CN103930425A

CN103930425A - 蝶啶酮衍生物及其作为egfr、blk、flt3抑制剂的应用

Info

Publication number: CN103930425A
Application number: CN201380003282.4A
Authority: CN
Inventors: 李洪林; 徐玉芳; 赵振江; 刘晓峰; 周伟; 白芳; 薛梦竹; 张磊; 张友利
Original assignee: Shanghai Xinyuan Environmental Engineering Co ltd
Current assignee: Shanghai Yidian Medical Science And Technology Development Co ltd
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2013-04-02
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2033-04-02
Also published as: CN106008511A; WO2013170671A1; US9670213B2; US20150126508A1; JP6114820B2; CN103930425B; CN106008511B; JP2015516445A; DE112013002484T5; DE112013002484B4

Abstract

提供一种作为EGFR、BLK及FLT3抑制剂的蝶啶酮衍生物及其应用，具体而言，提供一种下式Ⅰ所示的化合物，含有式Ⅰ化合物的药物组合物，及所述化合物在制备治疗EGFR、BLK或FLT3介导的疾病或抑制EGFR、BLK及FLT3用的药物中的用途。

Description

蝶啶酮衍生物及其作为 EGFR、 BLK：、 FLT3抑制剂的应用技术领域

本发明涉及到蝶啶酮类化合物的合成及其在药物化学及药物治疗学领域的应用，具体地说，涉及到不同取代基的蝶啶酮类化合物作为 EGFR、 BLK、 FLT3抑制剂尤其是在制备肿瘤相关疾病的药物中的应用。背景技术

恶性肿瘤为细胞性病变，其特点是细胞正常分裂失去控制，导致无节制分化、增殖，并能侵犯局部组织从而引起转移。恶性肿瘤成已成为严重危害人类生命健康的常见病，据不完全统计，全世界每年有近 2000万的新发病例。因此，抗肿瘤药物的研究与开发是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。

传统的抗肿瘤药物主要是细胞毒性类药物，这类药物具有难以避免的毒副作用、选择性差、容易产生耐药性等缺点。随着生命科学技术的飞速发展，恶性肿瘤细胞内信号转导、细胞周期的调节、血管生成等各种基本生命过程正逐步被阐明。以某些与肿瘤细胞增生相关的信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，开发治疗效果好、毒副作用小的抗肿瘤药物已成为当今抗肿瘤药物研究的一个重要方向。蛋白酪氨酸激酶 (protein tyrosine kinase)是一类催化 ATP上 γ-磷酸转移到蛋白特定氨基酸残基上的蛋白，在细胞内信号转导通路中占有非常重要的地位，并且调节着细胞生长、分化、死亡等一系列生理过程。已有资料表明，超过 50%的原癌基因及其产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞生命周期的紊乱，进而导致肿瘤的发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的转移、化疗抗性等密切相关。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶 (； epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, EGFR) 能够介导多条信号转导通路，将胞外信号传递到胞内，对正常细胞和肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡均发挥重要的调节作用（Cell, 2000， 100, 113-127)。因此选择性的抑制 EGFR介导的信号转导途径，可以达到治疗肿瘤的目的，为靶向治疗肿瘤开辟了一条可行之路。以 EGFR为靶点的药物，如 Gefitinib、 Erlotinib和 Laptinib已经上市，用于非小细胞肺癌及乳腺癌的治疗。然而，临床经验表明：大部分非小细胞肺癌患者在反复使用 Gefitinib或 Erlotinib治疗之后，产生了耐药性。其中 50%病例的耐药性与 EGFR激酶结构域中一个氨基酸的突变（790位苏氨酸残基突变为甲硫氨酸， T790M)有关（The New England Journal of Medicine, 2005, 352, 786-792)。为了克服 T790M突变相关的耐药性，一系列不可逆 ATP 竞争性抑制剂（如 CI-1033, BIBW2992, HKI-272, PF00299804等）已进入临床研究。不可逆抑制剂含有一个迈克尔受体片段，能与 EGFR的 ATP结合位点的一个保守氨基酸残基（Cys797)形成共价键，从而获得了比可逆性抑制剂更强的 EGFR结合亲和力（Journal of Medicinal Chemistry, 2009, 52, 1231-1246)。尽管如此，由于脱靶效应导致的毒性作用、低选择性导致的副作用、无法实现患者体内足够的药物浓度等原因，上述不可逆抑制剂的临床试验结果仍不够理想（Nature, 2009， 462， 1070-1074)。因此，开发新型的不可逆 EGFR 抑制剂具有重大的临床意义和应用前景。

B淋巴细胞酪氨酸激酶（B lymphocyte tyrosine kinase, BLK) 属于非受体型酪氨酸激酶，与 c-Src、 Fyn、 Lck、 c-Yes、 Fgr、 Hck、 Lyn等同归入 Src家族。 BLK主要表达于 B淋巴细胞系中，在除浆细胞期之外的 B淋巴细胞发育全过程中都有 BLK的表达。 BLK 与 B淋巴细胞受体 (BCR) 信号转导下游有关 (Molecular Biology Reports, 2011, 38， 4445-4453 )，并对前 B淋巴细胞受体的相关功能有影响（Journal of Experimental Medicine, 2003, 198, 1863-1873 ), 因此， BLK影响 B淋巴细胞的分化和增值。在鼠 B细胞系、 T细胞系中表达组成性激活的 BLK 将分别导致 B 细胞淋巴瘤、 T 细胞淋巴瘤的发生 (Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998， 95， 7351-7356)。更重要的是，人类皮肤 T细胞淋巴瘤（Cutaneous T-cell lymphomas, CTCL)中存在 BLK的异位表达（Blood, 2009, 113, 5896-5904), 预示着 BLK可作为潜在的抗肿瘤药物靶标。此外， BLK基因多态性与系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE)、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA) 等自身免疫性疾病的发病密切相关 (The New England Journal of Medicine, 2008, 358, 900-909), 诱导 B细胞的凋亡可有效治疗上述疾病 (Nat Reviews Immunology, 2006, 6， 394-403)。

FMS样酪氨酸激酶 3 (FMS-like tyrosine kinase 3， FLT3 )属于 III型受体酪氨酸激酶家族， FLT3 在造血细胞的增殖、分化及凋亡过程中起着重要作用（Oncogene, 1993, 8， 815-822)。 FLT3与 FLT3配体结合之后，激活多个下游信号通路，包括 STAT5、 Ras/MAPK 及 PBK/AKT通路。在大约三分之一的急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AMD 患者中存在 FLT3突变（Blood, 2002, 100, 1532-1542), 包括近膜结构域 14和（或） 15 号外显子的内部串联重复序列（FLT3-ITD) 突变、酪氨酸激酶结构域的激活环中氨基酸的缺失或插入（FLT3-TKD)突变。此外，在急性白血病病例中存在 FLT3高表达现象 (Blood, 2004, 103, 1901), FLT3的过表达、 FLT3-ITD突变及 FLT3-TKD突变均会导致 AML患者预后不良。因此， FLT3成为 AML治疗的重要靶标。到目前为止，尚无 FLT3抑制剂被批准用于临床使用，众多处于临床试验阶段的 FLT3抑制剂的临床效果仍不够理想。

因此，提高小分子激酶抑制剂临床有效率正成为当前抗肿瘤靶向药物研发的热点，最有前景的策略即为，开发同时靶向多个与疾病（肿瘤）发生相关的激酶的多靶点抑制剂。发明内容

本发明人采用计算机辅助药物设计手段建立了 EGFR、 BLK、 FLT3特异性小分子抑制剂的虚拟筛选平台，综合考虑药效团及分子对接方法，对商业化合物数据库（包括 ACD-3D(化学品库)、 ACD-SC、 MDDR-3D (；药物活性数据报道库)和 CNPD) 进行筛选，发现了一批具有潜在 EGFR、 BLK、 FLT3抑制活性的候选物。

对得到的候选化合物进行结构优化，设计并合成了一系列未见文献报道的蝶啶酮类化合物，并进行了结构表征。对此系列化合物进行了分子水平和细胞水平的活性测试，得到一批具有很高 EGFR抑制活性的化合物。其中化合物 032 对 EGFR^WT、 EGFR^L858R, EGFR^T79QM^^858R激酶抑制活性 IC_5Q值分别为 3.67、 2.36、 1.17 nM，对 HCC827 (非小细胞肺癌细胞， EGFR^{dd E746}-^A750), H1975(非小细胞肺癌细胞， EGFRL^858R/T79QM)细胞增殖抑制活性 IC_5Q为 0.004、 0.038 μΜ。

本发明所涉及到的蝶啶酮类化合物可用作 EGFR抑制剂，阻断 EGFR的磷酸化过程，抑制肿瘤细胞的生长、增殖和分化，因而可以开发成为新的抗肿瘤药物。此外，本发明的蝶啶酮类化合物具有很高的抑制 Β淋巴细胞激酶（BLK)、 FMS样酪氨酸激酶 3 ( FLT3 ) 活性，可用于治疗肿瘤、免疫性疾病药物的开发。

本发明所述蝶啶酮类化合物 I所示结构：

A和 B为带各种取代基的苯环或五元或六元杂环;

C选自如下所示的任一基团:

