO2006/069290的表5中被披露为V039（诺维信股份有限公司）
α-淀粉酶A：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（在EP1023439B1中的SEQ ID NO:3），具有WO2011/082425中示出为SEQ ID NO:6的截短至491个氨基酸的突变I181*+G182*+N193F。
α淀粉酶1407：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（EP1023439B1中的SEQ IDNO:3），具有截短至491个氨基酸（还参见WO2011/082425）的突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S。
蛋白酶：
蛋白酶196：来源于嗜热子囊菌CGMCC号0670的、披露为具有以下突变的WO2003/048353中的SEQ ID NO:2的氨基酸1至177的金属蛋白酶：A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L（还参见WO2011/072191）。
实例1：草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆
草酸青霉菌菌株cDNA的制备。
通过按照cDNA末端系统（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司（Invitrogen Corp.））的3’快速扩增技术的说明来合成cDNA。
草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆。
使用下文所示的、被设计成用来从5’末端扩增葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物来克隆草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因。
有义引物：5’-ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3’（SEQ ID NO:4）
通过PCR用有义引物和AUAP（由cDNA末端系统的3’快速扩增技术提供）、通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶（美国加利福尼亚州卡尔斯巴市的英杰公司）来扩增全长基因。扩增反应是由5μl的10x PCR缓冲液、2μl的25mM MgCl2、1μl的10mM dNTP、1μl的10uM有义引物、1μl的10uMAUAP、2μl的第一链cDNA、0.5μl的HIFI Taq、以及37.5μl的去离子水组成的。PCR程序是：94℃，3分钟；进行10次94℃持续40秒、60℃40秒（其中每次循环下降1℃）、68℃持续2分钟的循环；进行25次94℃持续40秒、50℃持续40秒、68℃持续2分钟的循环；在68℃进行10分钟最终延伸。
使用一个pGEM-T载体系统（美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司（PromegaCorporation））将获得的PCR片段克隆到pGEM-T载体（美国威斯康星州麦迪逊市普洛麦格公司）中以产生质粒AMG1。对插入到质粒AMG1中的葡糖淀粉酶基因进行测序确认。将含有质粒AMG1（表示为NN059173）的大肠杆菌菌株TOP10于2009年11月23日保藏在德国微生物与菌种保藏中心（DSMZ）并且指定保藏号为DSM23123。
实例2：克隆的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表达
通过PCR使用以下所示的两种克隆引物F和引物R将草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因重新从质粒AMG1克隆到曲霉菌表达载体中，这两种克隆引物是基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆。
引物F：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC（SEQ ID NO:5）
引物R：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG（SEQ ID NO:6）
用质粒AMG1来进行PCR反应以便扩增全长基因。PCR反应是由40μg的质粒AMG1DNA、1μl的每种引物（100μM）、12.5μl的2X扩展剂高保真主体混合物（Extensor Hi-FidelityMaster Mix，英国拜力公司（ABgene））、以及9.5μl的PCR级水组成。使用DYAD PCR仪（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad实验室国际公司）进行PCR反应，该仪器的程序为：在94℃下持续2分钟，随后进行94℃持续15秒、50℃持续30秒、以及72℃持续1分钟的25次循环；并且然后在72℃下10分钟。
通过1.0%琼脂糖凝胶电泳使用1xTAE缓冲液来分离反应产物，其中将约1.9kb的PCR产物带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用PCRDNA和凝胶带纯化试剂盒（通用电气医疗集团（GE Healthcare），英国）进行纯化。根据制造商的说明，使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托（Palo Alto）的BD生物科学公司（BD Biosciences））将与草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因相对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO2005/042735A1所述的。
将2μl体积的连接混合物用于转化25μl的融合蓝色（Fusion Blue）大肠杆菌细胞（包含在IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒中）。在42℃下热休克45秒并在冰中冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm下在37℃下孵育90分钟，随后铺在每ml含50μg氨苄西林的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用微型JETSTAR（德国Genomed公司）纯化来自所选择的菌落的质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序（Sanger sequencing）来验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。选择这些质粒之一用于进一步表达，并将其命名为XYZ XYZ1471-4。
如WO95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的XYZ1471-4质粒相混合，并且添加250微升的60%PEG4000（艾普利公司（Applichem））（聚乙二醇，分子量4,000）、10mMCaCl2、以及10mM Tris-HCl（pH7.5）并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖（Cove（科夫），1996，Biochim.Biophys.Acta（生物化学与生物物理学报）133:51-56）（1M）板上将原生质体与6%的低熔琼脂糖（惠泰克生物分子应用公司（Biowhittaker MolecularApplications））相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖（1M）板以用于转化株选择（每板4ml顶层琼脂）。在37℃下孵育5天之后，拾取十六种转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2%麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶，即Griton XTPrecast凝胶（伯乐公司（BioRad），美国加利福尼亚州）上分析来自每个孔的10μl培养液，以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴别最好的转化株。在原始转化板上鉴别所选择的转化株并将其作为孢子保存在20%甘油贮备物中并冷冻保存（-80℃）。
