CN103922991B - 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途，该化合物的化学名称为（S,E）-4-（4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯基）-4-（（3-（2-（二甲氨基）乙基）-1H-吲哚-5-基）氧基）丁-3-烯-2-酮，其俗名为圆锥山蚂蝗碱，其英文俗名为Desmodeleganine，该化合物是从圆锥山蚂蝗（<i>Desmodium</i><i>？elegans</i>）枝叶中经过大孔树脂、MCI、硅胶以及LH-20柱层析的方法获得，单胺氧化酶(MAO)抑制活性实验证明该化合物具有显著抗单胺氧化酶活性，动物体内试验表明该化合物具有抗抑郁、抗帕金森作用。

Description

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及圆锥山蚂蝗枝叶的生物碱的制备技术

背景技术

随着全球经济的快速发展以及人口老龄化问题的不断加重，现代人们的生活压力越来越大，抑郁症和帕金森病的患者越来越多。因此治疗抑郁症和帕金森病药物（单胺氧化酶抑制剂类药物）的研究引起了人们的广泛兴趣。对于寻找这样的药物来说，药用植物是一个非常丰富的资源，其药用成分具有疗效好、副作用小、作用面广等优点。

圆锥山蚂蝗（Desmodium elegans）为豆科山蚂蝗属植物，生于山脚路边、低山坡疏林下、林缘、田边或草丛中。分布于陕西西南部、甘肃、四川、贵州西北部、云南西北部和西藏等地。目前，圆锥山蚂蝗的研究主要集中在其形态，资源方面的研究。到目前为止未见其抗单胺氧化酶活性成分及抗抑郁抗帕金森的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途。

本发明是圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途，圆锥山蚂蝗（Desmodium elegans）枝叶中分离出的化合物，其化学名为其化学名为：（S,E）-4-（4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯基）-4-（（3-（2-（二甲氨基）乙基）-1H-吲哚-5-基）氧基）丁-3-烯-2-酮，其俗名为圆锥山蚂蝗碱，其英文俗名为Desmodeleganine，其结构经波谱解析方法确定，体内外活性实验表明：该化合物在体外具有单胺氧化酶抑制活性，在体内具有抗抑郁及抗帕金森作用。

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物是从圆锥山蚂蝗枝叶中经过大孔树脂、MCI、硅胶柱层析分离所得，化学名为:（S,E）-4-（4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯基）-4-（（3-（2-（二甲氨基）乙基）-1H-吲哚-5-基）氧基）丁-3-烯-2-酮，经波谱解析和化学方法确定其化学结构为：

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取粉碎的山蚂蝗枝叶，加入6倍体积95%的工业乙醇，充分混匀，回流提取2小时，过滤，滤渣重复提取一次，合并收集滤液，浓缩得到乙醇提取浸膏备用；

（2）将乙醇提取浸膏悬浮于2倍量的蒸馏水中，用2 mol/L HCl 调悬浮水溶液至pH= 2～3，静置过夜；抽滤；再用4 mol/L NaOH溶液调pH=10～11，用氯仿等体积萃取，减压浓缩，得生物碱提取物；

（3）将生物碱提取物用HPD-100大孔树脂进行柱层析、以水，30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分；

（4）将大孔树脂柱层析后的50-70%洗脱部分，浓缩，用MCI-gel-CHP-20P树脂柱层析，用水，30%、50%、70%、90%、100%甲醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分，浓缩；浓缩物进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇 50∶1～1∶1梯度洗脱，经过TLC硫酸乙醇显色剂检测显色，合并相同组分，得到该化合物。

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的用途，该化合物作为单胺氧化酶抑制剂，用于制备预防、治疗抑郁症和帕金森病的药物。

该化合物作为制备抑郁症和帕金森病药物组分之一的用途。

本发明提供的化合物（化合物1）的结构鉴定方法为：

1、化合物1的理化性质数据

无色油状，旋光度：+50°：氯仿：甲醇=1：1溶剂系统展开，硫酸乙醇显色为黄色斑点，碘化铋钾溶液显色为红色斑点，Rf值=0.15。IR（溴化钾压片，cm^-1）特征数据：3420 cm^-1说明含有羟基，1631 cm^-1说明含有羰基。

¹H-NMR：7.23(s ), 7.17(d, J=2.2)，6.88(dd, J=2.2, 8.8)，7.31(d, J=8.8)，3.10(t, J=7.4 )，3.25(t, J=7.4)，2.80(s)，1.62(dd, J=2.2, 12.1)，1.28(dd, J=5.4,12.1)，3.83(m)，2.41(dd, J=7.8, 18.0)，1.93(dd, J=10.2, 18.0)，5.40(s)，2.42(s)，0.99(s)，1.05(s)，1.97(s)。

