CN103893813B

CN103893813B - 高分子组合物与高分子材料

Info

Publication number: CN103893813B
Application number: CN201210586655.2A
Authority: CN
Inventors: 施亭宇; 邓泽民; 王嘉淳; 陈毓华; 陈瑞祥; 杨梅如; 江淑芳; 陈燕春; 张家霓
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103893813A

Abstract

本发明提供高分子组合物与高分子材料。一种高分子组合物，包括：具有羟基的高分子；以及组氨酸或组氨酸之衍生物接枝于该具有羟基的高分子上。

Description

高分子组合物与高分子材料

技术领域

本发明系关于一种高分子组合物，且特别关于一种具有锌离子亲和力之高分子组合物，而此高分子组合物具有基质金属蛋白酶(matrixmetallopoateinases,MMPs)抑制功效，可直接以块状形式作为慢性伤口敷料或可用以处理医疗器材之表面，以使病患使用此慢性伤口敷料或医疗器材之时可改善组织发炎症状及/或促进伤口愈合。

背景技术

目前已知高活性及浓度之基质金属蛋白酶(matrixmetallopoateinases,MMPs)是造成慢性伤口迟迟未愈的主因。伤口的感染及发炎会引起组织大量分泌基质金属蛋白酶以分解与移除伤口床死亡的细胞与细菌，但基质金属蛋白酶活性过高也会新生组织的分解和生长因子的损伤，使伤口再度回到发炎期，而形成恶性循环无法愈合。上述情形于糖尿病患或其它病源性慢性病患之伤口十分常见，乃至造成病患之伤口恶化甚至截肢。此时具有基质金属蛋白酶抑制效果之敷料可降低局部基质金属蛋白酶活性，促进伤口愈合。

又，于各式炎症反应，如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)及骨性关节炎(osteoarthritis)也均有组织大量分泌基质金属蛋白酶的情形。高活性之基质金属蛋白酶表现往往启动多种生化机制，为致病机转之一，造成软骨破坏。此外于冠状动脉疾病（如冠心病）和心肌损伤时，所产生具有活性之基质金属蛋白酶往往又进一步降解细胞外基质导致斑块和血管壁变薄乃至破裂。此时具有基质金属蛋白酶抑制效果之材料可作为缓解病症之功效。

此外，通常于血管新生、细胞迁移、组织新生重建时须有基质金属蛋白酶的生成以协助细胞外基质材料的降解。然而于肿瘤生成时，过量基质金属蛋白酶的活性表现会导致细胞外基底膜降解，而因此促进肿瘤的侵犯能力与移转能力随之上升，造成肿瘤细胞的扩散。此时具有抑制基质金属蛋白酶活性之抑制剂及材料之开发可有助于减少肿瘤血管新生与转移。

基质金属蛋白酶为一群含有锌离子，可分解大多数细胞外基质的多肽内切酶。其结构上含前区(prodomain)、催化中心、类血红素结合蛋白(hemopexin)作用区段及跨膜(transmembrane)四个作用区段(domain)所组成。现今已经发现超过25种之基质金属蛋白酶，其可约略分为四型，包括(1)胶原蛋白酶；(2)明胶酶；(3)基质溶素；与(4)膜型基质金属蛋白酶。可有效分解人体组织中富含的明胶、胶原蛋白、与蛋白多糖等，并且与组织形成、组织新陈代谢及发炎反应有关。基质金属蛋白酶于分泌生成时期，此时其活化位置的锌原子与胱氨酸结合，为非活化之状态，当多肽被切割之后打开，基质金属蛋白酶则成为有活性之形式。

目前研究针对基质金属蛋白酶的抑制方法主要有三种方法：(1)使用金属蛋白酶的组织抑制因子(tissue inhibitor ofmetalloproteinase)与基质金属蛋白酶血红素结合蛋白形成可逆、非共价键结合的复合物使其失去活性；(2)以肽或抗体方式直接抑制基质金属蛋白酶的活性表现；以及(3)使用与锌离子间具有高亲和性之分子以键结使酶失活。其螯合锌离子进而使基质金属蛋白酶失去活性的机制，系藉由磷、氮、硫、氧等带有未键结电子对(lone pairelectrons)之原子非常容易与过渡金属元素形成配位(coordination)形式。

由文献及近年相关产品研发方向显示，慢性伤口先进敷料开始诉求抑制基质金属蛋白酶活性以促进伤口床重建愈合。此类产品以开发和伤口床接触可抑制基质金属蛋白酶活性的生医材料为第三种抑制方法。以Systagenix公司的Promogran慢性伤口敷料为例，其氧化纤维素与胶原蛋白之组合基材可有效吸收伤口床渗出液，且藉由氧化纤维素酸根和锌离子的亲和力抑制酶活性。Smith &Nephew公司亦推出慢性伤口敷料Biostep其抑制机制乃是于基材中添加具有螯合锌离子作用之EDTA，由于基质金属蛋白酶必须藉由与锌离子的结合来维持其活化之状态，因此基材中游离之EDTA可有效降低锌离子浓度，甚而吸附含锌之基质金属蛋白酶使之失活。然而此螯合分子乃游离态存在，因此作用时间与效能易受限制。

