CN103930436A - 大肠杆菌疫苗组合 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含以下组合的免疫原性组合物：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白片段(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(ii)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
Description
技术领域
本发明一般涉及针对大肠杆菌(E.coli)免疫和大肠杆菌疫苗的领域。本发明更特定涉及用于制备预防性和治疗性疫苗组合的多肽组合，所述组合用于针对致病性大肠杆菌致病型进行免疫。特别地，本发明涉及用于保护人抵御广谱大肠杆菌菌株的疫苗。
发明背景
本申请引用数种出版物和专利文献以更充分描述本发明所属领域状态。各出版物的公开内容通过引用纳入本文。
大肠杆菌(Escherichia coli)是人胃肠道的常见移生菌，且尽管大肠杆菌株大多被视作共生体，一些分离物仍具有引起疾病的可能。根据是否引起肠道或肠外感染来识别2种不同的致病性大肠杆菌类型。肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)组包括引起尿道感染(UPEC)、新生儿脑膜炎(NMEC)和败血症的人致病性菌株。而其它ExPEC菌株是禽类致病性(APEC)。肠道致病性大肠杆菌(InPEC)组包括许多致病型，如产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌、粘附侵袭性大肠杆菌，和弥散粘附性大肠杆菌，这些均导致人肠道感染。这些大肠杆菌致病菌株是细菌感染的最常见病因，所述细菌感染带来导致全世界每年200万人死亡的经常性全球威胁。
接种疫苗毫无疑问是针对致病性大肠杆菌株所引起发病和死亡的最经济有效的预防性措施。然而，初步研究聚焦于鉴定用于针对个体致病类型提供保护的疫苗候选物，例如针对单独UPEC或单独NMEC。在基于比较基因组分析和采用3种ExPEC菌株(IHE3034、CFT073和536)完整基因组序列的早期出版物中，发明人鉴定了9种能保护性抵御败血症的可能候选疫苗(PNAS2010；107:20,9072-9077页)。
尽管针对个体疾病或病症应用的疫苗是有效的，仍需要提供在动物特别是人中产生保护性免疫的广谱疫苗，用于针对所有或大部分大肠杆菌引起的感染。例如，一旦接种疫苗，个体可被掩护或保护以抵御所有或很高比例的大肠杆菌可导致的疾病。由于抗生素耐药性细菌(CTX-Mβ-内酰胺酶和碳青霉烯酶)整体上在医院和社区的传播，广泛保护性疫苗将具有更多益处。然而，开发这种“通用”或“泛大肠杆菌(pan E.coli)”疫苗具有挑战性，因为需要针对通常不作为共生菌群部分的大肠杆菌株亚型进行选择性防护。因此，需要改良的大肠杆菌疫苗，包括需要从粗细胞裂解物移出并趋向更清楚定义的分子，并且需要鉴定适合纳入“通用”疫苗的抗原，特别是在临床相关菌株中普遍而在共生菌株中未发现的抗原。
另外，出于以下原因优选无针或粘膜给予的疫苗：提高的患者舒适度与给药简便性，以及减少污染风险和其它副作用，同时促进患者依从性且增加疫苗接种安全性。
本发明人发现了适用于制备针对致病性大肠杆菌株的广谱疫苗的抗原组合。令人吃惊地，所述疫苗组合提供抵御来自ExPEC和InPEC组的致病性大肠杆菌株引起的疾病/病症的保护。
发明概述
第一方面，本发明提供包含以下组合的免疫原性组合物：(i)具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白片段(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(ii)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
在某些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含(iii)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的upec1232或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
在其它实施方式中，所述免疫原性组合物还包含(iv)具有SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的gspK(orf3515)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
在其它实施方式中，所述免疫原性组合物还包含至少一种细菌毒素。具体而言，所述细菌毒素是大肠杆菌毒素。更具体地，所述细菌毒素是经修饰的大肠杆菌不耐热毒素(LTK63)，然而更具体地是脱毒的大肠杆菌不耐热毒素(LTK63)。
本发明组合物的蛋白质组分可以是本文所述蛋白质或氨基酸序列的片段。
在某些实施方式中，用于所述免疫原性组合物的推定脂蛋白(orf3526)是突变蛋白，其中以SEQ ID8为参照的第1304、1305、1306、1307和/或1308位处的至少一个氨基酸(如1、2、3、4或5个氨基酸)由不同氨基酸取代。在某些实施方式中，所述推定脂蛋白(orf3526)是突变orf3526蛋白，其中锌结合活性相对于野生型orf3526降低至少50％。在某些实施方式中，所述突变体的锌含量比等量野生型orf3526的含量低至少50％。所述突变多肽可脂化，例如在N末端半胱氨酸。可制备与其它orf3526多肽变体或其片段相比(例如与野生型orf3526多肽相比)锌离子含量减少或基本没有锌离子的突变多肽。如此锌结合活性下降的突变orf3526蛋白可具有第1304、1305、1306、1307和/或1308位处的一个或多个(如2、3、4或5个)上述氨基酸取代。特定突变orf3526蛋白包含SEQ ID:31的氨基酸序列或其免疫原性片段，其包括第1304、1305和1308位处的突变。一种此类片段包含第1304、1305和1308位处的突变且包含SEQ ID31的氨基酸残基24-1520，或残基34-1520。可制备与其它orf3526多肽变体或其片段相比(例如与野生型orf3526多肽相比)锌离子含量减少或基本没有锌离子的突变多肽或其免疫原性片段。
在某些实施方式中，优选orf3526的同种型B(对应于图9a中的峰B)或其免疫原性片段。一种此类示例性免疫原性片段是如下多肽的同种型B，所述多肽包括第1304、1305和1308位处的突变且包含SEQ ID31的氨基酸残基24-1520，或残基34-1520。
在其它实施方式中，优选orf3526的同种型A(对应于图9a中的峰A)或其免疫原性片段。一种此类示例性免疫原性片段是如下多肽的同种型A，所述多肽包括第1304、1305和1308位处的突变且包含SEQ ID31的氨基酸残基24-1520，或残基34-1520。
在其它实施方式中，优选orf3526的同种型C(对应于图9a中的峰C)或其免疫原性片段。
在其它实施方式中，优选orf3526同种型A、B和C中至少2种或其免疫原性片段的组合。特别优选orf3526同种型A和B或其免疫原性片段的组合。例如，优选如下多肽的同种型A和B的组合，所述多肽包括第1304、1305和1308位处的突变且包含SEQ ID31的氨基酸残基24-1520，或残基34-1520。
本发明的免疫原性组合物可包含一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或佐剂。本发明的免疫原性组合物可包含1,2,3-丙三醇(甘油)。本发明的免疫原性组合物可以是疫苗或疫苗组合物。
其它方面中，提供治疗或预防哺乳动物中大肠杆菌感染的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的本发明所述免疫原性组合物。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物将给予粘膜表面如鼻腔上皮、口腔粘膜或选自下组的胃肠器官腔表面：胃、小肠、大肠和直肠。本发明的免疫原性组合物优选通过胃肠外给药来给予。
其它方面中，提供本发明免疫原性组合物在药物中的应用，例如用于治疗或预防哺乳动物中的大肠杆菌感染，特别用于提供抵御致病性大肠杆菌(如肠外致病性大肠杆菌或肠内致病性大肠杆菌)的广泛保护，特别用于治疗或预防由一种以上大肠杆菌致病型引起的感染，如肠外致病性大肠杆菌和肠内致病性大肠杆菌(即ExPEC和InPEC致病型)引起的感染，所述ExPEC和InPEC致病型例如NMEC、APEC、UPEC、EHEC、AIEC、EPEC、EAEC、EIEC、ETEC和DAEC致病型。因此，所述对象可获得抵御疾病的保护，所述疾病包括但不限于：腹膜炎、肾盂肾炎、膀胱炎、心内膜炎、前列腺炎、尿路感染(UTI)、脑膜炎(特别是新生儿脑膜炎)、败血症(或SIRS)、脱水、肺炎、腹泻(婴儿、旅行者、急性、持续性等)、细菌性痢疾、溶血性尿毒综合征(HUS)、心包炎、菌尿症等。因此，本发明提供本发明免疫原性组合物在制备用于治疗或预防大肠杆菌(例如肠外致病性大肠杆菌或肠内致病性大肠杆菌)感染或任何上述疾病的药物中的应用，所述大肠杆菌感染特别是由一种以上大肠杆菌致病型引起的感染，如肠外致病性大肠杆菌和肠内致病性大肠杆菌即ExPEC和InPEC致病型(例如NMEC、APEC、UPEC、EHEC、AIEC、EPEC、EAEC、EIEC、ETEC和DAEC致病型)引起的感染。
本发明还提供orf3526突变多肽，其中第1304、1305、1306、1307和/或1308位(根据SEQ ID:8编号)处的至少一个氨基酸(如1、2、3、4或5个氨基酸)由不同氨基酸取代。在某些实施方式中，所述突变体的锌含量比等量野生型orf3526的含量低至少50％。特定突变orf3526多肽包含SEQ ID:31的氨基酸序列或其免疫原性片段，其包括所述氨基酸位置1304、1305和1308位。一种此类片段包含SEQID31的氨基酸残基24-1520，或残基34-1520。所述突变多肽可被脂化，例如在N末端半胱氨酸。可制备与其它orf3526多肽变体或其片段相比(例如与野生型orf3526多肽相比)锌离子含量减少或基本没有锌离子的突变多肽。
本发明还提供3526多肽的同种型B(对应于图9a中的峰B)或其免疫原性片段，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约17分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型C之前洗脱的部分的重组3526多肽。在其它实施方式中，同种型B是包括第1304、1305和1308位处突变且任选缺乏SEQ ID31氨基酸残基1-23或残基1-33的3526多肽的同种型。
本发明还提供3526多肽的同种型A(对应于图9a中的峰A)或其免疫原性片段，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约16分钟洗脱部分或在同种型B之前和/或同种型C之前洗脱部分的重组3526多肽。在其它实施方式中，同种型A是包括第1304、1305和1308位处突变且任选缺乏SEQ ID31氨基酸残基1-23或残基1-33的3526多肽的同种型。
本发明还提供3526多肽的同种型C(对应于图9a中的峰C)或其免疫原性片段，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约19分钟洗脱部分或在同种型A之后和/或同种型B之后洗脱部分的重组3526多肽。在其它实施方式中，同种型C是包括第1304、1305和1308位处突变且任选缺乏SEQ ID31氨基酸残基1-23、或残基1-33的3526多肽的同种型。
在其它实施方式中，本发明提供orf3526同种型A、B和C中至少2种或其免疫原性片段的组合，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括以下部分的重组3526多肽：就同种型A而言在约16分钟洗脱的部分，就同种型B而言在约17分钟洗脱的部分，和就同种型C而言在约19分钟洗脱的部分；或就同种型A而言在同种型B之前和/或同种型C之前洗脱的部分，或就同种型B而言在同种型A之后和/或同种型C之前洗脱的部分，或就同种型C而言在同种型A之后和/或同种型B之后洗脱的部分。例如，orf3526同种型A和B或其免疫原性片段的组合，如多肽同种型A和B的组合，所述多肽包括第1304、1305和1308位处的突变且包含SEQ ID31的氨基酸残基24-1520、或残基34-1520。
“同种型C”用作“片段C”的同义词。
本发明还提供结合至抗体的蛋白质，该抗体确实至3526多肽的同种型B，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约17分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分，但该抗体不结合至3526多肽的同种型A，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约16分钟洗脱或在同种型B之前和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分，且该抗体不结合至3526多肽的同种型C，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约19分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型B之后洗脱的重组3526多肽部分。在其它实施方式中，同种型B是包括第1304、1305和1308位处突变且任选缺乏SEQ ID31氨基酸残基1-23或残基1-33的3526多肽的同种型。
本发明还提供结合至抗体的蛋白质，该抗体结合至3526多肽的同种型A，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约16分钟洗脱部分或在同种型B之前和/或同种型C之前洗脱部分的重组3526多肽，但该抗体不结合至3526多肽的同种型B，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约17分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分，且该抗体不结合至3526多肽的同种型C，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约19分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型B之后洗脱的重组3526多肽部分。在其它实施方式中，同种型B是包括第1304、1305和1308位处突变且任选缺乏SEQ ID31氨基酸残基1-23或残基1-33的3526多肽的同种型。
本发明还提供结合至抗体的蛋白质，该抗体结合至3526多肽的同种型C，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约19分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型B之后洗脱的重组3526多肽部分，但该抗体不结合至3526多肽的同种型A，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约16分钟洗脱或在同种型B之前和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分，且该抗体不结合至3526多肽的同种型B，其可通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，包括在约17分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分。在其它实施方式中，同种型B是包括第1304、1305和1308位处突变且任选缺乏SEQ ID31氨基酸残基1-23或残基1-33的3526多肽的同种型。
这类抗体能通过本领域已知方法制备(如就阳性和阴性选择使用同种型的色谱；噬菌体展示)。
本发明还提供含一种或多种这些同种型的免疫原性组合物，和其在治疗或预防大肠杆菌感染方法中的应用，例如在哺乳动物中。
附图说明
图1：(A)在大部分致病菌株(特别是NMEC、APEC、UPEC、EHEC、EAEC、EIEC、EPEC、ETEC和AIEC)中测定本发明组合物所用各抗原的存在；(B)在测序基因组(基于>85％序列同源性)和临床分离物(通过PCR扩增)中评价保护性候选物的基因存在。
图2：基因分布分析-通过PCR扩增和blast搜索测序基因组来在603大肠杆菌株中评价最佳保护性候选物的基因存在。ExPEC:APEC＝禽致病性大肠杆菌，UPEC＝尿路致病性大肠杆菌，NMEC＝新生儿脑膜炎大肠杆菌，SEPEC＝败血性大肠杆菌，EPEC＝肠致病性大肠杆菌，ETEC＝产肠毒素性大肠杆菌，EHEC＝肠出血性大肠杆菌。粪便大肠杆菌(Faecal E.coli)和其它致病变型＝实验室菌株，STEC＝产志贺毒素大肠杆菌(Toxinproducing E.coli)，EIEC＝肠侵袭性大肠杆菌，AIEC＝粘附侵袭性大肠杆菌，EAEC＝肠粘附性大肠杆菌，AREC＝氨苄青霉素抗性大肠杆菌。orf3526(ECOK1_3385)表达用多克隆兔血清通过对上清液部分进行免疫印迹分析来评估。
图3：orf3526分子多样性的研究：orf3526蛋白217序列的序列比对分析显示86％-100％范围的序列相同性；衍生的系统树显示存在6个主要变体。用MEGA5软件包中执行的最大似然法推测系统树。
图4：发现针对抗原orf3526的抗体在败血症禽类(鸡)模型的被动免疫中起保护作用。
图5：用抗原orf3526(ECOK1_3385)的鼻内免疫在用ETEC菌株GL53攻击后减少回肠肠道中的定植。
图6：抗原405B(ECOK1_0290)在UTI感染模型中防止肾的定植。
图7：抗原upec1232(c1275)在UTI感染模型中防止肾的定植。
图8：分析orf3526序列揭示了数个保守基序。
图9(a)：DG3526TL的同种型通过SE-HPLC在Tosoh G3000SWxl柱上分离。结合至丁基琼脂糖的部分看来在SEC中不太紧密且形成峰A，而结合至丁基琼脂糖的形式形成峰B。峰C对应于N末端截短形式。
图9(b)：为评价DG3526TL与天然3526之间的可能功能差异，后者从ExPECIHE3034培养物上清中纯化。3526与DG3526TL同种型一起运行显示所述天然形式与峰B共洗脱，表明天然3526是i)紧密的和ii)单体。