、

其中， X选自 0、 S和 Se; R¹为氢、卤素原子、 d-C₆烷氧基（例如甲氧基、乙氧基等）、任选取代的 d-C₆烷基（例如卤素取代的烷基）、任选取代的芳基（例如卤素取代的芳基）或任选取代的芳烷基（例如芳基甲基）；

R²各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、

基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -Ν1^ 、任选取代的吡啶基；；

R³各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -NRaRb和任选取代的吡啶基；

Ra和 R_b各自独立选自烷基和链烯基；和

m和 n各自为 0、 1、 2、 3或 4。

在一实施例中， R³各自独立选自氢、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₄烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基。

在一实施例中， C为下式基团： N

在一实施例中， R¹选自 H和烷基。

在一实施例中， A B都为任选取代的苯基。

在一实施例中， R²独立选 g H、烷氧基、吗啉基、卤素、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、酰氨基和氨基甲酰基（NH₂C(0)-)，其中， ^和 R_b可选自烷基和链烯基。 ¾ X

在一实施例中， R²独立选自 4-N-甲 TN N基哌嗪基、 N-吗啉基、 N-哌啶基、 N-吡咯基、 N-吡咯烷基、 N，N-二乙基氨基、 N，N-二甲基甲胺基和 4-吡啶基。

在一实施例中， R³独立选自氢、氨基、酰氧N '基、烷氧基、卤素、羟基、烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基、吗啉基、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、口比啶基、酰氨基和氨基甲酰基，其中， Ra和 R_b可选自烷基和链烯基。

在一实施例中， R³独立选自酰氨基、酰氧基和烷氧基。

在一实施例中， R³独立选自以下基团：

oosnn

其中， X为卤素。

在一实施例中， R³独立选自以下基团:

在一实施例中， R³选自以下基团：在一实施例中， m为 1或 2。

在一实施例中， n为 1、 2、 3或 4。

在一实施例中， C所示的基团中，含 R¹的部分的波浪形与 C相连，而另一部分与 NH相连。

本发明的一个优选方案是所述化合物具有通式 Π所示结构：

式中，

Y选自 N、 CH;

Z选自 N、 CR⁶;

R¹为氢、卤素、 d-C₆烷氧基、任选取代的 d-C₆烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基；

R³独立选自氢、氨基、羟基、任选取代的酰氧基、烷氧基、 ^素、任选取代的烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基、吗啉基、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、 -Ν1^ 、任选取代的酰氨基、任选取代的烷氧甲酰基、和氨基甲酰基；

R⁴、 R⁵、 R⁶和 R⁷各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、任选取代的吡啶基；

Ra和 R_b选自烷基和链烯基；和

m为 0— 3的整数。

在式 II的一优选实施例中， R³选自任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₄烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基和任选取代的烷氧甲酰基。

本发明的一个更优选方案是所述化合物具有通式 III所示结构：式中，

R³独立选自氢、氨基、羟基、任选取代的酰氧基、烷氧基、 ^素、任选取代的烷基、

CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基、吗啉基、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、 -Ν1^ 、任选取代的酰氨基、任选取代的烷氧甲酰基、和氨基甲酰基；

R⁵、 R⁶和 R⁷各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -Ν1^ 、任选取代的吡啶基；

Ra和 Rb选自烷基和链烯基；和

m为 0、 1、 2或 3。

在式 III的一个优选实施例中， R¹选自 H和烷基。

在式 III 的一个优选实施例中， R³选自任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₄烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基和任选取代的烷氧甲酰基；在式 III的一个优选实施例中， R⁵和 R⁶独立选 g H、烷氧基、吗啉基、卤素、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、酰氨基和氨基甲酰基（NH₂C(0)-)，其中，和 R_b可选自烷基和链烯基。

在式 III的一个优选实施例中， R⁵选自 H、烷氧基、吗啉基、卤素、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、酰氨基和氨基甲酰基（NH₂C(0)-)，其中，

Ra和 Rb可选自烷基和链烯基。

在式 III的一个优选实施例中， R⁵选自 H、烷氧基、吗啉基、卤素、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、酰氨基和氨基甲酰基（NH₂C(0)-)，其中， Ra和 R_b可选自烷基和链烯基； 11⁶为11。

在式 III 的一个优选实施例中， R⁵选自卤素、 4-N-甲基哌嗪基、 N-吗啉基、 N-哌啶基、 N-吡咯基、 N-吡咯烷基、 N，N-二乙基氨基、 N，N-二甲基甲胺基和 4-吡啶基。在式 III的一个优选实施例中， R⁵和 R⁶为 H， R⁷为酰氨基。

在式 m的一个优选实施例中， R³独立选自酰氨基、酰氧基和烷氧基_;

在式 m的一个优选实施例中， R³独立选自以下基团：

在式 m的一个优选实施例中， R³选自以下基团:

， X为卤素。

在式 m的一个优选实施例中， R³选自以下基团:

0" 在式 III的一个优选实施例中， m为 1。

在式 III的一个优选实施例中， m为 1， R³在苯基的 4位。

本发明还包括本发明化合物在制备治疗由表皮生长因子受体激酶（EGFR)介导的疾病的药物中的用途。

发明还包括本发明化合物在制备治疗由 B淋巴细胞激酶（BLK) 或 FMS样酪氨酸激酶 3 (FLT3 ) 介导的疾病的药物中的用途。

在一实施例中，所述疾病为癌症。

在一实施例中，所述癌症选自弥漫性 B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，滤泡性淋巴瘤， B细胞前淋巴细胞型白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，浆细胞性骨髓瘤，浆细胞瘤，结外边缘区 B细胞淋巴瘤，淋巴结边缘区 B细胞淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，胸腺大 B细胞淋巴瘤，血管内大 B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿痛，成淋巴细胞性淋巴瘤， τ细胞原淋巴细胞性白血病， T细胞粒状淋巴细胞性白血病，侵蚀性 NK-细胞白血病，皮肤 T细胞淋巴瘤，整形大细胞淋巴瘤，周边 T细胞淋巴瘤，成人 T细胞淋巴瘤，急性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性前髓细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，慢性中性粒细胞白血病，急性未分化性白血病，退化发育性大细胞淋巴瘤，幼淋巴细胞性白血病，青少年粒单核细胞白血病，成人 T细胞 ALL, AML合并三谱系脊髓发育不良，混合谱系白血病，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常综合征，骨髓增生障碍，多发性骨髓瘤。

在一实施例中，所述疾病为免疫性疾病。

在一实施例中，所述免疫性疾病选自关节炎，狼疮，炎性肠病，类风湿性关节炎，银屑病性关节炎，骨关节炎，斯蒂尔病，青少年关节炎，糖尿病，重症肌无力症，桥本甲状腺炎，奥德甲状腺炎，格雷夫斯病，类风湿性关节炎综合征，多发性硬化症，传染性神经元炎，急性传播性脑脊髓炎，阿狄森病，再生障碍性贫血，自身免疫性肝炎，视神经炎，银血病，移植物抗宿主病，移植、输血过敏反应，变态反应， I型超敏反应，过敏性结膜炎，过敏性鼻炎，特应性皮炎。

在一实施例中，所述癌症选自非小细胞肺癌，乳腺癌，前列腺癌，神经胶质细胞瘤，卵巢癌，头颈部鳞癌，宫颈癌，食管癌，肝癌，肾癌，胰腺癌，结肠癌，皮肤癌，白血病，淋巴瘤，胃癌，多发性骨髓癌及实体瘤。

本发明还包括本发明化合物在制备抑制表皮生长因子受体激酶（EGFR)的药物中的用途。本发明还包括本发明化合物在制备抑制 B淋巴细胞激酶（BLK) 或 FMS样酪氨酸激酶 3 (FLT3 ) 的药物中的用途。

本发明特别优选式 ΠΙ化合物的上述用途。

本发明也包括含有本发明化合物的药物组合物，该药物组合物还可任选地含有药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。具体实施方式

对于本文中涉及到的一些术语进一步做如下说明：

本文中， "烷基"指碳链长度为 1一 10个碳原子的饱和的支链或直链烷基，优选的烷基包括长 2— 8个碳原子、 1一 6个、 1一 4个碳原子、 3— 8个碳原子、 1一 3个碳原子不等的烷基。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、庚基等。

烷基可以被 1个或多个（例如 2、 3、 4或 5个）取代基取代，例如被卤素或卤代烷基取代。例如，烷基可以是被 1一 4个氟原子取代的烷基，或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷基。

本文中， "烷氧基"指被烷基取代的氧基。优选的烷氧基是长 1一 6个碳原子的烷氧基，更优选为长 1一 4个碳原子的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

本文中， "链烯基"通常表示具有至少一个双键的单价烃基，通常含有 2— 8个碳原子，优选含有 2— 6个碳原子，可以是直链或支链。链烯基的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、己烯基等等。

本文中， "块基"通常表示具有至少一个三键的单价烃基，通常含有 2— 8个碳原子，优选含有 2— 6个碳原子，更通常含有 2— 4个碳原子，可以是直链或支链。链烯基的例子包括乙块基、丙块基、异丙块基、丁块基、异丁块基、己块基等。