培养：在100ml的MLC培养基中接种所选择的转化株并在30℃下在旋转振荡器上的500ml摇瓶中培养2天。将3ml的培养液接种到100ml的M410培养基中并在30℃下培养3天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。
α-环糊精亲和凝胶。使10克环氧基活化的琼脂糖6B（英国查尔方特圣吉尔斯（Chalfont St.Giles）的通用电气医疗集团）粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶合溶液（100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH）并在室温下孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH10的100ml1M乙醇胺中，并在50℃下孵育4小时以进行封闭。随后使用pH8的50mM Tris-HCl和可替代地pH4.0的50mM NaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液（50mM NaOAc，150mM NaCl，pH4.5）将该凝胶装填在35-40ml的柱中。
从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μm PES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液，并施加在之前在50mMNaOAc、150mM NaCl、pH4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现一条单独的带。
实例3：草酸青霉菌葡糖淀粉酶的定位变体的构建和表达
用实例2所述的质粒XYZ1471-4、使用以下所示的引物K79V F和K79V R（这些引物被设计成用于将成熟序列的位置79处的赖氨酸（K）取代为缬氨酸（V））以及以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940（这两个引物基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSIONTM策略直接克隆）进行两个PCR反应。
引物K79V F18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC（SEQ ID NO:7）
引物K79V R18mer AATTGGAAAGACTGCCCG（SEQ ID NO:8）
引物F-NP003940：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC（SEQ ID NO:9）
引物R-NP003940：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:10)
在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎进行PCR。
根据制造商的说明通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用N-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学公司）将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO2005/042735A1所述的。
使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞（TOYOBO公司）。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒微型试剂盒（凯杰公司）从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择这些质粒之一来用于进一步表达并且将其命名为pPoPE001。
如WO95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pPoPE001质粒相混合，并且添加250微升的60%PEG4000（艾普利公司（Applichem））（聚乙二醇，分子量4,000）、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl（pH7.5）并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟，并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖（科夫，1996，生物化学与生物物理学报133:51-56）中将原生质体与1%的琼脂糖L（日本基因公司（Nippon Gene））相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖板上以用于转化株选择（每板4ml顶层琼脂）。在37℃下孵育5天之后，拾取十六种转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2%麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE凝胶上分析来自每个孔的10μl培养液以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力来鉴别最好的转化株。
实例4：定点Po AMG变体PE001的纯化
将所选择的变体转化株和表达实例1所述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的菌株培养在100ml的YP-2%麦芽糖培养基中，并且培养物通过0.22μmPES过滤器过滤，并施加在之前于50mM NaOAc、150mM NaCl、pH4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。随后相对于pH5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。
实例5：PE001的表征
蛋白酶稳定性
将40μl在50mM乙酸钠缓冲液（pH4.5）中的酶溶液（1mg/ml）与1/10体积的1mg/ml蛋白酶溶液相混合，该蛋白酶是例如在Biochem J.（生物化学杂志）1975年4月;147(1):45-53中所述的曲霉酸性蛋白酶I（aspergillopepsin I）、或从西格玛公司（Sigma）可商购的产品以及在Biochemical journal（生物化学杂志）[0264-6021]八幡町市岛（Ichishima）2003年第371卷iss:Pt2第541页中所述的奥瑞素（aorsin）,并且在4℃或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H2O而不是蛋白酶添加到样品之中。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。
在SDS-PAGE中，PE001仅示出与完整分子相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kDa的更低分子大小的一条带。
表1蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果
N.D.：未检测到。
实例6：培养过程中更少切割
在32℃下将变体和野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的曲霉菌转化株在含有4X稀释的、补充有10mM乙酸钠缓冲液的YP-2%麦芽糖培养基（pH4.5）的6孔MT板中培养1周。
将培养物上清液装载在SDS-PAGE上。
表2培养物上清液的SDS-PAGE结果
野生型葡糖淀粉酶 PE001
完整的葡糖淀粉酶（约70kDa） 90% 100%
切割的葡糖淀粉酶（约60kDa） 10% N.D.
