CN103834742A - 检测刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）的专用探针、引物、基因芯片和方法。该专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示序列的反向互补序列的DNA片段。通过该基因芯片能够在短时间内对常见的花梨木刺猬紫檀进行鉴别，实现了在“种”的水平上对红木进行的鉴定，提升了红木鉴定的准确性和分辨率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及检测刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法。
背景技术
红木是一类外表呈红色的优质硬木的统称，多产于热带亚热带地区，历来就受到世界各地人民的青睐。尤其是在中国的明清两代，经传统工艺制成的红木家具更是创造了中国古典家具的典范。根据我国的国家标准GB18107-2000《红木》，“红木”范围确定为5属8类、33个主要品种。目前，传统的鉴定方法依据心材颜色、气味、管孔弦向直径、气干密度、射线等指标将红木分为八类，鉴定结果只分辨到“类”，很难再深入到“种”的层面进行鉴定。
基因芯片是DNA识别技术的一种体现，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多种红木的多个DNA条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还可以区分红木种与种之间的微小DNA差异，即基因芯片可以在“种”的水平上对不同红木进行准确鉴定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对目前在“种”的水平上对不同红木进行准确鉴定的缺陷，提供一种检测刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法，该方法能够在“种”的水平上对刺猬紫檀进行准确鉴定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的技术方案之一为：检测刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）的专用探针，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示序列的反向互补序列的DNA片段。
上述探针检测刺猬紫檀的靶序列是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示序列的反向互补序列的DNA片段。
本发明的技术方案之二为：检测刺猬紫檀的基因芯片，其含有所述的专用探针。本发明所述的基因芯片如本领域常规，而其上的检测探针则是如上所述的专用探针。
本发明的技术方案之三为：检测刺猬紫檀的装置，其包括所述的专用探针或者所述的DNA芯片。本发明所述的装置如本领域常规，其中，优选的，所述的装置还包括引物对，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.11所示。其中，优选的，所述的引物上含有荧光标记。
本发明的技术方案之四为：检测刺猬紫檀的引物，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的DNA片段。其中，优选的，所述的引物上含有荧光标记。
本发明的技术方案之五为：一种检测刺猬紫檀的方法，包括以下步骤：
（1）制备待测样本的总DNA，作为模板，用含检测标记的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.11所示；
（2）将专用探针结合于基因芯片的片基上，洗去未结合的探针，获得检测刺猬紫檀的基因芯片，所述的专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQID NO.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示序列的反向互补序列的DNA片段；
（3）在步骤（2）所得的检测刺猬紫檀的基因芯片中加入步骤（1）所得的PCR产物，进行杂交，洗去未杂交的PCR产物；
（4）检测步骤（3）所得的杂交后的基因芯片。
其中，步骤（1）所述的制备待测样本的总DNA的方法是常规的。所述PCR的扩增方法也是常规的，较佳的PCR扩增程序如下：95℃预热5min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；最后72℃延伸5min。
其中，步骤（2）所述的将专用探针结合于基因芯片的片基上的方法是常规的。基因芯片的片基是常规的，优选的，所述的片基是醛基片基，所述的探针是氨基化探针。优选的，在步骤（2）所述的基因芯片的另外的加样孔中加入花梨木管家基因检测探针，所述的花梨木管家基因检测探针是常规的，优选的是序列如序列表中SEQ ID NO.16所示序列的核苷酸片段。优选的，在步骤（2）所述的基因芯片的另外的加样孔中还可以加入其它试剂，如作为各种对照的试剂、检测其他种花梨木的检测探针等。
其中，步骤（3）所述的杂交是常规的。
其中，步骤（4）所述的检测方法是常规的，优选激光共聚焦扫描仪检测基因芯片，获得杂交结果。优选的，根据步骤（4）检测所得的杂交结果评判如下：杂交结果为阳性，则所述待测样本为刺猬紫檀；杂交结果不为阳性，则所述待测样本不为刺猬紫檀。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了鉴别刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法。对刺猬紫檀该种花梨木进行DNA鉴定，在“种”的水平上对该花梨木进行检测和鉴定，为传统的木材鉴定提供了一种新的技术和思路。
本发明的特点包括：
（1）高通量：能同时鉴定多个刺猬紫檀样品；若将多个花梨木的检测探针置于同一芯片上，能同时鉴定多个花梨木品种；
（2）准确性：基于DNA差异的检测，结果更可靠；
（3）时效性：相比于传统红木鉴定耗时15天，本发明只需要8小时即可完成对红木品种的鉴定。
（4）可靠性：含有内对照点，对检测操作的准确性进行质控。
附图说明
图1为安达曼紫檀的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图2为印度紫檀的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点；也是芯片的质控位点。