图10：描述7种所用orf3526突变体/变体的草图。
图11：通过原子吸收光谱测定多种orf3526衍生物的锌含量。结果表明每个蛋白质分子中存在单一锌离子。实际包含锌结合基序的3526B his的锌含量出乎意外地低，这可由该截短衍生物错折叠来解释，而E1305突变体中的单一氨基酸交换似乎不足以完全消除锌结合(红框)。相反，锌亲和性在TL3M三重突变体中完全丧失。
图12：orf352675％共有序列。在至少75％的orf3526序列中用于产生共有序列的位置处发现各特定残基。X表示任何氨基酸。突出显示MO60样结构域。
图13：orf3526100％共有序列。在所有orf3526序列中用于产生共有序列的位置处发现各特定残基。X表示任何氨基酸。突出显示MO60样结构域。
图14：用3526+明矾免疫后或用3526+MF59免疫后，细菌效价相较单独佐剂而言显著下降。在小鼠仅于第0天和第21天免疫的实验中证实了该结果(图14(b))。
图15：与单独LTK63相比，405B+3526+LTK63和3526+1232+LTK63显著减少GL53在盲肠中的肠道定植。
发明详述
本发明提供含大肠杆菌免疫原性成分的免疫原性组合物，其中所述免疫原性成分选自下组：具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白片段(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的upec1232或与其具有至少80％相似性的蛋白质，具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，以及具有SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的gspK(orf3515)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。本发明的组合物可包含例如上述组分中的1、2、3或4种，例如
orf405B和upec1232；orf405B和orf3526；orf405B和orf3515；
upec1232和orf3526；upec1232和orf3515；
orf3526和orf3515；
orf405B、upec1232和orf3526；orf405B、orf3526和orf3515；或upec1232、orf3526s、orf3515；
或与其中任何物质具有至少80％相似性的蛋白质。
本发明的免疫原性组合物优选包含选自下组的1、2或3种：orf405B、upec1232、orf3526的组分，或与其中任何物质具有至少80％相似性的蛋白质。例如，本发明的免疫原性组合物可包含3种组分orf405B、upec1232和orf3526，或与其中任何物质具有至少80％相似性的蛋白质。本发明的免疫原性组合物更优选包含选自下组的1或2种组分：orf405B和orf3526，或与其中任何物质具有至少80％相似性的蛋白质。例如，本发明的免疫原性组合物可包含2种组分orf405B和orf3526，或与其中任何物质具有至少80％相似性的蛋白质。或者，本发明的免疫原性组合物可包括orf405B、upec1232、orf3526和orf3515，或与其中任何物质具有至少80％相似性的蛋白质。
可分离或纯化本发明组合物的组分。
本文所用的术语“免疫原性”指例如多肽、组合物等能引发体液或细胞免疫应答，且优选两者都有。例如，术语“免疫原性组合物”指一旦给予对象(如动物例如人)时能诱导或刺激针对大肠杆菌的免疫应答的任何组合物。
免疫原性多肽也是抗原性的。若分子能与免疫系统的抗原识别分子，如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体特异性相互作用，则该分子是“抗原性的”。抗原性的多肽包含某一表位，所述表位具有至少约5个，且特定至少约10、至少15、至少20或至少50个氨基酸。多肽的抗原性部分也称为表位，可以是就抗体或T细胞受体识别而言呈免疫显性的部分，或可以是用于通过使所述抗原性部分与载体多肽偶联以供免疫来产生针对该分子的抗体的部分。技术人员会认识到，抗原性的分子本身不必具有免疫原性，例如，一些抗原需要佐剂或载体的存在以使其能引发免疫应答。
术语“抗原”指某一分子，对象针对其能起始体液和/或细胞免疫应答。针对组合物或疫苗的“免疫应答”是宿主中发展出对感兴趣组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种下列效应：特异性针对感兴趣的组合物或疫苗所含的一种或多种抗原生成抗体、B细胞、辅助T细胞，和/或细胞毒性T细胞，。优选地，所述对象将表现出治疗或保护性免疫应答，从而将提高对新感染的抗性和/或减轻疾病的临床严重性。这种保护可通过以下证实：减少或缺乏受感染对象一般显示的症状，更快的恢复时间和/或更低的病毒效价。本文所用的术语“免疫原性”蛋白质或多肽也指引起上述免疫应答的氨基酸序列。
所述免疫原性组合物预防、改善、减轻或消除动物疾病时，该免疫原性组合物可任选地被称为疫苗。
本文所用的术语“疫苗”指某一疫苗组合物，所述疫苗组合物在无致病生物体的情况下包含任一经纯化的抗原决定簇、编码经纯化的抗原决定簇或其片段的核酸。这种疫苗还可称为“亚单位疫苗”。所述术语不意在涵盖“全细胞疫苗”，例如由已死亡全细菌细胞获得的那些，其可包含未纯化形式的抗原决定簇作为复合和未鉴定组合物的一部分。
本文所用的术语“多价”指疫苗包含来自至少2种菌株或分离物的结构相似或“相关”的抗原决定簇，所述作为同源物的抗原决定簇在其氨基酸序列间有微小差异。
涉及多肽或抗原的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括来自或针对某一序列的一种(或多种)氨基酸或核苷酸的任何取代、变化、修饰、替代、缺失或添加。除非上下文另有说明，提及特定抗原包括提及这些变体、同源物、衍生物和片段。
优选的抗原变体能引起结合至该抗原的抗体。特别地，所述抗体结合至大肠杆菌细胞中存在的野生型抗原。
具体地，术语“同源物”涵盖结构和/或功能方面的相同性，只要所得氨基酸序列具有抗原或免疫原性活性。关于序列相同性(即相似性)，可能有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％的序列相同性。例如，可能有至少91％、92％、93％或94％的序列相同性。还可能有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列相同性。这些术语也涵盖衍生自氨基酸的多肽，其是核酸或氨基酸序列的等位变异。序列A与序列B之间的百分比序列相同性和相似性计算为(x/y)*100，其中x是A与B之间相同氨基酸的数目而y是选自A和B的最长序列的氨基酸数目。例如，在由50个氨基酸组成的第一序列A与由200个氨基酸组成的第二序列B之间具有10个相同残基情况下，所述两种序列间的序列相同性是5％。
提及多肽的“活性”或“生物活性”时，这些术语意在指多肽的抗原和免疫原性活性。这种活性以及对这些活性分析和定量的方法的示例为本领域已知，并于本文他处详述。
本文所用的“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列的变化，其中分别缺乏一个或多个核苷酸或氨基酸残基。本文所用的“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列的变化，其相较于天然产生的物质分别导致添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基。本文所用的“取代”由一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同核苷酸或氨基酸替换来产生。
本文所用的术语“抗原”和“氨基酸序列”应包括提及上述各序列以及其片段、同源物、衍生物和变体。
本文所用的术语“片段”指本发明所述的部分核苷酸或氨基酸序列。在某些实施方式中，氨基酸序列或多肽片段可包括含至少“n”个连续氨基酸的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸源自所列序列标识符，例如氨基酸序列的至少5个氨基酸残基，至少10个氨基酸残基，至少15个氨基酸残基，至少20个氨基酸残基，至少25个氨基酸残基，至少30个氨基酸残基，至少35个氨基酸残基，至少40个氨基酸残基，至少45个氨基酸残基，至少50个氨基酸残基，至少60个氨基酸残基，至少70个氨基酸残基，至少80个氨基酸残基，至少90个氨基酸残基，至少100、至少150、至少200或至少250个氨基酸残基。在某些实施方式中，氨基酸片段可包括含某一氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有不超过50个、不超60个、不超过75个、不超过100个、不超过150个、不超过200个、不超过250个、不超过300个、不超过350个、不超过400个的氨基酸残基。优选片段包含表位或是免疫原性片段。优选片段缺乏本发明多肽的氨基末端部分，如SEQID NO:8或SEQ ID NO:31的残基1-23或残基1-33，或本发明其它orf3526多肽的对应残基。片段与较长序列之间的序列相同性和相似性根据上述相同方法计算，即基于相对于最长序列的相同残基。
本文所用的术语“纯化”或“待纯化”指从样品移除污染物。例如，抗原通过移除污染蛋白质来纯化。污染物的移除使得样品中抗原(如本发明的抗原)百分比增加。
本文所用的“分离”和“纯化”描述某些分子、蛋白质、多糖、脂质、抗原等，并且所指状态超过如下状态：其中所述分子、蛋白质、多糖、脂质或抗原在细胞中天然存在的状态。例如，本文所用的术语特定指从其天然产生的环境如细胞中移出。在优选实施方式中，所分离的分子、蛋白质、多糖、脂质、抗原等从超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的蛋白质和/或脂质中分离，所述分子、蛋白、多糖、脂质、抗原等一般与其在细胞中天然相关。如果合成所分离的分子、蛋白质、多糖、脂质、抗原等，其有小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或0.1％的化学前体或用于合成该脂质抗原的合成试剂的污染。在优选实施方式中，所述分子、蛋白质、多糖、脂质或抗原为至少1％纯、5％纯、10％纯、20％纯、30％纯、40％纯、50％纯、60％纯、70％纯、80％纯、90％纯、95％纯、99％纯或100％纯。本文所用的术语“％纯”表示由感兴趣分子构成的组合物重量百分比。因此，含50克感兴趣分子的100克组合物就感兴趣分子而言是50％纯。
术语“治疗”包括治疗性处理和预防或防止性处理，其中目标是防止或减少感染。例如，治疗可包括直接影响或治愈、阻遏、抑制、防止、减少与例如感染相关症状的严重性，延迟所述症状的发生，减轻所述症状，或上述组合。“防止”可指延迟症状发生、防止疾病复发等。治疗还可包括“阻遏”或“抑制”感染或疾病，例如减少症状的严重性、数量、发生率或潜伏期，缓解症状，减少次要症状，减少继发感染，延长患者存活，或其组合。
用于本发明的多肽能以多种方式制备，例如通过化学合成(全部或部分)，用蛋白酶消化较长多肽，从RNA翻译，从细胞培养物(如来自重组表达)、生物本身(如细菌培养后，或直接来自患者)纯化等。一种生成<40个氨基酸的多肽的优选方法涉及体外化学合成[1,2]。特别优选固相肽合成，如基于tBoc或Fmoc[3]化学的方法。可部分或全部使用酶合成[4]。作为化学合成的替代，可采用生物合成，例如多肽可通过翻译生成。这可在体外或体内进行。生物学方法一般限于根据L氨基酸的多肽生成，但控制翻译装置(如氨酰tRNA分子)能用于引入D氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸等)[5]。然而，包括D氨基酸时，优选采用化学合成。多肽可在C末端和/或N末端有共价修饰。
多肽可采用多种形式(如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、微粒、变性等)。
多肽优选制备为纯化或基本纯化的形式。可使多肽连接至固体支持物。多肽可包含可检测标记物(如放射性标记物或荧光标记物，或生物素标记物)。
术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或分支的，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸中断。该术语也涵盖天然或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记成分偶联。例如，该定义还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知其它修饰的多肽。多肽可以单链或结合链的形式出现。多肽可被天然或非天然糖基化(即所述多肽的糖基化模式不同于对应天然产生的多肽中发现的糖基化模式)。
用于本发明的多肽可通过在诱导多肽表达的条件下培养宿主细胞来生成。多肽的表达可在就表达而言呈异源性的宿主中发生。异源性宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。合适的宿主包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、乳糖奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseriacinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。
用于本发明组合的特定多肽可包括获自细菌Ig样结构域(组1)蛋白片段(orf405B)、gspK(orf3515)、upec-1232和推定脂蛋白(orf3526)的氨基酸序列，上述各项在本文中有更充分描述。
细菌Ig样结构域蛋白片段‘orf405B’
WO2006/089264(SEQ ID809和810)公开了来自大肠杆菌NMEC的细菌Ig样结构域(组1)蛋白并称之为“orf405”，所述蛋白质还称为来自大肠杆菌NMEC菌株IHE3034的“orf284”、来自CFT073的“c0415”和来自536的“ecp_0367”。此orf405蛋白的片段首先公开于WO2011/004263(例如SEQ ID641和642)。本发明所述组合物优选包含细菌Ig样结构域蛋白片段“orf405B”。该蛋白质片段的核苷酸和氨基酸序列在本文中称为SEQ ID1和2，其是：
>orf405B(SEQ ID 1)
GTTGCTGATGGTCAGCAAGCCTACACGCTGACACTGACAGCGGTGGACTCCGAGGGTAATCCGGTGACGGGAGAAGCCAGCCGCCTGCGACTTGTTCCGCAAGACACTAATGGTGTAACCGTTGGTGCCATTTCGGAAATAAAACCAGGGGTTTACAGCGCCACGGTTTCTTCGACCCGTGCCGGAAACGTTGTTGTGCGTGCCTTCAGCGAGCAGTATCAGCTGGGCACATTACAACAAACGCTGAAGTTTGTTGCCGGGCCGCTTGATGCAGCACATTCGTCCATCACACTGAATCCTGATAAACCGGTGGTTGGCGGTACAGTTACGGCAATCTGGACGGCAAAAGATGCTAATGACAACCCTGTAACTGGCCTCAATCCGGATGCACCGTCATTATCGGGCGCAGCTGCTGCTGGTTCTACGGCATCAGGCTGGACGGATAATGGCGACGGGACCTGGACTGCGCAGATTTCTCTCGGCACTACGGCGGGTGAATTAGACGTTATGCCGAAGCTCAATGGGCAGGACGCGGCAGCAAATGCGGCAAAAGTAACCGTGGTGGCTGATGCATTATCTTCAAACCAGTCGAAAGTCTCTGTCGCAGAAGATCACGTAAAAGCCGGTGAAAGCACAACCGTAACGCTGGTGGCGAAAGATGCGCATGGCAACGCTATCAGTGGTCTTTCGTTGTCGGCAAGTTTGACGGGGACCGCCTCTGAAGGGGCGACCGTTTCCAGTTGGACCGAAAAAGGTGACGGTTCCTATGTTGCTACGTTAACTACAGGCGGAAAGACGGGCGAGCTTCGTGTCATGCCGCTCTTCAACGGCCAGCCTGCAGCCACCGAAGCCGCGCAGCTGACTGTTATTGCCGGAGAGATGTCATCAGCGAACTCTACGCTTGTTGCGGACAATAAAACTCCAACGGTTAAAACGACGACGGAACTCACCTTCACCATGAAGGATGCGTACGGGAATCCGGTCACCGGGCTGAAGCCAGATGCACCAGTGTTTAGTGGTGCCGCCAGCACGGGGAGTGAGCGTCCTTCAGCAGGAAACTGGACAGAGAAAGGTAATGGGGTCTACGTGTCGACCTTAACGCTGGGATCTGCCGCGGGTCAGTTGTCTGTGATGCCGCGAGTGAACGGCCAAAATGCCGTTGCTCAGCCACTGGTGCTGAATGTTGCAGGTGACGCATCTAAGGCTGAGATTCGTGATATGACAGTGAAGGTTAATAACCAA
>orf405B(SEQ ID2)
VADGQQAYTLTLTAVDSEGNPVTGEASRLRLVPQDTNGVTVGAISEIKPGVYSATVSSTRAGNVVVRAFSEQYQLGTLQQTLKFVAGPLDAAHSSITLNPDKPVVGGTVTAIWTAKDANDNPVTGLNPDAPSLSGAAAAGSTASGWTDNGDGTWTAQISLGTTAGELDVMPKLNGQDAAANAAKVTVVADALSSNQSKVSVAEDHVKAGESTTVTLVAKDAHGNAISGLSLSASLTGTASEGATVSSWTEKGDGSYVATLTTGGKTGELRVMPLFNGQPAATEAAQLTVIAGEMSSANSTLVADNKTPTVKTTTELTFTMKDAYGNPVTGLKPDAPVFSGAASTGSERPSAGNWTEKGNGVYVSTLTLGSAAGQLSVMPRVNGQNAVAQPLVLNVAGDASKAEIRDMTVKVNNQ
根据本发明使用时，orf405B蛋白可采用多种形式。特定orf405B序列与SEQID NO1和/或2具有80％或更高相同性(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。这包括变体(例如等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。