N.D.：未检测到。
在发酵过程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而变体则仅产生完整的分子。
实例7：变体与亲本相比的葡糖淀粉酶活性
针对野生型草酸青霉菌的纯化的酶和变体葡糖淀粉酶检查如上文所述作为AGU测量的葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶单位（AGU）被定义为在标准条件下（37℃，pH4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：6分钟）每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
表3
相对比活性 AGU/mg
野生型草酸青霉菌 100%
草酸青霉菌PE001（SEQ ID NO:3） 102%
实例8：具有增加的热稳定性的麦芽糖酶变体的纯化
可以类似于实例3中描述的程序构建并表达显示出增加的热稳定性的本发明的变体。根据本发明，所有变体都衍生自作为亲本葡糖淀粉酶并且被披露于SEQ ID NO:3中的PE001。在YPM培养基中表达以后，将包含T65A或Q327F取代的变体如下进行微纯化：
通过经由0.22μm过滤器过滤除去菌丝体。向滤板（华特曼（Whatman），UNI过滤器（Unifilter）800μl，25-30μm MBPP）的孔中添加50μl柱材料（根据制造商的推荐，与Mini-Leak二乙烯砜-活化的琼脂糖培养基偶联的α-环糊精）。通过两次添加200μl缓冲液用结合缓冲液（200mM乙酸钠，pH4.5）平衡该柱材料，剧烈震荡10min（海道夫（Heidolph），Titramax101摇床，1000rpm）并且通过真空除去缓冲液（华特曼，UniVac3）。随后，添加400μl培养上清液和100μl结合缓冲液，并且在剧烈振荡下将板孵育30min。通过真空除去未结合的材料并且重复结合步骤。通常地，每个变体使用4个孔。然后通过添加200μl具有减少的离子强度的缓冲液（50/10/5mM乙酸钠，pH4.5）进行三个洗涤步骤，振荡15min并且通过真空除去缓冲液。通过两次添加100μl洗脱缓冲液（250mM乙酸钠，0.1%α-环糊精，pH6.0）洗脱结合的AMG，振荡15min并且通过真空收集在微量滴定板中的洗脱材料。将合并的洗脱物浓缩并且使用具有10kDa截留单位的离心过滤器（Millipore Microcon Ultracel YM-10）将缓冲液变为50mM乙酸钠，pH4.5。将微纯化的样品保存在-18℃下直到热稳定性测试。
实例9：蛋白质热解折叠分析（TSA，热转变测定（Thermal shift assay））。
使用宝石橙（Sypro Orange）（英杰公司，S-6650）监测T65A和Q327F变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪（应用生物系统公司（AppliedBiosystems）；一步一加（Step-One-Plus））进行。
在一个96孔板中，将25微升微纯化的、处于约100微克/ml的50mM乙酸盐（pH4,5）中的样品与宝石橙（5:1）相混合（所得浓度=5X；来自供应商的母液=5000X）。用旋光PCR封条（optical PCR seal）将板密封。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用宝石橙（Sypro Orange）（英杰公司，S-6650）监测E501V+Y504T变体的蛋白质热解折叠并且使用实时PCR仪（应用生物系统公司（Applied Biosystems）；一步一加（Step-One-Plus））进行。
在一个96孔板中，在具有或不具有200ppm阿卡波糖（Acarbose）（西格玛公司A8980）的情况下，将15微升纯化的、处于约50微克/ml的50mM乙酸盐（pH4,5）中的样品与宝石橙（1:1）相混合（所得浓度=5X；来自供应商的母液=5000X）。用旋光PCR封条将板密封。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。
使用用于激发的内置（in-built）LED蓝光和ROX-滤波器（610nm，发射）每20秒监测荧光。
将Tm值计算为第一衍生物的最大值（dF/dK）（参考：Gregory（格雷戈里）等人；JBiomol Screen（生物分子筛选杂志）200914:700）。
表4a.
