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CN104262316B - 一种黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种黄酮类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN104262316B CN201410468326.7A CN201410468326A CN104262316B CN 104262316 B CN104262316 B CN 104262316B CN 201410468326 A CN201410468326 A CN 201410468326A CN 104262316 B CN104262316 B CN 104262316B
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Abstract

本发明公开了一种黄酮类化合物及其制备方法和应用，所述的黄酮类化合物是从豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodium？oxyphyllum)？的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素A，英文名为oxyphyllumflavone？A，其分子式为C21H16O6，具有下述结构：；所述的黄酮类化合物的制备方法，是以豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤。所述的应用为该黄酮类化合物在制备抗癌药物中的应用。经细胞毒活性实验，山蚂蝗素A对NB4,A549，SHSY5Y,PC3？和MCF7五株细胞均表现出较好的细胞毒活性；本发明中的黄酮类化合物结构简单，活性好，可作为抗癌药物的先导化合物，有较好的应用前景。

Description

一种黄酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取分离技术领域，具体涉及一种黄酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
豆科山蚂蝗属（学名DesmodiumDesv.），约350种，多分布于亚热带和热带地区。我国有27种5变种，大部分布于西南经中南部至东南部，仅1种产陕、甘西南部。研究表明，该属植物富含黄酮类化合物，这类成分结构新颖多样，且具有广泛的药理活性，如抗肿瘤，抗病毒，抗菌等活性。山蚂蝗（Desmodiumoxyphyllum）是一种高30厘米至1.5米的半灌木。在民间广泛用于疏风清热，解毒消肿。主治温病发热、风湿骨痛、咳嗽、咯血和疮毒痈肿。本发明从山蚂蝗（Desmodiumoxyphyllum）中分离得到一个新的黄酮类化合物，该化合物具有显著的抗癌细胞毒活性。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种黄酮类化合物；第二目的在于提供所述黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述黄酮类化合物在制备抗癌药物中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物是从干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素A，英文名为oxyphyllumflavoneA，其分子式为C21H16O6，具有下述结构：
本发明的第二目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于以干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到的，具体为：
A、浸膏提取：将豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：浸膏b用重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇水洗脱，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏c;
D、硅胶柱一次层析：浸膏c用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、硅胶柱二次层析：D步骤洗脱液的9:1部分进一步用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高压液相色谱分离：E步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。
以上述方法制备的黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明所述的黄酮类化合物为黄色胶状物，紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max(logε）：370(3.86),282(3.95),210(4.38)nm；红外光谱（溴化钾压片）νmax：3428,1738,1657,1603,1562,1463,1384,1172,1038,873,768cm-1；高分辨质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z387.0840[M+Na]+（计算值为387.0845），结合13C和1HNMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C21H16O6。从1HNMR（C5D5N，500MHz）和13CNMR（CDCl3，125MHz）中显示21个碳信号和16个氢信号。这些信号中有一个典型的黄酮骨架信号，即δ C160.7s,107.7d,180.1s,143.0s,116.0d,162.0s,101.8d,158.0s,114.2s,121.2s,139.8s,131.3s,105.3d,157.4s,101.2d以及氢谱中的δ H6.63s,1H,6.39s,1H,7.47s,and7.00s。这提示该化合物是一个黄酮类化合物。HMBC谱中观测到H-7′(δ H6.02s)与C-1′(δ C121.2s),C-2′(δ C139.8s),C-3′(δ C131.3s),C-8′(δ C155.3s)以及C-10′(δ C19.7q)的相关,同时，还观测到H-4′(δ H7.47s)与C-9′(δ C162.8s),C-2′(δ C139.8s),和C-3′(δ C131.3s)的相关，提示了丙基和酯基分别连接在C-2′和C-3′上，并且形成一个六元6-methyl-α-pyrone环。其它片段也通过HMBC得到证实。其中，甲基信号δ H2.32s与C-5(δ C143.0s),C-6(δ C116.0d),和C-10(δ C114.2s)相关，提示甲基联接在C-5上；而活泼氢δ H9.20brs与C-4′(δ C105.3d),C-5′(δ C157.4s),和C-6′(δ C101.2d)相关提示羟基连接在C-5′上；最后，甲氧基信号δ H3.90与C-7(δ C162.0s)相关则提示甲氧基连接在C-7。因此，该黄酮类化合物结构得以确定，并命名为山蚂蝗素A，英文名oxyphyllumflavoneB。