本文中， "卤素原子"或 "卤素"指氟、氯、溴和碘。

"芳基"指含有 6到 14个碳原子的单环、双环或三环芳族基团，包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、弗基、四氢化萘基、二氢化茚基等。芳基可任选地被 1一 5个（例如， 1、 2、 3、 4或 5个）选自以下的取代基取代：卤素、 d-4醛基、 d-6烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基（例如三氟甲基）、卤素取代的烷氧基（例如三氟甲氧基）、羧基、 d-4烷氧基、乙氧甲酰基、 Ν^Η₃^Β -4酰基等、杂环基或杂芳基等。

本文中， "芳烷基"指被芳基取代的烷基，例如被苯基取代的 d-C₆烷基。芳烷基的例子包括但不限于芳基甲基、芳基乙基等，例如苄基、苯乙基等。

例如，芳基可以被 1一 3个选自以下的基团取代：卤素， -OH, d-4烷氧基， d-4烷基， -N0₂， -NH₂， -N(CH₃)₂, 羧基，和乙氧甲酰基等。

本文所用的 "5元或 6元杂环"包括但不限于含有 1一 3个选自 0、 S和 N的杂原子的杂环基团，包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯烷基、吡唑基、咪唑基、三唑基、恶唑基、吡喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哌啶基、吗啉基等。

本文所用 "杂芳基"是指含有 5-14个环原子，并且有 6个， 10个或 14个电子在环体系上共用。而且所含环原子是碳原子和从氧、氮、硫中任选的 1-3个杂原子。有用的杂芳基包括哌嗪基、吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、包括但不限制于 2-吡啶基、 3-吡啶基和 4-吡啶基、吡嗪基、嘧啶基等。杂芳基或 5元或 6元杂环可任选地被 1一 5个（例如， 1、 2、 3、 4或 5个）选自以下的取代基取代：卤素、 d-4醛基、 d-6直链或支链烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基（例如三氟甲基）、卤素取代的烷氧基（例如三氟甲氧基）、羧基、 d-4烷氧基、乙氧甲酰基、 N(CH₃)和 d-4酰基。

本文中， "酰氧基"指结构式为 "-0-C(0)-R" 的基团，其中， R可选自烷基、链烯基和块基。所述 R可任选地被取代。

本文中， "酰氨基"指结构式为 "-R' -NH-C(0)-R"的基团，其中， R' 可选自键或烷基， R可选自烷基、链烯基、块基、被 NRaRb取代的烷基、被 NRaRb取代的链烯基和 NRaRb取代的块基、被卤素取代的烷基、被氰基取代的链烯基、、 , 其中，和 R_b可选自烷基和链烯基。

本文中， "任选取代的"指其所修饰的取代基可任选地被 1一 5个（例如， 1、 2、 3、 4或 5个）选自以下的取代基取代：卤素、 d-4醛基、 d-6直链或支链烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基（例如三氟甲基）、卤素取代的烷氧基（例如三氟甲氧基）、羧基、 d-4烷氧基、乙氧甲酰基、 N(CH₃)和 d-4酰基。

本发明包括一种药物组合物，该组合物含有治疗有效量的本发明式 I、 II或 III的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明化合物的药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三（羟基甲基）胺基甲烷（TRIS，胺丁三醇）和 N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。

虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定本发明药物组合物中每种活性成分的最佳剂量。一般情况下，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，对哺乳动物每天口服给药，药量按照约 0.0025到 50毫克 /公斤体重。但最好是每公斤口服给药约 0.01到 10毫克。例如，单位口服剂量可以包括约 0.01到 50毫克，最好是约 0.1到 10毫克的本发明化合物。单位剂量可给予一次或多次，每天为一片或多片，每片含有约 0.1到 50毫克，合宜地约 0.25到 10毫克的本发明化合物或其溶剂化物。

本发明的药物组合物可被配制成适合各种给药途径的制剂形式，包括但不限于被配制成用于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药的形式，用于治疗肿瘤和其他疾病。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。药的剂量将根据病人的年龄，健康与体重，并行治疗的种类，治疗的频率，以及所需治疗效益来决定。

本发明的药物制剂可以给予任何哺乳动物，只要他们能获得本发明化合物的治疗效果。在这些哺乳动物中最为重要的是人类。

本发明的化合物或其药物组合物可用于治疗或预防各种由表皮生长因子受体激酶 (EGFR) 介导的疾病。本文中，由 EGFR介导的疾病为各种癌症。所述癌症包括但不限于非小细胞肺癌，乳腺癌，前列腺癌，神经胶质细胞瘤，卵巢癌，头颈部鳞癌，宫颈癌，食管癌，肝癌，肾癌，胰腺癌，结肠癌，皮肤癌，白血病，淋巴瘤，胃癌，多发性骨髓癌及实体瘤。

本发明的化合物或其药物组合物可用于治疗各种由 B淋巴细胞激酶（BLK)或 FMS 样酪氨酸激酶 3 (FLT3 ) 介导的疾病。本文中，由 BLK、 FLT3介导的疾病为各种癌症、免疫性疾病。所述癌症包括但不限于弥漫性 B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，滤泡性淋巴瘤， B细胞前淋巴细胞型白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，浆细胞性骨髓瘤，浆细胞瘤，结外边缘区 B细胞淋巴瘤，淋巴结边缘区 B 细胞淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，胸腺大 B细胞淋巴瘤，血管内大 B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿痛，成淋巴细胞性淋巴瘤， T细胞原淋巴细胞性白血病， T细胞粒状淋巴细胞性白血病，侵蚀性 NK-细胞白血病，皮肤 T细胞淋巴瘤，整形大细胞淋巴瘤，周边 T细胞淋巴瘤，成人 T细胞淋巴瘤，急性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性前髓细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，慢性中性粒细胞白血病，急性未分化性白血病，退化发育性大细胞淋巴瘤，幼淋巴细胞性白血病，青少年粒单核细胞白血病，成人 T细胞 ALL, AML合并三谱系脊髓发育不良，混合谱系白血病，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常综合征，骨髓增生障碍，多发性骨髓瘤。所述免疫性疾病包括但不限于关节炎，狼疮，炎性肠病，类风湿性关节炎，银屑病性关节炎，骨关节炎，斯蒂尔病，青少年关节炎，糖尿病，重症肌无力症，桥本甲状腺炎，奥德甲状腺炎，格雷夫斯病，类风湿性关节炎综合征，多发性硬化症，传染性神经元炎，急性传播性脑脊髓炎，阿狄森病，再生障碍性贫血，自身免疫性肝炎，视神经炎，银血病，移植物抗宿主病，移植、输血过敏反应，变态反应， I型超敏反应，过敏性结膜炎，过敏性鼻炎，特应性皮炎。

本发明的药物制剂可用已知的方式制造。例如，由传统的混合，制粒，制锭，溶解，或冷冻干燥过程制造。制造口服制剂时，可结合固体辅料和活性化合物，选择性研磨混合物。如果需要或必要时加入适量助剂后，加工颗粒混合物，获得片剂或锭剂芯。

合适的辅料特别是填料，例如糖类如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇;纤维素制剂或钙磷酸盐，例如磷酸三钙或磷酸氢钙;以及粘结剂，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解剂，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，如海藻酸钠. 辅助剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如，硅石，滑石，硬脂酸盐类，如镁硬脂酸钙，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以給锭剂核芯提供可以抵抗胃液的合适包衣。为此，可以应用浓縮糖类溶液。这个溶液可以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和 /或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了制备耐胃液的包衣，可使用适当的纤维素溶液，例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸。可向药片或锭剂核芯的包衣加入染料或色素。例如，用于识别或为了表征活性成分剂量的组合。

因此，本发明还提供一种治疗或预防 EGFR介导的疾病的方法，该方法包括给予需要的对象以本发明的化合物或药物组合物。

本发明还提供一种治疗或预防 BLK或 FLT3介导的疾病的方法，该方法包括给予需要的对象以本发明的化合物或药物组合物。

给药方法包括但不限于本领域周知的各种给药方法，可根据患者的实际情况加以确定。这些方法包括但不限于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药。

本发明也包括本发明化合物在制备治疗 EGFR、 BLK或 FLT3介导的疾病用的药物中的用途。

本发明还包括本发明化合物在制备抑制激酶用的药物中的用途，以及抑制激酶的方法。所述方法包括给予需要的对象抑制有效量或治疗 /预防有效量的以本发明的化合物或药物组合物。

本发明中，对象可以是哺乳动物对象，优选是人。

本发明中，所述激酶包括但不限于 EGFR、 BLK、 FLT3、 HER2、 HER4、 FLT1、 CDK2、 JAK2、 LCK、 LYNA、 cKit、 PIM1、 FGFR3、 FGFR1、 PDGFRa、 PDGFRb、 KDR、 SRC、 ABL、 AUR B、 C-MET、 BRAF、 PKACa、 IKKB、 IGF1R、 GSK3b、 P38a禾口 ERK1。

本发明也包括本发明化合物在制备抑制所述激酶介导的各种疾病的药物中的用途，以治疗或预防上述各种激酶介导的疾病的方法。所述方法包括给予需要的对象治疗 /预防有效量的以本发明的化合物或药物组合物。所述激酶介导的各种疾病包括但不限于前文所述的各种癌症和免疫性疾病。抑制剂合成部分

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

III

试剂和条件：（a) ArNH₂， DIPEA, 1,4-二氧杂环已烷，室温；（b) ArNH₂， DIPEA, 1,4-二氧杂环已烷，室温；（c) Pd/C， H₂， EtOH; (d) R²COCOOEt， HOAc, EtOH, 回流；（e) 三氟乙酸， CH₂C1₂, 0 °C to r.t.; (f) 酰基氯， Et₃N， CH₂C1₂， 0 °C到室温，或酰基氯， 1-甲基 -2-吡咯烷酮， CH₃CN, 0 °C到室温。