Upec1232蛋白
来自大肠杆菌UPEC的“Upec1232”蛋白公开于WO2006/091517(SEQ ID138)且还称为：来自CFT073的“c1275”。根据本发明使用时，upec1232蛋白可采用多种形式。优选的upec1232序列与SEQ ID NO3、4、5或6具有80％或更高相同性(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。这包括变体(例如等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。
>upec-1232(SEQ ID3)
ATGATTCACCTGTTCAAAACCTGCATGATTACCGCCTTCATTCTGGGGTTAACGTGGTCTGCCCCACTCCGGGCACAGGATCAACGTTACATCAGTATACGCAATACAGATACGATATGGCTCCCGGGAAATATTTGTGCTTACCAGTTCCGGCTGGATAATGGCGGAAACGATGAAGGATTTGGCCCCCTCACCATCACTCTGCAACTCAAAGACAAATATGGTCAGACGCTGGTGACCAGAAAAATGGAAACGGAAGCCTTTGGTGACAGTAATGCCACGCGAACCACAGACGCATTTCTGGAAACGGAGTGCGTGGAAAATGTCGCCACAACCGAAATCATTAAAGCAACTGAAGAAAGTAACGGCCATCGTGTCAGTCTGCCGTTATCGGTTTTCGATCCCCAGGACTACCATCCACTGCTGATTACCGTTTCCGGAAAAAACGTTAAC
>upec-1232(SEQ ID4)
MIHLFKTCMITAFILGLTWSAPLRAQDQRYISIRNTDTIWLPGNICAYQFRLDNGGNDEGFGPLTITLQLKDKYGQTLVTRKMETEAFGDSNATRTTDAFLETECVENVATTEIIKATEESNGHRVSLPLSVFDPQDYHPLLITVSGKNVN
>pCFT-1232(SEQ ID5)
CAGGATCAACGTTACATCAGTATACGCAATACAGATACGATATGGCTCCCGGGAAATATTTGTGCTTACCAGTTCCGGCTGGATAATGGCGGAAACGATGAAGGATTTGGCCCCCTCACCATCACTCTGCAACTCAAAGACAAATATGGTCAGACGCTGGTGACCAGAAAAATGGAAACGGAAGCCTTTGGTGACAGTAATGCCACGCGAACCACAGACGCATTTCTGGAAACGGAGTGCGTGGAAAATGTCGCCACAACCGAAATCATTAAAGCAACTGAAGAAAGTAACGGCCATCGTGTCAGTCTGCCGTTATCGGTTTTCGATCCCCAGGACTACCATCCACTGCTGATTACCGTTTCCGGAAAAAACGTTAAC
>pCFT-1232(SEQ ID6)
QDQRYISIRNTDTIWLPGNICAYQFRLDNGGNDEGFGPLTITLQLKDKYGQTLVTRKMETEAFGDSNATRTTDAFLETECVENVATTEIIKATEESNGHRVSLPLSVFDPQDYHPLLITVSGKNVN
推定脂蛋白orf3526
辅助定植因子D(AcfD)前体，也称为“ECOK1_3385”、“推定脂蛋白orf3526”、来自大肠杆菌NMEC菌株IHE3034的“orf3526”蛋白，公开于WO2006/089264。根据本发明使用时，orf3526蛋白可采用多种形式。优选的orf3526序列与SEQ ID NO7-28具有80％或更高相同性(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。这包括变体(例如等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。
>orf03526(SEQ ID7)
ATGAATAAGAAATTTAAATATAAGAAATCGCTTTTAGCGGCTATTTTAAGCGCAACCCTGTTAGCCGGTTGTGATGGTGGTGGTTCAGGATCGTCCTCCGATACGCCGTCTGTAGATTCTGGATCAGGGACTTTGCCGGAAGTGAAACCCGATCCAACACCAACCCCGGAGCCGACACCTGAGCCGACGCCGGACCCAGAACCTACGCCGGATCCAACACCTGATCCTGAGCCGACACCAGAACCGGAGCCAGAACCTGTTCCTACGAAAACGGGTTATCTGACCCTGGGCGGAAGCCAGCGGGTAACTGGTGCTACCTGTAATGGTGAATCCAGCGATGGCTTTACCTTTACGCCAGGCAATACCGTGAGTTGTGTGGTGGGCAGTACGACCATTGCAACATTCAACACCCAGTCAGAAGCTGCGCGTAGCCTGCGTGCGGTTGACAAAGTGTCGTTTAGCCTGGAGGACGCGCAGGAGCTGGCGAATTCTGAAAATAAGAAAACCAACGCCATCTCTCTGGTGACGTCCAGCGACAGTTGCCCCGCAGATGCAGAACAGCTTTGTCTTACTTTCTCGTCAGTGGTTGATCGCGCGCGATTTGAAAAACTGTATAAGCAAATTGATCTGGCAACAGACAATTTCAGCAAGCTGGTCAATGAAGAGGTGGAAAACAATGCTGCGACTGATAAAGCGCCGTCCACCCATACCTCAACGGTAGTGCCAGTCACGACAGAGGGAACAAAACCGGATCTGAACGCGTCCTTCGTGTCGGCTAACGCGGAACAGTTTTATCAGTATCAACCCACTGAAATCATTCTTTCCGAAGGCCAACTGGTGGATAGCCTGGGGAACGGTGTTGCTGGCGTTGACTACTACACCAATTCAGGCCGTGGCGTAACTGACGAAAACGGTAAATTTTCCTTTAGCTGGGGCGAAACCATCTCCTTTGGTATCGATACCTTTGAACTGGGCTCAGTACGTGGCAATAAGTCGACCATTGCGCTGACTGAATTGGGTGATGAAGTTCGCGGGGCAAATATCGATCAGCTCATTCATCGTTATTCGACGACTGGTCAAAATAATACTCGTGTTGTTCCGGACGATGTACGCAAGGTCTTTGCCGAATATCCCAACGTGATCAACGAGATAATCAATCTTTCGTTATCCAACGGTGCGACGCTGGATGAAGGCGATCAAAACGTTGTGCTGCCTAACGAATTTATCGAGCAGTTTAAGACGGGTCAGGCCAAAGAGATCGATACCGCGATTTGTGCGAAAACCGACGGTTGTAACGAGGCTCGCTGGTTCTCGCTGACAACGCGCAATGTTAATGACGGCCAGATTCAGGGCGTTATTAACAAGCTGTGGGGCGTGGATACGAACTATCAGTCTGTCAGCAAGTTCCACGTCTTCCATGACTCTACCAACTTCTATGGCAGCACCGGTAACGCGCGCGGTCAGGCGGTGGTAAATATCTCCAACTCGGCATTCCCGATTCTGATGGCGCGTAATGATAAAAACTACTGGCTGGCGTTTGGCGAAAAACGCGCCTGGGATAAAAATGAGCTGGCGTACATTACGGAAGCGCCTTCCATTGTGCAGCCAGAGAACGTTACGCGCGATACTGCGACTTTCAACCTGCCGTTTATTTCGCTGGGGCAAGTCGGTGAAGGCAAACTGATGGTTATCGGTAACCCGCACTACAACAGCATCCTGCGTTGCCCGAACGGTTACAGTTGGGGCGGTGGTGTTAATAGTAAAGGTGAGTGTACGCTCAGCGGTGATTCTGATGACATGAAGCACTTTATGCAGAACGTACTGCGCTACTTGTCAAATGACATCTGGCAGCCAAATACCAAGAGCATCATGACTGTCGGCACCAACCTGGAGAACGTTTATTTCAAAAAAGCGGGCCAGGTATTGGGAAATAGTGCACCATTTGCTTTCCATGAGGATTTCACTGGTATCACGGTTAAACAGTTGACCAGCTATGGCGATCTGAATCCGGAAGAGATTCCGTTGCTGATCCTCAACGGCTTTGAATATGTGACTCAGTGGTCTGGCGATCCCTATGCTGTGCCTCTGCGTGCAGATACCAGCAAACCGAAGCTGACTCAGCAGGATGTGACCGATCTGATCGCTTATCTGAACAAAGGTGGCTCGGTGCTGATCATGGAAAACGTGATGAGCAATCTTAAGGAAGAGAGCGCGTCCAGTTTTGTGCGTCTGCTGGATGCCGCGGGTCTGTCAATGGCTCTGAACAAATCGGTGGTGAACAACGATCCGCAAGGGTATCCGGATCGCGTTCGTCAGCGTCGCGCGACTGGCATTTGGGTTTATGAACGTTATCCTGCTGCAGACGGCGCGCAACCGCCGTACACCATCGACCCAAATACAGGGGAAGTGACCTGGAAATACCAGCAAGACAACAAGCCTGATGACAAGCCGAAACTGGAAGTTGCGAGCTGGCAGGAGGAAGTTGAGGGCAAACAGGTAACGCGTTATGCCTTTATTGATGAAGCGGAATACACAACAGAAGAATCTCTGGAAGCGGCAAAGGCAAAAATCTTTGAGAAGTTTCCTGGGTTACAGGAGTGTAAGGACTCGACTTACCATTACGAGATTAACTGTTTGGAGCGCCGCCCAGGCACGGATGTTCCGGTAACAGGTGGCATGTATGTTCCGCGCTATACGCAACTGAATCTTGACGCCGACACCGCGAAAGCGATGGTGCAGGCGGCGGATTTAGGCACCAACATTCAGCGCCTGTATCAGCATGAGCTTTATTTCCGTACCAAAGGCAGTAAAGGTGAGCGTCTGAACAGTGTTGATCTGGAACGTCTGTACCAGAACATGTCGGTCTGGCTGTGGAACGATACGAAATATCGTTACGAAGAGGGCAAGGAAGATGAGCTGGGCTTTAAAACGTTCACCGAGTTCCTGAACTGCTACGCCAATGATGCCTATGCAGGCGGCACCAAGTGCTCCGCAGATCTGAAAAAATCGCTGGTCGATAACAACATGATCTACGGTGACGGTAGCAGCAAAGCGGGCATGATGAACCCAAGCTATCCGCTCAACTATATGGAAAAACCGCTGACGCGTCTGATGCTGGGCCGTTCCTGGTGGGATCTGAACATTAAGGTTGATGTGGAGAAGTACCCAGGATCCGTATCGGCAAAGGGTGAGAGCGTTACGGAAAACATCAGCCTGTACTCGAATCCGACCAAATGGTTTGCGGGTAACATGCAGTCAACCGGCCTGTGGGCACCGGCCCAGCAGGACGTCACCATTAAGTCTTCGGCGTCAGTCCCAGTGACTGTTACCGTGGCGCTGGCTGACGACCTGACTGGACGTGAGAAGCATGAAGTTGCGCTGAACCGTCCGCCAAGAGTGACTAAAACGTATACTCTGGAGGCTAACGGTGAAGTGACCTTCAAGGTGCCTTATGGTGGTCTGATTTATATCAAGGGCGACAGTAAGGATGATGTTTCTGCTAACTTCACCTTTACCGGTGTAGTAAAAGCGCCGTTCTATAAAGACGGCGAATGGAAAAACGATCTGGACTCACCGGCGCCGCTGGGCGAGCTGGAGTCTGCGTCGTTCGTCTATACCACGCCGAAGAAGAACCTTGAGGCCAGCAATTTCACTGGTGGTGTAGCAGAATTCGCTAAAGATCTGGATACCTTTGCCAGCTCGATGAATGACTTCTACGGTCGTAATGATGAAGACGGTAAGCACCGGATGTTTACCTATAAAAACTTGACGGGGCACAAGCATCGTTTCACCAACGATGTGCAGATCTCCATCGGTGATGCGCACTCGGGTTATCCGGTAATGAACAGCAGCTTCTCGACGAACAGCACCACGCTGCCGACGACGCCGCTGAACGACTGGCTGATTTGGCACGAAGTCGGTCATAACGCTGCAGAAACACCGCTGAACGTACCGGGTGCAACTGAAGTGGCGAACAACGTGCTGGCGCTGTACATGCAGGATCGCTATCTCGGTAAGATGAACCGTGTCGCTGACGACATTACCGTCGCGCCGGAATATCTGGACGAGAGCAACGGTCAGGCCTGGGCGCGCGGCGGTGCGGGTGACCGTCTGCTGATGTACGCACAGTTGAAGGAGTGGGCAGAGGAAAACTTTGATATCAAACAGTGGTATCCAGATGGTGAGCTGCCTAAGTTCTACAGCGATCGTAAAGGGATGAAGGGCTGGAACCTGTTCCAGTTGATGCACCGTAAAGCGCGCGGCGATGATGTTGGTAACAGCACCTTTGGTGGCAAGAATTACTGTGCTGAATCCAATGGTAACGCTGCCGACACGCTGATGCTGTGTGCATCCTGGGTCGCTCAGGCGGATCTTTCGGAATTCTTTAAGAAATGGAATCCGGGTGCAAGTGCTTACCAGTTGCCGGGAGCAACGGAGATGAGTTTCCAGGGCGGTGTGAGCTCTTCGGCTTACAGCACGCTGGCGTCACTCAAGCTGCCGAAACCGGAAAAAGGGCCGGAAACCATTAACAAGGTTACCGAGCATAAGATGTCTGCCGAG
>orf03526(SEQ ID8)
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GATACGCCGTCTGTAGATTCTGGATCAGGGACTTTGCCGGAAGTGAAACCCGATCCAACACCAACCCCGGAGCCGACACCTGAGCCGACGCCGGACCCAGAACCTACGCCGGATCCAACACCTGATCCTGAGCCGACACCAGAACCGGAGCCAGAACCTGTTCCTACGAAAACGGGTTATCTGACCCTGGGCGGAAGCCAGCGGGTAACTGGTGCTACCTGTAATGGTGAATCCAGCGATGGCTTTACCTTTACGCCAGGCAATACCGTGAGTTGTGTGGTGGGCAGTACGACCATTGCAACATTCAACACCCAGTCAGAAGCTGCGCGTAGCCTGCGTGCGGTTGACAAAGTGTCGTTTAGCCTGGAGGACGCGCAGGAGCTGGCGAATTCTGAAAATAAGAAAACCAACGCCATCTCTCTGGTGACGTCCAGCGACAGTTGCCCCGCAGATGCAGAACAGCTTTGTCTTACTTTCTCGTCAGTGGTTGATCGCGCGCGATTTGAAAAACTGTATAAGCAAATTGATCTGGCAACAGACAATTTCAGCAAGCTGGTCAATGAAGAGGTGGAAAACAATGCTGCGACTGATAAAGCGCCGTCCACCCATACCTCAACGGTAGTGCCAGTCACGACAGAGGGAACAAAACCGGATCTGAACGCGTCCTTCGTGTCGGCTAACGCGGAACAGTTTTATCAGTATCAACCCACTGAAATCATTCTTTCCGAAGGCCAACTGGTGGATAGCCTGGGGAACGGTGTTGCTGGCGTTGACTACTACACCAATTCAGGCCGTGGCGTAACTGACGAAAACGGTAAATTTTCCTTTAGCTGGGGCGAAACCATCTCCTTTGGTATCGATACCTTTGAACTGGGCTCAGTACGTGGCAATAAGTCGACCATTGCGCTGACTGAATTGGGTGATGAAGTTCGCGGGGCAAATATCGATCAGCTCATTCATCGTTATTCGACGACTGGTCAAAATAATACTCGTGTTGTTCCGGACGATGTACGCAAGGTCTTTGCCGAATATCCCAACGTGATCAACGAGATAATCAATCTTTCGTTATCCAACGGTGCGACGCTGGATGAAGGCGATCAAAACGTTGTGCTGCCTAACGAATTTATCGAGCAGTTTAAGACGGGTCAGGCCAAAGAGATCGATACCGCGATTTGTGCGAAAACCGACGGTTGTAACGAGGCTCGCTGGTTCTCGCTGACAACGCGCAATGTTAATGACGGCCAGATTCAGGGCGTTATTAACAAGCTGTGGGGCGTGGATACGAACTATCAGTCTGTCAGCAAGTTCCACGTCTTCCATGACTCTACCAACTTCTATGGCAGCACCGGTAACGCGCGCGGTCAGGCGGTGGTAAATATCTCCAACTCGGCATTCCCGATTCTGATGGCGCGTAATGATAAAAACTACTGGCTGGCGTTTGGCGAAAAACGCGCCTGGGATAAAAATGAGCTGGCGTACATTACGGAAGCGCCTTCCATTGTGCAGCCAGAGAACGTTACGCGCGATACTGCGACTTTCAACCTGCCGTTTATTTCGCTGGGGCAAGTCGGTGAAGGCAAACTGATGGTTATCGGTAACCCGCACTACAACAGCATCCTGCGTTGCCCGAACGGTTACAGTTGGGGCGGTGGTGTTAATAGTAAAGGTGAGTGTACGCTCAGCGGTGATTCTGATGACATGAAGCACTTTATGCAGAACGTACTGCGCTACTTGTCAAATGACATCTGGCAGCCAAATACCAAGAGCATCATGACTGTCGGCACCAACCTGGAGAACGTTTATTTCAAAAAAGCGGGCCAGGTATTGGGAAATAGTGCACCATTTGCTTTCCATGAGGATTTCACTGGTATCACGGTTAAACAGTTGACCAGCTATGGCGATCTGAATCCGGAAGAGATTCCGTTGCTGATCCTCAACGGCTTTGAATATGTGACTCAGTGGTCTGGCGATCCCTATGCTGTGCCTCTGCGTGCAGATACCAGCAAACCGAAGCTGACTCAGCAGGATGTGACCGATCTGATCGCTTATCTGAACAAAGGTGGCTCGGTGCTGATCATGGAAAACGTGATGAGCAATCTTAAGGAAGAGAGCGCGTCCAGTTTTGTGCGTCTGCTGGATGCCGCGGGTCTGTCAATGGCTCTGAACAAATCGGTGGTGAACAACGATCCGCAAGGGTATCCGGATCGCGTTCGTCAGCGTCGCGCGACTGGCATTTGGGTTTATGAACGTTATCCTGCTGCAGACGGCGCGCAACCGCCGTACACCATCGACCCAAATACAGGGGAAGTGACCTGGAAATACCAGCAAGACAACAAGCCTGATGACAAGCCGAAACTGGAAGTTGCGAGCTGGCAGGAGGAAGTTGAGGGCAAACAGGTAACGCGTTATGCCTTTATTGATGAAGCGGAATACACAACAGAAGAATCTCTGGAAGCGGCAAAGGCAAAAATCTTTGAGAAGTTTCCTGGGTTACAGGAGTGTAAGGACTCGACTTACCATTACGAGATTAACTGTTTGGAGCGCCGCCCAGGCACGGATGTTCCGGTAACAGGTGGCATGTATGTTCCGCGCTATACGCAACTGAATCTTGACGCCGACACCGCGAAAGCGATGGTGCAGGCGGCGGATTTAGGCACCAACATTCAGCGCCTGTATCAGCATGAGCTTTATTTCCGTACCAAAGGCAGTAAAGGTGAGCGTCTGAACAGTGTTGATCTGGAACGTCTGTACCAGAACATGTCGGTCTGGCTGTGGAACGATACGAAATATCGTTACGAAGAGGGCAAGGAAGATGAGCTGGGCTTTAAAACGTTCACCGAGTTCCTGAACTGCTACGCCAATGATGCCTATGCAGGCGGCACCAAGTGCTCCGCAGATCTGAAAAAATCGCTGGTCGATAACAACATGATCTACGGTGACGGTAGCAGCAAAGCGGGCATGATGAACCCAAGCTATCCGCTCAACTATATGGAAAAACCGCTGACGCGTCTGATGCTGGGCCGTTCCTGGTGGGATCTGAACATTAAGGTTGATGTGGAGAAGTACCCAGGATCCGTATCGGCAAAGGGTGAGAGCGTTACGGAAAACATCAGCCTGTACTCGAATCCGACCAAATGGTTTGCGGGTAACATGCAGTCAACCGGCCTGTGGGCACCGGCCCAGCAGGACGTCACCATTAAGTCTTCGGCGTCAGTCCCAGTGACTGTTACCGTGGCGCTGGCTGACGACCTGACTGGACGTGAGAAGCATGAAGTTGCGCTGAACCGTCCGCCAAGAGTGACTAAAACGTATACTCTGGAGGCTAACGGTGAAGTGACCTTCAAGGTGCCTTATGGTGGTCTGATTTATATCAAGGGCGACAGTAAGGATGATGTTTCTGCTAACTTCACCTTTACCGGTGTAGTAAAAGCGCCGTTCTATAAAGACGGCGAATGGAAAAACGATCTGGACTCACCGGCGCCGCTGGGCGAGCTGGAGTCTGCGTCGTTCGTCTATACCACGCCGAAGAAGAACCTTGAGGCCAGCAATTTCACTGGTGGTGTAGCAGAATTCGCTAAAGATCTGGATACCTTTGCCAGCTCGATGAATGACTTCTACGGTCGTAATGATGAAGACGGTAAGCACCGGATGTTTACCTATAAAAACTTGACGGGGCACAAGCATCGTTTCACCAACGATGTGCAGATCTCCATCGGTGATGCGCACTCGGGTTATCCGGTAATGAACAGCAGCTTCTCGACGAACAGCACCACGCTGCCGACGACGCCGCTGAACGACTGGCTGATTTGG
pK1-3526CdG(SEQ ID26)
DTPSVDSGSGTLPEVKPDPTPTPEPTPEPTPDPEPTPDPTPDPEPTPEPEPEPVPTKTGYLTLGGSQRVTGATCNGESSDGFTFTPGNTVSCVVGSTTIATFNTQSEAARSLRAVDKVSFSLEDAQELANSENKKTNAISLVTSSDSCPADAEQLCLTFSSVVDRARFEKLYKQIDLATDNFSKLVNEEVENNAATDKAPSTHTSTVVPVTTEGTKPDLNASFVSANAEQFYQYQPTEIILSEGQLVDSLGNGVAGVDYYTNSGRGVTDENGKFSFSWGETISFGIDTFELGSVRGNKSTIALTELGDEVRGANIDQLIHRYSTTGQNNTRVVPDDVRKVFAEYPNVINEIINLSLSNGATLDEGDQNVVLPNEFIEQFKTGQAKEIDTAICAKTDGCNEARWFSLTTRNVNDGQIQGVINKLWGVDTNYQSVSKFHVFHDSTNFYGSTGNARGQAVVNISNSAFPILMARNDKNYWLAFGEKRAWDKNELAYITEAPSIVQPENVTRDTATFNLPFISLGQVGEGKLMVIGNPHYNSILRCPNGYSWGGGVNSKGECTLSGDSDDMKHFMQNVLRYLSNDIWQPNTKSIMTVGTNLENVYFKKAGQVLGNSAPFAFHEDFTGITVKQLTSYGDLNPEEIPLLILNGFEYVTQWSGDPYAVPLRADTSKPKLTQQDVTDLIAYLNKGGSVLIMENVMSNLKEESASSFVRLLDAAGLSMALNKSVVNNDPQGYPDRVRQRRATGIWVYERYPAADGAQPPYTIDPNTGEVTWKYQQDNKPDDKPKLEVASWQEEVEGKQVTRYAFIDEAEYTTEESLEAAKAKIFEKFPGLQECKDSTYHYEINCLERRPGTDVPVTGGMYVPRYTQLNLDADTAKAMVQAADLGTNIQRLYQHELYFRTKGSKGERLNSVDLERLYQNMSVWLWNDTKYRYEEGKEDELGFKTFTEFLNCYANDAYAGGTKCSADLKKSLVDNNMIYGDGSSKAGMMNPSYPLNYMEKPLTRLMLGRSWWDLNIKVDVEKYPGSVSAKGESVTENISLYSNPTKWFAGNMQSTGLWAPAQQDVTIKSSASVPVTVTVALADDLTGREKHEVALNRPPRVTKTYTLEANGEVTFKVPYGGLIYIKGDSKDDVSANFTFTGVVKAPFYKDGEWKNDLDSPAPLGELESASFVYTTPKKNLEASNFTGGVAEFAKDLDTFASSMNDFYGRNDEDGKHRMFTYKNLTGHKHRFTNDVQISIGDAHSGYPVMNSSFSTNSTTLPTTPLNDWLIW
>pK1-L3526-2stop(SEQ ID27)
ATGAATAAGAAATTTAAATATAAGAAATCGCTTTTAGCGGCTATTTTAAGCGCAACCCTGTTAGCCGGTTGTGATGGTGGTGGTTCAGGATCGTCCTCCGATACGCCGTCTGTAGATTCTGGATCAGGGACTTTGCCGGAAGTGAAACCCGATCCAACACCAACCCCGGAGCCGACACCTGAGCCGACGCCGGACCCAGAACCTACGCCGGATCCAACACCTGATCCTGAGCCGACACCAGAACCGGAGCCAGAACCTGTTCCTACGAAAACGGGTTATCTGACCCTGGGCGGAAGCCAGCGGGTAACTGGTGCTACCTGTAATGGTGAATCCAGCGATGGCTTTACCTTTACGCCAGGCAATACCGTGAGTTGTGTGGTGGGCAGTACGACCATTGCAACATTCAACACCCAGTCAGAAGCTGCGCGTAGCCTGCGTGCGGTTGACAAAGTGTCGTTTAGCCTGGAGGACGCGCAGGAGCTGGCGAATTCTGAAAATAAGAAAACCAACGCCATCTCTCTGGTGACGTCCAGCGACAGTTGCCCCGCAGATGCAGAACAGCTTTGTCTTACTTTCTCGTCAGTGGTTGATCGCGCGCGATTTGAAAAACTGTATAAGCAAATTGATCTGGCAACAGACAATTTCAGCAAGCTGGTCAATGAAGAGGTGGAAAACAATGCTGCGACTGATAAAGCGCCGTCCACCCATACCTCAACGGTAGTGCCAGTCACGACAGAGGGAACAAAACCGGATCTGAACGCGTCCTTCGTGTCGGCTAACGCGGAACAGTTTTATCAGTATCAACCCACTGAAATCATTCTTTCCGAAGGCCAACTGGTGGATAGCCTGGGGAACGGTGTTGCTGGCGTTGACTACTACACCAATTCAGGCCGTGGCGTAACTGACGAAAACGGTAAATTTTCCTTTAGCTGGGGCGAAACCATCTCCTTTGGTATCGATACCTTTGAACTGGGCTCAGTACGTGGCAATAAGTCGACCATTGCGCTGACTGAATTGGGTGATGAAGTTCGCGGGGCAAATATCGATCAGCTCATTCATCGTTATTCGACGACTGGTCAAAATAATACTCGTGTTGTTCCGGACGATGTACGCAAGGTCTTTGCCGAATATCCCAACGTGATCAACGAGATAATCAATCTTTCGTTATCCAACGGTGCGACGCTGGATGAAGGCGATCAAAACGTTGTGCTGCCTAACGAATTTATCGAGCAGTTTAAGACGGGTCAGGCCAAAGAGATCGATACCGCGATTTGTGCGAAAACCGACGGTTGTAACGAGGCTCGCTGGTTCTCGCTGACAACGCGCAATGTTAATGACGGCCAGATTCAGGGCGTTATTAACAAGCTGTGGGGCGTGGATACGAACTATCAGTCTGTCAGCAAGTTCCACGTCTTCCATGACTCTACCAACTTCTATGGCAGCACCGGTAACGCGCGCGGTCAGGCGGTGGTAAATATCTCCAACTCGGCATTCCCGATTCTGATGGCGCGTAATGATAAAAACTACTGGCTGGCGTTTGGCGAAAAACGCGCCTGGGATAAAAATGAGCTGGCGTACATTACGGAAGCGCCTTCCATTGTGCAGCCAGAGAACGTTACGCGCGATACTGCGACTTTCAACCTGCCGTTTATTTCGCTGGGGCAAGTCGGTGAAGGCAAACTGATGGTTATCGGTAACCCGCACTACAACAGCATCCTGCGTTGCCCGAACGGTTACAGTTGGGGCGGTGGTGTTAATAGTAAAGGTGAGTGTACGCTCAGCGGTGATTCTGATGACATGAAGCACTTTATGCAGAACGTACTGCGCTACTTGTCAAATGACATCTGGCAGCCAAATACCAAGAGCATCATGACTGTCGGCACCAACCTGGAGAACGTTTATTTCAAAAAAGCGGGCCAGGTATTGGGAAATAGTGCACCATTTGCTTTCCATGAGGATTTCACTGGTATCACGGTTAAACAGTTGACCAGCTATGGCGATCTGAATCCGGAAGAGATTCCGTTGCTGATCCTCAACGGCTTTGAATATGTGACTCAGTGGTCTGGCGATCCCTATGCTGTGCCTCTGCGTGCAGATACCAGCAAACCGAAGCTGACTCAGCAGGATGTGACCGATCTGATCGCTTATCTGAACAAAGGTGGCTCGGTGCTGATCATGGAAAACGTGATGAGCAATCTTAAGGAAGAGAGCGCGTCCAGTTTTGTGCGTCTGCTGGATGCCGCGGGTCTGTCAATGGCTCTGAACAAATCGGTGGTGAACAACGATCCGCAAGGGTATCCGGATCGCGTTCGTCAGCGTCGCGCGACTGGCATTTGGGTTTATGAACGTTATCCTGCTGCAGACGGCGCGCAACCGCCGTACACCATCGACCCAAATACAGGGGAAGTGACCTGGAAATACCAGCAAGACAACAAGCCTGATGACAAGCCGAAACTGGAAGTTGCGAGCTGGCAGGAGGAAGTTGAGGGCAAACAGGTAACGCGTTATGCCTTTATTGATGAAGCGGAATACACAACAGAAGAATCTCTGGAAGCGGCAAAGGCAAAAATCTTTGAGAAGTTTCCTGGGTTACAGGAGTGTAAGGACTCGACTTACCATTACGAGATTAACTGTTTGGAGCGCCGCCCAGGCACGGATGTTCCGGTAACAGGTGGCATGTATGTTCCGCGCTATACGCAACTGAATCTTGACGCCGACACCGCGAAAGCGATGGTGCAGGCGGCGGATTTAGGCACCAACATTCAGCGCCTGTATCAGCATGAGCTTTATTTCCGTACCAAAGGCAGTAAAGGTGAGCGTCTGAACAGTGTTGATCTGGAACGTCTGTACCAGAACATGTCGGTCTGGCTGTGGAACGATACGAAATATCGTTACGAAGAGGGCAAGGAAGATGAGCTGGGCTTTAAAACGTTCACCGAGTTCCTGAACTGCTACGCCAATGATGCCTATGCAGGCGGCACCAAGTGCTCCGCAGATCTGAAAAAATCGCTGGTCGATAACAACATGATCTACGGTGACGGTAGCAGCAAAGCGGGCATGATGAACCCAAGCTATCCGCTCAACTATATGGAAAAACCGCTGACGCGTCTGATGCTGGGCCGTTCCTGGTGGGATCTGAACATTAAGGTTGATGTGGAGAAGTACCCAGGATCCGTATCGGCAAAGGGTGAGAGCGTTACGGAAAACATCAGCCTGTACTCGAATCCGACCAAATGGTTTGCGGGTAACATGCAGTCAACCGGCCTGTGGGCACCGGCCCAGCAGGACGTCACCATTAAGTCTTCGGCGTCAGTCCCAGTGACTGTTACCGTGGCGCTGGCTGACGACCTGACTGGACGTGAGAAGCATGAAGTTGCGCTGAACCGTCCGCCAAGAGTGACTAAAACGTATACTCTGGAGGCTAACGGTGAAGTGACCTTCAAGGTGCCTTATGGTGGTCTGATTTATATCAAGGGCGACAGTAAGGATGATGTTTCTGCTAACTTCACCTTTACCGGTGTAGTAAAAGCGCCGTTCTATAAAGACGGCGAATGGAAAAACGATCTGGACTCACCGGCGCCGCTGGGCGAGCTGGAGTCTGCGTCGTTCGTCTATACCACGCCGAAGAAGAACCTTGAGGCCAGCAATTTCACTGGTGGTGTAGCAGAATTCGCTAAAGATCTGGATACCTTTGCCAGCTCGATGAATGACTTCTACGGTCGTAATGATGAAGACGGTAAGCACCGGATGTTTACCTATAAAAACTTGACGGGGCACAAGCATCGTTTCACCAACGATGTGCAGATCTCCATCGGTGATGCGCACTCGGGTTATCCGGTAATGAACAGCAGCTTCTCGACGAACAGCACCACGCTGCCGACGACGCCGCTGAACGACTGGCTGATTTGGCACGAAGTCGGTCATAACGCTGCAGAAACACCGCTGAACGTACCGGGTGCAACTGAAGTGGCGAACAACGTGCTGGCGCTGTACATGCAGGATCGCTATCTCGGTAAGATGAACCGTGTCGCTGACGACATTACCGTCGCGCCGGAATATCTGGACGAGAGCAACGGTCAGGCCTGGGCGCGCGGCGGTGCGGGTGACCGTCTGCTGATGTACGCACAGTTGAAGGAGTGGGCAGAGGAAAACTTTGATATCAAACAGTGGTATCCAGATGGTGAGCTGCCTAAGTTCTACAGCGATCGTAAAGGGATGAAGGGCTGGAACCTGTTCCAGTTGATGCACCGTAAAGCGCGCGGCGATGATGTTGGTAACAGCACCTTTGGTGGCAAGAATTACTGTGCTGAATCCAATGGTAACGCTGCCGACACGCTGATGCTGTGTGCATCCTGGGTCGCTCAGGCGGATCTTTCGGAATTCTTTAAGAAATGGAATCCGGGTGCAAGTGCTTACCAGTTGCCGGGAGCAACGGAGATGAGTTTCCAGGGCGGTGTGAGCTCTTCGGCTTACAGCACGCTGGCGTCACTCAAGCTGCCGAAACCGGAAAAAGGGCCGGAAACCATTAACAAGGTTACCGAGCATAAGATGTCTGCCGAGTAA
>pK1-L3526-2stop(SEQ ID28)