表1化合物的1H和13CNMR数据（溶剂为CDCl3）(125and500MHz)
No. 13C 1H
2 160.7 s
3 107.7 d 6.52 s
4 180.1 s
5 143.0 s
6 116.0 d 6.63 s
7 162.0 s
8 101.8 d 6.39 s
9 158.0 s
10 114.2 s
11 22.8 q 2.32 s
1′ 121.2 s
2′ 139.8 s
3′ 131.3 s
4′ 105.3 d 7.47 s
5′ 157.4 s
6′ 101.2 d 7.00 s
7′ 106.0 d 6.02 s
8′ 155.3 s
9′ 162.8 s
10′ 19.7 q 2.00 s
7-OMe 55.7 q 3.90 s
5′-OMe
5′-OH 9.20 brs
本发明的第三目的是这样实现的，即将所述的黄酮类化合物在制备抗癌药物中的应用。
本发明黄酮类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定为黄酮类化合物，并表征了其具体结构。经对白血病急性早幼粒NB4细胞、肺腺癌A549细胞、人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒活性实验，本发明化合物对NB4,A549，SHSY5Y，PC3和MCF7细胞株具有较好的细胞毒活性，IC50值分别达5.2、4.2、6.2、5.8和8.2μM。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗癌药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
附图说明
图1为化合物山蚂蝗素A的核磁共振碳谱（13CNMR）；
图2为化合物山蚂蝗素A的核磁共振氢谱（1HNMR）；
图3化合物山蚂蝗素A的主要HMBC相关图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的黄酮类化合物是从干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素A，英文名为oxyphyllumflavoneA，其分子式为C21H16O6，具有下述结构：：
本发明所述的黄酮类化合物的制备方法，是以干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到的，具体为：
A、浸膏提取：将豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：浸膏b用重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇水洗脱，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏c;
D、硅胶柱一次层析：浸膏c用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、硅胶柱二次层析：D步骤洗脱液的9:1部分进一步用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高压液相色谱分离：E步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。
所述A步骤中的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种。
所述B步骤中的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。
所述C步骤中的甲醇水体积配比为8:2、8.5:1.5和9:1。
所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的甲醇或者丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
所述D步骤中D步骤中氯仿-甲醇溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
所述E步骤中石油醚-丙酮溶液体积配比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
所述F步骤中高压液相色谱分离纯化是以30~60%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样45~60μL，收集20~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。
本发明所述的黄酮类化合物在制备抗癌药物中的应用。
本发明所述的山蚂蝗属植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
实施例1
取干燥豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗的全草1.5kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超声提取4次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成120g浸膏a；在浸膏a中加入240g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成50g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入100g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水1至4升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到30g浸膏c；浸膏c用200目硅胶160g装柱，在浸膏c中加入60g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶60g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，其中，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液得第二部分样品2.5g，再重复硅胶柱层析，用体积比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,5:5的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到7个部分，其中第2部分，即8:2部分约860mg,再以48%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样48μL，收集25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物山蚂蝗素A。
实施例2