上述制备流程中， -R⁴的定义如上文所述。本领域技术人员可根据实际制备需要，采用本领域常规获得的各种起始化合物为原料，制备本发明的化合物。

实施例 1

上述步骤 a-f的具体合成方法如下：

(4-(2-氯 -5-硝基嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成（步骤 a)

称取 2,4-二氯 -5-硝基嘧啶（95 mg， 0.49 mmol)置于 10 mL圆底烧瓶中，加入 3 mL 1，4-二氧六环，室温下搅拌，另取 (4-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯（100 mg， 0.48 mmol)、 N，N-二异丙基乙胺（69 mg， 0.53 mmol) 溶于 2 mL 1,4-二氧六环，并滴加到上述反应液中，滴加完成后，继续在室温下搅拌 0.5小时， TLC跟踪至原料完全转化。旋转蒸发除去溶剂，粗品经硅胶柱层析（石油醚 /乙酸乙酯 =10:1， v/v) 分离，得到 (4-(2-氯 -5-硝基嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯橙色固体 144 mg，产率 82%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.38 (s， 1H), 9.46 (s， 1H), 9.12 (s， 1H), 7.49 (d， J = 8.6 Hz, 2H), 7.39 (d， J = 8.6 Hz, 2H), 1.49 (s, 9H)。

(4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -5- 甲酸叔丁酯的合成（步骤 b)

称取 (4-(2-氯 -5-硝基嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯（50 mg， 0.14 mmol)、对甲氧基苯胺（17 mg， 0.14 mmol)、 N，N-二异丙基乙胺（18 mg， 0.18 mmol) 置于 10 mL圆底烧瓶中，加入 5 mL 1，4-二氧六环，室温下搅拌 4小时， TLC跟踪至原料完全转化。旋转蒸发除去溶剂，粗品经硅胶柱层析（石油醚 /乙酸乙酯 =4:1， v/v) 纯化，得到 (4-(2-(4- 甲氧基苯基氨基) -5-硝基嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯黄色固体 51 mg，产率 82%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.30 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 9.45 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 7.49 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.73 (s， 3H), 1.50 (s， 9H)。

(4-(5-氨基 -2-(4-甲氧基苯基氨甲酸叔丁酯的合成（步骤 c)

称取 (4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -5-硝基嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯 (45 mg， 0.10 mmol) 置于 50 mL圆底烧瓶中，加入 20 mL乙醇、 5 mg钯碳（10%Pd)，通入氢气，室温下搅拌过夜。反应结束后，抽滤，将滤液旋干，粗品经硅胶柱层析（二氯甲浣 /甲醇 =5:1， v/v) 纯化，得到 (4-(5-氨基 -2-(4-甲氧基苯基氨基)嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯淡粉色固体 30 mg，产率 83%。1H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 9.23 (s, 1Η), 8.42 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.62 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.56 (s, 1H)， 7.53 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.70 (s， 3H), 1.48 (s， 9H)。

(4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成（步骤 d)

称取 (4-(5-氨基 -2-(4-甲氧基苯基氨基)嘧啶 -4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯 (30 mg， 0.07 mmol)置于 10 mL圆底烧瓶中，加入 0.29 mL冰醋酸、 5 mL无水乙醇，然后加入乙醛酸乙酯（50%甲苯溶液）（16 mg， 0.08 mmol), 加热至回流搅拌过夜。反应结束后，有固体析出，抽滤，滤饼用乙醇、氨水、去离子水洗涤，干燥。得到 (4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7- 氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)氨基甲酸叔丁酯黄色固体 18 mg，产率 76%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- e): δ 10.08 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.65 (d， J = 8.4 Hz, 2H), 7.30-7.28 (m， 4H)， 6.61 (br， 2H), 3.67 (s, 3H), 1.52 (s, 9H)。

8-(4-氨基苯基) -2-(4-甲氧基 -7(8H)-蝶啶酮（化合物 001) 的合成（步骤 e)

称取 (4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)氨基甲酸叔丁酯 (18 mg， 0.04 mmol)置于 5 mL圆底烧瓶中，加入 2 mL二氯甲烷， 0 °C下搅拌，加入 0.5 mL三氟乙酸。然后继续在 0 °C下搅拌 1小时，室温下搅拌 1小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液中和至溶液偏碱性，用二氯甲烷萃取（3 x50 mL)，有机相用去离子水、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干。得到 8-(4-氨基苯基) -2-(4-甲氧基苯基) -7(8H)-蝶啶酮黄色固体 14 mg，产率 99%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.04 (br, 1H), 8.81 (s， 1H), 8.00 (s， 1H), 7.40 (d， J = 7.6 Hz, 2H), 6.98 (d， J = 8.4 Hz, 2H), 6.73 (d， J = 8.4 Hz, 2H), 6.67 (br, 2H), 5.44(s, 2H), 3.70 (s, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, DMSO- ₆): δ 159.19, 158.53, 157.17, 154.95， 151.76, 149.66， 146.68， 133.17, 129.22, 122.66, 121.04, 120.70, 114.37, 113.87, 55.55. HRMS(ESI) 计算值 C₁₉H₁₇N₆0₂ [M+H]+ 361.1413，实验值 361.1414。

_N_(₄_(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物 002) 的合成（步骤 f)

称取 8-(4-氨基苯基) -2-(4-甲氧基苯基) -7(8H)-蝶啶酮（lOO mg, 0.28 mmol)置于 100 mL圆底烧瓶中，加入 50 mL二氯甲烷、三乙胺（28 mg， 0.28 mmol), 0 °C下搅拌，另取丙烯酰氯（29 mg， 0.31 mmol) 溶于 5 mL二氯甲烷，并滴加到上述反应液中，滴加完成后室温下搅拌过夜。旋转蒸发除去溶剂，粗品经硅胶柱层析（二氯甲浣 /乙酸乙酯 =5:1， v/v) 纯化，得到 N-(4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺黄色固体 34 mg，产率 30%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.42 (s, 1H), 10.07 (br, 1H), 8.84 (s， 1H), 8.04 (s， 1H), 7.87 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.38 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.30 (br, 2H), 6.59 (br, 2H), 6.52 (dd， J = 17.0, 10.0 Hz, 1H)， 6.33 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H)， 5.82 (dd， J = 10.0， 1.8 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, DMSO- ₆): δ 163.90, 159.28, 158.51, 156.68, 155.02, 151.44, 146.65, 139.72, 133.00, 130.18, 129.50, 127.72, 121.02, 120.61, 113.77, 55.40. HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₁₉N₆0₃ [M+H]⁺ 415.1519，实验值 415.1515。

以下化合物均按照上述步骤 a-f的方法合成得到：

_N_₍₄_(2-(4-吗啉基苯基氨基 -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物 003)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.44 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.02 (s, 1H)， 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (d， J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (br, 2H), 6.59 (br, 2H), 6.52 (dd， J = 17.2, 10.2 Hz, 1H)， 6.33 (d， J = 17.2 Hz, 1H)， 5.85 (d， J = 10.2 Hz, 1H)， 3.67 (br, 4H)， 2.92 (br, 4H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₅H₂₄N₇0₃ [M+H]⁺ 470.1941, 实验值 470.1932。

_N_(₄_(2-(4-甲氧基苯基氨基) -6-甲基 -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物

004)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.44 (s， 1H), 9.90 (br, 1H), 8.77 (s， 1H), 7.87 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.29 (br, 2H), 6.59 (br, 2H), 6.52 (dd, J = 17.0, 10.0 Hz, 1H), 6.33 (dd, J = 17.0, 1.9 Hz, 1H), 5.82 (dd, J = 10.0, 1.9 Hz, 1H), 3.61 (s， 3H), 2.42 (s， 3H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₃H₂₁N₆0₃ [M+H]⁺ 429.1675, 实验值 429.1671。

8-(3-氨基苯基) -2-(4-甲氧基 -7(8H)-蝶啶酮（化合物 005)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.06 (br, 1H)， 8.83 (s， 1H)， 8.01 (s， 1H)， 7.41 (d， J = 8.0 Hz, 2H), 7.22 (t， J = 8.0 Hz, 1H)， 6.75 (d， J = 7.6 Hz, 1H)， 6.67 (br, 2H), 6.53 (s， 1H)， 6.48 (d， J = 7.6 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 3.69 (s, 3H). HRMS(ESI) 计算值 C₁₉H₁₇N₆0₂ [M+H]+ 361.1413, 实验值 361.1413。

N-(3-(2-(4-甲氧基苯基氨基) - 烯酰胺（化合物 006)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.42 (s， 1H)， 10.10 (br, 1H)， 8.85 (s， 1H)， 8.05 (s， 1H)_: 7.84 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.78 (s， 1H)， 7.56 (t， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.31 (br, 2H), 7.13 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 6.58 (br, 2H), 6.45 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 16.8, 1.6 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10.4， 1.6 Hz, 1H)， 3.65 (s, 3H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₁₉N₆0₃ [M+H]+ 415.1519, 实验值 415.1516。