¹³C-NMR：125.74, 110.58，128.24，108.14，149.95，115.28，112.93，135.03，22.30，59.56，43.98，37.72，49.14，64.55，42.30，136.77，135.87，165.79，119.21，200.73，31.37，29.98，30.36，23.30。

2、化合物1分子式的确定

结合¹H-NMR以及¹³C-NMR数据及HRESIMS（实测值 411.2644[M+H]⁺，计算C₂₅H₃₅N₂O₃值为411.2642），确定其分子式为C₂₅H₃₄N₂O₃。

3、化合物1结构式的确定

通过IR数据可以知道化合物中含有羟基以及羰基（νmax = 1631、 3420 cm⁻¹）。在¹H, ¹³C, DEPT和HMQC核磁共振谱图中显示出6个甲基，4个sp³杂化的亚甲基，5个sp²杂化的次甲基，1个氧化的次甲级，8个sp²杂化的季碳（包括羰基碳原子，δ_C 200.7），1个sp³杂化的季碳。¹H 和¹³C-NMR数据显示了该化合物有一个蟾酥碱结构单元（a）和3-羟基-β-紫罗兰酮结构单元（b）。通过对二维核磁共振谱图（HMBC, HMQC, NOESY, ¹H-¹HCOSY）的分析，进一步确认了蟾酥碱结构单元与3-羟基-β-紫罗兰酮结构单元的存在。结构单元a与b有两种可能的连接方式：一种b通过氧原子连接a，另一种则是通过连接N原子连接a,b。HMBC谱图上没有显示明显的相关性，无法断定结构单元a与b如何连接。NOESY谱图中显示出H-13’与 H-4,H-13’与H-6具有相关性，表示结构单元b应该在苯环一侧而不是在吡咯环一侧，即结构单元b通过氧原子与a连接。在¹³C-NMR中C-7’的较大化学位移值（δ_C165.79）也表明结构单元b是通过氧原子与a连接的（如果是通过氮原子相连接，C-7’的化学位移应该是145.00）。化合物的立体化学构型通过NOESY和计算旋光值来确定，在NOESY谱图中可知H-8’与H-4, H-8’与H-6相关，显示出7’-8’位置的双键为E构型。绝对构型是通过比较相似文献得到的，比对文献（T. Miyase, et al. Chem. Pharm. Bull. 1988, 36: 2475-2484），发现当3-羟基-β-紫罗兰酮类似物的3位羟基为α构型时（S型）旋光值一般为正值，而为β构型（R型）时旋光值一般为正值，因此，确定化合物1为S构型

以上结构式为化合物1的结构及其子片段a,b。

具体实施方式

本发明是圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途，圆锥山蚂蝗（Desmodium elegans）枝叶中分离出的化合物，其化学名为：（S,E）-4-（4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯基）-4-（（3-（2-（二甲氨基）乙基）-1H-吲哚-5-基）氧基）丁-3-烯-2-酮，其俗名为圆锥山蚂蝗碱，其英文俗名为Desmodeleganine，其结构经波谱解析方法确定，体内外活性实验表明：该化合物在体外具有单胺氧化酶抑制活性，在体内具有抗抑郁及抗帕金森作用。

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物是从圆锥山蚂蝗枝叶中经过大孔树脂、MCI、硅胶柱层析分离所得，化学名为: （S,E）-4-（4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯基）-4-（（3-（2-（二甲氨基）乙基）-1H-吲哚-5-基）氧基）丁-3-烯-2-酮，经波谱解析和化学方法确定其化学结构为：

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取粉碎的山蚂蝗枝叶，加入6倍体积95%的工业乙醇，充分混匀，回流提取2小时，过滤，滤渣重复提取一次，合并收集滤液，浓缩得到乙醇提取浸膏备用；

（2）将乙醇提取浸膏悬浮于2倍量的蒸馏水中，用2 mol/L HCl 调悬浮水溶液至pH= 2～3，静置过夜；抽滤；再用4 mol/L NaOH溶液调pH=10～11，用氯仿等体积萃取，减压浓缩，得生物碱提取物；

（3）将生物碱提取物用HPD-100大孔树脂进行柱层析、以水，30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分；

