CN103849575B - 一种单细胞蛋白的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种单细胞蛋白的生产方法，按以下步骤：（1）将微生物提油后残渣与溶菌酶以20~200∶1的质量比混匀，40~60℃、初始pH 5.0~7.0、搅拌转速50~200转/分钟、2~5小时反应，再105℃处理10~30分钟；（2）将水与上述酶解液按5~2:1的质量比，并加入5~150mg/L的硫酸镁，100~200mg/L的氯化铁和5~50mg/L的磷酸二氢钠，经115~121℃，15~30分钟灭菌；（3）将螺旋藻和酵母接种于步骤（2）中培养液，pH 6.0~8.0、通气量0.1~5.0vvm，采用基于温度调控策略的两阶段培养法，前后两阶段培养时间分别为48~108小时和24~36小时；（4）收集步骤（3）中微生物生物质，用水冲洗，冷冻干燥机干燥，即得到单细胞蛋白产品。本发明提高了生产效率，降低生产成本，提高单细胞蛋白质量。
Description
技术领域
本发明涉及化工技术领域。
背景技术
微生物油脂，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物等物质通过一系列生化反应合成的油脂。微生物油脂是制备生物柴油的良好原料。微生物油脂提取是生物柴油生产关键环节之一。微生物提油后残渣主要含碳水化合物，蛋白质等物质，因此在微生物制备高品质生物柴油生产系统中，若对以上提油后残渣不加以利用将造成提油后微生物残渣高价值多元组成的浪费和环境污染。实际上，微生物提油后残渣是重要的生物质资源。通过合适的生物方法可以将微生物提油后残渣转化成单细胞蛋白等产品。
单细胞蛋白(SCP) 也叫微生物蛋白，主要由细菌、酵母、藻类等低等微生物繁殖生长而来。单细胞蛋白所含的营养物质极为丰富。其中，蛋白质含量高达40%～80%，比大豆高10%～20%，比肉、鱼、奶酪高20%以上；氨基酸的组成较为齐全，含有人体必需的8种氨基酸，尤其是谷物中含量较少的赖氨酸。一般成年人每天食用10～15 g干酵母，就能满足对氨基酸的需要量。单细胞蛋白中还含有多种维生素、碳水化合物、脂类、矿物质，以及丰富的酶类和生物活性物质，如辅酶A、辅酶Q、谷胱甘肽、麦角固醇等。单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白用途广泛：作为食品或食品添加剂，单细胞蛋白不仅能制成“人造肉”，供人们直接食用，还常作为食品添加剂，用以补充蛋白质或维生素、矿物质等。由于某些单细胞蛋白具有抗氧化能力，使食物不容易变质，因而常用于婴儿粉及汤料、作料中。干酵母的含热量低，常作为减肥食品的添加剂。此外，单细胞蛋白还能提高食品的某些物理性能，如意大利烘饼中加入活性酵母，可以提高饼的延薄性能。酵母的浓缩蛋白具有显著的鲜味，已广泛用作食品的增鲜剂。作为饲料蛋白，也在世界范围内得到了广泛应用。用作医药等领域，从单细胞蛋白质中可提取许多有用之物，如辅酶A，细胞色素C和辅酶I等医药产品，如酵母浸出汁等生物试剂。
单细胞蛋白的生产过程比较简单：在培养液配制及灭菌完成以后，将它们和菌种投放到发酵罐中，控制好发酵条件，菌种就会迅速繁殖；发酵完毕，收集菌体，最后经过干燥处理，就制成了单细胞蛋白成品。目前单细胞蛋白来源有二种方式：一种是从自然界获得，如藻类；另一种是人类主导的工业化生产，如酵母蛋白，石油酵母蛋白等。据联合国粮农组织(FAO)统计，到2010年，全球的单细胞蛋白产量约为3000万吨。当前单细胞蛋白生产存在以下问题：第一种方式产量有限，生产受季节和地域限制，且难以满足人类不断增长的需求；第二种方式生产成本偏高；所产蛋白营养价值有待提高。
发明内容
针对现有技术生物柴油生产系统中微生物提油后残渣未被充分利用，单细胞蛋白生产成本偏高、质量有待提高的问题，本发明的目的在于提供一种利用提油后微生物残渣生产单细胞蛋白的方法，通过温度调控，提高细胞蛋白质含量，该方法产率高、生产成本低、所产单细胞蛋白质量高、可再生。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种单细胞蛋白的生产方法，其特征在于按以下步骤。
（1）将微生物提油后残渣（干物质）与溶菌酶以20~200∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度40~60℃，初始pH 5.0~7.0，搅拌转速50~200转/分钟，时间2~5小时，反应结束后105℃处理10~30分钟，得到微生物残渣酶解液。