N-(3-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙酰胺（化合物 007)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.13 (s, 1H), 10.09 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.04 (s, 1H)， 7.74 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (s， 1H), 7.53 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (br， 2H), 7.07 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 6.59 (br, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.33 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.07 (t， J = 7.6 Hz, 3H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₂₁N₆0₃ [M+H]⁺ 417.1675，实验值 417.1678。

_N_(₄_(2-(4-甲氧基苯基氨基) - 酰胺（化合物 008)

H NMR (400 MHz, OMSO-d₆): δ 10.15 (s， 1H)， 10.08 (br, 1H)， 8.85 (s， 1H)， 8.04 (s， 1H)_: 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35-7.33 (m， 4H)， 6.61 (br, 2H), 3.67 (s， 3H), 2.41 (q， J = 7.6 Hz, 2H), 1.14 (t， J = 7.6 Hz, 3H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₂₁N₆0₃ [M+H]+ 417.1675, 实验值 417.1674。

4- (二甲基氨基) -N-(4-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基) -2-丁烯酰胺 (化合物 009)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.45 (s， 1H)， 10.10 (br, 1H)， 8.85 (s， 1H)， 8.05 (s， 1H)_: 7.87 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.30 (br, 2H), 6.82 (td， J = 15.4， 6.0 Hz, 1H)， 6.60 (br, 2H), 6.40 (d， J = 15.4 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.27 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.33 (s, 6H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₅H₂₆N₇0₃ [M+H]⁺ 472.2097，实验值 472.2095。

4- (二甲基氨基) -N-(3-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基) -2-丁烯酰胺 (化合物 010)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.33 (s， 1H), 10.08 (br, 1H), 8.86 (s， 1H), 8.05 (s， 1H)_: 7.83 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 7.78 (s， 1H), 7.55 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (br, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.74 (td， J = 15.2, 5.6 Hz, 1H), 6.59 (br, 2H) 6.30 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 3.66 (s， 3H), 3.06 (d， J = 5.6 Hz, 2H), 2.17 (s, 6H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₅H₂₄N₇0₃ [M+H]+ 472.2097, 实验值 472.2094。

丙烯酸 4-(2-(4-甲氧基苯基酯（化合物 011)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.15 (s， 1H), 8.87 (s， 1H), 8.06 (s， 1H), 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.31 (br, 2H), 6.69 (br, 2H), 6.60 (dd， J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 6.51 (dd， J = 17.2, 9.9 Hz, 1H), 6.22 (dd， J = 9.9， 1.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₁₈N₅0₄ [M+H]⁺ 416.1359, 实验值 416.1359。

4- (二甲基氨基) -N-(4-(7-氧代 -2- (苯基氨基) -8(7H)-蝶啶基)苯基) -2-丁烯酰胺（化合物

012)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.37 (s, 1H), 10.19 (br, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.08 (s, 1H)_: 7.87 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.03 (br, 1H)， 6.88 (t， J = 7.6 Hz, 1H)， 6.82 (td， J = 15.4， 5.6 Hz, 1H)， 6.37 (d, J = 15.4 Hz, 1H)， 3.14 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.24 (s, 6H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₄H₂₄N₇0₂ [M+H]+ 442.1991, 实验值 442.1989。

4- (二甲基氨基) -N-(3-(7-氧代 -2- (苯基氨基) -8(7H)-蝶啶基)苯基) -2-丁烯酰胺（化合物

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.32 (s， 1H), 10.17 (s， 1H), 8.90 (s， 1H), 8.08 (s， 1H)， 7.81-7.79 (m， 2H), 7.55 (t， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.41 (d， J = 7.2 Hz, 2H), 7.12 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.01 (br, 2H), 6.87 (t， J = 7.2 Hz, 1H)， 6.73 (td， J = 15.2, 5.6 Hz, 1H)， 6.28 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 3.05 (d， J = 5.6 Hz, 2H), 2.16 (s, 6H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₄H₂₄N₇0₂ [M+H]+ 442.1991 实验值 442.1996。

N-(4-(7-氧代 -2- (苯基氨基) -8(7 胺（化合物 014)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.44 (s, 1H), 10.19 (br, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.09 (s, 1H)， 7.88 (d， J = 8.4 Hz, 2H), 7.41-7.38 (m， 4H)， 7.03 (br, 2H), 6.88 (t， J = 7.2 Hz, 1H), 6.53 (dd， J = 16.8， 10.4 Hz, 1H)， 6.35 (dd， J = 16.8， 1.6 Hz, 1H)， 5.84 (dd， J = 10.4， 1.6 Hz, 1H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₁H₁₇N₆0₂ [M+H]⁺ 385.1413，实验值 385.1405。

N-(3-(7-氧代 -2- (苯基氨基) -8(7 胺（化合物 015)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.42 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.09 (s, 1H)， 7.84-7.81 (m， 2H), 7.57 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 (br, 2H), 7.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.02 (br, 2H), 6.87 (t, J = 7.6 Hz, 1H)， 6.45 (dd, J = 16.8， 10.4 Hz, 1H)， 6.26 (dd, J = 16.8， 1.6 Hz, 1H)， 5.77 (dd, J = 10.4, 1.6 Hz, 1H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₁H₁₇N₆0₂ [M+H]+ 385.1413, 实验值 385.1413 ο

N-(4-(2-(4-氯苯基氨基) -7-氧酰胺（化合物 016)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.46 (s， 1H), 10.34 (s， 1H), 8.92 (s， 1H), 8.11 (s， 1H)， 7.88 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.41-7.36 (m， 4H)， 7.06 (br, 2H), 6.53 (dd， J = 16.8, 10.4 Hz, 1H)， 6.36 (dd， J = 16.8, 1.6 Hz, 1H), 5.84 (dd， J = 10.4, 1.6 Hz, 1H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₁H₁₆N₆0₂C1 [M+H]+ 419.1023, 实验值 419.1031。

N-(3-(2-(4-氯苯基氨基) -7-氧酰胺（化合物 017)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.44 (s, 1H), 10.34 (br, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.11 (s, 1H)， 7.84 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 8.0 Hz, 1H)， 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.15 (d J = 7.6 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 16.8， 10.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 16.8， 1.8 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 10.12, 1.8 Hz, 1H). HRMS(ESI) 计算值 C₂₁H₁₆N₆0₂C1 [M+H]+ 419.1023，实验值 419.1027。

_N_₍₃_(2-(4-吗啉基苯基氨基 -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物 018)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.43 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.03 (s, 1H)， 7.92 (br, 1H), 7.72 (s， 1H), 7.56 (t， J = 7.6 Hz, 1H), 7.27 (br, 2H), 7.12 (d， J = 7.2 Hz, 1H)， 6.58 (br, 2H), 6.45 (dd, J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.26 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 3.71 (br, 4H)， 2.94 (br, 4H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₅H₂₄N₇0₃ [M+H]+ 470.1941, 实验值 470.1939。 N-(4-(2-(4-(4-甲基 -1-哌嗪基)苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺 (化合物

019)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.51 (s， 1H), 10.06 (s， 1H), 8.83 (s， 1H), 8.03 (s， 1H)， 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 6.4 Hz, 1H)， 6.56-6.49 (m， 3H), 6.34 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 2.94 (br, 4H)， 2.37 (br, 4H)， 2.20 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₆H₂₇N₈0₂ [M+H]⁺ 483.2257，实验值 483.2259。

N-(3-(2-(4-(4-甲基 -1-哌嗪基)苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺 (化合物

020)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.45 (s， 1H), 10.06 (s， 1H), 8.84 (s， 1H), 8.04 (s， 1H)， 7.93 (br, 1H), 7.73 (s， 1H), 7.56 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.25 (br, 2H), 7.12 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 6.57 (br, 2H), 6.46 (dd， J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.27 (dd， J = 16.8, 1.8 Hz, 1H), 5.78 (dd， J = 10.4, 1.8 Hz, 1H)， 2.98 (br, 4H)， 2.42 (br, 4H)， 2.22 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₆H₂₇N₈0₂ [M+H]⁺ 483.2257, 实验值 483.2259。

N-(3-(7-氧代 -2-(4-(l-哌啶 )丙烯酰胺（化合物 021)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.44 (s, 1H), 10.03 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.02 (s, 1H)， 7.94 (br, 1H), 7.73 (s， 1H), 7.55 (t，J = 8.0 Hz, 1H)， 7.24 (br, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57 (br, 2H), 6.46 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.77 (dd， J = 10.2, 1.8 Hz, 1H)， 2.95 (br, 4H)， 1.57 (br, 4H)， 1.49 (br, 2H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₆H₂₆N₇0₂ [M+H]⁺ 468.2148, 实验值 468.2146。

N-(3-(7-氧代 -2-(4-(l-吡咯基)丙烯酰胺 (化合物 022)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.40 (s， 1H), 9.92 (s， 1H), 8.79 (s， 1H), 7.99 (s， 1H)， 7.90 (br, 1H), 7.74 (br, 1H), 7.54 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.20 (br, 2H), 7.10 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 6.46 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 6.20 (br, 2H), 5.77 (dd， J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.10 (br, 4H)， 1.91 (br, 4H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₅H₂₄N₇0₂ [M+H]+ 454.1991，实验值 454.1995。