（4）将大孔树脂柱层析后的50-70%洗脱部分，浓缩，用MCI-gel-CHP-20P树脂柱层析，用水，30%、50%、70%、90%、100%甲醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分，浓缩；浓缩物进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇 50∶1～1∶1梯度洗脱，经过TLC硫酸乙醇显色剂检测显色，合并相同组分，得到该化合物。

圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的用途，该化合物作为单胺氧化酶抑制剂，用于制备预防、治疗抑郁症和帕金森病的药物。

该化合物作为制备抑郁症和帕金森病药物组分之一的用途。

实施例1：化合物1的制备

本发明提供的化合物制备方法，包括以下步骤：

10kg圆锥山蚂蝗，研成粉末,用6倍的95%工业乙醇在80℃水浴中回流提取2次，每次2小时。提取完毕后，合并乙醇提取液，过滤，滤液在减压条件下蒸至浸膏样。醇提浸膏被悬浮在2倍量蒸馏水中，搅匀后悬浮溶液用2mol/L盐酸溶液调至pH=2-3左右。酸液静置8小时候后，过滤，滤液用4mol/L 氢氧化钠调至pH=10-11，立刻用等体积的氯仿萃取三次，合并有机相，减压条件下蒸干得到生物碱提取物。共计7.5g。将山蚂蝗总生物碱进行HPD-100大孔树脂柱色谱，依次以水，30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度洗脱，弃去水洗脱部分，合并50%～70%洗脱部分。将大孔树脂柱层析后的50-70%洗脱部分，浓缩，用MCI-gel-CHP-20P树脂柱层析，用水，30%、50%、70%、90%、100%甲醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分，浓缩；浓缩物进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇 (50∶1～1∶1)梯度洗脱，经过TLC硫酸乙醇显色剂检测显色，合并相同组分，得到化合物1。

实施例2：化合物1抗单胺氧化酶活性

利用酶标法测定化合物1的抗单胺氧化酶活性，磷酸异丙烟肼为阳性对照药。具体实验过程如下：

（1）单胺氧化酶的制备：

将1只雌性wistar大鼠脱颈椎处死，取出其肝脏，将肝脏剪碎，用磷酸盐缓冲液（pH=7.6）洗涤数次，待洗涤干净后，加入20ml，0.3M蔗糖缓冲液进行匀浆，充分匀浆后，各取10ml倒入两个50ml离心管中。用20ml，0.3M蔗糖缓冲液洗涤匀浆器后，各取10ml倒入前面所述的离心管中。经托盘天平配平后，在-4℃下，1000×g离心10min。吸取上清液，将上清液配平，1200×g离心15min，吸取上清液，将上清液配平，10000×g离心30min，弃去上清液，沉淀加4ml的磷酸缓冲液混匀，得到Wistar大鼠肝脏线粒体浓缩物，即为实验用单胺氧化酶。

（2）样品对单胺氧化酶抑制活性的测定：

运用96孔酶标板测定样品对单胺氧化酶的抑制活性。在96孔酶标板中依次加入40μl单胺氧化酶(Wistar大鼠肝脏线粒体)，40μl样品溶液，40μl磷酸异丙烟肼溶液（阳性药），37℃孵育20min后，加120μl底物(2.5mM的酪胺)及40μl显色液(0.5mM的4-氨基安替吡啉，1mM的香草酸，4U/ml的辣根过氧化酶的混合物)。37℃孵育60min后，用酶标仪在490nm下测定各孔OD值。其中，空白孔（包含：单胺氧化酶40μl，磷酸缓冲液40μl，底物120μl，显色剂40μl），样品孔（包含：单胺氧化酶40μl，样品40μl，底物120μl，显色剂40μl），空白阴性孔和磷酸异丙烟肼对照孔用120μl磷酸缓冲液(pH=7.6)代替120μl底物。每组实验重复三次，并以下面公式计算样品对单胺氧化酶的抑制率。

抑制率%= × 100%

根据量效关系和直线回归法可以计算出样品对单胺氧化酶的半数抑制浓度值(IC₅₀)。结果表明新化合物1对单胺氧化酶具有明显的抑制活性。又测定了其半数抑制浓度值(IC₅₀)，发现该新化合物IC₅₀较小，说明具有强的单胺氧化酶抑制活性。实验数据见表1。