（2）将水与微生物残渣酶解液按5~2:1的质量比，并加入5~150mg/L的硫酸镁，100~200mg/L的氯化铁和5~50mg/L的磷酸二氢钠，经115~121℃，15~30分钟灭菌，用作培养液。
（3）将螺旋藻和酵母同时接种于步骤（2）的培养液中，置于发酵罐中生长。采用基于温度调控的二阶段培养法：第一阶段培养温度25~30℃、pH 6.0~8.0、通气量0.1~5.0vvm，时间48~108小时；第二阶段培养温度35~40℃、pH 6.0~8.0、通气量0.1~5.0vvm，时间24~36小时。
（4）收集步骤（3）中的微生物生物质，用水冲洗，冷冻干燥机干燥，即得到单细胞蛋白产品。
本发明步骤（3）中，也可以环绕发酵罐外置一串的人工灯。
本发明步骤（3）所述的基于温度调控的二阶段培养法的最佳培养温度是：第一培养阶段温度30℃，第二培养阶段温度40℃。
本发明所述的溶菌酶的主要作用于微生物细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4-糖苷键，微生物提油后残渣主要含细胞壁碎片等物质，经溶菌酶定向酶解得到主要含糖和蛋白质的酶解液，酶解效率高，酶解迅速，酶解过程无其他物质添加，酶解液无需其他预处理可直接用于微生物培养，不影响所产单细胞的质量和食品安全。
本发明利用高效液相色谱仪检测微生物残渣酶解液中糖含量，用凯氏定氮仪测定微生物残渣酶解液和微生物生物质中蛋白质含量，用紫外分光光度计测定微生物生物量。
本发明以利用微生物提油后残渣酶解液为原料生产单细胞蛋白，通过对可再生资源的生物转化利用，拓广单细胞蛋白来源，将酵母和螺旋藻混合作为单细胞蛋白，提高单细胞蛋白质量，通过温度调控，提高细胞蛋白质含量，同时解决粮食短缺及环境污染问题，降低生产成本。
本发明单细胞蛋白的生产是将微生物提油后残渣酶解液作为原料，通过混合培养螺旋藻和酵母进行转化，提高生产效率，降低生产成本，提高单细胞蛋白质量，是一种满足工业化需求的新方法。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
以下实施例所用到的富含油脂小球藻（Chlorella vulgaris），可从中国典型微生物保藏中心（武汉）获得，其保藏编号为CCTCC M209256；所用到的富含油脂微拟球藻（Nannochloropsis oculata），可从美国德州大学UTEX藻种库获得，其保藏编号为LB2164；所用到的富含油脂粘红酵母（Rhodotorula glutinis），可从德国DSMZ菌种保藏中心获得，其保藏编号为DSMZ 10134。所用的螺旋藻为极大螺旋藻（Spirulinamaxima）和钝顶螺旋藻（Spirulinaplatensis），可从中国科学院野生生物种质库----淡水藻种库获得，其保藏编号分别为FACHB-438和834。所用的酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和产朊假丝酵母（Candida utilis），可从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得，其保藏编号分别为CICC 1747和1314。
以下实施例所用的溶菌酶为购自生化制剂公司Sigma的市售商品酶L6876或L7651或L2879。
实施例1。
将富含油脂小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。将富含油脂粘红酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中：土豆浸出液 1000mL(200g土豆去皮，切小块后加水煮沸1小时，5层纱布过滤，定容至1000mL)和葡萄糖 20000 mg/L，置于摇床中培养，转速150转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分别将在光照培养箱中生长的50g富含油脂小球藻和摇床中发酵的50g富含油脂粘红酵母，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得生物质，用蒸馏水冲洗5次。经溶菌酶L6876预处理：富含油脂微生物（干物质）与溶菌酶L6876以150∶1的质量比混匀，55℃，初始pH 6.5，搅拌转速120转/分钟，3小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：2，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到微生物提油后残渣。