MNKKFKYKKSLLAAILSATLLAGCDGGGSGSSSDTPSVDSGSGTLPEVKPDPTPTPEPTPEPTPDPEPTPDPTPDPEPTPEPEPEPVPTKTGYLTLGGSQRVTGATCNGESSDGFTFTPGNTVSCVVGSTTIATFNTQSEAARSLRAVDKVSFSLEDAQELANSENKKTNAISLVTSSDSCPADAEQLCLTFSSVVDRARFEKLYKQIDLATDNFSKLVNEEVENNAATDKAPSTHTSTVVPVTTEGTKPDLNASFVSANAEQFYQYQPTEIILSEGQLVDSLGNGVAGVDYYTNSGRGVTDENGKFSFSWGETISFGIDTFELGSVRGNKSTIALTELGDEVRGANIDQLIHRYSTTGQNNTRVVPDDVRKVFAEYPNVINEIINLSLSNGATLDEGDQNVVLPNEFIEQFKTGQAKEIDTAICAKTDGCNEARWFSLTTRNVNDGQIQGVINKLWGVDTNYQSVSKFHVFHDSTNFYGSTGNARGQAVVNISNSAFPILMARNDKNYWLAFGEKRAWDKNELAYITEAPSIVQPENVTRDTATFNLPFISLGQVGEGKLMVIGNPHYNSILRCPNGYSWGGGVNSKGECTLSGDSDDMKHFMQNVLRYLSNDIWQPNTKSIMTVGTNLENVYFKKAGQVLGNSAPFAFHEDFTGITVKQLTSYGDLNPEEIPLLILNGFEYVTQWSGDPYAVPLRADTSKPKLTQQDVTDLIAYLNKGGSVLIMENVMSNLKEESASSFVRLLDAAGLSMALNKSVVNNDPQGYPDRVRQRRATGIWVYERYPAADGAQPPYTIDPNTGEVTWKYQQDNKPDDKPKLEVASWQEEVEGKQVTRYAFIDEAEYTTEESLEAAKAKIFEKFPGLQECKDSTYHYEINCLERRPGTDVPVTGGMYVPRYTQLNLDADTAKAMVQAADLGTNIQRLYQHELYFRTKGSKGERLNSVDLERLYQNMSVWLWNDTKYRYEEGKEDELGFKTFTEFLNCYANDAYAGGTKCSADLKKSLVDNNMIYGDGSSKAGMMNPSYPLNYMEKPLTRLMLGRSWWDLNIKVDVEKYPGSVSAKGESVTENISLYSNPTKWFAGNMQSTGLWAPAQQDVTIKSSASVPVTVTVALADDLTGREKHEVALNRPPRVTKTYTLEANGEVTFKVPYGGLIYIKGDSKDDVSANFTFTGVVKAPFYKDGEWKNDLDSPAPLGELESASFVYTTPKKNLEASNFTGGVAEFAKDLDTFASSMNDFYGRNDEDGKHRMFTYKNLTGHKHRFTNDVQISIGDAHSGYPVMNSSFSTNSTTLPTTPLNDWLIWHEVGHNAAETPLNVPGATEVANNVLALYMQDRYLGKMNRVADDITVAPEYLDESNGQAWARGGAGDRLLMYAQLKEWAEENFDIKQWYPDGELPKFYSDRKGMKGWNLFQLMHRKARGDDVGNSTFGGKNYCAESNGNAADTLMLCASWVAQADLSEFFKKWNPGASAYQLPGATEMSFQGGVSSSAYSTLASLKLPKPEKGPETINKVTEHKMSAE*
本发明的优选orf3526序列与SEQ ID NO:54所示共有序列匹配，或是其免疫原性片段。本发明的其它优选orf3526序列与SEQ ID NO:55所示共有序列匹配，或是其免疫原性片段。X表示任何氨基酸。其它优选orf3526序列还包含与SEQID NO:8中第1304-1308位对应的位置处的序列基序，选自：XEVGH、XXVGH、XEVGX、HXVGX和XXVGX，其中在任何这类序列基序中，X不是H或E；或者X不是H、E或D；或者X不是H、E、D、N、Q或C；或者X是非极性氨基酸，或者X选自A或G，或者X优选是A。在其它实施方式中，SEQ ID NO:54或SEQ IDNO:55的残基1-23或1-33缺失。
>共有_序列_75％(SEQ ID NO:54)
MNKKFKYKKSLLAAILSATLLAGCDGGGSGSSSDTPXVDSGXGXLPEVKPDPTPXPEPTPEPTPDPEPTPXPTPDPEPTPEPEPEPVPTKTGYLTLGGSQRVTGATCNGESSDGFTFTPGXXVXCVXGXXTTIATFBTQSEAARSLRAVXKVSFSLEDAQELAXSXBKKXNAXSLVTSXBSCPABXEQXCLXFSSVXXXXRFXXLYKQIDLAXXXFXKLVNEEVENNAATDKAPSTHTSXVVPVTTXGTKPDLNASFVSANAEQFYQYQPTEIILSEGXLVDSXGXGVXGVBYYTXSGRGVTXENGXFSFSWGETISFGIDTFELGSVRGNKSTIALTELGDEVRGANIDQLIHRYSXXGXNBTRVVPDXVRKVFAEYPNVINEIINLSLSNGATLXEGXQXVXLPNEFIEQFXTGQAKEIDTAICAKTXGCNEARWFSLTTRNVNDGQIQGVINKLWGVDXBYXSVXKFHVFHDSTNFYGSTGNARGQAVVNISNAAFPILMARNDKNYWLAFGEKRAWDKNELAYITEAPSJVZPENVTRDTATFNLPFISLGQVGXGKLMVIGNPHYNSILRCPNGYSWXGGVNXXGZCTLXXDXDDMKXFMZNVLRYLSBDXWXPBXKXXMTVGTNLXXVYFKXHGQVXGNSAXFXFHXDFXGIXVXXLXSYGDLBPZEXPLLILNGFEYVTQXGXDPYAXPLRADTSKPKLTQQDVTDLIAYLNKGGSVLIMENVMSNLKEESASXFVRLLDAAGLSMALNKSVVNNDPQGYPBRVRQXRATGIWVYERYPAXDGXXXPYTIDXXTGEVXWKYQXXNKPDDKPKLEVASWXEXVXGKQXTRYAFIDEAXXXTXXSLXAAKXKIXXXFPGLXECKDXXYHYEXNCLEXRPGTXVPVTGGMYVPXYTQLXLXADTAKAMVQAADLGTNIQRLYQHELYFRTNGXKGERLXSVDLERLYQNMSVWLWNXXXYRYEXXKXDELGFKTFTEFLNCYANDAYXXGTXCSAXLKKSLVDNXMIYGXXSXKAGMMNPSYPLNYMEKPLTRLMLGRSWWDLNIKVDVEKYPGXVSXXGZXVTEXISLYSNPTKWFAGNMQSTGLWAPAQXEVTIXSXAXVPVTVTVALADDLTGREKHEVALNRPPXVTKTYXLXAXGXVXFKVPYGGLIYIKGBSXXBXSAXFTFTGVVKAPFYKDGXWKNXLBSPAPLGELESXXFVYTTPKKNLXASNXTGGXXZFAXDLDTFASSMNDFYGRBXEXGKHRMFTYKXLTGHKHRFTNDVQISIGDAHSGYPVMNSSFSTNSTTLPTTPLNDWLIWHEVGHNAAETPLXVPGATEVANNVLALYMQDRYLGKMNRVADDITVAPEYLXESNGQAWARGGAGDRLLMYAQLKEWAEKNFDIKXWYPXGXLPXFYSXREGMKGWNLFQLMHRKARGDXVGXXXFGXXNYCAESNGNAADTLMLCASWVAQTDLSEFFKKWNPGANAYQLPGAXEMSFEGGVSQSAYXTLAXLXLPKPZXGPETINXVTEHKMSAE
>共有_序列_100％(SEQ ID NO:55)
MNKKFKYKKSLLAAILSATLLAGCDGGGSGXSSDTPXXDSGXGXLPXVKPDPTPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXPXXXPEXXXXPVXTKTGYLXLGGSXRXTGXXXCNXEXSDGFTFXXGXXVXCVXGXXTTIATFBTQSEAARSLRAVXKVSFSLEDAXELAXSXBKKXNAXSLVTXXBSCPABXEQXCLXFSSVXXXXRFXXLYKQIXLXXXXFXKLVNEEVENNAATDKAPSTHTSXXVPXTTXGTXPDLNASFVSANAEQXYQYQPXEIIXSEGXLVXSXGXGVXGVBYYTXXGRGVTXENGXFXFSWGEXJSFGIDTFELGSVRGNKSTIALTELGDEVRGANIDQLIHRXSXXXXNXXRXVPXXVRXVFAXYPNVINEIINLSLSNGXXLXEGXQXXXXXNXFJEQXXXGQXXEIDTAICXXXXGCNXXRWFSLTXRNVNXGXIQXVINKLWGVDXXYXSVXKFHVFHDSTNFYGSTGNARGQAVXNISNXAFPILMARNDKNYWLAFGEKRAWDKNXLAYITEAPSJVXXENVTRXTAXFNLPFISLGQVGXGKLMVIGNPHYNSILRCPNGYSWXGXVBXXGZCTXXXDXBDMKXFMZNVLRYLSBXXWXPBXKXXMTVGTNLXXVYFKXXGQVXGXXAXFXFHXDFXGIXXXXXXSYGBLBPXXXPLLILNGFEYVTQXXXDPYXXPLRADTSKPKLXQQDVTDLIAYXNKGGXVLIMENVMSNLKEESASXFVRLLDAAXLSMALNKSVVNXDPQGYPBRXRQXRXXXIWVYERYPXXXXXXXPYTIBXXTXXVXWKYQXXXKXDXKPKLEVASWXEXVXGXQXXXXAFIDXAXXXTXXXLXAAKXXIXXXFXGLXXCXBXXYHYEXNCLEXRXGXXVPXTXXXXXGMXVPXYTQLXLXADTAKAMXQAADXGTNIQRLYQHELYFRTXGXXGERLXXVDLERLYQNXSVWLWNXXXYXYXXXKXDELGFKTFTEFLNCYXNBAYXXGTXCSXXLKXSLXDNXMIYGXXXXXKAGMMNPXYPLNYMEKPLTRLMLGRSWWDLNIKVDVEXYPGXVXXXGZXVTZXIXLYSXPTKWFAGNMQSTGLXAPAXXXVXIXSXXXVXVTVTVAXADDLTGREKHEVXLNRPPXVTKTYXLXAXXXVXFXVPYGGLIYIKXBSXXXXXSAXFTFXGVVKAPFYKBGXWXXXXXSPAPLGELESXXFVYTXPKXNLXAXXXSNXXXGXXZFAXXLDTFAXSMNDFXGRBXXXGXHXMFTXXXLXGHKHRFXNDVQISIGDAHSGYPVMNSSFSXBSXTLPTXPLNDWLIWHEXGHNAAETPLXVPGATEVANXVLALYMQDRYLGKMNRVADDITVAPEYLXESNXQAWARGGAGDRLLMYAQLKEWAEXNFDIXXWYPXGXXLPXFXSXRXGMKGWNLFQLMHRKAXGDXVXXXXFGXXNYCAESNGNXADXLMLCASWVAQXDLSXFFKKWNPGAXAYQLPGXXEMXFXXGVXXSAYXTLAXXXLXKPXXGPEXXNXVTEXXMXXE
gspK(orf3515)
gspK一般分泌途径蛋白在本文中称为“orf3515”。来自大肠杆菌NMEC的“orf3515”蛋白公开于WO2006/089264(SEQ ID7029和7030)，还称为：来自大肠杆菌NMEC菌株IHE3034的“orf3332”、来自CFT073的“c3702”和来自536的ecp_3039。
根据本发明使用时，orf3515蛋白可采用多种形式。优选的orf3515序列与SEQ ID NO29和30具有80％或更高相同性(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。这包括变体(例如等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。
>orf03515(SEQ ID29)
ATGATCACCTCACCACCAAAACGCGGAATGGCACTGGTCGTGGTGCTGGTATTGCTGGCGGTTATGATGCTGGTGACCATCACGCTTTCCGGGCGGATGCAGCAACAACTTGGGCGAACGCGCAGCCAGCAGGAGTACCAGCAGGCGCTGTGGTACAGCGCCAGTGCAGAAAGCCTGGCGCTGAGCGCGCTCAGTCTGAGCCTGAAAAATGAAAAGCGTGTGCATCTGGCACAACCGTGGGCTTCTGGCCCGCGTTTTTTCCCACTGCCGCAGGGGCAAATTGCCGTCACTCTGCGTGACGCACAGGCCTGCTTTAACCTGAATGCCCTCGCTCAGCCGACGACGGCGTCGCGTCCGCTCGCGGTACAACAACTGATTGCCCTGATCTCGCGCCTCGATGTGCCTGCTTATCGGGCCGAACTGATAGCCGAAAGCCTGTGGGAGTTTATTGACGAAGACCGCAGCGTGCAGACGCGTCTGGGTCGTGAAGACAGCGAGTATCTCGCCCGCTCGGTGCCGTTCTACGCCGCTAATCAACCGCTGGCTGATATCAGCGAGATGCGCGTGGTGCAGGGAATGGACGCCGGGCTTTATCAAAAACTGAAACCGTTGGTCTGTGCGCTGCCGATGGCCCGCCAGCAAATCAACATCAATACATTAGATGTCACGCAAAGTGTGATTCTTGAGGCGCTGTTTGACCCGTGGTTAAGCCCTGTTCAGGCGCGGGCATTATTACAACAACGTCCGGCGAAGGGCTGGGAAGATGTCGATCAGTTTCTTGCTCAGCCGCTACTTGCAGACGTCGATGAGCGTACTAAAAAACAGCTAAAAACCATCCTGAGCGTGGACAGCAATTACTTCTGGCTGCGTTCAGATATCACCGTGAATGAGATTGAACTGACGATGAATTCGTTAATTGTCCGCATGGGCCCACAACACTTTTCTGTTCTCTGGCATCAGACAGGAGAAAGTGAG
>orf03515(SEQ ID30)
MITSPPKRGMALVVVLVLLAVMMLVTITLSGRMQQQLGRTRSQQEYQQALWYSASAESLALSALSLSLKNEKRVHLAQPWASGPRFFPLPQGQIAVTLRDAQACFNLNALAQPTTASRPLAVQQLIALISRLDVPAYRAELIAESLWEFIDEDRSVQTRLGREDSEYLARSVPFYAANQPLADISEMRVVQGMDAGLYQKLKPLVCALPMARQQININTLDVTQSVILEALFDPWLSPVQARALLQQRPAKGWEDVDQFLAQPLLADVDERTKKQLKTILSVDSNYFWLRSDITVNEIELTMNSLIVRMGPQHFSVLWHQTGESE
本发明的特定组合物包含以下组合：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(ii)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
本发明的其它特定组合物还包含(iii)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的upec1232或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
更具体地，本发明组合物的免疫原性组分基本由以下物质组成：(i)具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(ii)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。所述组合物可额外包含非免疫原性组分。
本发明组合物的其它特定免疫原性组分基本由以下物质组成：(i)具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(ii)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(iii)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的upec1232或与其具有至少80％相似性的蛋白质。所述组合物可额外包含非免疫原性组分。
具体地，本发明组合物还可包含至少一种细菌毒素。所述毒素特定衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。
将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂的描述参见WO95/17211，将其用作胃肠外佐剂的描述参见WO98/42375。
特定的脱毒LT突变体包括LT-K63、LT-R72和LTR192G。所述细菌毒素优选是突变或经修饰的细菌毒素。在一个优选的实施方式中，所述细菌毒素是经修饰的大肠杆菌不耐热毒素(LTK63)。