表1山蚂蝗枝叶中新生物碱化合物单胺氧化酶抑制活性

实施例3：化合物1小鼠体内抗抑郁试验

采用小鼠强迫游泳实验评价新化合物1的抗抑郁活性。

将昆明种小鼠单个放入水深为15cm的玻璃圆筒中(高40cm直径18cm)，水温(24±2)℃，水深可稍作调整，以小鼠后足刚可触及筒底又不足以支撑身体为宜。初放入时，小鼠强迫游泳并挣扎向上爬或潜入筒底，2-3min后活动逐渐减弱，出现间歇性不动状态，且时间越来越长，5-6min后不动状态的时间占总时间的80％左右，预试15 min以后将小鼠烘干。实验分组：剔除预试中的不合格者，将合格的10只小鼠随机分成2组，每组5只，空白对照组、氟西汀阳性对照组每天灌胃给予生理盐水，受试药物组灌胃给予相应剂量的药物，各组给药体积均为0.1mL/lOg，1次/d。灌胃3d后，第4d实验前30min，除氟西汀阳性对照组灌胃给予盐酸氟西汀10mg/kg外，其余各组按上述给药不变。灌胃给药后30min，把小鼠放入圆筒中，观察6min，记录后4min内小鼠强迫游泳的不动时间。结果表明，新化合物1能明显缩短强迫游泳致抑郁小鼠4min内的不动时间，即能明显改善抑郁小鼠的行为能力。实验数据见表2。

表2新化合物1对强迫游泳抑郁小鼠行为能力的影响

*：与空白对照组比较P<O.O5

采用小鼠强迫游泳实验评价新化合物1的抗抑郁活性

实施例4：化合物1大鼠体内抗帕金森试验

采用旋转实验(帕金森大鼠模型)评价新化合物1的抗帕金森作用。

SD雄性大鼠模型:以前囱为准，根据包新民等著(大鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,1991:5)大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质两处坐标：①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0mm，硬膜下9.0 mm；②前囟后5.2 mm，正中线右2.5mm，硬膜下8.5mm。在两处坐标处注射6-OHDA(溶于含O.02％抗坏血酸的生理盐水中，浓度为2g/L，每处3L)造模。正常对照组只固定大鼠，不进行任何处理。10d后用APO (0.5mg/kg)经腹腔注射诱发动物向健侧旋转，记录开始旋转至30min内的旋转圈数，以2-6圈/min者为合格的轻度损伤帕金森病模型。将造模成功的SD雄性大鼠14只，随机分为模型组，化合物1组(2 mg/ml)，每组7只。另纳入正常对照组大鼠7只。其中化合物1组每日给予1mL灌胃，模型组、正常对照组给予等量生理盐水灌胃，持续10d。实验结束后，大鼠腹腔注射APO，观察神经行为学变化。结果表明，化合物1能明显缩短6-OHDA致帕金森小鼠30min内的旋转圈数，即能明显改善帕金森大鼠的行为能力。实验数据见表3。

表3新化合物1对6-OHDA致帕金森小鼠行为能力的影响

*：与模型组比较P<O.O5。

Claims (5)

1.圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物，化合物名为：（S,E）-4-（4-羟基-2, 6, 6-三甲基环己-1-烯基）-4-（（3-（2-（二甲氨基）乙基）-1H-吲哚-5-基）氧基）丁-3-烯-2-酮，其通用名为圆锥山蚂蝗碱，其英文通用名为Desmodeleganine，其化学结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取粉碎的山蚂蝗枝叶，加入6倍体积95%的工业乙醇，充分混匀，回流提取2小时，过滤，滤渣重复提取一次，合并收集滤液，浓缩得到乙醇提取浸膏备用；

（2）将乙醇提取浸膏悬浮于2倍量的蒸馏水中，用2 mol/L HCl 调悬浮水溶液至pH = 2～3，静置过夜；抽滤；再用4 mol/L NaOH溶液调pH=10～11，用氯仿等体积萃取，减压浓缩，得生物碱提取物；

（3）将生物碱提取物用HPD-100大孔树脂进行柱层析、以水，30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分；

（4）将大孔树脂柱层析后的50-70%洗脱部分，浓缩，用MCI-gel-CHP-20P树脂柱层析，用水，30%、50%、70%、90%、100%甲醇梯度洗脱，收集50-70%洗脱部分，浓缩；浓缩物进行硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇 50∶1～1∶1梯度洗脱，经过TLC硫酸乙醇显色剂检测显色，合并相同组分，得到该化合物。

3.根据权利要求1所述的圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物在制备单胺氧化酶抑制剂中的用途。

4.根据权利要求3所述的圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的用途，其特征在于单胺氧化酶抑制剂是指用于预防、治疗抑郁症或者帕金森病的药物。

5.根据权利要求4所述的圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的用途，其特征在于圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物与药学上可以接受的载体，或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或其它剂型。