将微生物提油后残渣与溶菌酶L6876以150∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应；温度55℃，初始pH 6.5，搅拌转速120转/分钟，时间3小时。反应结束后105℃处理15分钟，得到微生物提油后残渣酶解液，检测其中糖和蛋白质含量。
将酶解液作为极大螺旋藻和酿酒酵母混合培养的培养基：自来水与酶解液质量比为3:1，并加入10mg/L的硫酸镁，150mg/L的氯化铁和10mg/L的磷酸二氢钠，置于5L发酵罐中，外置一排环绕发酵罐的日光灯管（共8根，管状），光照强度5000lx，时间96小时，通气量0.3vvm，光暗周期12/12；采用基于温度调控的二阶段培养法，培养初始3天温度30℃， 培养最后1天温度40℃，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得微生物生物质，用水冲洗3次，冷冻干燥机干燥，即得到单细胞蛋白产品。结果见表1。
实施例2。
将富含油脂微拟球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。将富含油脂粘红酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中：土豆浸出液 1000mL(200g土豆去皮，切小块后加水煮沸1小时，5层纱布过滤，定容至1000mL)和葡萄糖 20000 mg/L，置于摇床中培养，转速150转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分别将在光照培养箱中生长的50g富含油脂微拟球藻和摇床中发酵的50g富含油脂粘红酵母，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得生物质，用蒸馏水冲洗5次。经溶菌酶L7651预处理：富含油脂微生物（干物质）与溶菌酶L7651以50∶1的质量比混匀，55℃，初始pH 6.5，搅拌转速120转/分钟，3小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：1，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到微生物提油后残渣。
将微生物提油后残渣与溶菌酶L7651以50∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应；温度55℃，初始pH 6.5，搅拌转速120转/分钟，时间3小时。反应结束后105℃处理15分钟，得到微生物提油后残渣酶解液，检测其中糖和蛋白质含量。
将酶解液作为钝顶螺旋藻和产朊假丝酵母混合培养的培养基：自来水与酶解液质量比为2:1，并加入10mg/L的硫酸镁，150mg/L的氯化铁和10mg/L的磷酸二氢钠，置于5L发酵罐中，自然光，时间108小时，通气量0.3vvm；采用基于温度调控的二阶段培养法，培养初始3天温度30℃，培养最后36小时温度40℃，培养结束后；离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得微生物生物质，用水冲洗3次，冷冻干燥机干燥，即得到单细胞蛋白产品。结果见表1。
实施例3。
将富含油脂小球藻藻种经无菌操作接种于灭菌f/2培养基，置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度2000lx，培养10天。将富含油脂粘红酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中：土豆浸出液 1000mL(200g土豆去皮，切小块后加水煮沸1小时，5层纱布过滤，定容至1000mL)和葡萄糖 20000 mg/L，置于摇床中培养，转速150转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。分别将在光照培养箱中生长的50g富含油脂小球藻和摇床中发酵的50g富含油脂粘红酵母，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得生物质，用蒸馏水冲洗5次。经溶菌酶L2879预处理:富含油脂微生物（干物质）与溶菌酶L2879以20∶1的质量比混匀，55℃，初始pH 6.5，搅拌转速120转/分钟，3小时。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和预处理后的微生物生物质浆体积比为1：1：2，水相经离心（15000转/分钟，10分钟）后，用蒸馏水冲洗5次，冷冻干燥12小时后得到微生物提油后残渣。