N-(3-(2-(4- (二乙基氨基)苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物

023)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.42 (s， 1H), 9.92 (s， 1H), 8.80 (s， 1H), 8.00 (s， 1H)， 7.92 (br, 1H), 7.73 (s， 1H), 7.53 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.19 (br, 2H), 7.09 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 6.46 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.32 (br, 2H), 6.27 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.76 (dd， J = 10.2, 1.8 Hz, 1H)， 3.20 (br, 4H)， 1.00 (t， J = 6.8 Hz, 6H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₅H₂₆N₇0₂ [M+H]⁺ 456.2148, 实验值 456.2143。

N-(3-(2-(4- (乙酰氨基)苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物 024)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.43 (s, 1H), 10.16 (br, 1H), 9.78 (s, 1H), 8.87 (s, 1H)_: 8.06 (s， 1H), 7.82 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (s， 1H), 7.56 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (br, 2H), 7.23 (br, 2H), 7.15 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 6.46 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H)， 6.25 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.76 (dd， J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 1.98 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₃H₂₀N₇O₃ [M+H]+ 442.1628, 实验值 442.1624。

4-(8-(3-丙烯酰胺苯基 )-7- 胺（化合物 025)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.43 (s， 1H), 10.40 (s， 1H), 8.95 (s， 1H), 8.13 (s， 1H)， 7.86 (s， 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (br, 1H), 7.61 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.47 (br, 2H), 7.18 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.44 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.25 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.76 (dd， J = 10.2, 1.8 Hz, 1H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₁₈N₇0₃ [M+H]+ 428.1471, 实验值 428.1476。

N-(3-(2-(4-甲氧基苯基氨基) -6-甲基 -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物

026)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.42 (s, 1H)， 9.93 (br, 1H)， 8.78 (s, 1H)， 7.83 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.56 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (br, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.58 (br, 2H), 6.45 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (d， J = 17.0 Hz, 1H), 5.77 (d， J = 10.2 Hz, 1H)， 3.65 (s, 3H), 2.42 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₃H₂₁N₆0₃ [M+H]+ 429.1675, 实验值

429.1675

_N_(₃_(8_(4-甲氧基苯基) -7-氧代 -7,8-二氢蝶啶 -2-氨基)苯基)丙烯酰胺（化合物 027)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.17 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.07 (s, 1H)， 7.63 (br, 1H)， 7.33 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 7.11 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 6.89 (br, 1H), 6.46 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.25 (dd， J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 5.74 (dd， J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₁₉N₆0₃ [M+H]+ 415.1519, 实验值 415.1519。

2-(3-氨基苯基氨基 )-8-(4-甲 -7(8H)-蝶啶酮（化合物 028)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 9.91 (s， 1H)， 8.85 (s， 1H)， 8.04 (s， 1H)， 7.35 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.68-6.65 (m， 3H), 6.16 (d， J = 7.2 Hz, 1H)， 4.63 (s， 2H), 3.86 (s, 3H)o HRMS(ESI) 计算值 C₁₉H₁₇N₆0₂ [M+H]+ 361.1413，实验值 361.1411。

_N_(4_(₈_(4-甲氧基苯基) -7- 烯酰胺（化合物 029)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.19 (br, 1H), 10.03 (s， 1H), 8.87 (s， 1H), 8.05 (s， 1H)_: 7.36-7.34 (m， 6H)， 7.16 (d， J = 8.4 Hz, 2H), 6.41 (dd， J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.23 (dd， J = 17.0, 1.6 Hz, 1H), 5.72 (dd， J = 10.2, 1.6 Hz, 1H), 3.92 (s, 1H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₂H₁₉N₆0₃ [M+H]+ 415.1519，实验值 415.1524。

2-(4-氨基苯基氨基 )-8-(4-甲氧基苯基) -7(8H)-蝶啶酮（化合物 030)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 9.87 (s， 1H), 8.77 (s， 1H), 7.97 (s， 1H), 7.32 (d， J = 8.8 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.08 (br, 2H), 6.24 (br, 2H), 4.84 (s, 2H), 3.88 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₁₉H₁₇N₆0₂ [M+H]⁺ 361.1413，实验值 361.1417。

N-(4-(2-(2-甲氧基 )-4-(4-甲氧基 -1-哌嗪基)苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物 031)

H NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.43 (s， 1H), 8.80 (s， 1H), 8.42 (s， 1H), 8.03 (s， 1H)， 7.85 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H)， 6.54-6.48 (m， 2H), 6.33 (dd， J = 17.0, 1.6 Hz, 1H), 6.02 (br, 1H), 5.84 (dd， J = 10.2, 1.6 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.02 (br, 4H)， 2.43 (br, 4H)， 2.23 (s, 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₇H₂₉N₈0₃ [M+H]+ 513.2363, 实验值 513.2362。

N-(3-(2-(2-甲氧基 -4-(4-甲基 -1-哌嗪基)苯基氨基) -7-氧代 -8(7H)-蝶啶基)苯基)丙烯酰胺（化合物 032)

Ή NMR (400 MHz, DMSO- ₆): δ 10.41 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.44 (br, 1H), 8.02 (s, 1H)， 7.86 (br, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.52 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.46 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 17.0, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (br, 1H), 5.78 (dd, J = 10.2, 1.8 Hz, 1H), 3.76 (s， 3H), 3.04 (br, 4H)， 2.44 (br, 4H)， 2.23 (s， 3H)。 HRMS(ESI) 计算值 C₂₇H₂₉N₈0₃ [M+H]⁺ 513.2363，实验值 513.2361。实施例 2

生物活性测试部分 1

本发明提供的化合物对 EGFR激酶活性的体外抑制效果实验如下进行：

体外酶活性分析：野生型及各种突变型（T790M，L858R，L861Q，L858R/T790M) EGFR、 Z'-Lyte Kinase Assay Kit均购自于 Invitrogen。为所有的待测试化合物设置了从 5.1 10"¹¹ mol/L到 1.0 10"⁶ mol/L的 10个浓度梯度。

不同激酶的浓度由优化实验决定，相应的浓度为： EGFR (PV3872, Invitrogen) 0.287 μ^, EGFR-T790M (PV4803, Invitrogen) 0.174 μ^μΐ, EGFR-L858R (PV4128, Invitrogen) 0.054 μ^μΐ, EGFR-L858R/T790M (PV4879, Invitrogen) 0.055 g^L。化合物在 DMSO中从 5.1xl(T⁹ M到 lxl(T⁴ M稀释三倍。 4 化合物溶于 96 水，得到 4x的化合物溶液。 40 μΜ ATP溶于 1.33x激酶缓冲液，激酶 /肽混合物包含 2x激酶、 4 μΜ酪氨酸 4肽准备好待用。 10 激酶反应包括 2.5 μL化合物溶液， 5 μL激酶 /肽混合物， 2.5 μL ATP溶液。 5 μL 磷酸化肽溶液代替激酶 /肽混合物用作 100%磷酸化对照。 2.5 μΐ 1.33χ激酶缓冲液代替 ΑΤΡ溶液用作 100%抑制对照， 2.5 L 4%DMSO代替化合物溶液用作 0%抑制对照。板内溶液充分混合后在室温下培养 1.5小时。每孔加入 5 μ DevelopmentSolution后继续在室温下培养 1小时，非磷酸化肽在此时间内被裂解。最后，加入 5 μL Stop Reagent结束反应。孔板用 EnVision Multilabel Reader (Perkin Elmer)进行测量。实验数据使用 GraphPad Prism version 4.0进行计算。每次实验均重复 3次以上。

测试结果如表 1所示。

表 1

EGFR激酶抑制活性（IC_5Q， nM) 化合物编号

T790M WT L858R T790M/L858R

001 >10000 >10000 >10000 >10000

002 665 446 546 606

003 8698 8011 4082 3297

004 >10000 3181 4877 >10000

005 >10000 >10000 87159 >10000

006 19.4 10.6 10.1 8.4

007 >10000 >10000 >10000 >10000

008 >10000 >10000 >10000 >10000 009 10.9 60.7 81.11 39.1

010 2253 8086 6084 2022

Oi l 67 84.8 70.3

012 5980 5342 1920

013 86.6 101 39.5

014 16.1 26.4 113.2

015 14.7 12.4 5.28

016 7580 115.9 1491

017 67 84.8 70.3

018 7.94 5.83 3.02

019 1260 6382 738

020 1.47 1.2 0.824

021 19.7 11.7 5.49

022 23.3 12.6 5.33

023 23.1 16.3 5.57

024 15.8 13.4 5.12

025 12.7 9.64 4.39

026 7.24 5.93 16

027 2000 1710 1200

028 10603 18881 3534

029 >10000 1318 >10000

030 3415 23758 6751

031 429 376 229

032 3.67 2.36 1.17

WZ4002 9.58 2.6 1.02 生物活性测试部分 2

细胞增殖及生长抑制分析： H1975 (非小细胞肺癌细胞， _EGFRL^R/T⁷⁹()_{M )} 、 H_CC827 (非小细胞肺癌细胞， _EGFR ^{dd E746}- ^A75Q) 、 A549 (非小细胞肺癌细胞， EGFR野生型）、 BT474 (乳腺癌细胞， Her2 过表达）、 SK-BR-3 (乳腺癌细胞， Her2 过表达）、 MCF-7 (乳腺癌细胞， Her2 过表达）细胞均从 ATCC获得。细胞增殖活性采用 MTS分析法进行评估。细胞暴露在处理条件下 72小时，各细胞系每次实验所使用的细胞数根据吸光度值（490 nm处的吸光度值为 1.3-2.2)进行调整。为待测试化合物设置了 6个浓度梯度（0.1 nM - 10 μΜ ) ，每个浓度值至少使用 6组平行对照。