因此目前亟需一种新的材料，其可长效抑制基质金属蛋白酶之活性。

发明内容

本发明提供一种高分子组合物，包括：具有羟基的高分子；以及组氨酸或组氨酸之衍生物接枝于该具有羟基的高分子上。

本发明还提供一种高分子材料，包括：高分子组合物，其包括：具有羟基的高分子；以及组氨酸或组氨酸之衍生物接枝于该具有羟基的高分子上。

本发明进一步提供一种医疗器材，包括：高分子组合物，其包括：具有羟基的高分子；以及组氨酸或组氨酸之衍生物接枝于该具有羟基的高分子上。

为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：

附图说明

图1显示形成本发明高分子组合物之一实施例；

图2显示本发明高分子组合物的应用方式；

图3显示不同浓度的Boc组氨酸对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图4显示不同浓度之聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”（实施例1之Lot1）对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图5显示聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”（实施例1之Lot1）所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图6显示聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”（实施例1之Lot2）所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图7显示聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”（实施例1之Lot2）所形成之薄膜Lot1-1与Lot1-2对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图8显示聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物“EVOH-g-BocHis”（实施例2之Lot3与Lot4）所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图9显示羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”（实施例3之Lot5）所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图10显示羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”（实施例3之Lot6）所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图11显示羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”（实施例3之Lot6与Lot7）所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率；

图12显示聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot 3)对基质金属蛋白酶-9之长效抑制效能评估的结果；

图13显示经组氨酸含浸处理之基材(EVOH-c-BocHis)以及聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot 4)之长效抑制效能评估的结果。

图14显示接枝组氨酸衍生物薄膜样品对动物实验糖尿病鼠伤口渗岀液中基质金属蛋白酶-9之活性评估结果。

【主要组件符号说明】

101～具有羟基的高分子；

103～组氨酸或组氨酸之衍生物；

105～基材；

S1～混杂、涂布、含浸制程。

具体实施方式

在本发明一实施例中，本发明提供高分子组合物，其具有锌离子亲和力，并具有抑制基质金属蛋白酶(matrix metallopoateinases,MMPs)之活性的功效。参见图1。图1显示形成本发明高分子组合物之一实施例。于图1中显示，组氨酸或组氨酸之衍生物103被接枝于具有羟基的高分子101上而形成本发明高分子组合物。

由图1可知，本发明之高分子组合物可包括具有羟基的高分子101与组氨酸或组氨酸之衍生物103接枝于具有羟基的高分子101上。本发明高分子组合物具有锌离子亲和力，并具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效。在一实施例中，可被本发明高分子组合物所抑制之基质金属蛋白酶可包括，但不限于基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9及/或基质金属蛋白酶-13。

于本发明之高分子组合物中，组氨酸或组氨酸之衍生物为约0.1~99wt%。

于本发明之高分子组合物中，羟基的高分子可包括合成高分子或天然高分子，而上述合成高分子或天然高分子可包括线性高分子或具有支链之高分子。

在一实施例中，上述合成高分子可为线性合成高分子。上述线性合成高分子之例子可包括聚烯烃基二醇(polyalkylene glycol)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)、聚醋酸乙烯酯(polyvinyl acetate,PVAc)、乙烯醇-醋酸乙烯酯共聚合物(poly(vinylalcohol-co-vinylacetate))、乙烯-乙烯醇共聚物(poly(ethylene vinyl-co-alcohol,EVOH))其衍生物与上述之组合等，但不限于此。

又，在一实施例中，于本发明高分子组合物中，上述羟基的高分子可为天然高分子，而天然高分子可包括多糖高分子。适用于本发明高分子组合物之多糖高分子可包括，但不限于，透明质酸(hyaluronic acid)、淀粉(starch)、纤维素(cellulose)、甲基纤维素(methylcellulose)、羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methylcellulose)、氧化纤维素(oxidizedcellulose)、葡聚糖(dextran)、硬葡聚糖(scleroglucan)、几丁质(chitin)、几丁聚醣(chitosan)、卡德兰胶(crudlan)、褐藻胶(alginate)、角叉藻胶(carrageenan)、果胶(pectin)、阿拉伯树胶(gumArabic)、关华豆胶(guar gum)、结兰胶(gellan)、普路兰(pullulan)、软骨素(chondroitinsulfate)、肝素(heparin)或硫酸角蛋白(keratin sulfate)或其衍生物等。