将微生物提油后残渣与溶菌酶L2879以20∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度55℃，初始pH 6.5，搅拌转速120转/分钟，时间3小时。反应结束后105℃处理15分钟，得到微生物提油后残渣酶解液，检测其中糖和蛋白质含量。
将酶解液作为极大螺旋藻和产朊假丝酵母混合培养的培养液：蒸馏水与酶解液质量比为4:1，并加入10mg/L的硫酸镁，150mg/L的氯化铁和10mg/L的磷酸二氢钠，置于5L发酵罐中，外置一排环绕发酵罐的日光灯管（共8根，管状），光照强度5000lx，时间72小时，通气量0.3vvm，光暗周期12/12；采用基于温度调控的二阶段培养法：培养初始2天温度30℃， 培养最后1天温度40℃；培养结束后，离心（8000转/分钟，10分钟）收集获得微生物生物质，用水冲洗3次，冷冻干燥机干燥，即得到单细胞蛋白产品。结果见表1。
对比例1。
将极大螺旋藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（g/L）：NaHCO3 16.8，NaNO3 2.5，K2SO4 1.0，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.04，K2HPO4·H2O 0.5，FeSO4·7H 2O0.01，Na-EDTA 0.08，置于光照培养箱中培养，培养温度30℃，初始pH 7.0，光照强度1500lx，培养7天。结果见表1。
对比例2。
将钝顶螺旋藻藻种经无菌操作接种于灭菌培养基（g/L）： NaHCO3 16.8，NaNO32.5，K2SO4 1.0，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.04，K2HPO4·H2O 0.5，FeSO4·7H 2O 0.01，Na-EDTA 0.08，置于光照培养箱中培养，培养温度30℃，初始pH 7.0，光照强度1500lx，培养7天。结果见表1。
对比例3。
将酿酒酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中：土豆浸出液 1000mL(200g土豆去皮，切小块后加水煮沸1小时，定容至1000mL)和葡萄糖 10000 mg/L，置于摇床中培养，初始pH 5.5，转速120转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。结果见表1。
对比例4。
将产朊假丝酵母菌种经无菌操作接种于灭菌摇瓶培养液中（mg/L）：K2HPO4·H2O500，MgSO4·7H2O 200，NaNO3 5000和葡萄糖 15000，置于摇床中培养，初始pH 5.5，转速140转/分钟，培养温度37℃，培养72小时。结果见表1。
表1 实施例及对比结果
Claims (3)
1.一种单细胞蛋白的生产方法，其特征是步骤如下：
（1）将微生物提油后残渣与溶菌酶以20~200∶1的质量比混匀，置于反应器中，磁力搅拌下反应，温度40~60℃，初始pH 5.0~7.0，搅拌转速50~200转/分钟，时间2~5小时，反应结束后105℃处理10~30分钟，得到微生物残渣酶解液；
（2）将水与微生物残渣酶解液按5~2:1的质量比混匀，并加入5~150mg/L的硫酸镁，100~200mg/L的氯化铁和5~50mg/L的磷酸二氢钠，经115~121℃，15~30分钟灭菌，用作培养液；
（3）将螺旋藻和酵母同时接种于步骤（2）的培养液中，置于发酵罐中生长：采用基于温度调控的二阶段培养法：第一阶段培养温度25~30℃、pH 6.0~8.0、通气量0.1~5.0vvm，时间48~108小时；第二阶段培养温度35~40℃、pH 6.0~8.0、通气量0.1~5.0vvm，时间24~36小时；
（4）收集步骤（3）中的微生物生物质，用水冲洗，冷冻干燥机干燥，即得到单细胞蛋白产品。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是在步骤（3）所述的发酵罐周围环绕安置一串人工灯。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是步骤（3）所述的基于温度调控的二阶段培养法：第一培养阶段温度30℃，第二培养阶段温度40℃。
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