表4b.
实例10：通过差示扫描量热法（DSC）分析热稳定性
基本如在实例3中所描述构建在特定位置处具有取代和/或缺失的额外的位点特异性变体并且如在实例4中所描述进行纯化。
使用VP-毛细管差示扫描量热器（美国新泽西州的皮斯卡塔韦的米克罗卡公司（MicroCal Inc.）），通过差示扫描量热法（DSC）在pH4.0或4.8处（50mM乙酸钠）测定纯化的Po-AMG PE001衍生的变体的热稳定性。在以200K/hr的恒定的程序化加热速率下，在选择的缓冲液（50mM乙酸钠，pH4.0或4.8）中加热酶溶液后获得的热分析图（Cp对T）中，将热变性温度Td（℃）当作变性峰（主要的吸热峰）的顶端。
将样品溶液和参照溶液（约0.3ml）装载到来自10℃的保存条件的热量计中（参照：没有酶的缓冲液），并且在从20℃至110°DSC扫描以前，用热方法预平衡10分钟。以约+/-1℃的精确度测定变性温度。
分离的变体以及DSC数据披露于下表5中。
表5.
实例11：通过热应激测试和pNPG测定分析热稳定性
从来自实例10的经鉴别的取代变体之一（被鉴别为PE008）开始，通过热应激测定测试额外的变体，在该热应激测定中在83℃下热休克5min后，测定来自生长培养物的上清液的葡糖淀粉酶（AMG）活性。
在热休克以后，测量变体连同在非应激样品中的变体的残余活性。
Po-AMG pNPG活性测定的说明：
草酸青霉菌葡糖淀粉酶pNPG活性测定是一种光谱端点测定（spectrometricendpoint assay），其中将样品一分为二并且进行热应激地和非热应激地测量。所以，数据输出是应激样品中的残余活性的量度。
生长：
向无菌微量滴定板（MTP）的每个孔中添加200μL富生长培养基（没有Dowfax的FTX-14）。将来自冻存物的感兴趣的菌株一式三份地直接接种在MTP中。在20个孔中接种基准点。将具有培养基的未接种的孔用作测定空白。将MTP放在包含湿巾的塑料箱中，以阻止孵育过程中这些孔的蒸发。将塑料箱在34℃下放置4天。
测定:
将50μL上清液转移至50μL0.5M NaAc（pH4.8）中，以获得的准确的样品pH。
将50μL稀释物转移至PCR板上并且在PCR仪中在83℃下热应激5分钟。将剩余的一半稀释物保持在室温下。
将20μL的应激的和非应激的样品转移至标准MTP中。添加20μL pNPG-底物，以起始该反应。将该板在室温下孵育1h。
终止该反应并且通过添加50μL0.5M Na2CO3进行显色。在405nm处，在酶标仪（分子设备公司（Molecular Devices））上测量黄色。
缓冲液：
0.5M NaAc pH4.8
0.25M NaAc pH4.8
底物，6mM pNPG：
15mg在10mL0.25NaAc（pH4.8）中的4-硝基苯基D-吡喃葡萄糖苷
终止/显色溶液：
0.5M Na2CO3
数据处理：
在Excel中，来自应激和非应激样品两者的原始Abs405数据是用其对应的空白进行空白消除。计算残余活性（%残余活性=(Abs非应激-(Abs非应激-Abs应激))/Abs非应激*100%）并且相对于基准点Po-amg0008绘图。
表6
表7
实例12：根据本发明的热稳定性变体的葡糖淀粉酶活性测试
已经使用在实例11中描述的pNPG测定证实了在表5、6、和7中披露的所有以上描述的变体在培养上清液上的葡糖淀粉酶活性。
在此描述并且要求权益的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
本发明进一步通过以下编号的段落进行说明。
[1]在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468、477、501、502、504、516、524、526、563、564、568、571中的一个或多个位置处包含取代或缺失的葡糖淀粉酶变体，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
[2]如段落1所述的变体，该变体选自下组，该组由以下各项组成：
a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65%序列一致性的一种多肽；
b)由在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及
d)SEQ ID NO:3的多肽的、具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。
[3]如段落1-2中任一项所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列一致性。
[4]如段落1-2中任一项所述的变体，其中该变体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补体杂交。
[5]如段落1-2中任一项所述的变体，其中该变体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列一致性。
[6]如段落1-5中任一项所述的变体，该变体是选自下组的一种亲本葡糖淀粉酶的一种变体，该组由以下各项组成：
a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65%序列一致性的一种多肽；
b)由在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及
d)SEQ ID NO:3的成熟多肽的、具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。
[7]如段落6所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3的多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[8]如段落6或7所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者(ii)(i)的全长互补体杂交。
[9]如段落6-8中任一项所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[10]如段落1-9中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