取干燥豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗的全草3kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超声提取4次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成240g浸膏a；在浸膏a中加入360g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成100g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入150g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水2至6升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到60g浸膏c；浸膏c用200目硅胶320g装柱，在浸膏c中加入120g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶120g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，其中，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液得第二部分样品5g，再重复硅胶柱层析，用体积比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,5:5的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到7个部分，其中第2部分，即8:2部分约1.6g,再以48%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样48μL，收集25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物山蚂蝗素A。
实施例3
取干燥豆科植物山蚂蝗属尖叶山蚂蝗的全草1.5kg，粗粉碎至40目，用80%的甲醇超声提取4次，每次50min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成150g浸膏a；在浸膏a中加入300g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成60g浸膏b；浸膏b用MCI装柱，在浸膏b中加入100g的80%甲醇水溶解，然后上柱，用90%甲醇水1至4升洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到35g浸膏c；浸膏c用200目硅胶160g装柱，在浸膏c中加入70g的甲醇溶解，然后加入100目硅胶60g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，其中，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液得第二部分样品3.2g，再重复硅胶柱层析，用体积比分别为9:1,8:2,7:3,6:4,5:5的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到7个部分，其中第2部分，即8:2部分约860mg,再以48%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样48μL，收集25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物山蚂蝗素A。
实施例4
取实施例1制备的化合物山蚂蝗素A，为黄色胶状物。
测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
（1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max(logε）：370(3.86),282(3.95),210(4.38)nm；
（2）红外光谱（溴化钾压片）νmax：3428,1738,1657,1603,1562,1463,1384,1172,1038,873,768cm-1；
（3）高分子质谱（HRESIMS）显示本发明化合物准分子离子峰m/z387.0840[M+Na]+（计算值为387.0845），
结合13C和1HNMR谱（见图1、图2，数据归属见表1）给出其分子式为C21H16O6。DEPTNMR谱(图1)和1HNMR谱(图2)中显示21个碳信号和16个氢信号。这些信号中有一个典型的黄酮骨架信号，即δ C160.7s,107.7d,180.1s,143.0s,116.0d,162.0s,101.8d,158.0s,114.2s,121.2s,139.8s,131.3s,105.3d,157.4s,101.2d以及氢谱中的δ H6.63s,1H,6.39s,1H,7.47s,and7.00s。这提示该化合物是一个黄酮类化合物。HMBC谱中观测到H-7′(δ H6.02s)与C-1′(δ C121.2s),C-2′(δ C139.8s),C-3′(δ C131.3s),C-8′(δ C155.3s)以及C-10′(δ C19.7q)的相关,同时，还观测到H-4′(δ H7.47s)与C-9′(δ C162.8s),C-2′(δ C139.8s),和C-3′(δ C131.3s)的相关，提示了丙基和酯基分别连接在C-2′和C-3′上，并且形成一个六元6-methyl-α-pyrone环。其它片段也通过HMBC得到证实。其中，甲基信号δ H2.32s与C-5(δ C143.0s),C-6(δ C116.0d),和C-10(δ C114.2s)相关，提示甲基联接在C-5上；而活泼氢δ H9.20brs与C-4′(δ C105.3d),C-5′(δ C157.4s),和C-6′(δ C101.2d)相关提示羟基连接在C-5′上；最后，甲氧基信号δ H3.90与C-7(δ C162.0s)相关则提示甲氧基连接在C-7。因此，该黄酮类化合物结构得以确定，并命名为山蚂蝗素A。
实施例5
取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物，测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的黄酮类化合物山蚂蝗素A。
实施例6
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物，测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述的黄酮类化合物山蚂蝗素A。
实施例7
取实施例1~3所制备的任一黄酮类化合物进行细胞毒活性检测试验，试验情况如下：
细胞株:白血病细胞(NB4)、肺癌细胞(A549)、人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)、前列腺癌细胞(PC3)、乳腺癌细胞(MCF7)均由中国科学院上海药物研究所提供。
实验设计:以上细胞与不同浓度化合物温育72小时,每株细胞的实验均重复一次,用两次实验的结果进行数据处理,采用改良MTT法及SRB法评价化合物对细胞增殖的抑制程度,计算抑制率,根据抑制率采用Logit方法计算IC50,比较化合物的体外抗肿瘤活性。
细胞的增殖抑制率=(空白对照OD值-加药孔的OD值)/空白对照OD值×100%。
(a)改良MTT法