而于本发明高分子组合物中，组氨酸及其组氨酸衍生物因其具有保有孤电子对(lone pair)之氮，所以可进行螯合锌离子之作用。上述组氨酸之衍生物可包括N^α-保护组氨酸衍生物，但不限于此。上述N^α-保护组氨酸衍生物的例子可包括，但不限于N^α-Boc-组氨酸(N^α-Boc-histidine)、N^α-Cbz-组氨酸(N^α-Cbz-histidine)、N^α-Fmoc-组氨酸(N^α-Fmoc-histidine)与N^α-Ac-组氨酸(N^α-Ac-histidine)等。

于本发明高分子组合物中，该上述组氨酸或组氨酸之衍生物可直接接枝于具有羟基的高分子上，或可藉由间连剂接枝于具有羟基的高分子上。

在一实施例中，组氨酸或组氨酸之衍生物为直接接枝于具有羟基的高分子上。于此实施例中，上述组氨酸或组氨酸之衍生物可以化学共价键结直接接枝于具有羟基的高分子上，而上述化学共价键结可包括酯键或胺基甲酸乙酯，但不限于此。酯键键结将组氨酸或组氨酸之可质子化官能基团取代于具有羟基的高分子的羟基。

于一特定实施例中，本发明高分子组合物包括具有羟基的高分子与组氨酸之衍生物直接接枝于上述具有羟基的高分子上，其中上述具有羟基的高分子包括聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、透明质酸、纤维素或羟丙基甲基纤维素，而上述组氨酸之衍生物为N^α-Boc-组氨酸。

在另一实施例中，上述组氨酸或组氨酸之衍生物可藉由间连剂(spacer)接枝于具有羟基的高分子上，而适用于本发明之间连剂的例子，可包括聚乙烯乙二醇类、烷类碳链等，但不限于此。

本发明高分子组合物之基质金属蛋白酶抑制率可达10-100%。在一实施例中，本发明高分子组合物对基质金属蛋白酶-9之抑制率可达约20.39%-62.15%。

本发明高分子组合物的应用方式可参见图2，但不限于此。图2显示，包含具有羟基的高分子101与接枝于具有羟基的高分子101之组氨酸或组氨酸之衍生物103的本发明高分子组合物藉由混杂、涂布、含浸制程S1而与基材105结合使用。

本发明高分子组合物可以混杂方式分布于基材内或医疗器材之表面及/或内部。

或者，本发明高分子组合物可形成溶液。在一实施例中，上述溶液可被直接加工为块材，而此块材可用于医疗用途，但不限于此。

在另一实施例中，上述溶液可被用以处理基材或医疗器材以物理吸附于该基材或医疗器材之表面。于此实施例中，基材之材料可包括，但不限于，多糖类（例如，纤维素及其衍生物、透明质酸及其衍生物等）、聚氨基甲酸酯类、聚乙烯醇类、乙烯-乙烯醇共聚物、聚丙烯类等，或上述之组合，而医疗器材的例子可包括，例如伤口敷料、组织替代物、组织工程支架、血液接触装置与导管等，但不限于此。

在本发明另一实施例中，本发明还提供一种高分子材料，其包括上述本发明之高分子组合物，而上述本发明之高分子组合物具有锌离子亲和力，并具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效。由于本发明之高分子材料包含有具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的高分子组合物，因此其可用于医疗以用以改善病患组织发炎之症状及/或促进伤口愈合，但不限于此。

在一实施例中，高分子材料本发明高分子材料可更包括基材。于此实施例中，于本发明高分子材料中，高分子组合物可与基材混杂或者是高分子组合物物理吸附于基材之表面或内以形成医疗器材。

上述基材之材料的例子，可为多糖类（例如，纤维素及其衍生物、透明质酸及其衍生物等）、聚氨基甲酸酯类、聚乙烯醇类、乙烯-乙烯醇共聚物、聚丙烯类等，或上述之组合，但不限于此。此外，上述医疗器材可包括，但不限于伤口敷料、组织替代物、组织工程支架、血液接触装置或导管等。

【实施例】

实施例1

聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”的合成

聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”的结构如下方式(I)所示：

式(I)。

将Boc-His-OH(4.48g,17.57mmol)与DMAP(1.95g,15.97mmol)置于装有磁石的双颈瓶中。将双颈瓶抽真空3分钟以移除瓶内空气并之后填充干燥氮气。接着加入DMAc(35ml)于双颈瓶中并搅拌10分钟使内容物均匀悬浮。取EDC固体(3.06g,15.97mmol)快速倒入双颈瓶中，以30℃水浴反应3小时以活化Boc-His-OH。将PVA_10k（分子量为10000）（2.79g,53.24mmol,80%水解(hydrolyzed)）加入DMAc(28ml)中并于80℃搅拌至完全溶解以形成PVA溶液，且之后降温至45℃备用。将活化后之Boc-His-LG溶液(LG=Leaving Group（离去基）)快速加入上述PVA溶液，并于45℃持续反应24小时以形成一反应溶液。自然降温后，将上述反应溶液装于透析袋(MWCO:6-8,000)，以DMAc(1.5L,20X)透析40小时（于第16小时更换透析液一次），再以DIW(7.5L,100X)透析48小时（于第3、6、9、12、24、27、30、33与36小时更换透析液）。收集固体，冷冻干燥而得到产物PVA-g-BocHis。