将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂的应用可参见下列参考文献，各文献全文通过具体引用纳入本文：Beignon等,"The LTR72Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enahnces theAbility of Peptide Antigens to Elicit CD4T Cells and Secrete Gamma Interferonafter Coapplication onto Bare Skin(大肠杆菌不耐热肠毒素的LTR72突变体在共应用于裸露皮肤后增强肽抗原引发CD4T细胞和分泌γ干扰素的能力)",Infection and Immunity(2002)70(6):3012-3019；Pizza等,"Mucosal vaccines:nontoxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants(粘膜疫苗：LT和CT的非毒性衍生物作为粘膜佐剂)",Vaccine(2001)19:2534-2541；Pizza等,"LTK63andLTR72,two mucosal adjuvants ready for clinical trials(LTK63和LTR72，两种准备用于临床研究的粘膜佐剂)"Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5):455-461；Scharton-Kersten等,"Transcutaneous Imrnunization with BacterialADP-Ribosylating Exotoxins,Subunits and Unrelated Adjuvants(用细菌ADP-核糖基化外毒素、亚基和不相关佐剂进行经皮免疫)",Infection and Immunity(2000)68(9):5306-5313；Ryan等,"Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act asEffective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine:Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1andTh2Cells(大肠杆菌不耐热毒素突变体作为有效粘膜佐剂用于鼻腔给药无细胞百日咳疫苗：无毒AB复合体和酶活性对Th1和Th2细胞的差异化效果)"Infectionand Immunity(1999)67(12):6270-6280；Partidos等,"Heat-labile enterotoxin ofEscherichia coli and its site-directed mutant LTK63enhance the proliferative andcytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides(大肠杆菌不耐热肠毒素和其定点突变体LTK63增强增殖性和细胞毒性T细胞对鼻内共免疫合成肽的反应)",Immunol.Lett.(1999)67(3):209-216；Peppoloni等,"Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strongadjuvants for intranasal delivery of vaccines(大肠杆菌不耐热肠毒素突变体作为安全和强佐剂用于鼻内递送疫苗)",Vaccines(2003)2(2):285-293；和Pine等,(2002)"Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant ofheat labile enterotoxin from Escherichia coli(LTK63)(用流感疫苗和大肠杆菌不耐热肠毒素脱毒突变体(LTK63)进行鼻内免疫)"J.Control Release(2002)85(1-3):263-270。氨基酸取代的数字基准优选基于ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对，如Domenighini等,Mol.Microbiol(1995)15(6):1165-1167所示，其全文通过具体引用纳入本文。
因此，本发明上下文中的词语“毒素”意在指经脱毒成对人而言不再有毒的毒素，或在人中基本没有毒性的毒素亚基或其片段。
其它脱毒毒素包括来自大肠杆菌不耐热毒素(LT)的B亚基，炭疽致死因子(LF)的氨基末端结构域，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)外毒素A、来自百日咳杆菌(B.Pertussis)的腺苷酸环化酶A，来自AB5家族毒素如霍乱毒素(CT)、百日咳博德特氏菌(Bordatella Pertussis)毒素(PT)的衍生物或突变体，以及近期鉴定的枯草杆菌酶细胞毒素。(Paton等,J Exp Med2004,第200卷35-46页)。
大肠杆菌不耐热毒素(LT)由2个亚基组成，即五聚B亚基和单体A亚基。A亚基负责毒性，而B亚基负责转运到细胞内。LT结合G M1神经节苷脂受体。
同源性等于或大于90％的大肠杆菌不耐热毒素衍生物在氨基酸水平具有大于90％的同源性。在另一个实施方式中，所述蛋白具有等于或大于90％的同源性，例如96、97、98或99％。例如，可产生不影响功能的氨基酸缺失。在另一个实施方式中，衍生物仍能结合G M1神经节苷脂受体。
因此，本发明的特定组合物包含选自下组的至少2种、至少3种、至少4或5种大肠杆菌抗原的组合：orf405B、upec1232、orf3526、orf3515和LTK63。本发明的特定组合物包含选自下组的不超过2种、不超过3种、不超过4种或不超过5种抗原：orf405B、upec1232、orf3526、orf3515和LTK63。更特定地，本发明组合物由选自下组的2、3、4或5种抗原的组合组成或基本由其组成：orf405B、upec1232、orf3526、orf3515和LTK63。特定组合包含以下大肠杆菌抗原/免疫原性组分：
Orf405B+orf3526
Orf405B+upec1232+orf3526
Orf405B+upec1232+orf3526+orf3515
Orf405B+orf3526+LTK63
Orf405B+upec1232+orf3526+LTK63
Orf405B+upec1232+orf3526+orf3515+LTK63
抗原orf3526包含涵盖以SEQ ID8为参照的第1304-1308位(SEQ ID8中带下划线的HEVGH)的氨基酸的锌结合基序。由于此锌结合基序可能与毒性相关联，锌结合活性缺乏或减少的orf3526多肽特别有用于本发明的组合。优选地，相对于野生型orf3526或与之相比，突变orf3526蛋白的锌结合活性减少或降低到至少50％、至少45％、至少40％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、至少15％、至少10％或至少5％。锌结合性能通过本领域技术人员已知的原子吸收和其它试验来测定。因此，锌结合基序的突变对减少锌结合和相关毒性而言是有用的。例如，锌结合基序中从野生型HEVGH到AEVGH的突变能使锌结合性降低到约43％，或更特定地，从野生型到AAVGA的突变能使锌结合性降低到约5％。令人意外地，含AAVGA序列的orf3526突变体具有额外优势，即其与天然orf3526共洗脱且仅以2种同种型(单体和截短形式)存在，意味着纯化效率相较其它测试的突变体而言有所简化并显著提高。本发明组合物可包括含有选自XEVGH、XXVGH、XEVGX、HXVGX或XXVGX的序列基序的orf3526突变体，其中在任何这类序列基序中，X不是H或E；或者X不是H、E或D；或者X不是H、E、D、N、Q或C；或者X是非极性氨基酸，或者X选自A或G，或者X优选是A。
本发明的疫苗组合宜与B族链球菌(Streptococcus)疫苗联用以预防大部分新生儿脑膜炎病例。因此，在某些实施方式中，本发明的组合可包含：(i)一种或多种其它非大肠杆菌多肽，所述多肽引发针对B族链球菌(GBS)蛋白的抗体反应；(ii)来自B族链球菌的荚膜糖；和/或(iii)一种或多种其它免疫原，所述免疫原引发识别非GBS生物体上表位的抗体反应。在其它实施方式中，本发明的免疫原性组合在与GBS疫苗几乎相同的时间分开给予。
特定GBS多肽包括：“GBS80”(SAG0645)，细胞壁表面锚定家族蛋白(参见GI:22533660)；“GBS1523”(SAN1518；SpbI)，细胞壁表面锚定家族蛋白(参见GI:77408651)；“GBS104”(SAG0649)(参见GI:22533664)；“GBS67”(SAG1408)，细胞壁表面锚定家族蛋白(参见GI:22534437)；“GBS59”，毒力岛2a(BP_2a)编码的菌毛主干蛋白；“GBS3”(SAG2603；BibA)，病原性蛋白(参见GI:22535109)；“SAN1485”，细胞壁表面锚定家族蛋白(参见GI:77408233)；“GBS147”(SAG0416)，推定蛋白酶(参见GI:GI:22533435)；“GBS328”(SAG1333)，5’-核苷酸酶家族蛋白(参见GI:22534359)。
免疫原性组合物和药物
上述多肽可用作本发明免疫原性组合物中的活性成分(免疫原)，而这些组合物可用作疫苗。
免疫原性组合物将是药学上可接受的。其通常包含抗原以外的组分，例如其通常包括一种或多种药物运载体、赋形剂和/或佐剂。关于疫苗佐剂的详细讨论参见参考文献6和7。
组合物一般以水性形式给予哺乳动物。然而，给药前，所述组合物可以是非水性形式。例如，尽管一些疫苗被制备成水性形式，随后还以水性形式填装、分销和给药，但其它疫苗在生产期间被冻干并在使用时重建成水性形式。因此，本发明组合物可被干燥，如冻干制剂。
所述组合物可包括防腐剂如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为改善热稳定性，组合物可包含温度保护剂。
为了控制张力，优选包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以l-20mg/ml存在，例如约10±2mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg,更优选在290-310mOsm/kg范围内。
组合物可包括一种或多种缓冲剂。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体是有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂一般是5-20mM。
组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。
所述组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。
所述组合物可含有一次免疫用的物质，或者可含有多次免疫用的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以供取出物质的容器中。
人疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。
在某些实施方式中，所述疫苗组合物包含一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：
·矿物盐，如铝盐和钙盐，包括氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献8的第8和9章]；
·水包油乳剂，如鲨烯-水乳剂，包括MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)[参考文献6的第10章；也参见参考文献9-12，参考文献13的第10章和参考文献14的第12章]、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；
·皂苷制剂[参考文献6的第22章]，如QS21[15]和ISCOM[参考文献6的第23章]；
·病毒体和病毒样颗粒(VLP)[16-22]；
·细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物[23,24]、免疫刺激性寡核苷酸[25-30]，如IC-31TM[31](含26聚体序列5’-(IC)13-3’(SEQ ID NO:56)的脱氧核苷酸和含11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:57)的聚阳离子聚合物肽)和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物[32-41]；
·人免疫调节剂，包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12)[42,43]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；
·生物粘着剂和粘膜粘着剂，如壳聚糖及其衍生物、酯化透明质酸微球[44]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素[45]；
·微粒(即直径为约100nm～约150μm，更优选直径约200nm～约30μm，最优选直径约500nm～约10μm的颗粒)，其由生物可降解的无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成；
·脂质体[参考文献46-48的第13和14章]；
·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[49]；
·PCPP制剂[50和51]；
·胞壁酰肽，包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(去甲-MDP)、和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)；和
·咪唑并喹诺酮化合物，包括咪喹莫特及其同系物(例如“瑞喹莫德3M”)[52和53]。
本发明还可包括一种或多种上文所鉴定佐剂的组合。例如，下列佐剂组合物可用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[54]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[55]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[56]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[57]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribilmmunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)—种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
用作免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献6的第7章。
氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂的应用有效，特别是在儿童中，且抗原通常吸附于这些盐。也优选水包鲨烯乳液，特别在老年人中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。
本发明组合物可引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。
通常认为两种T细胞类型，CD4和CD8细胞，是启动和/或增强细胞介导免疫和体液免疫所必需的。CD8T细胞可表达CD8共受体，通常称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能够识别MHC I型分子上展示的抗原或与之相互作用。
CD4T细胞可表达CD4共受体，通常称为T辅助细胞。CD4T细胞能够识别结合至MHC II型分子的抗原性肽。与MHC II型分子相互作用后，CD4细胞可分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子能激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可进一步分为两个功能不同的亚组：即细胞因子和效应功能不同的TH1表型和TH2表型。
活化的TH1细胞能增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL生成增加)，因而对响应胞内感染而言具有特定价值。活化的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)导致局部炎症反应。TH1免疫应答也可用于通过用IL-12刺激B和T细胞的生长来放大免疫应答。TH1刺激的B细胞可分泌IgG2a。
活化的TH2细胞提高抗体生成，因此对响应胞外感染而言具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可导致产生IgG1、IgE、IgA和用于未来保护的记忆B细胞。
增强的免疫应答可包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。
TH1免疫应答可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-2、IFN-γ和TNF-β)增加，活化巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a生成增加。增强的TH1免疫应答优选包括IgG2a生成增加。
可使用TH1佐剂引发TH1免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH1佐剂通常引起IgG2a生成水平增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如，皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸如含有CpG基序的寡核苷酸是本发明所用的优选TH1佐剂。
TH2免疫应答可包括以下一种或多种：与TH2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成增加。增强的TH2免疫应答优选包括IgG1生成增加。
可使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH2佐剂通常引起IgG1生成水平增加。适用于本发明的TH2佐剂包括例如，含矿物质组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素和其脱毒衍生物。含矿物质组合物如铝盐是本发明使用的优选TH2佐剂。
组合物可包括TH1佐剂和TH2佐剂的组合。这种组合物优选引发增强的TH1和增强的TH2应答，即IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫均有增加。更优选地，相对于用单一佐剂的免疫(即，相对于只用TH1佐剂的免疫或只用TH2佐剂的免疫)，包含TH1和TH2佐剂组合的组合物引起TH1和/或TH2免疫应答增强。
所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答之一或两种。免疫应答优选提供增强的TH1应答和增强的TH2应答之一或两种。