取处于对数生长期的悬浮细胞,将细胞浓度调整为4×104/ml,加入96孔培养板,90μL/孔。阳性对照为顺铂,用生理盐水溶解。每孔分别加入10μl不同浓度的样品(1号试液-5号试液)。加样组及对照组均设4个复孔,加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。样品的终浓度分别为10-2、10-1、1、10及102 μg/mL,相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度102 μg/mL时,用0.1%DMSO作为溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10-1、1、10μg/mL。细胞在37℃,5%CO2培养箱中分别孵育48h后,加入MTT(5mg/ml,Sigma),10μL/孔。继续培养4h后,加入三联液[10%SDS–5%异丁醇–0.012mol/LHCL(w/v/v)],100μL/孔,放置过夜后用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各孔的OD值。
(b)SRB法
取处于对数生长期的贴壁细胞株,用25%胰酶常规消化后,再用15%小牛血清完全RPMI-1640培养基将细胞浓度调整为5×104/mL,加入96孔培养板,90μL/孔。细胞在37℃,5%CO2培养箱中分别孵育24h后加入阳性对照、阴性对照以及受试样品(各受试浓度同上MTT法，10μL/孔)，样品的终浓度分别为10-2、10-1、1、10、102 μg/mL,相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度102 μg/mL时用0.1%DMSO作为溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10-1、1、10μg/mL,阴性对照为等体积的生理盐水。加样组及对照组均设4复孔,加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。将96孔培养板置于37℃,5%CO2培养箱中孵育(细胞与样品作用)48h后,加入4℃、50%的TCA(三氯乙酸)50μL/孔。加完TCA后,将96孔培养板置于4℃孵育1小时,取出培养板,轻轻倾去板内液体。用自来水轻轻冲洗5遍(将自来水由烧杯中轻轻倒入板中,轻晃后再将水倒去),置于空气中风干至不见水痕。然后加入配制好的0.4%SRB(用1%乙酸稀释),50μL/孔,于室温下静置染色30分钟后倾去SRB溶液,用1%乙酸冲洗4遍,以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风干至无水痕后,加入10mM未缓冲Tris(缓血氨酸)溶液150μL/孔(PH10,用三蒸水配制),将染料溶解后,于振荡器上振荡5分钟,用酶标仪在570nm波长下读取各孔OD值。
(c)实验结果
实验结果表明：经对白血病急性早幼粒NB4细胞、肺腺癌A549细胞、人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒活性实验，山蚂蝗素A对NB4,A549，SHSY5Y，PC3和MCF7细胞株具有较好的细胞毒活性，IC50值分别达5.2、4.2、6.2、5.8和8.2μM。
表2化合物山蚂蝗素A的细胞毒活性

Claims (10)

1.一种黄酮类化合物，其特征在于所述化合物是从干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草中分离得到，命名为山蚂蝗素A，英文名为oxyphyllumflavoneA，其分子式为C21H16O6，具有下述结构：
。
2.一种权利要求1所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于以干燥的豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草为原料，经浸膏提取、有机溶剂提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到的，具体为：
A、浸膏提取：将豆科山蚂蝗属植物尖叶山蚂蝗(Desmodiumoxyphyllum)的全草粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60分钟，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：浸膏b用重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇-水洗脱，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏c;
D、硅胶柱一次层析：浸膏c用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、硅胶柱二次层析：D步骤洗脱液的9:1部分进一步用重量比6~10倍量的160~200目硅胶装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为1:0~0:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
F、高压液相色谱分离：E步骤洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的黄酮类化合物。
3.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤中的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇、甲醇中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中的甲醇-水体积配比为8:2、8.5:1.5和9:1。
6.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的甲醇或者丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
7.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤中氯仿-甲醇溶液体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
8.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述E步骤中石油醚-丙酮溶液体积配比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。
9.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述F步骤中高压液相色谱分离纯化是以30~60%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样45~60μL，收集20~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。
10.一种权利要求1所述的黄酮类化合物在制备抗癌药物中的应用。
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