根据上所述之实验方法，藉由调整PVA与Boc-His-OH之间的反应当量而得到不同批次之不同BocHis接枝程度之高分子材料PVA-g-BocHis，并以核磁共振光谱仪(NuclearMagnetic ResonanceSpectroscopy)确定其接枝率。结果如表1所示。

表1、PVA-g-BocHis材料规格

实施例2

聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物“EVOH-g-BocHis”的合成

聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物“EVOH-g-BocHis”的结构如下方式(II)所示：

式(II)。

将Boc-His-OH(11.46g,44.88mmol)与DMAP(4.98g,40.8mmol)置于装有磁石的双颈瓶中。将双颈瓶抽真空3分钟以移除瓶内空气并之后填充干燥氮气。接着加入DMAc(90ml)于双颈瓶中并搅拌10分钟使内容物均匀悬浮。取EDC固体(7.82g,40.8mmol)快速倒入双颈瓶中，以30℃水浴反应3小时以活化Boc-His-OH。将EVOH(5.84g,150mmol,32mol%ethyleneunit)加入DMAc(58ml)中并于80℃搅拌至完全溶解以形成EVOH溶液，且之后降温至45℃备用。将活化后之Boc-His-LG溶液(LG=Leaving Group（离去基）)快速加入上述EVOH溶液，并于45℃持续反应24小时以形成一反应溶液。自然降温后，将上述反应溶液装于透析袋(MWCO:6-8,000)，以DMAc(3.0L,20X)透析40小时（于第16小时更换透析液一次）。之后，将透析袋中液体倒入DIW(5.0L,25X)进行第一次再沉淀。收集固体以MeOH回溶(10%w/v)，再倒入DIW(7.0L,35X)进行第二次再沉淀。收集固体并将固体展开以DIW清洗三次。冷冻干燥而得到产物EVOH-g-BocHis。

根据上所述之实验方法，藉由调整EVOH与Boc-His-OH之间的反应当量而得到不同BocHis接枝程度之高分子材料EVOH-g-BocHis，并以核磁共振光谱仪确定其接枝率。结果如表2所示。

表2、EVOH-g-BocHis材料规格

实施例3

羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”的合成

羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”的结构如下方式(III)所示：

式(III)。

将Boc-His-OH(2.92g,11.44mmol)与DMAP(1.27g,10.4mmol)置于装有磁石的双颈瓶中。将双颈瓶抽真空3分钟以移除瓶内空气并之后填充干燥氮气。接着加入DMAc(22.9ml)于双颈瓶中并搅拌10分钟使内容物均匀悬浮。取EDC固体(1.99g,10.4mmol)快速倒入双颈瓶中，以30℃水浴反应3小时以活化Boc-His-OH。将HPMC（2.0g，10.4mmol，Mn120,000，甲氧基(methoxy)之取代程度(degree of substitution,DS):1.1-1.6mol，环氧丙烷(propyleneoxide)之摩尔取代程度(molar degree of substitution,MS):0.1-0.3mol）加入DMAc(40ml)中并于80℃搅拌至完全溶解以形成HPMC溶液，且之后降温至50℃备用。将活化后之Boc-His-LG溶液(LG=Leaving Group（离去基）)快速加入上述HPMC溶液，并于50℃持续反应24小时以形成一反应溶液。自然降温后，将上述反应溶液装于透析袋(MWCO:6-8,000)，以DMAc(1.4L,20X)透析40小时（于第16小时更换透析液一次），再以DIW(7.0L,100X)透析72小时（于第3、6、9、12、24、27、30、33、36、48、52与56小时更换透析液）。收集固体，冷冻干燥而得到产物HPMC-g-BocHis。

根据上所述之实验方法，藉由调整HPMC与Boc-His-OH之间的反应当量而得到不同BocHis接枝程度之高分子材料HPMC-g-BocHis，并以核磁共振光谱仪确定其接枝率。结果如表3所示。