增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答之一或两种。该免疫应答优选提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答之一或两种。优选粘膜免疫应答为TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA生成增加。
感染可影响机体的各个部分，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂供于胃肠外给药。还能制备适合在注射前溶解或悬浮于液体载剂的固体形式(如冻干组合物或喷雾冻干组合物)。可制备所述组合物用于局部给药，例如作为油膏、乳膏或粉剂。所述组合物可配制用于使用“疫苗贴片”或膏药的给药。该组合物可制备用于口服给药，如作为片剂或胶囊、喷雾剂或糖浆剂(任选调味)。可将所述组合物制备成采用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。可将所述组合物制备成栓剂或阴道栓。所述组合物可制备供于鼻部、耳部或眼部给药，例如作为滴剂。组合物可以是药盒形式，其被设计成在临给予患者之前重建合并组合物。这种药盒可包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干的抗原。
组合物在使用前临时制备(例如，提供冻干形式的组分)和以药盒形式提供时，该药盒可包括两个药瓶，或者可包括一个已填充的注射器和一个药瓶，所述注射器内容物用于在注射前再次激活所述药瓶内容物。
WO99/27961公开了包括胃肠外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)和直肠、口服(如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮给药在内的递送方法，WO02/074244和WO02/064162公开了经皮方法，WO03/028760公开了鼻内方法。其它给药途径包括眼、耳、肺或其它粘膜给药。
具体而言，本发明组合物可经全身途径或粘膜途径或透皮途径给药或者其可直接给予特定组织。本文所用的术语“透皮递送”包括皮内(如进入真皮或上皮)和透皮(如“通过皮肤”)，即通过试剂进入或穿过至少皮肤表层来递送。本文所用的术语“全身给药”包括但不限于任何胃肠外给药途径。特定地，胃肠外给药包括但不限于：皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内或胸骨内注射，静脉内、动脉内或肾透析输注技术。所述全身、胃肠外给药一般是肌内注射。本文所用的术语“粘膜给药”包括但不限于口服、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠道和眼部给药。新型直接递送形式还可包括多肽组合在食物中的转基因表达，如马铃薯中的转基因表达。
用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫有效量的抗原以及需要的任何其它组分。“免疫有效量”指以单剂或系列剂量的部分给予个体的量对治疗或预防有效。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配方、治疗医生对医疗情况的评价，和其它相关因素。预期所述量会落在能通过常规试验确定的相对广泛范围内。
药学上可接受的运载体
除了上述组分，本发明组合物通常还包含一种或多种“药学上可接受的运载体”。这些包括本身不诱导对接受该组合物的个体有害的抗体生成的任何载体。合适的运载体通常是较大、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸聚合物和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这类运载体为本领域普通技术人员熟知。组合物还可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。另外，可存在辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于药学上可接受组分的详细讨论参见Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice ofPharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》).第20版,ISBN:0683306472。如本领域已知，本发明组合物可制备成各种形式(如液体、冻干形式)。
治疗和给予本发明免疫原性或疫苗组合物的方法
本发明还提供引发对象(特别是哺乳动物)中免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明组合物的步骤。所述免疫应答优选是保护性的且优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可引起增强的反应。
本发明还提供用作药物的免疫原性组合或组合物，例如用于引起对象(如哺乳动物)中的免疫应答。
本发明还提供本发明多肽或组合物的组合在制备用于引起对象(如哺乳动物)中免疫应答的药物中的应用。
本发明还提供用本发明免疫原性组合物预填充的递送装置。
通过这些应用和方法在对象中引起免疫应答，能保护所述对象(例如哺乳动物)抵御大肠杆菌感染，所述大肠杆菌例如一种以上的大肠杆菌致病型，包括ExPEC和非ExPEC菌株。本发明特别用于提供广泛保护抵御致病性ExPEC大肠杆菌，包括肠致病型如EPEC、EAEC、EIEC、ETEC和DAEC(弥散粘附性大肠杆菌)致病型。因此，可保护所述对象抵御疾病，所述疾病包括但不限于腹膜炎、肾盂肾炎、膀胱炎、心内膜炎、前列腺炎、尿路感染(UTI)、脑膜炎(特别是新生儿脑膜炎)、败血症(或SIRS)、脱水、肺炎、腹泻(婴儿、旅行者、急性、持续性等)、细菌性痢疾、溶血性尿毒综合征(HUS)、心包炎、菌尿症等。
所述对象优选是哺乳动物，特别是人，但以非限制性例子为例，对象也可以是牛、猪、羊、马、猫或狗，因为大肠杆菌疾病在这些物种中也引起问题。在某些实施方式中，所述对象可以是禽类对象，例如鸡、鹅、火鸡等。
疫苗用于预防性用途时，人具体是儿童(如幼儿或婴儿)或青少年；疫苗用于治疗性用途时，人具体是青少年或成年人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。
一种检查治疗性处理功效的方法包括在给予本发明组合物后监控大肠杆菌感染。一种检查预防性处理功效的方法包括在给予所述组合物后监控全身(如监控IgG1和IgG2a生成水平)和/或粘膜(如监控IgA生成水平)免疫应答，所述免疫应答针对本发明组合物中的抗原。通常，在免疫后但在攻击前测定抗原特异性血清抗体反应，而在免疫后和攻击后测定抗原特异性粘膜抗体反应。
另一种评价本发明组合物免疫原性的方法是使蛋白质重组性表达以通过免疫印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者样品之间的阳性反应表明该患者产生对所研究蛋白质的免疫应答。此方法还可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原内的表位。
通过用疫苗组合物攻击大肠杆菌感染的动物模型(如豚鼠或小鼠)，还能测定本发明组合物的功效。ExPEC和致死性败血症的鼠模型描述于参考文献58。棉鼠模型公开于参考文献59。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。在一些实施方式中，本发明组合物与抗生素治疗方案联合给予。在一个实施方式中，在给予本发明组合物前给予抗生素。在另一个实施方式中，给予本发明组合物之后给予抗生素。
多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各剂量，例如采用胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫等。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
本发明疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人患者的年龄可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的特定患者组是老年人(如≥50岁、≥60岁和优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院患者、医护人员、部队和军事人员、旅行者、孕妇、长期病患或免疫缺陷患者。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
本发明疫苗特定用于预期接受外科手术的患者，或其他住院患者。其还用于待鉴定患者。其还用于年轻女性(如11-18岁)和慢性泌尿道感染患者。
可将本发明疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)或联合给予患者，例如与如下疫苗基本上同时给药：麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、b型流感嗜血杆菌(H.influenzae)配对疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、链球菌疫苗如A族链球菌疫苗或B族链球菌疫苗等。
概述
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如参考文献60-61等。
在一些实施方式中，术语“包括”指纳入所示活性剂如所列举多肽，以及纳入其它活性剂和药学上可接受载体、赋形剂、润滑剂、稳定剂等，如制药工业已知。在一些实施中，术语“基本由…组成”指某一组合物，其中仅活性成分是所示活性成分，然而，可纳入的其它化合物用于使制剂稳定、防腐等，但不直接参与所示活性成分的治疗效果。使用连接词“基本由…组成”指待解释的权利要求涵盖权利要求所示指定物质或步骤，和实质上不影响要求权利的发明的基本和新特征的那些。参见In re Herz,537F.2d549,551-52,190USPQ461,463(CCPA1976)(原文的重点)；还参见MPEP§2111.03。因此，术语“基本由…组成”用于本发明权利要求时，不意在解释为等同于“包括”。
与数值x相关的术语“约”表示例如x±10％。
本文使用“GI”编号。GI编号，或者“基因信息识别号”(Genlnfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。
两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同(即等同)氨基酸的百分数，相对于序列中最长的一条。利用本领域已知软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。
上面已描述并具体例证了本发明的某些实施方式，但并不意味着本发明限于这些实施方式。可进行各种修改而不偏离下列权利要求所示的本发明范围和精神。
具体实施方式
实施例1
表达、测序和纯化细菌Ig样结构域(组1)蛋白(orf405B)、gspK(orf3515)、upec-1232和orf3526，其各自已在本文中有更充分的描述。就多种其它大肠杆菌株的直系同源物获得序列。在大部分致病菌株中测定各候选抗原的分布，所述致病菌株特别是NMEC、APEC、UPEC、EHEC、EAEC、EIEC、EPEC、ETEC和AIEC。各抗原的存在如图1A和B所示。
实施例2
从基因组DNA模板中PCR扩增出抗原，克隆到pET-21b载体(诺凡基公司(Novagen))并转入DH5α-T1化学感受态细胞以用于增殖(英杰公司(Invitrogen))。采用BL21(DE3)化学感受态细胞用于表达。所有候选物经克隆并在没有信号序列情况下作为His-标签融合蛋白表达。候选物通过亲和色谱纯化。
实施例3
在败血症动物模型中评价保护。在第1天、第21天和第35天对来自意大利查尔斯河公司(Charles River Italia)的CD1远交雌性小鼠(5周龄)皮下注射含20μg重组蛋白的弗氏(Freund’s)佐剂进行免疫。阳性对照用内含108个热灭活细菌(65℃处理30分钟)的0.15ml弗氏佐剂(西格玛公司(Sigma))中的生理溶液中免疫，而阴性对照用弗氏佐剂中的生理溶液免疫。在第49天用107个新鲜细菌培养物/小鼠(LD80)的剂量通过腹膜内注射(用于菌株IHE3034和CFT073)或静脉内注射(用于菌株536)进行攻击。在攻击后24小时采集存活小鼠的肝素化血液样品以确定菌血症水平，并观察攻击后4天的死亡率。
实施例3A
在败血症动物模型中评价保护。在第0天、第21天和第35天对CD1小鼠皮下注射含20μg重组蛋白的弗氏完全佐剂或明矾进行免疫。阳性对照用内含108个热灭活细菌(65℃处理30分钟)的0.15ml弗氏完全佐剂或明矾中的生理溶液免疫，而阴性对照用弗氏完全佐剂或明矾中的生理溶液免疫。在第49天用107个新鲜细菌培养物/小鼠(LD80)的剂量通过腹膜内注射(用于菌株IHE3034和CFT073)或静脉内注射(用于菌株536)进行攻击。在攻击后24小时采集存活小鼠的肝素化血液样品以确定菌血症水平，并观察攻击后4天的死亡率。
使用弗氏完全佐剂的保护：
使用明矾-同源攻击的保护：
使用明矾-异源攻击的保护：
保护率＝((％死亡对照-％死亡的免疫小鼠)/(％死亡对照))x100
实施例3C
通过主动或被动免疫在败血症动物模型中评价交叉保护。小鼠在攻击前用明矾中的抗原3526-his免疫(主动免疫)或在攻击后给予抗3526-his抗体(被动免疫)。3526-his的序列基于来自NMEC菌株IHE3034的天然3526蛋白序列。小鼠用菌株IHE3034、B616、IN1S或9855/93攻击。％PE(保护效力)计算为：1–(％死亡的接种疫苗小鼠/％死亡对照)x100。
结果显示来自ExPEC-NMEC菌株IHE3034的3526赋予主动免疫小鼠针对至少3种额外ExPEC株(一个NMEC和两个SEPEC)的保护。被动免疫实验证实针对至少1种额外ExPEC株(SEPEC)的交叉保护。
实施例4
在败血症动物模型中根据下列方案评价保护：
·24小时时从尾部收集血液以评价菌血症
·感染后监控4天的死亡率和
实施例5
为了研究抗原orf3526的基因分布、遗传变异性和蛋白质表达以及评估有效疫苗覆盖，我们研究了3种不同的人和动物分离物集合，包括不同致病性(ExPEC、ETEC、EPEC)和粪便菌株。简言之，通过在含5％CO2的湿润大气下于LB(Difco)中37℃过夜培养细菌来制备基因组DNA。用GenElute细菌基因组DNA试剂盒(西格玛公司)根据厂商说明书从1.5mL培养物中制备染色体DNA。通过在260nm测定光密度来计算DNA浓度。约100ng染色体DNA用作扩增抗原orf3526的模板。所用扩增酶是DNA聚合酶(Finnzymes)。所有基因用编码区外部引物扩增。引物设计在保守DNA区域中且所述序列报告于表1。抗原orf3526用引物ECOK1_3385_1和ECOK1_3385_22扩增。PCR条件如下：98℃变性10s、55℃退火20s、72℃延伸3min，共35轮。PCR产物用 操作(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))纯化并在毛细管测序仪ABI3730xl DNA分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))上测序。序列用Sequencher4.8(基因编码公司(Gene Codes))组装并用Vector NTI Suite10比对及分析。
表1.用于扩增和测序orf3526(Orf03343_1-Orf03343_22对应于SEQ ID NO32-53)的引物列表
Elisa试验
上清(SN)中的orf3526抗原检测和相对定量通过抗体-夹心法ELISA进行并通过碱性磷酸酶偶联的抗兔抗体来显示，所述ELISA用兔抗orf3526抗原多克隆抗体靶向orf3526抗原。简言之，微量滴定板(能肯(Nunc),Maxi Sorp)的孔用0.22μm-过滤的细菌上清液在4℃过夜包被。未结合的SN用PBS-吐温(0.05％)(PBS-T)溶液冲洗2次，且非特异性结合位点用PBST-BSA(1％)溶液在37℃封闭1小时。板再用PBS-T洗涤3次，然后向复孔添加连续稀释的抗orf3526多克隆抗体，在37℃持续1小时37分钟。用PBS-T洗涤3次后，添加碱性磷酸酶偶联的抗兔多克隆抗体。随后，微板在37℃孵育1小时并用PBST洗涤3次，然后通过添加酶底物来显示。室温避光孵育30分钟后，添加50ul NaOH溶液(3N)来终止反应。在酶标仪(帝肯(TECAN))中以405nm读板。
总体上，ECOK1_3385基因在超过80％的分析的417菌株中存在并表达，氨基酸序列相同性从未低于86％。总之，本文所示结果表明抗原orf3526在致病性和粪便分离物中良好呈现、保守和表达，指示该靶标可能是针对大肠杆菌的广泛保护疫苗的有用候选(图2(a)、2(b)和2(c))。
系统发育重建
用MEGA v.4(参考文献Tamura K,Dudley J,Nei M,Kumar S(2007)MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version4.0(MEGA4:分子进化遗传分析(MEGA)软件4.0版).Mol Biol Evol24:1596–1599.)计算orf3526抗原的217个氨基酸序列的系统树，采用来自最大组成似然法所计算的蛋白质序列间距离矩阵的邻接(Neighbor Joining)算法(参考文献Tamura K,NeiM,Kumar S(2004)Prospects for inferring very large phylogenies by using theneighbor-joining method(使用邻接法推测极大系统发生的前景).Proc Natl AcadSci U S A101:11030–11035.)(图3)。
实施例6
orf3526在禽类模型中具有保护性
3日龄鸡(Bar-On)用5x106大肠杆菌O2菌株1772腹膜内攻击，所述攻击采用2次注射，各0.2ml，间隔3小时。第一注射后20分钟皮下施用(颈部)0.15ml抗体(抗orf3526)。发现针对抗原orf3526的抗体在败血症鸡模型的被动免疫中起保护作用(图4)。
实施例7
此实验的目的是评价有和没有LTK63的保守抗原orf3526抵御小猪腹泻病的保护能力，所述疾病由肠致病性K88大肠杆菌(ETEC)引起。