图3为的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图4对照组越柬紫檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图5对照组刀状黑黄檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图6对照组刀绒毛黄檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1靶序列的确定
根据报道的安达曼紫檀（Pteroearpus dalbergioides Benth.）、印度紫檀（Pterocarpus indicus Wiild.）、刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）基因序列，选择一段特异性较好、片段长度适合的基因序列作为检测的靶序列。所选取的靶序列经过同源性比对检索后，目前确定为一段特异性较高的DNA序列。
3种花梨木的特异性检测靶序列分别为：
安达曼紫檀：
5’AGTTTATTTTGAAATAATTCATTTTTTTTTCCTTACAATACAAAGAGAAATNTATGTTTGGCAAAATTTTGAAAAAGGGGGTAAAATNTTCAATGTNTTTCTTTAGATNTTAAAAAGGTAAAAAAAAAGATAAAAAAAGGGGGGGGTAAGATATATGGGTAATTAATCAAAGAAGAATTAGTTTTCCTTTTGAGAACCGAAGGAAGGTTTTTCCCCTGACCCGGAGCAATG—3’（SEQ ID NO.1）；
印度紫檀：
5’GAAAGGAAAAGGCTATACATATATATATATGTATATATACGTATTTGTACTGAAATACTATTTCAATTGAGTAATGAAGACTCCAAATCTCTATTTGTGACTCTTTATATCACAAATGACAAATGAAAAATGTGAATCAAATCAATCCAAGTTGA—3’（SEQ ID NO.5）；
刺猬紫檀：
5’CAATCCCGGCGCCTCCGGGCACCGGGCGGGGCGGATGCTGGCCTCCCGCGAGCGAGCGCCTCTCGGTTGGCCGAAAATCGGGTTCGTGGCGGAGGGCAGCGCCACGACAGGTGGCGGTTGAGCGCAATCTCGAGGCCGGCCGTGCGCGCGCCCCCTCCGTCGTTGCGGACCCTAAGACCCGCGGGCGGCACCGATCCGCCGCCCATGACGCGACCTC—3’（SEQ ID NO.9）。
实施例2引物与探针的设计和合成
靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：
安达曼紫檀：
引物1:5’Hex—AGTTTATTTTGAAATAATTCA—3’（SEQ ID NO.2）；
引物2：5’—CATTGCTCCGGGTCAGGGGAAAAAC—3’（SEQ ID NO.3）；
检测探针：
5’NH3—TTTTTTTTTTTCAAAAGGAAAACTAATTCTTCTTTGATT—3’（SEQ ID NO.4）。
将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的安达曼紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出安达曼紫檀。
印度紫檀：
引物1:5’Hex—GAAAGGAAAAGGCTATACAT—3’（SEQ ID NO.6）；
引物2：5’—TCAACTTGGATTGATTTGATTC—3’（SEQ ID NO.7）；
检测探针：
5’NH3—TTTTTTTTTTGATATAAAGAGTCACAAATAGAGATT—3’（SEQ ID NO.8）。
将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的印度紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出印度紫檀。
刺猬紫檀：
引物1:5’Hex—CAATCCCGGCGCCTCCGGGCACC—3’（SEQ ID NO.10）；
引物2：5’—GAGGTCGCGTCATGGGCGGCGG—3’（SEQ ID NO.11）；
检测探针：
5’NH3—TTTTTTTTTTTTGAGATTGCGCTCAACCGCCACCTGTCG—3’（SEQ ID NO.12）。
将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的刺猬紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出刺猬紫檀。
并且，通过同源比对，在3种花梨木的叶绿体基因组上找到了一段高度保守的基因序列，并将其作为管家基因对制备的芯片进行质控。序列如下：
5’AATAATTTTTCGTCTACCTTATCCTTCTTCAAGGATCCTTTGATTCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCCATTCTGGCTTCAAAGAATGCGCCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATACTATCTCATCTATTTCTGGCAATGTCATTTTGATGTTTGGTCTCAACCAGGAACGATCCATATAAACCAATTATTATCCG—3’（SEQ ID NO.13）
针对管家基因序列，设计PCR扩增引物及其修饰位点如下：
质控引物1:5’Hex—AATAATTTTTCGTCTACCTTATC—3’（SEQ ID NO.14）；
质控引物2：5’—CGGATAATAATTGGTTTATATG—3’（SEQ ID NO.15）。
针对管家基因序列，设计检测探针的序列及其修饰位点如下：
5’NH3—TTTTTTTTTGATAGTATTTCCATTTATTCATCAAAAGAGGCGC—3’（SEQ ID NO.16）。
将以上引物和检测探针送上海生物工程有限公司进行人工合成。引物的5’端带HEX荧光标记，备用。探针的5’端带氨基基团，即探针的氨基化，备用。
实施例3模板提取
用OMEGA的植物基因组提取试剂盒SP Plant DNA Maxi Kit（购自美国Omega Bio-Tek公司），取用安达曼紫檀、印度紫檀、刺猬紫檀三种木材的心材部分提取总DNA。提取方法及步骤详见说明书。最后将DNA溶解于水中，制备成浓度为10ng/μl的溶液。
实施例4PCR扩增及荧光标记
用已经荧光标记的引物对提取的模板进行PCR扩增（采用日本TaKaRa公司的PCR Amplification Kit），PCR扩增体系如下：