表3、HPMC-g-BocHis材料规格

实施例4

透明质酸接枝组氨酸衍生物“HA-g-BocHis”的合成

透明质酸接枝组氨酸衍生物“HA-g-BocHis”的结构如下方式(IV)所示：

式(IV)。

将Boc-His-OH(8.42g,33.0mmol)与DMAP(3.67g,30.0mmol)置于装有磁石的双颈瓶中。将双颈瓶抽真空3分钟以移除瓶内空气并之后填充干燥氮气。接着加入DMAc(66ml)于双颈瓶中并搅拌10分钟使内容物均匀悬浮。取EDC固体(5.75g,30.0mmol)快速倒入双颈瓶中，以30℃水浴反应3小时以活化Boc-His-OH。将HATBA(18.6g,30.0mmol)倒入玻璃反应槽内。将玻璃反应槽架设机械搅拌装置后抽真空10分钟以除去瓶内空气，之后并以干燥氮气回填。将以分子筛除水过之DMAc(186ml)加入玻璃反应槽内，并置于45℃循环水浴且以转速250rpm机械搅拌2小时以上，以使HA₁₆₀₀₀TBA（分子量为16000）或HA₃₅₀₀₀₀TBA（分子量为350,000）均匀溶解以形成HA溶液。将活化后之Boc-His-LG溶液(LG=Leaving Group（离去基）)快速加入含上述HATBA溶液之玻璃反应槽中。30分钟后提高玻璃反应槽中之机械搅拌转速至300rpm，并使反应槽内溶液于45℃持续反应24小时以形成反应溶液。自然降温后，将反应溶液转移至透析袋(MWCO:12-14,000)，以DMAc(6.0L,20X)透析40小时（第16小时更换透析液一次），再以DIW(18.0L,100X)透析72小时（第3、6、9、12、24、27、30、33、36、48、52与56小时更换透析液）。接着，收集透析袋中水溶液通过钠离子交换树脂（ROHM HAAS，食品级，520g），将TBA置换为钠离子，并将其真空浓缩至水溶液浓度约为1-1.5wt%。之后，以0.1M NaOH调整溶液pH值至7.6±0.2，利用冷冻干燥法干燥得到产物HA-g-BocHis。

根据上所述之实验方法，藉由调整HA与Boc-His-OH之间的反应当量而得到不同BocHis接枝程度之高分子材料HA-g-BocHis，并以核磁共振光谱仪确定其接枝率。结果如表4所示。

表4、HA-g-BocHis材料规格

实施例5

纤维素接枝组氨酸衍生物“Cellulose-g-BocHis”的合成

纤维素接枝组氨酸衍生物“Cellulose-g-BocHis”的结构如下方式(V)所示：

式(V)。

将Boc-His-OH(1.39g,5.34mmol)与DMAP(0.6g,4.94mmol)置于装有磁石的双颈瓶中。将双颈瓶抽真空3分钟以移除瓶内空气并之后填充干燥氮气。接着加入DMAc(10.9ml)于双颈瓶中并搅拌10分钟使内容物均匀悬浮。取EDC固体(0.95g,4.94mmol)快速倒入双颈瓶中，以30℃水浴反应3小时以活化Boc-His-OH。将纤维素布料(2.00g,12.34mmol)放入150ml玻璃反应槽内，含浸于分子筛除水过之DMAc(20ml)，并于45℃以转速100rpm搅拌2小时以上。将活化后之Boc-His-LG溶液(LG=Leaving Group（离去基）)快速加入玻璃反应槽内，使布料与Boc-His-LG溶液于45℃持续反应24小时。自然降温后，将反应后之纤维素布料，浸入DMAc(0.5L,20X)中并搅拌0.5小时，再放入DIW(1.0L,100X)中搅拌1小时，之后再使用DIW清洗三次，以去除反应后之不纯物。最后将Cellulos-g-BocHis干燥即得。

实施例6

不同样品对基质金属蛋白酶-9活性抑制试验

分析方法

步骤1：前(pro)-基质金属蛋白酶-9活化

于10μg/ml之前-基质金属蛋白酶-9(R&D)溶液加入100mMAPMA（终浓度1mM），并于37℃培养箱中作用2小时以前-基质金属蛋白酶-9转变成活化之前基质金属蛋白酶-9(activatedpro-matrix metallopoateinases)

步骤2：测试样品

将活化之前基质金属蛋白酶-9以基质金属蛋白酶-9活性分析缓冲溶液（50mMTris,10mM CaCl₂,150mM NaCl,0.05%Brij-35(w/v),pH7.5）稀释至浓度为100ng/ml。每一测试样品分别加入活化之前基质金属蛋白酶-9，放在37℃培养箱中反应2或24小时。阴性对照组为不含测试样品反应的活化之前基质金属蛋白酶-9溶液，阳性对照组于活化之前基质金属蛋白酶-9溶液中加基质金属蛋白酶-9活性抑制剂1,10-二氮杂菲(1,10-Phenanthroline,1,10-PT)（终浓度0.1mM）。