H1975、 HCC827、 A549、 BT474、 MCF-7 SK-BR-3细胞在相应的培养基中培养，细胞在复苏后至少传代两次，然后用于实验使用。对数期的细胞受胰蛋白酶作用并在培养基中再悬浮。 H1975 (每孔 1000细胞）、 BT474 (每孔 1500细胞）、 MCF-7 (每孔 1500 细胞）、 HCC827 (每孔 2000细胞）、 SK-BR-3 (每孔 2000细胞）、 A549 (每孔 2000 细胞）播种于 96孔板中，体积 lOO L; 设置 6组平行及 7列。孔板放于 37 °C 5% 二氧化碳的培养箱中过夜。将化合物溶于 DMSO, 配制浓度为每升 10 μΜ，随后将化合物浓度逐步稀释得到的化合物浓度分别为每升 10 μΜ、 1 μΜ、 0.1 μΜ、 0.01 μΜ、 0.001 μΜ、 0.0001 μΜ。 2 μ 化合物溶液加到 998 μ 的培养基中，混合物经充分混合。 100 μ 的混合物加入 96孔板中。 2 μL DMSO代替化合物溶液用作 0%抑制对照。培养 68小时之后，加入 20 L MTT (5 mg/mL) 。 4小时候，抛弃上清液并加入 150 DMSO。摇振 10分钟之后，孔板用 Synergy HT( Bio TeK)(OD490)读取数据。数据使用 GraphPad Prism version 4.0进行计算， IC_5Q值通过使用剂量反应曲线的非线性回归模型调整得到。

测试结果如表 2、表 3所示。

表 2

细胞增殖抑制活性 (IC_5Q， μΜ)

化合物编号

HCC827 H1975

001 >10 >10

002 1.29 2.75

003 3.01 >10

004 3.33 >10

005 >10 >10

006 0.009 0.133

007 >10 >10

008 >10 >10

009 0.91 4.65

010 4.16 >10

011 2.29 5.6

012 4.42 18.9

013 0.914 3.51

014 68.1 77.8

015 0.015 0.437

016 68.7 20.8

017 0.163 0.82

018 0.017 0.216

019 0.676 8.87

020 0.002 0.043

021 0.02 0.238

022 0.073 0.531

023 0.031 0.477

024 0.229 6.08

025 0.604 7.3

026 0.013 1.22

027 0.408 3.05 028 15.9 82.8

029 0.543 0.953

030 4.65 15.3

031 0.466 2.88

032 0.004 0.038

WZ4002 0.014 0.039

Iressa 0.006 13

表 3

生物活性测试部分 3

激酶选择性分析：激酶选择性实验使用 Caliper assay screening platform由上海睿智化学研究有限公司完成，所有激酶及其它材料均购自商业公司。化合物对不同激酶抑制活性的测试使用 staurosporine和 PI103作为对照化合物。

I. 迁移率改变分析

1. 配制用于激酶测试的激酶基质缓冲液和终止缓冲液： 1 ) lx激酶基质缓冲液： 50 mM HEPES H 7.5, 0.0015% Brij-35, 10 mM MgC12, 2 mM DTT. 2) 终止缓冲液： 100 mM HEPES, pH 7.5, 0.015% Brij-35, 0.2% Coating Reagent #3， 50 mM EDTA。

2. 配制化合物溶液： 1 )将化合物用 100% DMSO稀释至测试用最高浓度的 50倍浓度，取 100 上述化合物溶液置于 96孔板的一个孔中。 2) 转移 30 化合物溶液到相邻孔的 60 μ 100% DMSO中，重复上述操作，将化合物依次稀释。 3 )加入 100 μ 100% DMSO到两个空白孔中用于无化合物和无酶对照，将孔板标记为储备液板。 4) 从储备液板取 10 μL溶液加到另一 96孔板中，作为临时板，往每个孔中加入 90 μL的 lx激酶缓冲液，将临时板置于振荡器上使化合物溶液混合均匀。

3. 准备分析板：从 96孔临时板的每孔中取 5 溶液加入到 384孔板中，并重复独立实验。

4. 激酶反应： 1 ) 配制 2.5x酶溶液，加入激酶到 lx激酶基质缓冲液。 2)配制 2.5x 肽溶液：加入 FAM标记的肽、 ATP到 lx激酶基质缓冲液。 3 ) 转移 2.5x酶溶液到分析板中。 4)分析板中包含 5 μL化合物的 10%DMSO溶液。 5 )添加 10 μL 2.5x酶溶液到 384 孔分析板的每个孔中。 6)室温下孵化 10分钟。 7)转移 2.5x肽溶液到分析板中，添加 10 肽溶液到 384孔分析板的每个孔中。8)激酶反应及终止：在 28 °C下孵化特定的时间后，加入 25 μL终止缓冲液以结束反应。

5. Caliper读数：在 Caliper上收集实验数据。

6. 曲线拟合： 1 ) 从 Caliper程序中复制转变数据。 2)将转变值转换为抑制率，百分抑制率 = (最大值-转变值） I (最大值-最小值） * 100， "最大值"代表 DMSO对照，最小值代表低对照。

II. Kinase-Glo分析

1 .配制 lx激酶缓冲液用于 PBKa激酶测试： lx激酶缓冲液： 50 mM HEPES, pH 7.5， 3 mM MgC12, 1 mM EGTA, 100 mM NaCl, 0.03% CHAPS, 2 mM DTT。

2. 准备化合物用于 PBKa激酶测试： 1 ) 连续稀释化合物并准备储备液板。将化合物用 100% DMSO稀释至反应用最高浓度的 100倍浓度，转移 100 ΐ,上述化合物溶液到

96孔板的孔中。转移 30 xL化合物溶液到相邻孔的 60 xL 100% DMSO中，重复上述操作，将化合物依次稀释。加入 100 \xL 100% DMSO到两个空白孔中用于无化合物和无酶对照，将孔板标记为储备液板。 2) 准备临时板。从储备液板转移 4 化合物溶液到另一 96孔板中，加入 96 L lx激酶缓冲液到每孔中，将临时板置于振荡器上振荡 10分钟使化合物混合均匀。 3 ) 准备分析板：从 96孔临时板的每孔中取 2.5 溶液加入到 384孔板中，并重复独立实验。

3. 激酶 PBKa反应： 1 ) 准备 4x激酶溶液。配制 PBKa的 lx激酶缓冲液溶液，浓度为试验中最终浓度的 4倍。添加 2.5 \, lx激酶溶液到分析板的每个孔中（对照孔除外，加入 2.5 激酶缓冲液代替），振荡分析板。 2)准备 2x底物溶液。准备 PIP2底物、 ATP 的 lx激酶反应缓冲液溶液，浓度为试验最终浓度的 2倍，添加 5 μΐ底物溶液到分析板的每个孔中，并振荡以混合均匀。 3 ) 激酶反应，室温下孵化 1小时。 4. 激酶检测。平衡 Kinase-Glo试剂到室温下，添加 10 μL Kinase-Glo试剂到分析板以终止反应。简单混合后离心，于振荡器上缓慢振荡 15分钟后，在冷光读数仪上读取数据。

5. 读取数据，在 Flexstation上采集数据。

6. 曲线拟合：从 Flexstation程序上复制 RLU数据，将 RLU数据转换成百分抑制率。百分抑制率 = (样品 RLU-最小值） I (最大值-最小值） * 100， "最大值"为无酶对照组的 RLU值， "最小值" 为 DMSO对照组的 RLU值。

III. BRAF 分析

1 . 准备 lx激酶缓冲液： 50 mM HEPES, H 7.5, 10 mM MgCl₂， 1 mM EGTA, 0.01% BRIJ-35。

2. 准备化合物用于测试激酶 BRAF: 1 ) 连续稀释化合物并准备储备液板。将化合物用 100% DMSO稀释至反应用最高浓度的 100倍浓度，转移 100 \,上述化合物溶液到 96孔板的孔中。转移 30 ΐ,化合物溶液到相邻孔的 60 ΐ, 100% DMSO中，重复上述操作，将化合物依次稀释。加入 100 ΐ, 100% DMSO到两个空白孔中用于无化合物和无酶对照，将孔板标记为储备液板。 2) 准备临时板。从储备液板转移 4 化合物溶液到另一 96孔板中，加入 96 L lx激酶缓冲液到每孔中，将临时板置于振荡器上振荡 10分钟使化合物混合均匀。 3 ) 准备分析板：从 96孔临时板的每孔中取 2.5 溶液加入到 384孔板中，并重复独立实验。

3. 激酶 BRAF反应： 1 ) 准备 2x激酶溶液。准备 BRAF于 lx激酶缓冲液的溶液，浓度为试验中最终浓度的 2倍。添加 5 激酶溶液到分析板的每个孔中（对照孔除外，加入 5 L l_X激酶缓冲液代替），振荡分析板。 2) 准备 4x底物溶液。准备

Fluorescein-MAP2KK ATP的底物于 lx激酶缓冲液的溶液，浓度为试验中最终浓度的 4 倍，添加 2.5 底物溶液到分析板中以开始反应，振荡分析板。 3 ) 激酶反应，室温下孵化 1小时。