进行2个研究：
1.11NAHLW1019v：通过超免疫法生成蛋白orf3526抗血清(I期)，小猪中抗血清口服给药预攻击(II期)
2.11NAHLW1020v：ExPEC抗血清给药，攻击评价orf3526蛋白
第一个实验设计以在CD/CD猪中生成有和没有LTK63的orf3526蛋白的抗血清，然后用最小和最大剂量以及对照预给予免疫原初小猪以评价攻击模型中抗血清型产物的初步功效。
第二个实验是随机、盲试验，设计以评估以抗血清形式给予免疫原初小猪的orf3526蛋白然后口服K88大肠杆菌攻击。
使用下列材料：
-纯化的重组orf3526蛋白
-纯化的重组orf3526蛋白+LTK63
-针对orf3526的单克隆抗体，用于稳定性测试
攻击
K88攻击培养物(批量编号TBD)在室温(约23摄氏度)解冻，收集在一起，用2.0ml无菌蛋白胨缓冲液1:2稀释并重分装于3ml冷冻管并在<-60摄氏度冷冻。冷冻后活菌计数根据SO6.001进行，以确立给予的抗原量。
产仔时，各小猪的产仔日期和时间记录在产仔/攻击形式上。小猪在处理前对耳进行标记，因为记录出生时间和日期时需要小猪标识号。小猪可自由吃奶。在出生6小时(+/–2小时)内，对小猪称重。处理后立即使用符合纳入后移出/退出(Post-inclusion Removal/Withdrawal)标准的小猪用于攻击研究。
稀释并重分装的K88攻击培养物(批量编号TBD)在室温(约3摄氏度)解冻，且以2.0ml经口服给予各小猪。攻击后，将小猪放回母猪处。
通过收集自超免疫猪的血清中蛋白orf3526的抗体效价来评价I期的治疗结果。II期的治疗结果通过哪组有来自攻击前2剂口服抗血清的最高保护来评价；由收集自临床观察和验尸结果的死亡率/发病率信息来测定。
实施例8
肠道定植鼠模型中的Orf3526保护，通过用ETEC株GL53-K88进行胃内感染：
小鼠在感染前48-24小时通过饮用水(富集有6,7％果糖)接受链霉素(5克/升)以消除正常常驻菌群。之后，用109CFU的GL53菌株悬液通过口腔灌洗感染小鼠，总体积为400ul。为减少胃酸对细菌生物的影响，在细菌接种前15分钟胃内给予碳酸氢盐。感染后24小时，对小鼠实施安乐死，收集回肠区段(2cm)并均质化。将抗卡那霉素的GL53连续稀释物接种到富集有抗生素的LB琼脂板上。为确认所回收细菌是接种菌株，用编码LT全毒素的引物通过PCR测试菌落。为测试抗原orf3526的保护效果，用单独抗原(20ug)或与作为粘膜佐剂的LTR72联用(比例1:10)在第1、7、21和35天鼻内免疫小鼠。第49天时，用109CFU的GL53菌株通过口腔灌洗感染小鼠。
如图5所示，用抗原orf3526鼻内免疫在ETEC菌株GL53攻击后减少回肠管道中的定植。因此，orf3526能在UTI鼠模型中提供抵御UPEC菌株536攻击的保护。
实施例9
如上所述制备和给予抗原orf3526，联合单独的FCA、IC31、明矾、MF59或其组合。抗原orf3526在与多种佐剂一起给予时仍有保护性：
实施例10
抗原405B和upec1232的保护效果用UTI小鼠感染模型测定：
用于感染小鼠的细菌在过滤除菌的人体尿液中生长并传代3次。细菌在37℃孵育，以200转/分钟振荡过夜，并以6,500×g离心10分钟。然后，使所得团块悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)，至约1010CFU/ml的浓度。
通过腹腔给药0.08ml的Hypnorm(柠檬酸芬太尼,0.315mg/ml；氟阿尼酮10mg/ml)和地西泮(Stesolid)(安定,5mg/ml)混合物(比例为5:1.5)来麻醉小鼠。
麻醉的小鼠用塑料导尿管经尿道给予细菌悬液(大肠杆菌536)。0.05ml细菌悬液在5秒内注入膀胱以避免膀胱输尿管反流(12,18)。接种后立即移出导管。通过温和挤压腹部将各小鼠的尿液收集到Eppendorf管中，用颈椎脱臼法处死小鼠。无菌取出器官，在尿道附近切下膀胱，通过钝器解剖法取出肾以防止出血。将器官置于含750-μl胶原酶悬液(500U/ml；西格玛(Sigma)C9891)的冷冻管(能肯(Nunc)363452)并-80℃保存。均质化前，使受感染器官在室温孵育1.5小时，然后用接种环和旋涡混合机手动均质化。测量来自接种体的细菌、从尿样品回收的细菌和来自膀胱或肾之一的细菌。结果分别如图6和7所示，证明抗原405B和upec1232防止UTI感染模型中的肾定植。
实施例11
orf3526的突变体/变体
细菌在30ml培养基中培养并在25℃诱导表达orf3526变体(没有前导肽的orf3526(3526)，经gly-ser接头(linker)或gly-ser区移除N末端的orf3526(ΔG3526)，和经脯氨酸富集区移除N末端的orf3526(ΔG3526))，所述细菌具有表达带his标签的orf3526变体的3个构建体之一。收获细菌并通过声波裂解。分离可溶部分并加载到IMAC柱上。所述柱用20mM咪唑缓冲液洗3次。然后，orf3526变体用3次洗涤的500mM咪唑缓冲液洗脱。经gly-ser接头或gly-ser区移除orf3526的N末端可显著增加纯化蛋白的溶解度和产量。所得产量由Bradford法估计如下：0.18mg3526和2.34mgΔG3526。
实施例12
orf3526的突变体/变体
尽管orf3526的功能未知，但orf3526序列分析显示有数个保守基序和一个不完整的GTP结合基序，大部分保守基序是锌结合基序，可能是金属蛋白酶功能的一部分(图8)。天然orf3526是潜在脂蛋白，也分泌到培养物上清液中。序列比对研究显示所述蛋白质与来自霍乱弧菌的AcfD(辅助定居因子)具有同源性。天然orf3526由2型分泌系统(T2SS)组成型表达并分泌。如图10所示制备7个orf3526的突变体/变体。
多种orf3526衍生物的锌含量通过原子吸收光谱测定。图11所示结果提示每个蛋白质分子中存在单一锌离子。实际包含锌结合基序的3526B his的锌含量出乎意外地低，这可由该截短衍生物错折叠来解释，而E1305突变体中的单一氨基酸交换似乎不足以完全消除锌结合(红框)。
制备纯化的三重突变orf3526(DG3526TL)蛋白，其中根据SEQ ID8的H1304、E1305和H1308位处的氨基酸由其它氨基酸取代，具体是H1304A、E1305A和H1308A。令人惊讶的是，锌亲和性在DG3526TL三重突变体中完全丧失，所述突变体包括SEQ ID8中第1304、1305和1308位氨基酸处的锌结合基序突变，从氨基酸序列HEVGH突变为AAVGA。
为了能进行功能和结构鉴定，无标签的可溶重组蛋白DG3526TL(164KDa)通过CaptoQ和丁基琼脂糖色谱纯化。SE-HPLC/MALLS分析显示DG3526TL以2种同种型(图9a的峰A和B)和1种截短形式(图9a的峰AC)存在。所述同种型能在丁基琼脂糖上分离。然而，没有甘油稳定的情况下，随着时间观察到一种形式向另一形式的转变(图9(a)和9(b))。因此，所述三重突变同种型还在纯化方面具有优势。
三重突变体TL3M的氨基酸序列是：
>orf03526三重突变体(SEQ ID31)
MNKKFKYKKSLLAAILSATLLAGCDGGGSGSSSDTPSVDSGSGTLPEVKPDPTPTPEPTPEPTPDPEPTPDPTPDPEPTPEPEPEPVPTKTGYLTLGGSQRVTGATCNGESSDGFTFTPGNTVSCVVGSTTIATFNTQSEAARSLRAVDKVSFSLEDAQELANSENKKTNAISLVTSSDSCPADAEQLCLTFSSVVDRARFEKLYKQIDLATDNFSKLVNEEVENNAATDKAPSTHTSTVVPVTTEGTKPDLNASFVSANAEQFYQYQPTEIILSEGQLVDSLGNGVAGVDYYTNSGRGVTDENGKFSFSWGETISFGIDTFELGSVRGNKSTIALTELGDEVRGANIDQLIHRYSTTGQNNTRVVPDDVRKVFAEYPNVINEIINLSLSNGATLDEGDQNVVLPNEFIEQFKTGQAKEIDTAICAKTDGCNEARWFSLTTRNVNDGQIQGVINKLWGVDTNYQSVSKFHVFHDSTNFYGSTGNARGQAVVNISNSAFPILMARNDKNYWLAFGEKRAWDKNELAYITEAPSIVQPENVTRDTATFNLPFISLGQVGEGKLMVIGNPHYNSILRCPNGYSWGGGVNSKGECTLSGDSDDMKHFMQNVLRYLSNDIWQPNTKSIMTVGTNLENVYFKKAGQVLGNSAPFAFHEDFTGITVKQLTSYGDLNPEEIPLLILNGFEYVTQWSGDPYAVPLRADTSKPKLTQQDVTDLIAYLNKGGSVLIMENVMSNLKEESASSFVRLLDAAGLSMALNKSVVNNDPQGYPDRVRQRRATGIWVYERYPAADGAQPPYTIDPNTGEVTWKYQQDNKPDDKPKLEVASWQEEVEGKQVTRYAFIDEAEYTTEESLEAAKAKIFEKFPGLQECKDSTYHYEINCLERRPGTDVPVTGGMYVPRYTQLNLDADTAKAMVQAADLGTNIQRLYQHELYFRTKGSKGERLNSVDLERLYQNMSVWLWNDTKYRYEEGKEDELGFKTFTEFLNCYANDAYAGGTKCSADLKKSLVDNNMIYGDGSSKAGMMNPSYPLNYMEKPLTRLMLGRSWWDLNIKVDVEKYPGSVSAKGESVTENISLYSNPTKWFAGNMQSTGLWAPAQQDVTIKSSASVPVTVTVALADDLTGREKHEVALNRPPRVTKTYTLEANGEVTFKVPYGGLIYIKGDSKDDVSANFTFTGVVKAPFYKDGEWKNDLDSPAPLGELESASFVYTTPKKNLEASNFTGGVAEFAKDLDTFASSMNDFYGRNDEDGKHRMFTYKNLTGHKHRFTNDVQISIGDAHSGYPVMNSSFSTNSTTLPTTPLNDWLIWAAVGANAAETPLNVPGATEVANNVLALYMQDRYLGKMNRVADDITVAPEYLDESNGQAWARGGAGDRLLMYAQLKEWAEENFDIKQWYPDGELPKFYSDRKGMKGWNLFQLMHRKARGDDVGNSTFGGKNYCAESNGNAADTLMLCASWVAQADLSEFFKKWNPGASAYQLPGATEMSFQGGVSSSAYSTLASLKLPKPEKGPETINKVTEHKMSAE
实施例13
抗原组合
带His标签的抗原与明矾联合并一起给予。计算保护率：
| 抗原 | 保护率 |
| Orf3526(2μg) | 61％ |
| Orf3526(2μg)+405B(10μg)+upec-1232(10μg) | 87.5％ |
实施例14
抗原组合
抗原与明矾联合并一起给予。用IHE3034(NMEC)或9855/93(SEPEC)ExPEC菌株攻击后计算存活率和保护率。
实施例15
3625在肠定植模型中的保护效力
用3526抗原与明矾或MF59在第0、21和35天经肌肉内途径免疫小鼠。第48天用GL53(ETEC)攻击小鼠并评价盲肠中的细菌效价。图14(a)显示与单独佐剂相比，细菌效价在3526+明矾免疫后或3526+MF59免疫后显著降低。小鼠仅在第0和21天免疫的实验确认了所述结果(图14(b))。
实施例16
抗原组合在肠定植模型中的保护效力
用不同组合的抗原405B、1232和3526(有或没有LTK63)(图15)在第1、21和35天免疫小鼠。用GL53(ETEC)攻击小鼠并评价盲肠中的细菌效价。结果显示与单独LTK63相比，405B+3526+LTK63和3526+1232+LTK63显著减少盲肠中GL53的肠定植。
实施例17
3526同种型A、B和C的保护效力
用单独同种型A，单独同种型B，或同种型A、B和C的组合免疫小鼠。用IHE3034攻击小鼠并评价细菌效价。结果显示单独同种型B或其与同种型A和C的组合赋予最高的保护效力。
其他参考文献
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Claims (22)
1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含如下组合：(i)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的细菌Ig样结构域蛋白片段(orf405B)或与其具有至少80％相似性的蛋白质，和(ii)具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的推定脂蛋白(orf3526)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含(iii)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的upec1232或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
3.如权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含(iv)具有SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的gspK(orf3515)或与其具有至少80％相似性的蛋白质。
4.如权利要求1～3中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种细菌毒素。
5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细菌毒素是大肠杆菌毒素。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述细菌毒素是经修饰的大肠杆菌不耐热毒素(LTK63)。
7.如权利要求1～6中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述推定脂蛋白(orf3526)是突变蛋白，其中以SEQ ID8为参照的第1304、1305、1306、1307和/或1308位处的至少一个氨基酸被其它氨基酸取代，且其中该突变orf3526蛋白的锌结合活性相对于野生型orf3526降低至少50％。
8.如权利要求7所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述突变orf3526蛋白包含SEQ ID:31的氨基酸序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或佐剂。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物是疫苗组合物。
11.如权利要求1～10中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物用于医学。
12.如权利要求1～10中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物用于治疗或预防大肠杆菌感染。
13.一种治疗或预防哺乳动物中大肠杆菌感染的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的权利要求1～10中任一项所述的免疫原性组合物。
14.如权利要求13所述的方法或如权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述方法或组合物用于权利要求12所述的应用，其中，所述大肠杆菌感染包括肠外致病性大肠杆菌和肠内致病性大肠杆菌的感染。
15.如权利要求13或14所述的方法或如权利要求12或14所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述方法或组合物用于权利要求12或14所述的应用，其中，将所述免疫原性组合物给予粘膜表面。
16.如权利要求15所述的方法或如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述方法或组合物用于权利要求15所述的应用，其中，所述粘膜表面包括鼻腔上皮。
17.如权利要求15所述的方法或如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述方法或组合物用于权利要求15所述的应用，其中，所述粘膜表面包括口腔粘膜。
18.如权利要求15所述的方法或如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述方法或组合物用于权利要求15所述的应用，其中，所述粘膜表面包括选自下组的胃肠器官腔表面：胃、小肠、大肠和直肠。
19.如权利要求13或14所述的方法或如权利要求12或14所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述方法或组合物用于权利要求12或14所述的应用，其中，所述免疫原性组合物经胃肠外给予。
20.一种多肽，所述多肽包含(i)氨基酸序列SEQ ID:31，或(ii)包含第1304、1305和1308位氨基酸的SEQ ID:31的免疫原性片段。
21.一种结合至抗体的多肽，所述抗体
(i)与3526多肽的同种型B结合，所述3526多肽的同种型B能通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，所述组合物包含在约17分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分，但该抗体
(ii)不与3526多肽的同种型A结合，所述3526多肽的同种型A能通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，所述组合物包含在约16分钟洗脱或在同种型B之前和/或同种型C之前洗脱的重组3526多肽部分，并且该抗体不与3526多肽的同种型C结合，所述3526多肽的同种型C能通过用尺寸排阻色谱(如CaptoQ和/或丁基琼脂糖色谱)纯化从组合物获得，所述组合物包含在约19分钟洗脱或在同种型A之后和/或同种型B之后洗脱的重组3526多肽部分。
22.如权利要求1～12中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述推定脂蛋白(orf3526)是权利要求21所述的多肽。
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