步骤3：基质金属蛋白酶-9活性分析

取出与材料反应后的活化之前基质金属蛋白酶-9溶液于96-孔黑盘(blackplate)。加入等体积基质金属蛋白酶-9基质（终浓度10uM）于37℃培养箱中反应0.5-1小时，于高感度荧光测定仪(Flexstation3)测定荧光读值(Ex/Em=320/405nm)。

实验结果

A.Boc-组氨酸浓度对基质金属蛋白酶-9活性抑制之影响

将已知不同浓度的Boc组氨酸与经活化之基质金属蛋白酶-9作用2小时，测量基质金属蛋白酶-9活性受到不同浓度组氨酸的影响变化。结果如图3所示。当组氨酸浓度达2.64mg/ml时即对基质金属蛋白酶-9有50%以上的抑制效果。y=21.83ln(x)+28.06。

B.聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”粉末浓度对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能的评估

将接枝率为13.3%之聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”(实施例1之Lot1)粉末配成为不同浓度之测试样本，并测试其对基质金属蛋白酶-9活性的影响。结果如表5与第4图所示。

表5、不同浓度之聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

结果显示，PVA-g-His接枝率为13.3%，PVA-g-His浓度为2%~10%时对基质金属蛋白酶-9的抑制率为即有47.78%；PVA-g-His浓度为20%基质金属蛋白酶-9即具有62.15%抑制效果。

C.实施例1之Lot1的聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例1之Lot1所获得之聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”粉末（接枝率13.3%）加入DMAC中，并于室温搅拌溶解（500rpm，6小时），溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行24小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并分别以BocHis与PVA薄膜为对照组。结果显示于表6与图5中。

表6、聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物所形成之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

结果显示，Lots1之薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制率可达到33.27%之抑制率而相较之下PVA薄膜（对照组）缓慢溶解仅有16.89%活性衰减情形。

D.实施例1之Lot2的聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例1之Lot2所获得之聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”粉末（接枝率19.0%）加入DMAC中，并于室温搅拌溶解（500rpm，6小时），溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行24小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并以交联PVA(cPVA)薄膜为对照组。结果显示于表7与图6中。

表7、聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

-:不含组氨酸

由于薄膜面积固定，因此根据薄膜重量及接枝率可知实施例1之Lot2其接枝之组氨酸相对于基质金属蛋白酶活性分析溶液之浓度约为19.4mg/ml，该Lots2薄膜对基质金属蛋白酶-9可达到41.04%之抑制率。相较之下交联PVA(cPVA)薄膜对基质金属蛋白酶-9并不具活性抑制效果。

E.实施例1之Lot1的聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例1之Lot1所获得之聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物“PVA-g-BocHis”粉末（接枝率13.3%）加入DMAC中，并于室温搅拌溶解（500rpm，6小时），溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行24小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并以交联PVA薄膜(cPVA)为对照组。结果显示于表8与图7中。

表8、聚乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

-:不含组氨酸

由于薄膜面积固定，而批次不同造成PVA-g-BocHis样品Lot1-1与Lot1-2批次间之厚度差异，因此PVA-g-BocHis薄膜根据重量及接枝率可知PVA-g-BocHis薄膜Lot1-1与Lot1-2其接枝之组氨酸相对于基质金属蛋白酶活性分析溶液之浓度分别为21.64mg/ml与12.4mg/ml。由结果可知，Lots1-1与1-2薄膜对基质金属蛋白酶-9分别有29.26%与44.97%之活性抑制率。相较之下交联PVA薄膜(cPVA)并不具活性抑制效果。

F.实施例2之Lot3与Lot4的聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物“EVOH-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例2之Lot3与Lot4所获得之聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物“EVOH-g-BocHis”粉末加入DMAC中，并于室温搅拌溶解（500rpm，6小时），溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行24小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并以EVOH薄膜为对照组。结果显示于表9与图8中。

表9、聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

-不含组氨酸

由于薄膜面积固定但样品Lot1-1与Lot1-2批次间之厚度差异，因此根据重量及接枝率可知EVOH-g-BocHis薄膜Lot3与Lot4其接枝之组氨酸相对于基质金属蛋白酶活性分析溶液之浓度分别为17.7mg/ml与24.03mg/ml。由结果可知，Lots3与4薄膜之活性抑制效能因其组氨酸重量百分率上升分别有43.68%与38.25%之活性抑制率Lots3与4薄膜对基质金属蛋白酶-9分别有43.68%与38.25%之活性抑制率。相较之下EVOH薄膜并不具活性抑制效果。

G.实施例3之Lot5的羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例3之Lot5所获得之聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”粉末溶解于DMAC后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行3小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并以HPMC薄膜为对照组。结果显示于表10与图9中。