[11]如以上段落中任一项所述的变体，在选自SEQ ID NO:3的位置65、327、501、504的至少一个位置处包含取代或缺失。
[12]如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包含一个或多个选自下组的取代或由其组成，该组由以下各项组成：T65A、Q327F、E501V、Y504T、Y504*。
[13]如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：
T65A；或
Q327F；或
E501V；或
Y504T；或
Y504*；或
T65A+Q327F；或
T65A+E501V；或
T65A+Y504T；或
T65A+Y504*；或
Q327F+E501V；或
Q327F+Y504T；或
Q327F+Y504*；或
E501V+Y504T；或
E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V；或
T65A+Q327F+Y504T；或
T65A+E501V+Y504T；或
Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+Y504*；或
T65A+E501V+Y504*；或
Q327F+E501V+Y504*；或
T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
T65A+Q327F+E501V+Y504*。
14.如段落1-13中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代的组合中的至少一个：
E501V+Y504T；
T65A+K161S；
T65A+Q405T；
T65A+Q327W；
T65A+Q327F；
T65A+Q327Y；
P11F+T65A+Q327F；
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；
P11F+T65A+Q327W；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
T65A+Q327F+E501V+Y504T；
T65A+S105P+Q327W；
T65A+S105P+Q327F；
T65A+Q327W+S364P；
T65A+Q327F+S364P；
T65A+S103N+Q327F；
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；
S255N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
[15]如段落1-14中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有一个改进的特性，其中这一改进的特性是对蛋白酶降解的减小的敏感度。
[16]如段落1-15中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有一个改进的特性，其中这一改进的特性是改进的热稳定性。
[17]在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置10、11、12、18、26、31、33、34、65、72、74、79、80、103、105、112、161、172、218、220、221、245、253、255、279、325、327、359、364、370、375、377、405、445、447、460、463、465、468中的一个或多个位置处包含取代的变体葡糖淀粉酶催化结构域，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。
[18]如段落17所述的变体葡糖淀粉酶催化结构域，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸30至494具有至少65%序列一致性的一个催化结构域；
(b)由在中严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482、或者(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
(c)由与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482具有至少65%的序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；并且
其中该催化结构域具有葡糖淀粉酶活性。
[19]如段落18所述的多肽，该多肽进一步包含一个接头和一个碳水化合物结合域。
[20]一种组合物，该组合物包含段落1-19中任一项所述的多肽。
[21]根据段落20所述的组合物，包含一种α-淀粉酶以及一种如权利要求1-19中任一项所述的多肽。
[22]一种如段落1-19中任一项所述的多肽用于生产糖浆和/或一种发酵产品的用途。
[23]根据段落22所述的用途，其中起始材料是胶凝化或未胶凝化的含淀粉的材料。
[24]一种如段落1-19中任一项所述的多肽用于酿造的用途。
[25]一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；
(b)对这一液化的材料进行糖化；并且
(c)用一种发酵有机体进行发酵；
其中使用如段落1-19中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶进行步骤(a)和/或步骤(b)。
[26]一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)在低于所述含淀粉的材料的起始胶凝化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；并且
(b)用一种发酵有机体进行发酵,
其中使用如段落1-19中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶进行步骤(a)。
[27]一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-19中任一项所述的多肽。