| 成分 | 浓度 | 用量 |
| 引物（HEX标记5’端） | 10pM | 0.2μl |
| 10×PCR buffer | 2.5μl | |
| 模板DNA | 10ng/μl | 3μl |
| DNA聚合酶 | 5U/μl | 0.5μl |
| dNTP | 10mM | 2μl |
| ddH2O | 补充至25μl |
PCR程序如下：95℃预热5min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；最后72℃延伸5min。
实施例5芯片制备
将氨基化的探针按终浓度20pmoL/L（点样体积为500nl）分别点在醛基片基（购自上海领成生物科技有限公司）上，室温放置过夜，先后用洗脱液I（5×SSC,1%SDS）、洗脱液II(0.25×SSC,1%SDS)各洗脱5min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用。
实施例6分子杂交
将实施例4的PCR产物点在实施例5制备好的芯片上，在42℃下保持40min，用洗脱液I（5×SSC,1%SDS）、洗脱液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脱5min。各芯片的上样情况见下表：
实施例7杂交结果检测
用激光共聚焦扫描仪检测上述3芯片的杂交结果，结果参见图1-3。从图中可见，三张结果图中的质控点都显示正常，说明整个检测操作流程是可靠的，三种红木的检测探针都分别杂交上了靶序列，芯片特异性较好。
实施例8对比试验
为进一步验证芯片的可靠性和分辨率，选取另外的三种红木越柬紫檀（Pterocarpus cambodianus Pierre）、刀状黑黄檀（Dalbergia cultrata Grah）和绒毛黄檀（Dalbergia frulescens）进行对照检验。步骤如下：
1）模板提取：用OMEGA的植物基因组提取试剂盒分别提取越柬紫檀、刀状黑黄檀和绒毛黄檀三种木材的总DNA。提取方法及步骤同实施例3。
2）PCR扩增：按照实施例4中的PCR扩增体系和条件，对步骤1）获得的模板DNA进行扩增。
3）分子杂交：将步骤2）的PCR产物与实施例5中制备的芯片进行原位杂交，杂交条件与实施例6一致。
4）结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果，结果见图4-6，显示本发明所制备的芯片无法检测出越柬紫檀、刀状黑黄檀和绒毛黄檀三种红木，对照试验说明该芯片能将检测的靶序列同其他树种区分开，验证了本发明芯片的准确性和分辨度。
本发明中，各序列分别为：
安达曼紫檀：靶序列：SEQ ID NO.1；引物1：SEQ ID NO.2；引物2：SEQ ID NO.3；检测探针：SEQ ID NO.4。
印度紫檀:靶序列：SEQ ID NO.5；引物1：SEQ ID NO.6；引物2：SEQID NO.7；检测探针：SEQ ID NO.8。
刺猬紫檀：靶序列：SEQ ID NO.9；引物1：SEQ ID NO.10；引物2：SEQID NO.11；检测探针：SEQ ID NO.12。
质控基因序列:SEQ ID NO.13；质控引物1：SEQ ID NO.14；质控引物2：SEQ ID NO.15；质控检测探针：SEQ ID NO.16。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.检测刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）的专用探针，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示序列的反向互补序列的DNA片段。
2.检测刺猬紫檀的基因芯片，其特征在于，其含有权利要求1所述的专用探针。
3.检测刺猬紫檀的装置，其特征在于，其包括如权利要求1所述的专用探针或者如权利要求2所述的DNA芯片。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述的装置还包括引物对，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.11所示。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的引物上含有荧光标记。
6.检测刺猬紫檀的引物，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQID NO.10或SEQ ID NO.11所示的DNA片段。
7.如权利要求6所述的引物，其特征在于，所述的引物上含有荧光标记。
8.一种检测刺猬紫檀的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备待测样本的总DNA，作为模板，用含检测标记的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.11所示；
（2）将专用探针结合于基因芯片的片基上，洗去未结合的探针，获得检测刺猬紫檀的基因芯片，所述的专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQID NO.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示序列的反向互补序列的DNA片段；
（3）在步骤（2）所得的检测刺猬紫檀的基因芯片中加入步骤（1）所得的PCR产物，进行杂交，洗去未杂交的PCR产物；
（4）检测步骤（3）所得的杂交后的基因芯片。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的基因芯片的片基是醛基片基，所述的探针是氨基化探针。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的基因芯片的另外的加样孔中加入花梨木管家基因检测探针，所述的花梨木管家基因检测探针的序列如序列表中SEQ ID NO.16所示序列的核苷酸片段。
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| CN101392300A (zh) * | 2008-10-28 | 2009-03-25 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 菜豆荚斑驳病毒的一步法实时荧光反转录pcr检测 |
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