表10、羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

-:不含组氨酸

根据重量及接枝率可知HPMC-g-BocHis Lot5薄膜其接枝之组氨酸相对于基质金属蛋白酶活性分析溶液之浓度为2.4mg/ml。由结果可知，Lot5薄膜对基质金属蛋白酶-9有33.2%之活性抑制率。相较之下HPMC薄膜并不具活性抑制效果。

H.实施例3之Lot6的羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例3之Lot6所获得之聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”粉末溶解于DMAC后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行24小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并以交联之HPMC(cHPMC)薄膜为对照组。结果显示于表11与图10中。

表11、羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

-:不含组氨酸

根据重量及接枝率可知HPMC-g-BocHis Lot6薄膜其接枝之组氨酸相对于基质金属蛋白酶活性分析溶液之浓度为10.15mg/ml。由结果可知，Lot6薄膜对基质金属蛋白酶-9有42.41%之活性抑制率，相较之下cHPMC薄膜并不具活性抑制效果。

I.实施例3之Lot6与Lot7的羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”的薄膜对基质金属蛋白酶-9活性抑制效能评估

将实施例3之Lot6与Lot7所获得之羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物“HPMC-g-BocHis”粉末加入DMAC中，并于室温搅拌溶解（500rpm，6小时），溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。将膜片裁切为直径1cm之薄膜样品进行2小时基质金属蛋白酶-9活性测试，并以交联之HPMC(cHPMC)薄膜为对照组。结果显示于表12与图11中。

表12、羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物薄膜对基质金属蛋白酶-9的抑制功效

-:不含组氨酸

由于薄膜面积固定但Lot6与Lot7批次间之厚度差异，因此根据重量及接枝率可知HPMC-g-BocHis薄膜Lot6与Lot7其接枝之组氨酸相对于基质金属蛋白酶活性分析溶液之浓度分别为5.52mg/ml与8.71mg/ml。由结果可知，Lots6与7薄膜对基质金属蛋白酶-9因受其亲水性质改变之影响分别有37.26%与36.37%之活性抑制率。相较之下cHPMC薄膜并不具活性抑制效果。

实施例7

长效抑制效能评估实验

实验样品制备

A.聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品制备(EVOH-g-BocHis)：

将Lot3与Lot4之聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物粉末加入DMAC中，并于室温搅拌溶解，溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。

B.含浸薄膜样品制备（涂覆Boc组氨酸之EVOH薄膜(BocHiscoated EVOH Film,EVOH-c-Bochis)）：

取适量Boc组氨酸震荡溶解于10ml共溶液(co-solvent)(DMAc/MeOH5:95)以使其溶解。溶解完成后将聚乙烯乙烯醇薄膜浸入此Boc组氨酸(Boc-Histidine)溶液后取出，之后将薄膜放置于60℃烘箱中24小时，移除溶液中之溶剂后即完成涂覆Boc组氨酸之EVOH薄膜。EVOH薄膜涂覆Boc组氨酸含量以核磁共振光谱仪及元素分析测定为约9.18%。

实验方法与结果

A.聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot3)对基质金属蛋白酶-9之长效抑制效能评估实验

将聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot3)放置于PBS缓冲溶液中于37℃以150rpm进行震荡，并每2小时置换新鲜之PBS缓冲溶液以模拟体液生理情形。每4、8与24小时取样进行基质金属蛋白酶-9活性测试。以聚乙烯乙烯醇薄膜做为对照组。结果如表13与图12所示。

表13、聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot3)对基质金属蛋白酶-9之长效抑制效能评估的结果

由表13与图12可知，聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品对基质金属蛋白酶-9之抑制效果均有效维持于20.39%至27.84%间。

B.仅经组氨酸含浸处理之基材(EVOH-c-BocHis)以及聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot4)之长效抑制效能评估

分别将经组氨酸含浸处理之基材(EVOH-c-BocHis)以及聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(EVOH-g-His,Lot4)样品放置于PBS缓冲溶液中于37℃以150rpm进行震荡，并每2小时置换新鲜之PBS缓冲溶液以模拟体液生理情形。于起始及第24小时分别取样进行基质金属蛋白酶-9活性测试。结果如表14与图13所示。

表14、经组氨酸含浸处理之基材(EVOH-c-BocHis)以及聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot4)之长效抑制效能评估的结果

结果显示聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(Lot4)，不仅对基质金属蛋白酶-9具有抑制效果，更可长效维持此抑制功能。反之涂布组氨酸衍生物溶液重量百分率达9.18%之EVOH-c-BocHis，虽起始时对基质金属蛋白酶-9具有良好之抑制效能，但在24小时后却几近丧失抑制功能。