[28]一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落27所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
[29]一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如段落27所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽的产生的一个或多个控制序列。
[30]一种产生如段落1-19中任一项所述的多肽的方法，包括：
(a)培养一种细胞，该细胞在其野生型形式中在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
[31]一种产生如段落1-19中任一项所述的多肽的方法，包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如段落29所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
[32]一种核酸构建体，包含如段落27所述的多核苷酸。
[33]一种表达载体，包含如段落27所述的多核苷酸。
[34]一种宿主细胞，包含如段落27所述的多核苷酸。

Claims (17)

1.一种具有改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体，其中在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置的一个或多个位置处进行了取代，其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性，且其中所述取代选自下组：
E501V+Y504T；
T65A+K161S；
T65A+Q405T；
T65A+Q327W；
T65A+Q327F；
T65A+Q327Y；
P11F+T65A+Q327F；
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；
P11F+T65A+Q327W；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
T65A+Q327F+E501V+Y504T；
T65A+S105P+Q327W；
T65A+S105P+Q327F；
T65A+Q327W+S364P；
T65A+Q327F+S364P；
T65A+S103N+Q327F；
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；
K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；
S255N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
2.一种组合物，该组合物包含如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体。
3.根据权利要求2所述的组合物，包含一种α-淀粉酶以及如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体。
4.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体用于生产糖浆的用途。
5.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体用于发酵产品的用途。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中该起始材料是胶凝化或未胶凝化的含淀粉的材料。
7.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体用于酿造的用途。
8.一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；
(b)对该液化的材料进行糖化；并且
(c)用一种发酵有机体进行发酵；
其中使用如权利要求1所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)和/或步骤(b)。
9.一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)在低于所述含淀粉的材料的起始胶凝化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；并且
(b)用一种发酵有机体进行发酵，
其中使用如权利要求1所述的至少一种葡糖淀粉酶进行步骤(a)。
10.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体。
11.一种核酸构建体或表达载体，包含了可操作地连接到一个或多个控制序列的如权利要求10所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导在一个表达宿主中所述葡糖淀粉酶变体的产生。
12.一种重组宿主细胞，包含了可操作地连接到一个或多个控制序列的如权利要求10所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导所述葡糖淀粉酶变体的产生。
13.一种产生如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：
(a)培养一种细胞，该细胞在其野生型形式中在有益于产生所述葡糖淀粉酶变体的条件下产生所述葡糖淀粉酶变体；并且
(b)回收所述葡糖淀粉酶变体。
14.一种产生如权利要求1所述的葡糖淀粉酶的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生所述葡糖淀粉酶变体的条件下培养如权利要求12所述的宿主细胞；并且
(b)回收所述葡糖淀粉酶变体。
15.一种包含如权利要求10所述的多核苷酸的核酸构建体。
16.一种包含如权利要求10所述的多核苷酸的表达载体。
17.一种包含如权利要求10所述的多核苷酸的宿主细胞。
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