4. 激酶检测：准备 2倍最终浓度的检测溶液于抗体稀释缓冲液的溶液，最终浓度：抗体 2 ηΜ， ΕϋΤΑ 10 μΜ。添加 10 检测溶液到分析板的每个孔中以终止缓冲液，简单混合并离心，至少孵化 30分钟。

5. 读取数据：于 Envision上读取数据， 340 nM激发， 520 nM、 495 nM发射。

6. 曲线拟合：从 Envision程序复制 RFU值，计算 RFU 520 M / 495 M的比率，将比率值转换为百分抑制率。百分抑制率 = (最大值 -样品比率） I (最大值-最小值） * 100，

"最大值"为 DMSO对照比率， "最小值"为无酶对照比率。曲线通过 XLFit excel add-in version 4.3.1拟合。

生物活性测试部分 4

本发明提供的化合物对 BLK、 FLT3激酶活性的体外抑制效果实验如下进行，其中 BLK、 FLT3购自 BPS, 以十字孢碱（staurosporine) 作为对照化合物。

配制 lx激酶基质缓冲液和终止缓冲液。 lx激酶基质缓冲液： 50 mM HEPES, pH 7.5， 0.0015%Brij-35, 10mM 氯化镁， 2 mM DTT; 终止缓冲液： 100 mM HEPES, pH 7.5, 0.0015%Brij-35, 0.2% Coating Reagent #3, 50 mM EDTA。配制化合物溶液。将化合物溶于 100% DMSO, 配制成 50倍最终的最高抑制浓度的溶液，并转移 100 μL上述溶液到 96 孔板中；依次稀释上述化合物溶液到最终所需浓度；在同一 96孔板的两个空白孔中，加入 100 100% DMSO作为无化合物和无激酶对照，此孔板作为原始孔板；准备中间孔板，从原始孔板中转移 10 化合物溶液到另一 96孔板中作为中间孔板，往中间孔板的每个孔中加入 90 的 lx激酶缓冲液，将中间孔板振摇 10分钟。准备分析孔板，从中间孔板每个孔中取出 5 L溶液到 384孔板中，并做重复对照。激酶反应。配制 2.5x激酶溶液， 2.5x肽溶液，转移 2.5x激酶溶液到分析孔板中，分析孔板 5 L化合物的 10% DMSO 溶液，往 384孔分析孔板的每个孔中加入 10 μ 的 2.5x激酶溶液，在室温下孵育 10分钟，转移 2.5x肽溶液到每个孔中，在 28 °C孵育相应的时间后，加入 25 的终止缓冲液以结束反应。采集实验数据于 Caliper。曲线拟合，从 Caliper程序中拷贝实验数据，将实验数据转换成抑制率，抑制百分率 = (Max-Conversion) /(Max-Min)* 100， "Max"代表 DMSO 对照， "Min"代表低对照。

测试结果如下表 5所示。

表 5

激酶抑制活性（IC_5Q， nM)

化合物

BLK FLT3

001 >10000 27

002 3037 128

003 4168 137

004 >10000 206

005 >10000 30

006 69 1591

007 >10000 1486

008 >10000 115

009 5312 152

010 106 4387

011 89 48

012 6321 160

013 171 3778

014 7479 129

015 124 1859

016 >10000 358

017 156 2825

018 41 798 019 796 51

020 <14 322

021 83 878

022 98 1084

023 83 1757

024 148 3548

025 76 1791

026 96 568

027 5656 119

028 7946 34

029 >10000 100

030 >10000 43

031 812 180

032 463 1169

十字孢碱 5.6 0.28

虽然以具体实施例的方式描述了本发明，但应理解，本发明的范围并不限于这些具体实施例，而应有本申请的权利要求书所限定。对本发明做出的任何等价形式的改动，都在本发明的范围之内。

Claims

1. 具有通式 I所示结构的化合物:

式中，

A和 B为带各种取代基的苯环或五元或六元杂环；

C选自如下所示的任一基团：

其中， X选自 0、 S和 Se; R¹为氢、卤素原子、 d-C₆烷氧基、任选取代的 d-C₆ 浣基、任选取代的芳基或任选取代的芳烷基；

R²各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -Ν1^ 、任选取代的吡啶基；

R³各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -Ν1^ 、任选取代的吡啶基；

Ra和 Rb各自独立选自烷基和链烯基；和

m和 n各自为 0、 1、 2、 3或 4。

2. 如权利要求 1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有通式 Π所示结构：

式中，

Y选自 N、 CH;

Z选自 N、 CR⁶;

R³独立选自氢、 ^素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -Ν1^ 、任选取代的吡啶基；

Ra和 R_b各自独立选自烷基和链烯基；和

m和 n各自为 0、 1、 2、 3或 4

3. 如权利要求 1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有通式 III所示结构：式中，

R⁵、 R⁶和 R⁷各自独立选自氢、卤素、 d-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的 d-C₆烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的 N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、 -Ν1^ 、任选取代的吡啶基；

Ra和 R_b各自独立选自烷基和链烯基；和

m和 n各自为 0、 1、 2、 3或 4。

4. 如权利要求 3所述的化合物，其特征在于，

R¹选自 H和 d-C₆烷基；

R³选自氢、氨基、酰氧基和烷氧基、卤素、羟基、烷基、 CN、磺酸基、氨基磺酰基、羧基、吗啉基、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、酰氨基和氨基甲酰基，其中， Ra和 R_b选自烷基和链烯基；

R⁵选自 H、烷氧基、吗啉基、卤素、 N-烷基-哌嗪基、哌啶基、吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、酰氨基和氨基甲酰基，其中， Ra和 R_b可选自烷基和链烯基；

R⁶选自 H; 和

R⁷选自 H或酰氨基。

5. 如权利要求 4所述的化合物，其特征在于，

R⁵选自卤素、 4-N-甲基哌嗪基、 N-吗啉基、 N-哌啶基、 N-吡咯基、 N-吡咯烷基、 Ν,Ν- 二乙基氨基、 N，N-二甲基甲胺基和 4-吡啶基;

R³选自以下基一个：

其中， X为卤素；和

R H。

6. 选自表 1所示的化合物 001-032。

7. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求 1-6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。

8. 权利要求 1一 6中任一项所述的化合物在制备治疗或预防 EGFR、 BLK、 FLT3、 HER2、 HER4、 FLT1、 CDK2、 JAK2、 LCK、 LYNA、 cKit、 PIM1、 FGFR3、 FGFR1、 PDGFRa、

PDGFRb、 KDR、 SRC、 ABL、 AUR B、 C-MET、 BRAF、 PKACa、 IKKB、 IGF1R、 GSK3b、 P38a和 ERK1介导的疾病，或抑制 EGFR、 BLK、 FLT3、 HER2、 HER4、 FLT1、 CDK2、 JAK2、 LCK、 LYNA、 cKit、 PIM1、 FGFR3、 FGFR1、 PDGFRa、 PDGFRb、 KDR、 SRC、 ABL、 AUR B、 C-MET、 BRAF、 PKACa、 IKKB、 IGF1R、 GSK3b、 P38a禾口 ERK1的药物中的用途。

9. 如权利要求 8所述的用途，其特征在于，所述疾病为癌症或免疫性疾病。

10. 如权利要求 9所述的用途，其特征在于，所述癌症选自非小细胞肺癌，乳腺癌，前列腺癌，神经胶质细胞瘤，卵巢癌，头颈部鳞癌，宫颈癌，食管癌，肝癌，肾癌，胰腺癌，结肠癌，皮肤癌，白血病，淋巴瘤，胃癌，实体瘤，弥漫性 B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，滤泡性淋巴瘤， B细胞前淋巴细胞型白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，浆细胞性骨髓瘤，浆细胞瘤，结外边缘区 B细胞淋巴瘤，淋巴结边缘区 B细胞淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，胸腺大 B细胞淋巴瘤，血管内大 B 细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿痛，成淋巴细胞性淋巴瘤， T细胞原淋巴细胞性白血病， T细胞粒状淋巴细胞性白血病，侵蚀性 NK-细胞白血病，皮肤 T细胞淋巴瘤，整形大细胞淋巴瘤，周边 T细胞淋巴瘤，成人 T细胞淋巴瘤，急性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，急性前髓细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，慢性中性粒细胞白血病，急性未分化性白血病，退化发育性大细胞淋巴瘤，幼淋巴细胞性白血病，青少年粒单核细胞白血病，成人 T细胞 ALL, AML合并三谱系脊髓发育不良，混合谱系白血病，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常综合征，骨髓增生障碍，多发性骨髓瘤；

所述免疫性疾病选自关节炎，狼疮，炎性肠病，类风湿性关节炎，银屑病性关节炎，骨关节炎，斯蒂尔病，青少年关节炎，糖尿病，重症肌无力症，桥本甲状腺炎，奥德甲状腺炎，格雷夫斯病，类风湿性关节炎综合征，多发性硬化症，传染性神经元炎，急性传播性脑脊髓炎，阿狄森病，再生障碍性贫血，自身免疫性肝炎，视神经炎，银血病，移植物抗宿主病，移植、输血过敏反应，变态反应， I型超敏反应，过敏性结膜炎，过敏性鼻炎，特应性皮炎。