实施例8

糖尿病鼠伤口液中基质金属蛋白酶活性检测

实验样品制备

A.聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜样品(EVOH-g-BocHis)制备：

将实施例2之聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物(EVOH-g-BocHis)粉末以固成分15%之比例加DMAC中，并于室温搅拌溶解，溶解后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。

B.聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物薄膜样品制备(HPMC-g-BocHis)：

将实施例3所获得之聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物(HPMC-g-BocHis)粉末以固成分15%比例溶解于DMAC后置入模具以60℃进行烘干72小时以成膜片。

C.糖尿病鼠；以链佐霉素(streptozotocin,STZ)连续注射大鼠（品系：Sprague-Dawley(SD)）4周，使产生类似第二型糖尿病的动物模式。

实验方法与结果

A.分别将编号为1至6之六只糖尿病大鼠背后，开出5cm X6cm大的伤口。编号1与编号2之小鼠为EVOH处理组、编号3与编号4之大鼠为聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜(EVOH-g-BocHis)处理组，而编号5与编号6之大鼠为聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物薄膜(HPMC-g-BocHis)处理组。

B.将样品薄膜敷盖在伤口表面，再于薄膜上加上一层防水透气敷料，并以手术缝线将敷料固定于伤口四周。手术后第1天与第3天，分别抽取伤口渗出液，进行伤口液中基质金属蛋白酶活性检测。

C.基质金属蛋白酶活性分析：伤口渗出液以分析缓冲溶液（50mM Tris,10mMCaCl₂,150mM NaCl,0.05%Brij-35(w/v),pH7.5）稀释50倍。取稀释后伤口渗出液加入等体积基质金属蛋白酶-9基质（终浓度10uM）于37℃培养箱中反应0.5-1小时，于高感度荧光测定仪(Flexstation3)测定荧光读值(Ex/Em=320/405nm)。

表15、接枝组氨酸衍生物薄膜样品对动物实验糖尿病鼠伤口渗出液中基质金属蛋白酶-9之活性评估结果

由表15与图14可知，在手术后第3天，接枝组氨酸衍生物薄膜敷料（聚乙烯乙烯醇接枝组氨酸衍生物薄膜(EVOH-g-BocHis)与聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物薄膜(HPMC-g-BocHis)），其伤口渗出液中基质金属蛋白酶活性明显较第1天时降低，其中又以聚羟丙基甲基纤维素接枝组氨酸衍生物材料效果为佳。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

Claims

1.一种高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该高分子组合物包括：

具有羟基的高分子，其中该具有羟基的高分子为聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、透明质酸、纤维素或羟丙基甲基纤维素；以及

组氨酸或组氨酸之衍生物接枝于该具有羟基的高分子上。

2.如权利要求1所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸或该组氨酸之衍生物为该高分子组合物的0.1～99wt％。

3.如权利要求1所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸之衍生物为N^α-保护组氨酸衍生物。

4.如权利要求3所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该N^α-保护组氨酸衍生物包括N^α-Boc-组氨酸(N^α-Boc-histidine)、N^α-Cbz-组氨酸(N^α-Cbz-histidine)、N^α-Fmoc-组氨酸(N^α-Fmoc-histidine)或N^α-Ac-组氨酸(N^α-Ac-histidine)。

5.如权利要求1所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸或该组氨酸之衍生物为直接接枝于该具有羟基的高分子上，或藉由间连剂接枝于该具有羟基的高分子上。

6.如权利要求5所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸或该组氨酸之衍生物为直接接枝于该具有羟基的高分子上。

7.如权利要求6所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸或该组氨酸之衍生物为以化学共价键结直接接枝于该具有羟基的高分子上。

8.如权利要求7所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该化学共价键结包括酯键或胺基甲酸乙酯。

9.如权利要求6所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸之衍生物N^α-Boc-组氨酸。

10.如权利要求5所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该组氨酸或该组氨酸之衍生物为藉由该间连剂接枝于该具有羟基的高分子上。

11.如权利要求10所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该间连剂包括聚乙烯乙二醇类或烷类碳链。

12.如权利要求1所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该高分子组合物以混杂方式分布于基材内或医疗器材之表面及/或内部。

13.如权利要求1所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该高分子组合物形成溶液。

14.如权利要求13所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该溶液被直接加工为块材。

15.如权利要求13所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该溶液被用以处理基材或医疗器材以物理吸附于该基材或医疗器材之表面。

16.如权利要求12或15所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该基材之材料为多糖类、聚氨基甲酸酯类、聚乙烯醇类、乙烯-乙烯醇共聚物、聚丙烯类或上述之组合。

17.如权利要求12或15所述之高分子组合物用于制备具有抑制基质金属蛋白酶之活性的功效的医疗器材或抑制剂的用途，其中该医疗器材包括伤口敷料、组织替代物、组织工程支架、血液接触装置或导管。